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Neue Kortikoide, ihre Herstellung
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und Verwendung
Die Erfindung betrifft neue Koftikoide
der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 1, kortikoidhaltige Präparate gemäß Anspruch
6, ihre Verwendung und Verfahren zur Herstellung von Kortikoiden, die als Wirkstoffe
für die pharmazeutischen Präparate gemäß Anspruch 6 verwendet werden können.
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Kortikoidhaltige pharmazeutische Präparate sind wegen ihres entzündungshemmenden
Effekts heute bekanntlich für die therapie, zum Beispiel in der inneren Medizin,
in der Dermatologie aber auch in allen anderen klinisch-medizinischen Bereichen,
von überragender Bedeutung und nicht selten lebensrettend für den Patienten. Da
aber alle systemisch wirksamen Kortikoide starke Nebenwirkungen (z.B. Blutbildveränderungen,
Zerstörung des lymphatischen Systems, Erhöhung der Infektionsanfälligkeit, Beeinflussung
der Natriumretention, Atrophien der Milz, des ghyraus der Nebenniere, des Körpergewichts
etc.) verursachen, ist die Therapie mit kortikoidhaltigen Präparaten problematisch,
zumal diese Nebenwirkungen bei der Dauertherapie mit Kortikoiden ständig vorhanden,
oft am sogenannten Cushing-Syndrom des Patienten äußerlich erkennbar und nicht selten
sogar lebenbedrohend sind.
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Pharmazeutische Präparate, die Kortikoide der allgemeinen Formel II
gemäß Anspruch 6 und insbesondere Kortikoide der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch
1 enthalten, zeigen in den pharmakologischen Tests eine so günstige Dissoziation
zwischen erwünschter entzündungshemmender Wirksamkeit und unerwünschter Nebenwirkungen,
daß
von ihrer Anwendung in der Humanmedizin ein nicht unbedeutender Fortschritt im Bereich
der Kortikoid-Therapie erwartet werden kann.
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Die lokale antiinflammatorische Wirksamkeit der Kortikoide wurde mittels
des bekannten Vasokonstriktionstests ermittelt.
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Auf dem Rücken freiwilliger Versuchspersonen wurde durch 20-mal übereinander
angelegte Abrisse mit einem 2 cm breiten esafilm das Stratum corneum zerlegt und
somit eine ausgeprägte Hyperämie erzeugt.
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Auf gekennzeichnete 4 cm2 große Felder innerhalb des gestrippten Bereiches
wurden 50 mg 0,01 %iger Salbenzubereitungen aufgetragen, Die Salbengrundlage ohne
Wirkstoff diente als Leerwert.
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Der Farbwerk der unbehandelten Haut wurde als 100, der der gestrippten
Haut als 0 angesetzt. Entsprechend wurde der Eautfarbwert der in Vasokonstriktion
befindlichen Haut zwischen 0 und 100 bewertet.
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In der nachfolgenden Tabelle werden Mittelwerte, die aus Untersuchungen
verschiedener Probanden und verschiedener Rückenregionen stammen, aufgeführt.
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Die systemische Wirksamkeit der Kortikoide wurde mit Hilfe des bekannten
Adjuvans-Ödem-Tests wie folgt ermittelt: SPF-Ratten im Gewicht von 130 bis 150 g
wurden zur Erzeugung eines Entzündungsherdes 0,1 ml einer 0,5 %igen IIycobacterium
butyricum
Suspension (erhältlich von der amerikanischen Firma Difko)
in die rechte Hinterpfote injiziert. Vor der Injektion maß man das Pfotenvolumen
der Ratten 24 Stunden nach der Injektion wurde das Pfotenvolumen zur Bestimmung
des Ausmaßes des Ödems abermals gemessen. Anschließend applizierte man den Ratten
oral unterschiedliche Mengen der Testsubstanz. Nach weiteren 24 Stunden wurde das
Pfotenvolumen erneut ermittelt. In gleicher Weise wurden Kontrolltiere behandelt,
diese erhielten aber keine Testsubstanz.
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Aus den erhaltenen Pfotenvolumina wurde in üblicher Weise die Menge
an Testsubstanz bestimmt, welche erforderlich ist, um eine 50 %ige Reduktion des
Pfotenödems zu erzielen.
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Die systemischen Nebenwirkungen der Kortikoide wurden unter anderem
mittels des bekannten Thymolysetestes, der als ein empfindlicher Parameter für den
zytotoxischen Effekt auf bestimmte Lymphozyten ist, wie folgt ermittelt: SPF-Ratten
im Gewicht von 70 bis 110 g wurden unter Äthernarkose adrenalektomiert. 6 Tiere
bildeten jeweils eine Destgruppe, welchen man jeweils 3 Tage eine definierte Menge
Testsubstanz oral appliziert. Am vierten Tag wurden die Tiere getötet und ihr Thymus-Gewicht
bestimmt. Die Kontrolltiere wurden in der gleichen Weise behandelt, erhielten aber
keine Gestsubstanz. Aus den erhaltenen Thymus-Gewichten wurde in üblicher Weise
die Menge Testsubstanz ermittelt, bei der eine 50 %ige Thymolyse beobachtet wird.
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Die systemischen Itebenwirkungen der Kortikoide wurden ferner durch
Bestimmung der Gewichtsreduktion der Nebennieren, die ein indirektes Maß für die
zentrale Hemmung der AC2H-Sekretion ist, wie folgt ermittelt: Männliche Wistar-Ratten
erhielten an 9 aufeianderfolgenden Tagen einmal täglich oral eine Suspension des
Kortikoids in physiologischer Kochsalzlösung. Am zwölften Tag wurden die Tiere getötet
und das Gewicht ihrer Nebennieren bestimmt.
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Unbehandelte Kontrolltiere dienten als Vergleich.
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Ermittelt wurde in üblicher Weise die Menge Testsubstanz bei der eine
50 %ige Nebennierengewichtsreduktion beobachtet wird.
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Letzlich wurde die mineralkortikoide Wirksamkeit der Verbindungen
wie folgt ermittelt: Juvenile männliche Ratten mit Gewichten um 70 g wurden adrenalektomiert
und erhielten bis Versuchsbeginn Standardfutter, 5 %ige Glukose- und 0,9 %ige Kochsalzlösung
ad lib. Nach 2 Tagen wurden zunichst 0,1 mg Testsubstanzoder das Suspensionsmittel
oral, 30 Minuten später 3 ml 0,9 %ige Kochsalzlösung, ebenfalls oral mit einer Schlundsonde
appliziert. Anschließend wurden die Tiere einzeln in Stoffwechseltöpfe gesetzt und
der Harn 6 Stunden lang gesammelt. Die Bestimmung des Natriumgehaltes in Harn erfolgte
mit einem Autoanalyzer mit Flammenfotometervorsatz.
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Die Testsubstanzen waren in Wasser mit einem Zusatz von 0,9 %
Kochsalz
und 0,05 Xo Polyvinylpyrrolidon suspendiert. Von dieser Suspension wurden 0,2 ml
pro Ratte verabreicht.
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In diesen pharmakologischen Testen wurden folgende Verbindungen untersucht;
Verbindung 1: 6α-Fluor-11ß,21-dihydroxy-16α-methyl-1,4-pregnadien-3,20-dion
(=Fluocortolon); ein anerkannt gut wirksames und gilt verträgliches systemisch wirksames
Kortikoid.
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Verbindung 2: 6-Chlor-llß,I7a,-2l-trihydroxy-l,4,6-regnatrien-3,20-dion
(= Cloprednol); ein vorbekanntes strukturanaloges Kortikoid sowie folgende Kortikoide
der allgemeinen Formel II gemäß Anspruch 6.
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Verbindung 3: 6-Chlor-11ß,17α,21-trihydroxy-1α,2α-methylen-4,6-pregnadien-3,20-dion
.
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Verbindung 4: 21-Acetoxy-6-chlor-11ß,17α-dihydroxy-1α,2α-methylen-4,6-pregnadien-3,20-dion.
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Verbindung 5: 6-Chlor-11ß,17α-dihydroxy-1α,2α-methylen-21-trimethylacetoxy-4,6-pregnadien-3,
20-dion.
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Die nachfolgende Tabelle zeigt die pharmakologischen Testergebnisse.
| Ver- Vasokonstriktions- Adjuvansödem- Thymolyse Neben- Harnaus-
µval |
| bindung test nach test ED50 mg/kg ED50 mg/kg nierenreduk- scheidung
Natrium im |
| Nr. 4 Stunden 8 Stunden Körpergewicht Körpergewicht tion ED50
in ml Harm |
| mg/kg |
| Körpergewicht |
| 1 56 78 4,4 0,75 5,0 3,4 749 |
| 2 45 66 9,8 1,3 10,3 4,9 512 |
| 3 60 74 4,7 0,98 9,6 3,0 442 |
| 4 75 78 4,7 1,2 12,9 1,3 229 |
| 5 73 82 3,6 1,2 14,0 1,1 276 |
| Kontrolle 23 29 -.- -.- -.- 1,1 286 |
Die pharmakologischen Testergebnisse zeigen, daß die Verbindungen
3 bis 5 bezüglich ihrer Dissoziation zwischen erwünschter entzündungshemmender Wirksamkeit
und unerwünschter Nebenwirkungen den vorbekannten Verbindungen Fluocortolon und
Cloprednol überlegen sind.
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Die neuen Kortikoide der allgemeinen Formel II können in üblicher
Weise zu Arzneimittelspezialitäten verarbeitet werden, indem man sie gegebenenfalls
mit geeigneten Zusätzen, Trägersubstanzen, Lösungsvermittlern, Stabilisatoren und
Geschmackskorr@gentien in die gewünschten Applikationsformen, wie Salben, Cremes,
Tabletten, Dragees, Kapseln, Lösungen etc. überführt Salben oder Cremes enthalten
vorzugsweise 0,05 0% bis 1 % des Winkstoffes, Tabletten, Dragees oder Kapseln vorzugsweise
5 bis 200 mg des Wirkstoffs.
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Ferner ist es möglich, pulverförmige Gemische, die beispielsweise
0,5 bis 20 mg Wirkstoff neben einem wasserlöslichen Träger wie Lactose enthalten,
als Inhalationemittel anzuwenden.
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Zur Behandlung werden den Patienten je nach Schwere des Krankheitszustandes
vorzugsweise 1 bis 1 000 mg des Wirkstoffes pro Tag appliziert.
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Die Herstellung der neuen Kortikoide der allgemeinen Formel I erfolgt
nach einem dem Fachmann wohlbekannten Verfahren. So kann man beispielsweise das
Kortikoid der Formel III mit den Carbonsäuren
in Gegenwart von
Trifluoressigsäureanhydrid, Carbonyldiimidazol, Cyclohexylcarbodiimid etc umsetzen.
Andererseits is-t es beispielsweise möglich, die Anhydride oder Chloride dieser
Säuren in Gegenwart von Basen (Pyridin, Lutidin, Natriumcarbonat etc.) mit dem Kortikoid
der Formel III umzusetzen.
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Das als Ausgangsverbindung verwendete Kortikoid der Formel III für
dessen Herstellung und Anwendung im Rahmen der vorliegenden Anmeldung ebenfalls
Schutz begehrt wird, wird in der US-Patentschrift 3,598,893 erwähnt, seine Herstellung
und seine physikalischen und physiologischen Eigenschaften sind aber nicht vorbeschrieben.
Diese Verbindung kann beispielsweise auf folgendem Wege sythetisiert werden.
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Eine Lösung von 10 g 6-Chlor-17-hydroxy-1α,2α-methylen-4,6-pregnadien-3,20-dion
in 75 ml Methanol und 75 ml Tetrahydrofuran wird mit 15 g Calciumoxid und 500 mg
Azoisobutyronitril versetzt Nan trop£t einige ml einer Lösung von 10 g Jod in 50
ml Tetrahydrofuran und 30 ml Methanol hinzu, Nach einer Induktionszeit von 60 Minen
entfärbt sich die Lösung; die restliche Jodlösung wird innerhalb 8 Stunden eingetropft
Das Reaktionsgemisch wird mit 500 ml Dichlor
methan verdünnt, das
Calciumoxid wird abfiltriert und das Filtrat mit Natriumthiosulfatlösung und Wasser
gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und bei 35°C im Vakuum eingeengt Nan erhält
13 g 6-Chlor-17-hydroxy-21-jod-1α,2α-methylen-4,6-pregnadien-3,20-dion.
Dieses wird in 130 ml Aceton und 45 ml Essigsäure gelöst, mit 69 mi Triäthylamin
versetzt und 90 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wird in Eiswasser eingerührt,
der entstehende Niederschlag isoliert und an Kieselgel chromatographiert. Mit 16-20%
Aceton-Pentan erhält man 6.1 g 21-Acetoxy-6-chlor-17-hydroxy-1α,2α-methylen-4,6-pregnadien-3,20-dion
vom Schmelzpunkt 224°C.
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Ein 2 l-Erlenmeyerkolben, der 500 ml einer 30 Minuten bei 120°C im
Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 1 % Cornsteep liquor, 1 % Sojapuder und
0.005 % Sojaöl, eingestellt auf pH 6.2, enthält, wird mit einer Lyophilkultur von
Curvularia lunata (NRRL 2380) beimpft und 72 Stunden bei 30°C auf einem Rotationsschüttler
geschüttelt. Mit dieser Vorkultur wird dann ein 20 1-Fermenter. beimpft, der. 15
1 eines bei 12100 und 1,1 atü sterilisierten Mediums aus .1 % Cornsteep liquor,
0.5 % Stärkezucker und 0.005 % Sojaöl, cingestellt auf pH 6.2, enthält. Unter Zugabe
von Silicon 51-1 als Antischaummittel wird bei 29°C unter Belüftung (10 l/Min.),
O 7 a-tü Druck und Rühren (220 U/Min.) 24 Stunden germiniert. 1 Liter der Kulturbrühe
wird unter sterilen Bedingungen in 14 l eines wie oben sterilisierteri Mediums aus
1 % Cornsteep liquor, 1-25 % Sojapuder und 0.005 % Sojaöl überführt und unter gleichen
Bedingungen angezüchtet. Nach 12 Stunden wird eine Lösung von 15 g 21-Acetoxy-6-chlor-17-hydroxy-1α,2α-methylen-4,6-pregnadien-3,20-dion
in 150 ml Dimethylformamid zugegoben und weiter gerührt und belüftet. Nach 26 Stunden
Kontaktzeit
wird der Fermenterinhalt zweimal mit je 10 1 Methylisobutylketon
ausgerührt und die vereinigten Extrakte bei 50°C Badtemperatur im Vakuum eingedampft.
Der Rückstand rrrird in Mothanol aufgenommen, das nich-t gelöste Siliconöl abgetrennt,
die Lösung mit A-Kohle behandelt und nach dem Konzontrieren zur Kristallisation
gebracht. Das ausgeschiedene kristalline Produkt wurde zur weiteren Reinigung über
eine Kieselgelsäule mittels eines Methylenchlorid-Aceton-Gradienten chromatographiert
und danach aus Aceton-Methanol umkristallisiert. Das reine 6-Chlor-11ß,17,21-trihydroxy-1α,2α-methylen-4,6-pregnadien-3,20-dion
(8.1 g) schmilzt bei 271-272°C. UV:#283=17300 (Methanol).
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[α]D25= +273° (Methanol).
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Die nachfolgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung des orfindungsgemäßen
Verfahrens.
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Beispiel 1 1 g 6-Chlor-11ß,17,21-trihydroxy-1α,2α-methylen-4,6-pregna
dien-3,20-dion wird in 5 ml Pyridin gelöst, 1 ml Acetanhydrid zugegeben und 2 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt. Danach gießt man das Reaktionsgemisch in 8prozentige
Schwefelsäure, rührt einige Zeit nach und saugt das ausgefallene Kristallisat ab
Nach Kristallisation aus Aceton-Hexan erhält man 825 mg 21-Acetoxy-6-chlor-11ß,17-dihydroxy-1α,2α-methylen
4,6-pregnadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 158-160°C.
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UV:#284=15700 (Methanol). [α]D25= +290° (Chloroform).
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Beispiel 2.
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1 g 6-Chlor-11ß,17,21-trihydroxy-1α,2α-methylen-4,6-pregnadien-3,20-dion
wird in 5 ml Pyridin gelöst, 0.5 ml Buttersäureanhydrid zugegeben und 3 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt. Nach Stehen über Nacht im Kühlschrank rührt man das
Reaktionsgemisch in 8prozentige Schwefelsäure ein, filtriert das ausgeschiedene
Eristallisat ab, wäscht neutral und kris-tallisiert aus Aceton-isopropyläther um.
Man erhält 728 mg 21-Butyryloxy-6-chlor-11ß, 17-dihydroxy-1α,2α-methylen-4,6-pregnadien-3,20-dion
vom Schmelzpunkt 138-140°C.
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UV:#284=16100 (Methanol). [α]D25= +271° (Methanol).
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Beispiel 3 Dic Lösung von 500 mg 6-Chlor-11ß,17,21-trihydroxy-1α,2α-methylon-4,6-pregnadien-3,20-dion
in 12 ml Pyridin wird mit 6 ml Capronsäureanhydrid versotzt und 16 Stunden bei Raumtemperatur
stehen gelassen Nach Zugabe von 2 ml Wasser wird die Roaktionslösung 2 Stunden auf
dein Dampfbad erhitzt und anschließend in Eiswasser eingerührt. Das ausgefallene
Produict wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen, getrocknet und aus Acet on-Diisopropyläther
umkcristallisiert. Man erhält 465 mg 6-Chlor-21-hexanoyloxy-11ß,17-dihydroxy-1α,2α-methy-.
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len-4,6-prognadien-3,20-dion. Schmelzpunkt 162°C.
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UV:#283=16400 (Methanol). [α]D25= +272° (Chloroform).
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Beispiel 4 600 mg 6-Chlor-11ß,17,21-trihydroxy-1α,2α-methylen-4,6-pregnadien-3,20-dion
werden in einem Gemisch aus 15 ml Pyridin und 7.5 ml Trimethylessigsäureanhydrid
3 Stunden auf 80°C erhitzt. Die Aufarbeitung erfolgt wie im Beispiel 4 beschrieben.
Das Rohprodukt wird aus Aceton-Diisopropylether umkristallisiert. Ausbeute 120 mg
6-Chlor-11ß,17-dihydroxy-1α,2α-methylen-21-trimethylacetoxy-4,6-pregnadien-3,20-dion.
Schmelzpunkt 2170 G. UV:#283 = 16100 (Methanol).
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[α]D25= +271° (Chloroform).