DE2800780A1 - Verfahren zur untersuchung von koerperfunktionen - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE 280C780

DR. A. VAN DERWERTH DR. FRANZ LEDERER REINER F. MEYER

DIPL.-ING. (1934-1974) DlPL-CHEM. DIPL.-ING.

8000 MÜNCHEN 80 LUCILE-GRAHN-STRASSE 22

TELEFON: (089) 47 2947 TELEX: 524624 LEDER D TELEGR.: LEDERERPATENT

9. Januar 1978 5414

THE RADIOCHEMIC&L CENTRE LIMITED White Lion Road, Amersham, Buckinghamshire, England

Verfahren stir Untersuchung von Körperfunktionen

Die Erfindung besieht sich auf die Untersuchung von ILorperiunktionen, insbesondere der Punktion des Dünndarms, aber auch der Leber, unter Verwendung von Gallensäuren und deren Salzen oder ihren Stoffwechsel-Vorläufern, mit Isotopen des Selens oder Tellurs radioaktiv markiert.

lOie entsprechenden 3alse v/erden in der Leber aus Cholesterin aufgebaut, gelangen über Leber- und gewöhnliche Gallenwege in den Verdauungstrakt, werden wieder im Ileum absorbiert und gelangen über das Pfortadersysteir. in die Leber surück. Bei diesem enteroLepatischen Kreislauf in einem normalen Menschen werden mehr als 95 vj der in den Dünndarm gelangenden Gallensalse wieder absorbiert, der Rest gelangt in den Dickdarm und erscheint eventuell in den faeces. Sine gestörte Punktion des Ileum, die durch eine Reihe pathologischer Zustände ausgelöst werden kann, kann su mangelhafter Absorption von Gallensalsen führen. Eine Kessung der

809828/09B0

Gallensalz-Absorption durch das Gedärm würde daher eine nützliche Information liefern, die es ermöglichen würde, den distalen Dünndarm als Quelle für gastrointestinale Störungen zu erkennen oder auszuscheiden.

Gallensäuren können durch die folgende Formel dargestellt werden:

(1)

COOH

worin R₁, Rp> R₅ und R. unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine α- oder ß-Hydroxyl-Gruppe bedeuten und Hc entweder in α- oder ß-Stellung steht.

Gallensalze sind Verbindungen der obigen Gallensäuren mit Aminosäuren, insbesondere Glycin und Taurin.

Carboxyl- X-cholsäure (Formel 1, R_? = H, R₁ = R, = R. = Q-OH; ß-Hc) und ihre Taurinverbindung wurden zur Untersuchung der Absorption von Gallensalzen im Gedärm sowohl von Tieren als auch von Menschen unter einer Reihe pathologischer Zustände verwendet, z.B. Ileitis regionalis, Ileum-ReSektion und induzierter Diarrhöe. Die Untersuchungen machten die Messung von C-Radioaktivität in Faeces, Urin und Galle erforderlich. Im Atmungstest nach Fromm und Hofmann wird Glycin-1-( C)glykocholat zum Nachweis verstärkter bakterieller Zersetzung oder Spaltung von Gallensalzen verwendet. Nach dieser Spaltung im Dünndarm als Ergebnis eines übermäßigen bak-

809828/0950

teriellen Wachstums oder im Dickdarm nach Malabsorption von Gallensalz unterliegt das freigesetzte Glycin dem Stoffwechsel, wird absorbiert und teilweise als COp ausgeatmet. Im Falle von Gallensalz-Malabsorption tritt ein Teil der ¹^C-Radioaktivität in den Faeces auf. Eine Faeces- C-Messung ist wesentlich für die vollständige Auswertung des Diagnosebereichs des Atmungstests. Bei der Diagnose von Gallensäure-Malabsorption ist der Schilling-Test unter Verwendung von markiertem Cyanocobalamin mit Eigenfaktor oft hilfreich, er kann jedoch selbst nicht zwischen übermäßigem Bakterienwachstum und Ileum-Dysfunktion unterscheiden.

Die Messung der Gallensäure-Adsorption als Routinetest für die Dünndarmfunktion würde stark erleichtert, wenn die Gallensäuren mit einem y-emittierenden Isotop markiert werden könnten. Zählen von y-Strahlern ist im allgemeinen leichter und wirtschaftlicher als Zählen von β-Strahlern: Dies gilt insbesondere für biologische Proben, wie Galle oder Faeces, wobei es für β-Strahler erforderlich wäre, die Probe zu bearbeiten, bevor mit dem Zählen begonnen werden könnte. Das Markieren mit einem y-Strahler würde den zusätzlichen Vorteil haben, eine Körperzählung zu ermöglichen und so die Notwendigkeit der Handhabung von Faeces-Proben umgehen; auch eine Sichtbarmachung des enterohepatischen Systems ware möglich. Die y-emittierenden Isotope, die möglicherweise zum Markieren von Gallensäuren ohne Änderung ihres biologischen Verhaltens verwendet werden könnten, und bei denen die Markierung durch den ganzen enterohepatischen Zyklus erhalten bliebe, sind zahlenmäßig begrenzt.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Radioisotopen des Selens und Tellurs, wie Selen-75 und Tellur-123m, zur Erfüllung der erforderlichen Funktion. Der Einbau entweder von Selen oder Tellur in die Struktur des Gallensäuremoleküls ist bisher noch nicht beschrieben worden; dies gilt

809828/0950

sowohl für die radioaktive als auch die nicht-radioaktive Form dieser Elemente.

Der hinter der Erfindung liegende Grundgedanke entstammt der Peststellung, daß, wenn 19-Kethyl-( Se)selenocholesterin Menschen intravenös verabreicht v/urde, mit dem Ziel der Sichtbarmachung des Adrenalsystems, die Radioaktivität des 3elen-75 im enterohepatischen System konzentriert wurde und daß der Stoffwechsel des 19-Methyl-('⁵Se)selenocholesterins dem des Cholesterins parallel zu sein schien. Es wurde vermutet, daß 19-Methyl-( Se)selenocholesterin in Analoga der Gallensalze überführt wurde, in denen eine Methyl seleno -Gruppe an das Cjg-Kohlenstoffatom gebunden war.

Die Erfindung bietet gemäß einem Aspekt eine Methode zur Untersuchung von Körperfunktionen, insbesondere der Dünndarmfunktion, eines Säugetiers, bei der ein y-Strahlen emittierendes, mit Se oder Te markiertes radioaktives Derivat einer Gallensäure oder einer Aminosäure-Verbindung von dieser (Gallensalz) oder ein Stoffwechsel-Vorlaufer in das lebende Säugetier eingeführt und nach dem Ablauf einer geeigneten Zeitspanne die Radioaktivitätsverteilung bestimmt wird. Zur Bestimmung der Dünndarmfunktion wird die markierte Gallensäure oder das entsprechende Gallensalz vorzugsweise oral eingeführt. Die Verteilung der Radioaktivität kann durch Zählen der Körper-Radioaktivität bestimmt werden, z.B. mit Hilfe eines Ganzkörperzählers oder durch Messung der Strahlung der Faeces. Bei Messungen der Faeces gehört zur Erfindung auch die Verwendung eines zweiten, nicht-absorbierbaren, y-Strahlen emittierenden Isotops, z.B. I-Polyvinylpyrroiidon oder Cr als Karkierungsmittel. Diese Untersuchung der Körperfunktion kann die Sichtbarmachung eines Teils, z.B. des Leber-Galle-Systems, des Säugetiers umfassen, indem in das lebende Säugetier ein y-Strahlen emittierendes radioaktives Selenoder Tellurderivat einer Gallensäure oder deren Aminosäure-

809828/0950

Verbindung eingeführt, die Konzentrierung der markierten Gallensäure in dem Teil, z.B. dem Leber-Galle-System, abgewartet und die von der markierten Gallensäure in diesem Teil emittierte Strahlung festgestellt wird.

Im Falle der Ganzkörper- und Faeces-BeStimmung der Se-oder Te-Verteilung können die Kessungen nicht eher beginnen, als bis ein Teil der Radioaktivität aus dem Körper ausgeschieden ist. Dies wäre normalerweise eine Mindestzeit von etwa 24 h nach der Aufnahme des markierten Gallensalzes, könnte aber bei einigen Patienten schwanken. Die Messungen können auch über einen längeren Zeitraum durchgeführt werden, beispielsweise über 7-14 Tage, um genauere V/erte der Ausscheidungsraten zu erhalten. Im Falle von Plasma-Bestimmung können die Messungen innerhalb weniger als 24 h nach Aufnahme des Gallensalzes begonnen werden, da die Absorption durch das Eingeweide in das Plasma deutlich vor dem Ausscheiden von Radioaktivität über die Faeces eintreten würde. Auch hier ist es wieder möglich, die Messungen über einen längeren Zeitraum durchzuführen, um genauere Informationen zu erlangen.

In jüngerer Zeit wurde gezeigt, daß der Blutgehalt an Gallensäuren und deren Salzen, in vitro durch Radioimmuntest (Radioimmunoassay), eine empfindliche Anzeige der Leberfunktion bieten kann. Erfindungsgemäß ermöglicht die Einführung einer radioaktiv markierten Gallensäure oder eines entsprechenden Salzes in den Blutstrom die Durchführung der Bestimmung in vivo rasch und in einfacher V/eise. Hierzu wird die markierte Gallensäure oder deren Salz vorzugsweise intravenös verabreicht und Blutproben zur radioaktiven Auszählung nach geeigneten Zeiträumen entnommen.

Für einen ausgewachsenen Menschen liegt die verabreichte Dosis im allgemeinen im Bereich von 1 bis 500 μθΐ, z.B. zwischen 1 und 50 μθί, zur Untersuchung von Organfunktionen

809828/0950

oder zwischen 50 und 500 p.Ci zur Sichtbarmachung von Organen·

Techniken zur Einführung einer Gallensäure in lebende Säugetiere und zu deren Absorption und Lokalisierung sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden hier nicht weiter beschrieben. Messungen der γ-Strahlung, die von dem Selen oder Tellur emittiert wird, und die Sichtbarmachung des Leber-Galle-Systems oder anderer Teile des Säugers, in denen die markierte Gallensäure angereichert ist, können mit Standardmitteln durchgeführt werden. Eine Ausstattung zur Messung der Körper-Radioaktivität kann in geeigneter Weise ein Ganzkörperzähler oder eine y-Kamera mit abgenommenem Kollimator sein, gerichtet auf den ganzen Körper oder nur gerade auf den einschlägigen Teil.

Zu den markierten Gallensäuren oder ihren Salzen und ihren Stoffwechsel-Vorprodukten, die bei dem obigen Verfahren verwendet werden, gehören solche gemäß den folgenden Formeln (2) und (3) und die entweder mit Se oder Te entweder in C-ig-Stellung oder in der C^-Seitenkette des Moleküls substituiert sind; auch Se- oder Te-markierte Derivate von Verbindungen wie 7K-Hydro:xy-19-methylselenocholesterin, die zwischendurch bei der Stoffwechselumwandlung von Verbindungen wie 19-Methylselenocholesterin in 19-Methylseleno-Gallensäuren oder deren Salzen auftreten; sowie die der folgenden Formel (4).

CDR

(2)

809828/0950

worin Z ein y-Strahlen emittierendes radioaktives Isotop des Selens oder Sellurs,

R¹ Alkyl (z.B. Cj-C^-Alkyl), Cycloalkyl {z.B. Cyclohexyl),

oder Aralkyl (z.B. Benzyl),

2 5 4· 5
R , R , R und R unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine od-oder ß-Hydro3cyl-Gruppe,
R -OH oder ein Aminosäurerest ist, H tf-H oder ß-H sein kann und
^n O oder 1 ist,

(3)

/ /λ
worin R -(CH)_A(CH₂)_B-Z-(CH₂)_cCH-C0R⁶,

A 0 oder 1,

B 0 Ms 4,

C 0 Ms 4,

Z ein !'-Strahlen emittierendes radioaktives Isotop des Selens oder Tellurs,

R -OH oder ein Aminosäurerest,

R' »"asserstoff oder eine gesättigte C₁ bis C^-Alkylgruppe, wenn A 1 ist, und

R Wasserstoff oder eine gesättigte C. bis C --Alkylgruppe, η 0 oder 1,

809828/0950

280Ü73Ü

R , R , R⁴ und R" -unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine d- oder ß-Hydroxyl-Gruppe oder eine Oxagruppe und Ir ein OL- oder ß-H ist,

11

COR*

(4)

worin R -OH oder ein Aininosäurerest ist,

A A O

-IQ A A A

R , R und R

unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Λ- oder ß-Hydroxyl-Gruppe oder eine <X- oder ß-SeCH~-Gruppe, -SeR , wobei R^ C₁ bis C,-Alkyl ist, vor-

13 ausgesetzt, daß wenigstens eine eine α- oder ß-Gruppe-SeR ist, sind und

H entweder in c(- oder ß-Stellung steht.

Gemäß einem weiteren Aspekt gehören zur Erfindung markierte Gallensäuren und deren Salzderivate, substituiert durch Se oder Te entweder am C.q oder in der C.,,-Seitenkette, wie durch die obigen Formeln (2) bzw. (5) definiert.

Die Erfindung umfaßt die inaktiven Verbindungen und auch

insbesondere die mit radioaktiven Isotopen des Selens und 75

Seilurs, z.B. Se und ^J Te, markierten Verbindungen. Die inaktiven Verbindungen sind nützliche Hilfsmittel zur Bestimmung der Eigenschaften der radioaktiven Verbindungen.

Die erfindungsgemäß markierten Gallensäuren und deren Aminosäure-Verbindungen können auf folgende Weise hergestellt v/erden:

809828/0950

1 · 19-Alkylselenogallensäuren und deren Verbindungen

Die der Formel (2) entsprechenden Verbindungen dieser Gruppe können biologisch hergestellt werden.

19-Methyl-(' Se)selenocholesterin oder eine geeignete Zwischenstufe auf dem Stoffwechselweg der Umwandlung in ein

75 Gallensalz-Analogon, z.B. Ttf-Hydroxy-IS-methyl- Se-selenocholesterin, wird einem geeigneten Tier, z.B. einer Ratte oder einem Kaninchen, mit einer Gallenfistel intravenös ver-

75
abreicht. Die ^Se-Verbindung wird in der Leber des leben-

75

den Tieres in ein ^Se-markiertes Gallensalz-Analogon überführt, das in der Galle über die Gallenfistel gesammelt wird. Trenn- und Reinigungsmethoden für Gallensäuren und ihre Verbindungen aus Gallenproben sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispielsweise wird die Galle zu 20 Volumina absoluten Äthanols gegeben. Nach kurzem Sieden und anschließendem Abkühlen wird der Extrakt filtriert und zur Trockne eingeengt. Nach Extraktion mit Petroläther zur Entfernung von Fetten wird der feste Rückstand dann in Methanol gelöst und die methanolische Lösung nach dem Filtrieren zum Entfernen anorganischer Salze im Vakuum zur Trockne eingeengt, um

ein Gemisch von natürlichen und '^Se-markierten Gallensalzen zu erhalten. Das Rohprodukt kann durch präparative Dünnschichtchromatographie weiter gereinigt werden. Der Vorteil der Verwendung eines Stoffwechsel-Zwischenprodukts, wie 7of—

75
Hydröxy-19-methyl- Se-selenocholesterin, liegt darin, daß

75
höhere Ausbeuten der Se-Gallensäuren erhalten werden. Als Alternative zur Verwendung eines lebenden Tieres für die

75
biologische Herstellung eines Se-markierten Gallensalzc kann eine isolierte, perfundierte Leber verwendet werden.

Das oben beschriebene Verfahren wurde angewandt, um Analoga von Gallensalzen herzustellen, in denen die Methylgruppe am C. (.-Kohlenstoffatom durch eine Methylselenomethylgruppe

809828/0950

ersetzt ist. Die Produkte verhielten sich wie Aminosäure-Verbindungen von Gallensäuren sowohl hinsichtlich ihres chromatographischen Verhaltens als auch als Substrate für das Enzym Cholylglycinhydrolase.

2. Gallensäuren und ihre Verbindungen mit einem Selenatom in der C. „-Seitenkette

Die Verbindungen dieser Gruppe, entsprechend der Formel (3), können durch Umsetzen eines geeigneten Selen- oder Tellurnucleophils mit einer modifizierten Gallensäure mit einem endständigen Halogenatom, z.B. Brom oder Jod, in der C₁^- Seitenkette hergestellt werden. Diese Umsetzungen erfolgen in Lösungsmitteln wie Äthanol, Propanol, Tetrahydrofuran oder Dimethylformamid oder Gemischen dieser Lösungsmittel, im allgemeinen bei Raumtemperatur. Die Selen- oder Tellurnucleophile entstehen durch Umsetzung von Dinatriumdiselenid oder -ditellurid in flüssigem Ammoniak mit einer ω-halogenierten Carbonsäure oder deren Ester, wobei sich das anfallende organische Diselenid oder Ditellurid in einem der obigen Lösungsmittel löst und durch Reagentien wie Natriumborhydrid oder Dithiothreitol gespalten wird; weitere Umsetzung mit der modifizierten Gallensäure erfolgt in situ.

Alternativ kann die halogenierte Gallensäure mit Dinatriumdiselenid in einem Lösungsmittel, wie Propanol, bei erhöhten Temperaturen umgesetzt werden, um ein Disteroid-diselenid zu liefern. Das Disteroid-diselenid wird in Äthanol gelöst, mit Natriumborhydrid gespalten, und das Selenol wird in situ mit einem ω-halogenierten Carbonsäureester umgesetzt.

Die Verwendung von Kaliumselenocyanat bietet einen brauchbaren Weg zu den Verbindungen dieser Gruppe. Kaliumselenocyanat, hergestellt durch Lösen von rotem Selen in äthanolischem Kaliumcyanid, wird in Äthanol bei niederen Temperaturen mit einem ω-Halogencarbonsäureester umgesetzt. Der

809828/0950

entstandene w-Selenocyanat-carbonsäureester wird mit Natriumborhydrid reduziert und in situ mit der halogenieren Gallensäure-Zwisehenstufe umgesetzt. Diese Reaktionen erfolgen gewöhnlich "bei Raumtemperatur in Äthanol oder Äthanol/Tetrahydrofuran-Gemisehen.

a-Halogenierte Carbonsäureester können anstelle von ω-halogenierten Verbindungen in der obigen Reaktion verwendet werden, um Produkte mit einer Seitenkette in α-Stellung zur Carboxylgruppe zu liefern.

Wurden Hydroxylgruppen durch Acylierung und Carbonsäuregruppen durch Veresterung geschützt, werden die Schutzgruppen vor der abschließenden Reinigung des Produkts nach Standardmethoden durch präparative Chromatographie an Kieselgel entfernt.

Die Gallensäuren-Analoga mit entweder einem Selen- oder einem Tellur-Atom in der C. .,-Seitenkette können über eine Amidbindung an Aminosäuren, wie Glycin und Taurin,gebunden werden. Die zur Herstellung der Gallensäure-Verbindungen angewandten Methoden sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und hängen von der Kondensation der Gallensäure mit der Aminosäure in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, und in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie Carbodiimid oder N-Äthoxy-carbonyl-Z-äthoxy-dihydrochinolin (Äädch) ab.

Die nachfolgend gezeigten Reaktionsschemata veranschaulichen die vorstehend breit beschriebene Herstellung. Weitere Einzelheiten finden sich in den Beispielen. Natürlich können diese Herstellungen entweder mit natürlichem Selen oder Tellur oder mit an ihren jeweiligen Radioisotopen angereicherten Elementen, z.B, '^Se oder *^mTe, durchgeführt werden.

809828/0950

i) Na₀Se₀ + ICH₀COOH fluss ^{2 2 2}

uss. NH, T¹ % [

SeCH₉COOH (Te)² j

¹SeCH₂COOH

+ Mthiothreitol ^C2^H5^0H/^]DMF

2 R

(CH₀),, SeCH₀COOH Ii ^{2 n} (Te)²

ii) Na₂Se₂ +

fr

(CH₂)_nSe»

X n-Propanol

+ BrCH₂CO₂Et + NaBH

SeCH₂CO₂Et

iii) Se + KCN

KSeCN

KSeCN ₊ BrCH₂CO₂Et

+ NCSeCH₀CO₀Et + NaBH

SeCH₂CO₂Et

R = Gallensäure-Kern, X = Halogen

Der Einbau entweder eines Selen- oder Tellur-Atoms in die C₁ ,,-Seitenkette einer Gallensäure gemäß Formel (2) hängt von der Verfügbarkeit modifizierter Gallensäure-Zwischenstufen mit einem endständigen Halogenatom, z.B. Brom oder Jod, in der Cjy-Seitenkette ab. Die Bereitstellung solcher Zwischenstufen erforderte die Verkürzung oder Verlängerung der C₁₇-Seitenkette nach auf dem Fachgebiet bekannten Methoden, z.B. dem Barbler-V/ieland-Abbau bzw. der Arndt-Eistert-Reaktion. Ersatz der endständigen Carboxylgruppe durch ein Halogenatom kann nach dem Kunsdiecker-Abbau erfolgen. Eine besonders wirksame Maßnahme zur Erzielung dieses Ersatzes besteht darin, die Gallensäure in Tetrachlorkohlenstoff unter Rückfluß

809828/0950

mit Bleitetraacetat/Jod-Reagens unter Bestrahlung des Reaktionsgemische mit Licht zu behandeln. Die Hydroxylgruppen der Gallensäure müssen mit geeigneten Gruppen, wie Pormyl-, Acetyl-, Nitro-Gruppen usw., geschützt werden. Diese Reaktion führt zum Ersatz der Carboxylgruppe durch ein Jodatom. Der Abbau der C. ,,-Seitenkette von Cholsäure, um ein 20-Jod-5ß-pregnan-Derivat zu liefern, kann durch drei aufeinanderfolgende Reaktionen erfolgen:

1. Rückflußkochen der geschützten Gallensäure in trockenem Benzol und unter Stickstoff mit Bleitetraacetat in Gegenwart von Kupfer(II)acetat und Pyridin liefert das entsprechende Δ -24-Nor-5ß-cholen (A);

2. Behandeln von A mit Natriumperjodat/Kaliumpermanganat

in wässrigem 2-Methylpropan-2-ol in Gegenwart von Kalium-

22 carbonat führt zur Oxydation der Δ -Bindung und liefert die 3a,7a,12a-Triformoxy-23,24-bisnor-5ß-cholansäure (B);

3. B wird in Tetrachlorkohlenstoff mit Bleitetraacetat/Jod-Reagens unter Lichtbestrahlung rückflußgekocht, um das 3a,7a,12a-Triformoxy-20-jod-5ß-pregnan-Derivat (C) zu ergeben. C ist vermutlich ein Gemisch von R- und S-Isomeren, die Anteile wurden jedoch nicht bestimmt.

Die obige Reaktion kann ebenfalls unter Verwendung von Sterddon in der 5a- oder 5ß-Konfiguration durchgeführt werden. Zu verfügbaren Steroiden in der 5α-Konfiguration gehören 5a-Cholansäure-3ß-ol und 22,23-Bisnor-5a-cholansäure-3ß-ol.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.

3. Gallensäuren mit Ring-Selenoalkyl-Substitution

Die Verbindungen dieser Gruppe entsprechend der Formel (4) können aus der entsprechenden Ring-OH-substituierten Verbindung hergestellt werden, indem zuerst die Hydroxylgruppe durch Jod und dann das Jod in an sich bekannter Weise durch

809828/09 5

Selenoalkyl ersetzt wird·

Auf die vorstellend allgemein und in den folgenden Herstellungsbeispielen im einzelnen beschriebene Weise wurden die folgenden zehn Verbindungen hergestellt:

Hergestellte Verbindungen (endgültige Nomenklatur)

i 19-Methyl-'^Se-selenogallensäure-salze, biosynthe-

75 tisch hergestellt aus 19-Methyl- Se-selenocholesterin.

ii 5 oif 12«-Mhydroxy-22-(carboxymethyl-⁷⁵Se-seleno) -25,24-bisnor-5ß-cholan

nr

(23- Se-Selena-25-homodesoxycholsäure)

iii 3ef, 7cc -Dihydroxy-23- (ß-carboxyäthyl-⁷⁵Se-seleno) -24-nor-5ß-cholan.

iv 3 <K_f 7ίκ, 12f(-Trihydroxy-23- (ß-carboxyäthyl-' -'se-seleno) 24-nor-5ß-cholan.

v 3 <*_t 7 oc, 12oi-Trihydroxy-20- ( carbo^methyl-' ³Se-seleno) -5ßpregnan.
(22-⁷⁵Se-Selenacholsäure).

75
vi Grlyko-22- Se-selenacholsäure

(GIyein-Verbindung von v)

75
vii 3rt-Hydroxy-24-(earboxymethyl- Se-seleno)-5ß-cholan·

viii 3ίΧ, 12of-Dihydroxy-23- ( earboxymethyl- *^mTe- tellur ο) 24-nor-5 ß - cholan.

75
ix Tauro-23- Se-Selena-25-homodesoxycholsäure (Taurin-Verbindungen von ii)

75

x 3,7,12-Triketo-23-(earboxymethyl-'^Se-seleno)-24-nor-5ß-cholan.

) Biologische Auswertung

A, Untersuchungen zur Verteilung im Gewebe

Untersuchungen zur Verteilung im Gewebe in Ratten nach oraler Verabreichung von Verbindungen i bis viii zeigen, daß

Selen und Tellur als Teil einer Vorsilbe, z.B. Carboxymethylseleno sind als Seleno und Telluro bezeichnet. Selena und Tellura bezeichnen den Ersatz einer CH₂-GrUgPe durch Selen bzw. Tellur, z.B. bedeutet 22-Selenacholsäure den Ersatz des C^-Kohlenstoffatoms durch Selen.

809828/0950

diese Verbindungen nach einer Zeit von 7 bis 8 Tagen zu mehr als 90 % in den Faeces ausgeschieden werden. Das Muster der Verteilung im Gewebe ist für alle Verbindungen ähnlich. Nach 20 h ist die ⁷⁵Se-Radioaktivität weitgehend auf die Leber, den Darm und die Faeces beschränkt; abgesehen von den Verbindungen iii und iv sind weniger als 5 % der Radioaktivität auf andere Organe verteilt* Verbindung ii zeigt zu diesem Zeitpunkt ein etwas anderes Verhalten,

75 indem es einen äußerst geringen Prozentsatz an Se-Radioaktivit'ät in den Faeces und einen entsprechend höheren Anteil im Dünndarm aufweist.

B. Ganzkörper-Ausscheidungsuntersuchungen

Untersuchungen zur Ganzkörperausscheidung in Ratten über einen Zeitraum von 8 Tagen nach oraler Verabreichung der Verbindungen i bis viii zeigen, daß bezüglich einem nicht-

131 absorbierbaren radioaktiven Markierungsmaterial, ^ J-PoIyvinylpyrrolidon, die Ausscheidung verzögert ist.

Von jeder der acht untersuchten Verbindungen wurden Ratten etwa 10-15 μθί über einen in das Verdauungssystem geführten Schlauch verabreicht. Ganzkörperzählungen wurden unmittelbar nach Verabreichung und in Abständen während der folgenden 6 bis 8 Tage bestimmt. Ein Ganzkörperstandard erlaubte Korrekturen des radioaktiven Zerfalls und von Schwankungen in der Zählleistung.

Die Ganzkörper-Retention wird als Prozentsatz der unmittelbar nach der Verabreichung bestimmten Zählimpulse ausgedrückt.

Graphische Analyse der Ergebnisse zeigte, daß in jedem Falle die Werte näherungsweise durch eine Funktion der Form

Retention (t) = ae"^xt + bc~^yt + c (1) wiedergegeben v/erden können. Die für jeden der Parameter in Gleichung 1 erhaltenen Werte für jede Substanz sind nachfolgend tabellarisch zusammengefaßt:

809828/0950

ti

	aft)	xCd"1)	27.6	y\£ )	3.36
ii	190	2.29	42.5	0.65	15.5*
iv	260	2.77	37.5	0.66	4.0
iii	170	2.31	16.5	0.53	0.8
V	98	2.52	7.2	0.38	0.58
vi	221	1.54	11.8	0.54	2.85
vii	203	2.29	7.1	0.44	6.0
i	80	2.02	6.3	0.62	1.3
viii	173	2.26	0.43

* Vermutlich näher bei 5,5 % nach Sezierergebnissen. Die erste Komponente (ae"^xt) ist variabel. Es ergibt sich jedoch ein konsistentes Muster. Die Halbwertszeit dieser ersten Komponente lag im Bereich von 0,25 bis 0,45 Tagen. Die Halbwertszeit des nicht-absorbierten Magen-Darm-Markierungsmaterials, ¹⁵¹J-PYP, stellte sich zu etwa 0,17 Tagen heraus, und so stellt die erste Komponente der GaI-lensalzausscheidung kein Material dar, das unabsorbiert durch den Nährstoff kanal gegangen ist. Sie kann jedoch den Teil des verabreichten Gallensalzes darstellen, der nach Absorption beim ersten Durchgang durch die Leber dem Stoffwechsel unterliegt und nicht wieder absorbiert wird.

Die zweite Komponente (be"^y ) hatte eine Halbwertszeit im Bereich von 1,05 bis 1,82 Tagen. Dies entspricht etwa dem 10-fachen der Halbwertszeit eines nicht-absorbierten Markierungsmaterials und stellt sicherlich Material dar, das vom Magen-Darm-Trakt absorbiert worden ist. Dieses Mate-

609828/0 950

rial wird wahrscheinlich in den enterohepatischen Kreislauf einbezogen.

Die Konstante (c) "bedeutet den Prozentsatz der verabreichten Substanz, der mathematisch als niemals ausgeschieden (oder mit einer sehr langen Halbwertszeit, verglichen mit den anderen Komponenten, ausgeschieden) bezeichnet wird. Der Wert für die Trihydroxy-Verbindung ist anomal - Untersuchungen zur Gewebeverteilung nach 8 Tagen zeigten eine Ganzkörperretention von etwa 5,5 %·

C. Untersuchungen zur Gallenabsonderung

Die Gallenabsonderung von Ratten mit ^C/'⁵Se-Radioaktivitat nach oraler Verabreichung eines Gemischs von 'Se-SeIenogallensäure und ^C-Cholsäure liefert in früheren Untersuchungen nicht enthüllte Informationen. Die ^"C-Cholsäure wirkt als interne Vergleichsmarkierung für jede untersuchte Ratte, Messungen des Verhältnisses der ^C/'^Se-Radioaktivität in einer 24 h-Gallenprobe zu der oral verabreichten ¹^C/⁷⁵Se-Radioaktivität ergibt einen Wert der Leistungsfähigkeit der Absorption der Selenogallensäure im Vergleich zur · C-Cholsäure. Im Idealfalle, wenn diese Absorptionen gleich wären, wäre das Verhältnis 1, da aber die Leistung der Selengallensäure abfällt, steigt das Verhältnis. In den untersuchten Verbindungen liegt das Verhältnis für i, ii und ν im Bereich von 3 bis 5» während es für iii 54 ist, was eine stark reduzierte Absorption anzeigt. Im Pail der Verbindungen i, ii und ν ist das Muster des Auftretens der ⁷⁵Se-Radioaktivität in der Galle ähnlich dem der ^C-Radioaktivität. Diese Ähnlichkeit, die bei der Verbindung iii nicht auftritt, zeigt sowohl für die Selenogallensäure als auch für die Cholsäure die gleiche Stelle der Absorption an«

D. Klinische Verwendung

Durch Ganzkörperzählung wurde gezeigt, daß bei normalen Menschen ohne zurückliegende Darm-Dysfunktion die Ausschei-

809828/0950

' 75

dungsgeschwindigkeit von Se-ii aus dem Körper beträchtlich geringer ist als für Ratten. I¹Ur Menschen jedoch, die eine Ileum-ReSektion hinter sich haben, ist diese Ausseheidungsgeschwindigkeit erhöht.

Diese ' Se-Selenogallensäurenkönnen deshalb verwendet werden, um Malabsorption von Gallensäuren in Verbindung mit Ileum-Dysfunktion zu untersuchen. Messungen der Absonderungsgeschwindigkeit können entweder durch Ganz-körperzählung oder durch Faeces-Zählung unter Verwendung eines γ -Szintillationszählers erfolgen.

Klinische Beispiele

Etwa 1 uCi der Verbindung ii wurde vier erwachsenen Freiwilligen oral als Getränk in Wasser verabreicht, von denen zwei Personen normal aktive erwachsene Männer im Alter von 35 bis 50 Jahren waren und zwei 10 Jahre zuvor eine Ileum-Totalresektion erlitten hatten. Alle waren auf normale Diät gesetzt. Se-ii wurden zwischen 10 und 12 Uhr Mittags verabreicht. Dann wurde die Körper-Radioaktivität in einem Ganz-

75 körperzähler unmittelbar nach der Verabreichung des Se-ii und später nach 48 Stunden und 7 Tagen gemessen.

Ergebnisse

75
Retention der '^Se-Radioaktivität

Zeit 0 48 h 7 Tage

Normal (1) 100 % 80 % 31

Normal (2) 100 % 100 % 27

Ileum-Resektion (3) 100 % 26 96 7,5

Ileum-Resektion (4) 100 % 80 % 9,5

(4) war eine alte, inaktive Patientin, die mit Arzneimitteln zur Verlangsamung des Darmtransports behandelt wurde.

Der Unterschied der zurückgehaltenen Radioaktivität zwischen Normalpatienten (1) und (2) und Patienten (3) und (4)

809828/095Q

mit Heum-ReSektion ist groß genug, um leicht erkennbar zu sein. Die Methode bietet die folgenden Vorteile gegenüber der Verwendung von mit ⁴O markierten Gallensäuresalzen:

a) Die Darmfunktion kann durch Körperzählung der y-Strahlung untersucht werden, ohne Faeces zählen zu müssen oder Proben zur Zählung der ß-Strahlung vorbereiten zu müssen.

b) Da nur kleine Mengen markierter Gallensäuresalze verwendet werden und diese rasch ausgeschieden werden, wird der Patient nur geringen Strahlungswerten ausgesetzt.

Die markierten Verbindungen könnten bequem in Form einer das markierte Gallensäuresalz auf einem Träger adsorbiert enthaltenden Kapsel verabreicht werden.

Die folgenden präparativen Beispiele veranschaulichen weiter die Erfindung:

Beispiel 1

75 Herstellung eines Gemische von 19-methyl- Se-seleno-markierten Gallensalzen

Ein männliches Kaninchen (NZW χ LOP; 4,8 kg) wurde mit Natriumpentobarbiton ("Sagatal")» intravenös injiziert, anäs-

809828/0950

- 2C-

thesiert. Nach. Tracheotomie wurde in eine Halsvene eine Kanüle mit einem 3-V/egehahn eingesetzt. Das Tier wurde durch intermittierende Druckte aufs chlagung "beatmet und die Anästhesie durch intravenöse Verabreichung von Pentobarbiton nach Bedarf aufrechterhalten. Dann wurde in die Bauchdecke ein Einschnitt auf der Mittellinie vorgenommen und die Leber zurückgebogen, um die Gallenblase, den Gallenblasengang und den Gallengang freizulegen. Nach Abbinden des^ Gallenblasengangs wurde der Gallengang zum Sammeln von Galle kanüliert.

Nach einer Stabilisierungsperiode wurde 1 ml einer Lösung von 19-Methyl-(⁷⁵Se)selenocholesterin (0,01 mg; 12mCi) in Polysorbat/Normalsalzlösung über die Halskanüle injiziert. Galle wurde in Form einer Serie von 15 min-Proben in vorgewogenen Röhrchen gesammelt. Nach dem Sammeln wurde jede

75
Probe gewogen und auf ' Se-Radioaktivität ausgezählt. Der Gallenfluß, anfangs bei 3,4 ml/15 min, fiel nach 6,5 Stunden auf 1,5 ml/15 min ab. In dieser Zeit wurden 56,65 g Galle aufgefangen, die etwa 100 μϋχ Se-Radioaktivität enthielten (etwa 1 % der injizierten Dosis).

Die markierte Galle wurde in 1 000 ml absolutes Äthanol gegeben, kräftig gerührt und momentan zum Sieden gebracht. Nach dem Abkühlen wurde die äthanolische Lösung filtriert und auf 10 ml Volumen eingeengt. In dieser Stufe wurde eine kleine Fällung wieder abfiltriert, und das Piltrat wurde*im Vakuum zur Trockne eingeengt. Das verbliebene grüne Harz wurde mit 40-60° Petroläther (4 x 5 ml) zum Entfernen von Lipidmaterial extrahiert und dann in Methanol (2 χ 5 ml)

75 gelöst und die Lösung filtriert. Ausbeute an '^Se-Gallensalzen 60 μθί. TLC: Kieselgel 60 F₂54» Chloroform, Methanol 5:1, Hauptkomponente (> 90 %) R_f 0,00 (inaktive Markierungen von Glykocholsäure, R^ 0,00; Glykocheno-desoxycholsäure, R^ 0,06; Cholsäure, R^ 0,14; Desoxycholsäure, R^ 0,70).

809828/0950

- at -

Die methanolische Lösung, die sowohl natürliche Gallensalze als auch Se-markierte Gallensalze enthielt, wurde auf ein kleineres Volumen gebracht und auf sechs PLC-Platten aufgebracht (Kieselgel 60 F₂54» ^2mm)· ^Die Platten wurden mit Chloroform, Methanol (5:1) eluiert, autoradiographiert, und die Komponente "bei Rj> 0,00 von den Platten entfernt und in Methanol extrahiert. Ausbeute: 26 uCi. Bei der Behandlung einer Probe dieses gereinigten 19-methyl-( Se)seleno-markierten Gallensalzes mit dem Enzym Cholylglycinhydrolase änderte'sich die chromatographische Mobilität auf Merck Kieselgel 60 F₂^/ (Chloroform/Methanol 5:1) von R_f 0,00 zu R_f 0,30 und 0,47.

Beispiel 2

Herstellung von 3 α,12a-Dihydroxy-22-(carboxymethyl-/' SeJ seleno)-23 , 24-bisnor-5ß-cholan

(23-Selena-25-homodesoxycholsäure)

i) 3α.12a-Diacetoxy-22-i od-23«24-bisnor-5ß-eholan

3a»12a-Diacetoxy-24-nor-5ß-eholansäure (0,3 g) in trockenem Tetrachlorkohlenstoff (30 ml) wurde mit trockenem, gepulvertem Bleitetraacetat (0,3 g) behandelt und in einer Atmosphäre trockenen Stickstoffs zum Rückfluß erhitzt. Die lösung wurde mit einer Atlas 275 Watt-IR-Lampe bestrahlt, und eine Lösung von Jod (0,16 g) in trockenem Tetrachlorkohlenstoff (12 ml) wurde über 10 min portionsweise zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bestrahlt und eine v/eitere Stunde gerührt und abkühlen gelassen. Die Lösung wurde filtriert, das Piltrat nacheinander mit 5 %iger ITatriumthiosulfatlösung und Wasser gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Verdampfen des Lösungsmittels und Kristallisieren des Rückstands aus Äthanol ergab 3a,12a-Diacetoxy-22-jod-23,24-bisnor-5ß-cholan (0,3 g, 85 %) Schmp. 172-174°.

TLC (Merck Kieselgel 60 P^,, Chloroform) Einzige Komponente R- 0,50

809828/0950

Vi

IR-Spektrum

ν max: 2960, 2930, 2870, 1735, H53, 1374, 1239, 1194, 1018 cm"¹.

MR (22OMHz. CDCl.-)

τ 4,95 (1H,S,C₁₂-Proton); τ 5,32 (1H,M,C₃-Proton);

τ 6,76 (2H,M,C₂₂-H), τ 7,86 (5H, S, ^-Acetat-Protonen), τ 7,98 (3H,S,3-Acetat-Protonen), τ 8,00 - 9,05 (22H, Steroidkern),

τ 9,10 (6H,S (mit geringer Aufspaltung), C₁₉-HH-C₂₁-H),

τ 9,23 (3H,S,C₁₈-H).

ii) 2;?-Selena-25-homodesoxycholsäure- 'Se

75
Rotes Se wurde durch. Einperlen von Schwefeldioxid in eine lösung von Natriumselenit (15,9 mg) in V/asser (2 ml) und konzentrierter Salzsäure (4 ml) mit Se-Natriumselenit (11,7 mCi, 1,2 mg Selen) ausgefällt. Me Fällung wurde abzentrifugiert, gründlich mit entionisiertem Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxid im Vakuum getrocknet.

Rotes "^Se (8,4 mg, 0,11 mA, 109 mCi/mA) wurde in Äthanol (2 ml) suspendiert, und Kaliumcyanid (7 mg, 0,11 mMol) wurde zugesetzt; das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2 h bis zur völligen lösung gerührt. Wiederholt destilliertes Äthylbronacetat (12 ul) wurden der Lösung bei O⁰C zugesetzt, und es wurde 1,5 h gerührt. 3a, 12a-Diacetoxy-22-jod-23,24-bisnor-5ß-cholan (60 mg) in trockenem Tetrahydrofuran (1 ml) wurde zu ITatriumborhydrid (9 mg) in Äthanol (1 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde in Eis gekühlt, und die äthanolische Lösung von Athyiselenocyanatoacetat-'^Se wurde über 10 min zugegeben. Eo wurde v/eitere 2 h gerührt, während die Temperatur auf Raumtemperatur stieg. Aceton (1 ml) wurde zugesetzt, und die Lösung wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Dem Rückstand wurde Chloroform (2 ml) zugesetzt, unlösliches Material wurde abfiltriert und die Lösung auf

809828/0950

- 2*3 -

eine kleine Menge aufkonzentriert. Das gewünschte Produkt wurde durch präparative Schichtchromatographie (Anachem Silicagel GF, 1 mm; Chloroform/Methanol 20:1) isoliert. Die Hauptkomponente, R~ 0,85, festgestellt durch Autoradiographie, wurde von der Platte entfernt und in Äthylacetat (3x4 ml) extrahiert. Ausbeute an Äthyl-3a,12a-diacetoxy-23-

selena-25-homo-5ß-cholanat- Se: 6,1 mCi.

IR-Spektrum

7 max: 2935, 2860, 1735, 1450, 1378, 1245, 1050, 750 cm"¹.

Die Lösung wurde abgedampft, und Natriumhydroxid (100 mg) in Äthanol (5 ml) und V/asser (1 ml) wurde zugesetzt. Die Lösung wurde 2 h gerührt und auf Rückfluß erhitzt; dann wurde abgekühlt und eingeengt. V/asser (3 ml) wurde zugesetzt, die Lösung wurde von etwas unlöslichem Material abfiltriert und durch Zugabe von Bio-Rad AG 50V/-X12-Kationenaustauscherharz in der H⁺-Porm angesäuert. Das Harz wurde ab filtriert, mit Methanol (3 ml) gewaschen, und das vereinigte Piltrat wurde eingedampft. Der Rückstand wurde in der Mindestmenge an Methanol gelöst, und das Produkt wurde durch präparative Schichtchromatographie (Anachem Silicagel GP, 1 mm; Chloroform/Methanol 6:1) isoliert. Der gewünschte Bereich, R^ 0,42, wurde autoradiographisch lokalisiert; er wurde von der Platte entfernt und durch Extraktion in Methanol isoliert. Verdampfen des Lösungsmittels lieferte 23-Selena-25-homodesoxychoisäure-'^Se (2,4 mCi).

TLC (Mer-ck Kieselgel 60 ?25-1^

a) Chloroform/Methanol 5:1; Hauptkomponente.(95 %) R_f 0,36

b) Isooctan/Diisopropyläther/Essigsäure 2:1:1; Hauptkomponente R_f 0,43

IR-Spektrum

Vmax: 3380, 2930, 2860, 1700, 1443, 1380, 1255, 1105, 1035 cm'¹.

809828/0950

- 34 -

iii) gauro-23~selcna-25-homodesoxycholsäure- Se 23-Selena~25-homodesoxyc]iolsäure- ^Se (0,2? mCi, 2,0 mg) wurde mit einer lösung von lJ-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-dihydrochinolin (3 mg) in trockenem Dimethylformamid (620 ul) behandelt und 30 min gerührt. Die lösung wurde zu einem Gemisch von Taurin {1,55 mg) in Dimethylformamid (350 ul) mit einem Gehalt an Triäthylamin (3,3 μΐ) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei ca. 90⁰C gehalten. Nach dem Stehen über Nacht bei Raumtemperatur wurde Wasser (1 ml) zugesetzt, die Lösung wurde durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure angesäuert und eingedampft. Äthanol (0,5 ml) wurde dem Rückstand zugesetzt, und das Produkt wurde durch präparative Schichtchromatographie (Anachem Silicagel GF, 1 mm; Chloroform/Methanol 5:2) isoliert. Der Produktbereich, R~ 0,32, wurde von der Platte entfernt, und das Produkt wurde durch Extraktion mit Methanol isoliert. Verdampfen des Lösungsmittels ergab Tauro-23-selena-25-homodesoxycholsäure-Se (0,14 mCi).

TLC (Merck Kieselgel 60 ?254* Chloroform/Methanol 3:1) Hauptkomponente (94 %) R_f 0,34 (vgl. 23-Selena-25-homodesoxycholsäure R^ 0,65 im gleichen System).

IR-SOektrum

"vmax: 3400, 2940, 2870, 1698, 1650, 1545, 1390, 1208, 1180, 1070 cm"¹.

iv) lthyl-3α,12a-Diacetoxy-23-selena-25-homo-5ß-cholanat und 23-Selena-25-homodesoxycholsäure

Nicht-radioaktives Äthyl-3α,12a-diacetoxy-23-selena-25-homo-5ß-cholanat und 23-Selena-25-homodesoxycholsäure wurden nach der unter 2(ii) beschriebenen Methode hergestellt. Mengen der eingesetzten Reagentien: Äthylselenocyanatoacetat 35 mg in 0,7 ml Äthanol; Natriumborhydrid 12,6 mg; 3α,12α-Diacetoxy-23-Jod-23,24-bisnor-5ß-cholan 100 mg; Äthanol 5 ml;

809828/0950

Tetrahydrofuran T ml. Ausbeute an Äthyl-3a,12a-diaeetoxy-23-selena-25-homo-5ß-cholanat 64 mg.

IR-Spektrum

ν max: 2940, 2865, 1738, 1450, 1380, 1245, 1105,-1060 cm"¹. UI-IR (220 KHz, CDCl,)

τ 4,93 (1H,S,C₁₂-PrOtOn), τ 5,32 (1H,M,C₃-PrOton), τ 5,84 (2H,<i,Äthyl-CH₂),' τ 6,90 (2H,S,C^-Protonen), τ 7,06 „(1H,M,C₂₂-PrOton), τ 7,45 (1H,q,C₂₂-Proton), τ 7,90 (3H,S,^-Acetat-Protonen), τ 7,96 (3H,S,3-Acetat-Protonen), τ 8,72 (3H,t,Ithyl-CH₃), τ 9,08 (3H,d,C₂₁-Protonen), τ 9,12 (3H,S,C_1g-Protonen), τ 9,25 (3H,S,C₁₈-Protonen), τ 8,0-9,25 (22H, Steroid-Kern).

Äthyl-3a,12a-diacetoxy-23-selena-25-homo-5ß-cholanat (120 mg) wurde in Äthanol (5 ml) gelöst und wie in 2(ii) 'beschrieben zu 23-Selena-25-homodesoxycholsäure (45 mg) hydrolysiert.

TLC (Merck Kieselgel 60 SV*; Chloroform/Methanol 5;1)

Das Produkt, durch Joddämpfe sichtbar gemacht, zeigte bei Chromatographie eine einzige Komponente (R^ 0,32) und fiel mit der radioaktiven Markierung zusammen.

IR-Spektrum

ν max: 3430, 2920, 2855, 1700, 1448, 1375, 1255, 1038 cm""¹.

NI-IR (220 MHz, CD

τ 5,12 (Lösungsmittel-Peak), τ 6,05 (1H,S,C₁₂-Proton), τ 6,50 (IHjmjC^-Proton), τ 6,7 (Lösungsmittel-Peak), τ 6,93 (2H,S,C₂.-Protonen), τ 7,07 (1H,m,C₂₂-PrOton), " τ 7,54 (1H,q,C₂₂-Proton), τ 7,85 (3H,S,CH₅CO₂H), τ 8,88 (3H,d,C₂₁-Protonen), τ 9,07 (3H,S,C₁₉-Protonen), τ 9,28 (3H,S,C₁₈-Protonen), τ 8,0-9,2 (22H,Steroid-Kern).

609828/0950

v) 23-Selena-25"-hoiaodesoxycholsäure-selenoxid" ^Se

or

23-Selena-25-iiomodesoxycholsäure-'^Se ( 68,4 μθΐ, 1,1 uMol) in Methanol (1,0 ml) wurde mit einer wässrigen Wasserstoffperoxidlösung (5 ul, 4 uMol) behandelt und 90 min "bei Raumtemperatur stehengelassen.

TIC (Merck Kieselgel 60 F₂54» Dichlormethan/Aceton/Essigsäure 7/2/1)

Hauptkomponente (> 90 %) R- 0,19 (vgl. 23-Selena-25-homodesoxycholsäure-^Se R~ 0,84 in diesem System).

Beispiel 3

Herstellung von 3a,7a-Dihydroxy-23-(ß-carboxyäthylseleno)-24-nor-5ß-cholan

i) 3a,7a-Dihydroxy-23-(ß-carboxyäthylseleno)-24-nor-5ßcholan-3»7-dinitrat-'^Se

Rotes ^/pSe (5,0 mg, 6,4 mCi) wurde wie in Beispiel 2 (ii) beschrieben hergestellt und in entionisiertem Wasser (0,55 ml) suspendiert. Kaliumcyanid (4 mg) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde gerührt, bis das gesamte Selen sich gelöst hatte. ß-Propiolacton (5 μΐ) wurde zugesetzt, und nach 15-minütigem Rühren wurde die Lösung durch Zutropfen konzentrierter Salzsäure angesäuert (etwas rotes Selen fiel aus) und eingeengt. Dem Rückstand wurde Äther (3 ml) zugesetzt, und die Lösung von ß-Selenocyanatopropionsäure-

Se wurde zum Entfernen unlöslicher Produkte filtriert

und eingeengt (5,4 mCi).

3a,7a-Dihydroxy-23-brom-24-nor-5ß-cholan-3,7-dinitrat (30,8 mg) wurde in Tetrahydrofuran (1,0 ml) gelöst und zu Natriumborhydrid (8,3 mg) in Äthanol (0,7 ml) gegeben. Die Lösung wurde in Eis gekühlt, und ß-Selenocyanatopropionsäure-⁵Se in Äthanol (1,0 ml) wurde in Anteilen über 10 min zugegeben. Nach einer weiteren Stunde wurde Aceton (1 ml) zugesetzt, die Lösung wurde mit konzen-

B09828/09BÖ

-niSalzsäure angesäuert und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in A'tner extrahiert, und die Lösung wurde von unlöslichem Material filtriert. TLC (Merck Kieselgel 60 2?p54» Chloroform/Methanol 10:1) zeigte drei radioaktive Hauptprodukte, R_£ 0,97, 0,85 und 0,09. Die Komponente mit R.O. 0,85 entsprach dem inaktiven Markierungsmaterial (Beispiel 3 (iii)).

Das Produkt wurde durch präparative Schichtchromatographie (Anachem Silicagel Gf, 1 mm; Chloroform/Methanol 10:1) isoliert. Es wurde autoradiographisch lokalisiert (R- 0,41)» von der Platte entfernt und in Äther (3 x 3 ml) extrahiert und ergab 1,1 mCi 3a,7a-Dihydroxy-23-(ß-carboxyäthylseleno) 24-nor-5ß-cholan-3,7-dinitrat.

TLC (Merck Kieselgel 60 F _{0c A} ', Chloroform/Methanol 10:1) i O4·¹

Hauptkomponente (95 %) Rf 0,54 entspricht nicht-radioaktivem Standard.

ii) 3a,7a-Dihydroxy-23-(ß-carboxyäthylseleno)-24-nor-5ß-75

cholan-¹ Se

Das Dinitrat (1,1 mCi - hergestellt wie oben beschrieben 3 (i)) wurde in Eisessig (1 ml) gelöst, und Zinkstaub (60 mg) wurde in Portionen zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 1 h gerührt und über Nacht bei -20⁰C aufbewahrt. Nach dem Erwärmen auf Raumtemperatur wurde die Lösung filtriert und das Filtrat lyophilisiert. Das Produkt wurde durch präparative Schichtchromatographie (Anachem Silicagel GP, 1 mm; Chloroform/Methanol 7:1) isoliert. Es wurde autoradiographisch lokalisiert (R_f 0,30), von der Platte entfernt und in Methanol extrahiert und ergab 3a,7a-Dihydroxy-23-(ß-carboxyäthylseleno)-24-nor-5ß-cholan (0,6 mCi).

TLC (Merck Kieselgel 60

a) Chloroform/Methanol 5:1; Hauptkomponente (97 %) R_f 0,65

b) Chloroform/Methanol 10:1; Hauptkomponente R^ 0,22

809828/0950

-2A-

c) Isooctan/Diisopropylather/Essigsäure 2:1:1; Hauptkomponente R^. 0,4-1

In jedem Pall fiel das Produkt mit dem nieht-radioaktiven Standard zusammen.

iii) 3a,7a-Dihydroxy-23-(ß-carboxyäthylseleno)-24-nor-5ßcholan-3,7-dinitrat

Nicht-radioaktives 3a,7d-Dihydroxy-23-(ß--carboxyäthylseleno)-24-nor-5ß-cholan wurde nach der unter 3 (i) beschriebenen Methode unter Verwendung folgender Mengen an Reagentien hergestellt: 3a,7a-Dihydroxy-23-brom-24-nor-5ß-cholan-3,7-dinitrat (173,1 mg) in Tetrahydrofuran (4 ml); Natriumborhydrid (45»8 mg) in Äthanol (2,2 ml) und ß-Selenocyanatopropionsäure (61,4 mg) in Äthanol (2,2 ml). Das Reaktionsgemisch wurde mit Aceton (1 ml) behandelt, in Wasser (25 ml) gegossen, mit konzentrierter Salzsäure angesäuert und mit Äther (2 χ 20 ml) extrahiert. Die vereinigten Ätherextrakte wurden mit 5 /jiger Natriumcarbonatlösung (2 χ 20 ml) gewaschen, und die vereinigten alkalischen Extrakte wurden angesäuert. Die Fällung wurde durch Äther isoliert, die Extrakte wurden getrocknet und eingeengt. Das Produkt wurde durch präparative SchichtChromatographie (Merck Kieselgel F254» ^{2 111111}I Chloroform/Methanol 10:1) gereinigt. Der gewünschte Bereich wurde unter u.v. lokalisiert, von der Platte entfernt und in Äther extrahiert. Abdampfen der lösungsmittel hinterließ 3a,7a-Dihydroxy-23-(ß-carboxyäthylseleno)-24-nor-5ß-cholan-3,7-dinitrat als weißen Feststoff (82 mg).

IR-Sbektrum

Vmax: 3450, 2940, 1710, 1620, 1278, 862 cm"¹

NMR (220 MHz. CDCl^)

τ 4,95 (1H,S, C_?-Proton), τ 5,22 (1H,m, C^-Proton), τ 7,23 (4K,S, C₂J₅- und C₂g-Protonen), τ 7,6 (2H,m, (^-Protonen), τ 9,05 (6H,s + d, ^-Protonen und C₂.j-Protonen), τ 9,32

809828/0950

(3H,S,C₁₈-PrOtonen), τ 7,85-9,10 (24H, Steroid-Kern).

iv) 3a,7a-Dihydroxy-23-(ß-carboxyäthylseleno)-24-nor-

— 5ß-cholan

3α,7a-Dihydroxy-23-(ß-carboxyäthylseleno)-24-nor-5ß-cholan (50 mg) wurde aus seinem Dinitratester (80 mg) nach der unter 3 (ii) beschriebenen Methode hergestellt.

IR-Soektrum

Vmax: 3435, 2940, 2870, 1715, 1550, 1410, 1300, 1080, 960 cm"¹

KMR (220 MHz, CI

τ 5,16 (lösungsmittel-Peak), τ 6,20 (1H,S, C₇-PrOtOn), τ 6,94 (1H,m, C,-Proton), τ 6,99 (Lösungsmittel-Peak), τ 7,25 (4H,S, C₂₅-UrId C₂₆-Protonen), τ 7,45 (2H,m, C₂₅-Protonen), τ 9,02 (3H,d, C₂₁-Protonen), τ 9,07 (3H,S, C^- Protonen), τ 9,29 (3H,S, C₁₈-Protonen).

Beispiel 4

Herstellung von 3α,7a,12a-Trihydroxy-23-(ß-carboxyäthylseleno)-24-nor-5ß-cholan

i) Cholinsäure-triforiniat

Cholinsäure (50 g) wurde mit 100 % Ameisensäure (240 ml) behandelt, und das Ganze wurde 6 h bei 70-80⁰C gerührt. Die Lösung wurde gekühlt, und der größte Teil des Lösungsmittels wurde abgedampft. Der Rückstand wurde mit Äther (500 ml) verrieben und ergab einen weißen Peststoff, der filtriert und getrocknet wurde (43 g). Das Rohprodukt konnte durch mehrfaches Umkristallisieren aus 60 %igem wässrigem Äthanol und 1:1 Petroläther (60-80°)/Aceton weiter gereinigt werden. Schmp. des gereinigten Materials 204-208°C.

ii) 3α«7α, 12a-Triformoxy-23-.iod-24-nor-5ß-cholan Cholinsäure-triformiat (1,06 g) und Bleitetraacetat (0,97 g)

809828/0950

wurden in trockenem Tetrachlorkohlenstoff (100 ml) suspendiert, und die Suspension wurde gerührt und in einer trockenen Stickstoffatmosphäre auf Rückfluß erhitzt. Durch Bestrahlen mit einer Atlas 275 Watt-IR-Lampe wurde auf Rückfluß gehalten, und eine Lösung von Jod (0,52 g) in Tetrachlorkohlenstoff (40 ml) wurde in Portionen zugesetzt. Eine weitere Stunde wurde rückflußgekocht. Das Reaktionsgemisch konnte sich abkühlen und wurde dann filtriert.

Das Pil trat wurde nacheinander mit 5 /iiger Natriumthiosulfatlösung und Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Verdampfen des Lösungsmittels und Umkristallisieren des Rückstands aus Äthanol (zweimal) ergab 3a, 7a,12a-Triformoxy-23-Dod-24-nor-5ß-cholan (0,65 g) in Form farbloser Kristalle, Schmp. 166-168°.

IR-Suektrum

7 max: 2960, 2938, 2862, 2712, 1721, 1518, 1360, 1160, 1060,

995, 6 ¹
MMR .(220 MHz.

995, 600 cm"¹

τ 1,85, 1,90, 1,98 (3H, 3 Singuletts, 3-,7-und 12-Formiat-Protonen),T 4,74 (1H,S, C₁₂-ErOton), τ 4,94 (1H,S, C₇-PrO-tonen), τ 5,30 (iH,m, C^-Proton), τ 6,72 + 6,95 (2H,m, C₂₃-Protonen), τ 9,06 (3H,S, C₁g-Protonen), τ 9,15 (3H,d, C₂₁-Protonen), τ 9,22 (3H,S, C₁₃-Prοtonen), τ 7,8 - 9,05(22H, Steroid-Kern)·

iii) 3α,7α,12a-Trihydroxy-23-(ß-carboxyäthylseleno)-24-nor-5ß-cholan-⁷⁵Se

ß-Selenocyanatopropionsäure- ³Se (4,42 mCi, 108 mCi/mMol) wurde aus rotem '³Se, wie in Beispiel 3 (i) beschrieben, hergestellt. 3α,7a,12a-Triformoxy-23-jod-24-nor-5ß-cholan (23 mg) in Tetrahydrofuran (0,5 ml) wurde zu Natriumborhydrid (5,5 mg) in Äthanol (0,5 ml) gegeben, und die Lösung wurde in Eis gekühlt. ß-Selenocyanatropropionsäure-' Se

809828/0950

(4,42 mCi) in Äthanol (0,8 ml) wurde der Lösung über 10 min zugesetzt, und es wurde 1 h weiter gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Aceton (1 ml) behandelt, mit konzentrierter Salzsäure angesäuert und eingeengt. Der Rückstand wurde zwischen Äther und Wasser verteilt, und die Ätherphase wurde abgetrennt und mit 5 5aiger wässriger Natriumcarbonatlösung extrahiert. Der alkalische Extrakt wurde angesäuert, und die Fällung wurde durch Ätherextraktion isoliert.

Äthanol (2 ml), Wasser (0,75 ml) und Kaliumhydroxid (100 mg) wurden der rohen Probe des 3a,7a,12a-Triformoxy-23-(ß~carboxyäthylseleno)-24-nor-5ß-cholans zugesetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 2 h gerührt, dann angesäuert und eingeengt. Methanol (2 ml) wurde dem Rückstand zugesetzt, die Lösung wurde von unlöslichem Material filtriert und auf eine kleine Menge aufkonzentriert. Das Produkt wurde durch präparative Schichtchromatographie (Merck Kieselgel 60 ^54 1 mm; Chloroform/Methanol 5:1) gereinigt. Der gewünschte Bereich wurde autoradiographisch lokalisiert (R₁P 0,35), von der Platte entfernt und in Methanol extrahiert, um 3a,7a,12a-Trihydroxy-23-(ß~carboxyäthylseleno)-24-nor-5ß-cholan-'^pSe (1,2 mCi) zu ergeben,

TLG (Merck Kieselp;el

a) Chloroform/Methanol 5:1 - Hauptkomponente (95 %) R_f 0,57, entsprach nicht-radioaktivem Standard

b) Isooctan/Diisopropyläther/Essigsäure 2:1:1; R„ 0,21

IR-Snektrum

ν max: 3520, 3416, 2930, 2870, 1740, 1718, 1440, 1380, 1322, 1170, 1080 cm"¹

809828/0950

iv) 3α,7α,12a-Trihydroxy-23-<ß-carboxyäthylseleno) -24-nor-5ß-cholan

Nicht-radioaktives 3α,7α, 12a-Trihydroxy-23-(ß-carboxyäthylseleno)-24-HOr-SB-ChOIaH wurde nach der unter 4 (iii) "beschriebenen Methode hergestellt, Die folgenden Mengen an Reagentien wurden verwendet: 3a,7a,12a-Triformoxy-23-;jod-24-nor-5ß-cholan 258,7 mg; Natriumborhydrid 61,2 mgj ß-Selenocyanatopropionsäure 79,6 mg. Nach der letzten Hydrolysestufe wurde das Produkt durch Verteilung zwischen Äther und 5 &Lger Natriumcarbonatlösung gereinigt. Das saure Produkt wurde isoliert und mit Aceton verrieben, um 3a,7a,12a-!Drihydroxy-23-(ß-carboxyäthylseleno)-24-nor-5ß-cholan (70 mg) als weißes Pulver, Schmp. 198-200°, zu ergeben.

IR-Spektrum

v"max: 3520, 3410, 2930, 2870, 1740, 1718, 1440, 1382, 1323, 1170, 1080 cm"¹

NMR (220 MHz. CD^OD)

τ 5,11 (Lösungsinittel-Peak), τ 6,06 (1H,S, C₁ g

τ 6,23 (1H,S, C₇-Proton), τ 6,67 (1H,m, C,-Proton),

τ 6,71 (iösungsmittel-Peak), τ 7,30 (4H,S, C₂₅ + C₂₆

tonen), τ 7,47 und τ 7,78 (2H,m, C₂,-Protonen), τ 8,97

(3H,d, C₂.j-Protonen), τ 9,10 (3H,S, C_ig-Protonen), τ 9,30

(3H,S, C₁₈-PrOtonen), τ 9,70 (nicht identifiziert).

Beispiel 5

Herstellung von 3a,7a,12a-Trihydroxy-20-(carboxy-methylseleno)-5 ß-pregnan- (22-solenachi.säure)

i) 3at7a,12a-Triformox?/--A²²-24-nor-5ß-cholen

Kupfer(II)acetat-Dihydrat (1,0 g) und Pyridin (0,7 ml) wurden zu Benzol (170 ml) zugegeben, und die Suspension wurde durch azeotrope Destillation unter Verwendung einer Dean and Stark-Apparatur getrocknet. Nach geringfügigem Abkühlen wur-

809828/0950

-3S-

den trockenes Bleitetraäcetat (20 g) und Cholsäuretriformiat (10,5 g, hergestellt wie unter 4 (i) beschrieben) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde gerührt und in einer trockenen Stickstoffatmosphäre 1,5 h auf Rückfluß erhitzt. Dann wurde abkühlen gelassen und filtriert. Das FiI-trat wurde nacheinander mit Wasser, 1 m Natriumhydroxidlösung und schließlich mit V/asser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Verdampfen des Lösungsmittels und Kristallisieren des Rückstands aus Äthanol er-

gab 3a,7a,12a-Triformoxy-A -24-nor-5ß-cholen (4,0 g),
Schmp. 188-190°.

IR-Spektrum

7 max: 3077, 2960, 2865, 1725, 1714, 1637, 1468, 1449,
1380, 1180 cm"¹

NMR-Spektrum

τ 1,83, 1,91, 1,98 (3H, drei Singuletts, 3-, 7- und 12-Formiat-Protonen), τ 4,4 (1H,m, C₂₂-Proton), τ 4,77
(1H,S, C₁₂-Proton)_f τ 4,97 (1H,S, Ογ-Proton), τ 5,16
(1K,d, C₂₅-PrOtOn (eis)), τ 5,18 (1H,S, C₂₅-PrOtOn (trans)), τ 5,30 (1H,m, C^-Proton), τ 9,07 (6H,s + d, C₁ η-Protonen + C₂^Protonen), τ 9,24 (3H,S, C₁₈-PrOtonen), τ 7,75 - τ 9,1 (22H, Steroid-Kern).

ix) 3« 3Ία »12flf-Triformoyf-23,24-bisnor-5ß-cholansäure

on

5*,7«,12«-Trifornoxy-A -24-nor-5ß-cholen (2,4 g) wurde in 2-Methylpropan-2-ol (800 ml) gelöst, und Kaliumcarbonat
(1,41 g) in Wasser (800 ml) wurde zugesetzt. Natriumperjodat (20,86 g) und Kaliumpermanganat (0,395 g) wurden in V/asser (11) gelöst, und der lösung des Olefins wurde eine Teilmenge ( 455 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Zur Beseitigung der Permanganat-Pärbung wurde ausreichend 40 &Lge Natriumhydrogensulfitlösung zugesetzt, dann 5 %ige Natriumcarbonatlösung zum pH 8, und die

809828/0950

Lösung wurde unter vermindertem Druck auf ca. 250 ml aufkonzentriert. Sie wurde mit Chloroform (2 χ 100 ml) extrahiert, mit weiterem 40 ?Sigen Natriumhydrogensulfit behandelt und mit konzentrierter Salzsäure angesäuert. Das Gemisch wurde mit Chloroform (4 x 100 ml) extrahiert, und die kombinierten Extrakte wurden nacheinander mit 5 ?&Lger Natriumthiosulfatlösung und V/asser gewaschen und dann getrocknet. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und 100 %ige Ameisensäure (30 ml) wurde dem Rückstand zugesetzt. Die Lösung wurde gerührt und 6 h auf 70-80° erwärmt und dann 'abkühlen gelassen. Sie wurde in Wasser gegossen, und der Niederschlag wurde in Chloroform (3 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde aus Äthanol unikristallisiert und ergab 3#,7<*,12«-Triformoxy-23,24-bisnor-5ß-cholansäure (0,8 g), Schmp. 165-170°.

IR-Spektrum

"vmax: 3410, 2965, 2940, 2870, 1722, 1450, 1385, 1178, 890 cm"¹

NMR-Spektrum (220 MHz. CDCl.?)

τ 1,83, 1,91 und 1,98 (3H, 3 Singuletts, 3-, 7- und 12-Formiat-Protonen), τ 4,78 (1H, 3,C₁₂-PiOtOn), τ 4,93 (1H,S,C₇-Proton), τ 5,30 (1II,m,C₃-Proton), τ 6,29 (2H,q,CH₂ des Äthanols vom Kristallisieren), τ 7,64 (1H,q,Cp₀~Proton), τ 8,77 (3H,t,CH, des Äthanols vom Kristallisieren), τ 8,88 (3H,d,C₂₁-Protonen), τ 9,05 (3,S,.CjQ-Protonen), τ 9,22 (3H,S,C₁₈-PrOtonen), τ 7,75 - 9,05 (19H, Steroid-Kern).

iii) 3<r,7««12«f-Triformoxy-20-.iodpregnan

3<x,7Ä,12c(-Triformoxy-23,24-bisnor-5ß-cholansäure (0,2 g) wurde in 3tf,7«»12«-Triformoxy-2O-3odpregnan (0,11 g) nach der unter 2 (i) beschriebenen Methode umgewandelt, Schmp· 145-146,5° (Zers.).

809828/0950

28Q078Q

IR-Spektrum

ν max: 3405, 2950, 2860, 1713, 1445, 1377, 1180 cm"¹

MR-Spektrum (220 MHz, CDCl₃)

τ 1,81, 1,91 und 1,98 (3Η, 3 Singuletts, 3-, 7- und 12-Formiat-Protonen), τ 4,75 (1H,S,C₁₂-PrOton), τ 4,93 (1H,S,C_?-Proton), τ 5,30 (iH,m,C₃-Proton), τ 5,80 (1H,q,C₂₀-Proton), τ 8,06 (3H,d,C₂;,-Protonen), τ 9,07 (3HjSjC_{1 g}-Protonen), τ 9,25 (3H,S,C₁₈-PrOtonen), τ 7,5 - 9,0 (19H, Steroid-Kern).

iv) 22-Selenacholsäure-^^Se

Rotes Se (8,2 mg, 106 mCi/mA) wurde hergestellt, wie unter 2 (ii) "beschrieben. Es wurde in Äthanol (2 ml) suspendiert, und trockner Stickstoff wurde durch die Lösung geperlt. Die austretenden Gase wurden durch eine Falle geführt, die 5 ?oige Bleiacetatlösung enthielt. Natriumborhydrid (2,7 mg) wurde zugegeben, und die Suspension wurde 20 min bei Raumtemperatur gerührt. n-Propanol (5 ml) wurde zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde auf einem siedenden Wasserbad 20 min erwärmt. 3ff,7<x,12<*-Triformoxy-20-3odpregnan (35 mg) in warmem n-Propanol (2 ml) wurde der Lösung

75
des Dinatriumdiselenid-'^Se zugesetzt, und das Ganze wurde auf einem siedenden V/asserbad in einer trockenen Stickstoffatmosphäre 3,5 h erwärnt. Nach dem Abkühlen wurde unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand mit Chloroform (5 ml) behandelt. Die Lösung wurde filtriert und zur Trockne eingeengt, wobei das unreine Dipregnandiselenid-^/pSe (4,2 iaCi) zurückblieb.

ITatriumborhydrid (5 mg) wurde in Äthanol (1 ml) gelöst, die Lösung wurde in Eis gekühlt und Äthylbromacetat (20 μΐ) zugesetzt. Das Dipregnandiselenid-'^pSe wurde in Äthanol- (3 ml) gelöst und über 10 min zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h gerührt, Aceton (1 ml) wurde zugesetzt, und die Lösung

809828/0950

Vi

- 3-6 -

wurde eingeengt. Chloroform (3 ml) wurde zugegeben, anorganische Salze wurden abfiltriert, und die Lösung wurde mit Natriumhydroxid (100 mg) in Wasser (1 ml) behandelt. Die Lösung wurde 3 h unter Rückfluß erwärmt, abgekühlt und eingeengt. Der Rückstand wurde in Wasser (2 ml) gelöst, und die Lösung wurde mit konzentrierter Salzsäure angesäuert und lyophilisiert. Essigsäure (3 ml) wurde dem Rückstand zugesetzt, die-Lösung wurde filtriert und auf eine kleine Menge aufkonzentriert. Das Produkt wurde durch präparative Schichtchromatographie (Anachem Silicagel G¥_f 1 mm; Dichlormethan/Aceton/ Essigsäure 7:2:1) gereinigt. Seine Lage wurde autoradiographisch bestimmt, der Bereich wurde von der Platte entfernt und das Produkt in Essigsäure extrahiert und das Lösungsmittel verdampft, um 22-Selenacholsäure-'-'se (0,8 mCi) zu ergeben.

TIiG (Merck Kieselgel 60 Fog J

a) Dichlormethan/Aceton/Essigsäure (7:2:1) Hauptkomponente R^ 0,22

b) Chloroform/Methanol (5:1)
Hauptkomponente R~ 0,11

IR-Spektrum

7max: 3400, 2925, 2780, 1715, 1440, 1375, 1265, 1073, 1040 cm"¹

v) Glyko-22-selenacholsäure-'^?Se

22-Selenacholsäure-'^Se (0,40 mCi; 1,9 mg) in Essigsäure wurde zur Trockne eingeengt. Trockenes Äthylacetat (450 ul) wurde zugesetzt, dann N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxydihydrochinolin (14,2 mg). Äthylglycinat-HydroChlorid (8,0 mg), in trockenem Äthylacetat (0,6 ml) suspendiert, wurde mit Triäthylamin (8,3 μΐ) behandelt; das Gemisch wurde 30 min gerührt und zu einer Lösung von 22-Selenacholsäure-''^r5se gegeben, eine weitere Menge Äthylacetat (0,4 ml) wurde zur vollständigen

809828/0950

Yl

Überführung verwendet. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluß auf einem siedenden Yfasserbad 6 h erwärmt;, dann wurde es gekühlt und eingeengt. Chloroform (4 ml) wurde dem Rückstand zugesetzt, und unlösliches Material wurde abfiltriert.

Äthyl-22-selenaglykocholat-^Se wurde durch präparative Schichtchromatographie (Anachem Silicagel Gf, 1 mm; Chloroform/Methanol 8:1) gereinigt. Der radioaktive Hauptbereich wurde autoradiographisch lokalisiert, R^ 0,4; er wurde von der Platte entfernt und in Methanol (3x4 ml) extrahiert. Das Lösungsmittel wurde verdampft, Äthanol (4 ml) und 10 ?oige Kaliucicarbonatlösung (1 ml) wurden zugesetzt, und die Lösung wurde 1 h auf Rückfluß erhitzt und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wurde mit konzentrierter Salzsäure angesäuert, zur Trockne eingeengt, und das Produkt wurde aus dem Rückstand durch. Lösen in Äthanol extrahiert. Die Lösung wurde filtriert und eingeengt und hinterließ &lyko-22-selenacholsäure-^lvSe (0,21 mCi).

TLG (Merck Kieselgel 60 Fq54 ^; Ck^oro^oPM/Methanol 3;1)

Hauptkomponente (ca. 85 %) R_£ 0,04 (vgl. 22-Selenacholsäure, R_f 0,31 xind Grlykocholsäure, R_f 0,02 in diesem System).

Beispiel 6

Herstellung von 3«-Hydroxy-24-(carboxymethylseleno)~5ßcholan

i) 3<*-Acetoxy-25-homo-5ß-cholansäure

3<<-Acetoxy-25-homo-5ß-cholansäure wurde aus Lithocholsäure unter Anwendung der Arndt-Eistert-Reaktion, zur Verlängerung der C₁„-Seitenkette hergestellt.

809828/095G

ii) 3rf-Aeetoxy-24-;Jod-5ß-eholan

3cc-Acetoxy-25-homo-5ß-cholansäure wurde in 3*-Aeetoxy-24-jod-5ß~cholan nach, der unter 4 (ii) angegebenen Methode überführt. Die Mengen der verwendeten Reagentien waren wie folgt: 3tf-Acetoxy-25-homo-5ß-cholansäure (1,8 g) in trockenem Tetrachlorkohlenstoff (120 ml), Bleitetraacetat (2,0 g) und Jod (1,04 g) in Tetrachlorkohlenstoff (80 ml). Das Rohprodukt wurde durch präparative Schichtchromafographie unter Verwendung von 5 Merck Kieselgel 60 Fpp-^-Platten ^⁰¹¹ 2 mm, entwickelt in Chloroform, gereinigt. Der gewünschte, UV-absorbierende Bandbereich wurde von 3eder Platte entfernt und das Produkt durch Extraktion mit Ither isoliert. Abdampfen des Lösungsmittels und Verreiben des Rückstands mit Äthanol ergab 3of-Acetoxy-24-3od-5ß-cholan (0,43 g, Schmp. 140-146°) als weißes Pulver.

IR-S-pektrum

7max: 2940, 2865, 1738, 1473, 1459, 1383, 1366, 1258, 1028 cm"¹

HMR-Spektrum (220 MHz, CDCl^)

τ 5,19 (1H,m,C~-Proton), τ 6,83 (2H,m,C₂^-Protonen), τ 7,98 (3H,S,Acetat-Protonen), τ 9,07 (6H,1s + 1d, C₁₉ + C₂₁-Protonen), τ 9,36 (3H,S,C₁₈-Prοtonen), τ 8,0 - 9,1 (28H, Steroid-Kern).

iii) 3<ü-Hydroxy-24-(carboxyraethylseleno)-Sß-cholan-' ^Se Äthylselenocyanatoacetat-'^Se (17 mg, 9,2 mCi) wurde in der zuvor (2 (ü)) beschriebenen Weise hergestellt. Es wurde mit Natriumborhydrid (8,2 mg) in Äthanol (2 ml) und 3*-Acetoxy-24-;j°d— 5ß-cholan (50 mg) in Tetrahydrofuran (3 ml), wie in 2 (ii) beschrieben, umgesetzt. Die Zwischenstufe, 3Ä-Acetoxy-24-(carboxymethylseleno)-*5ß-

75
cholanäthylester-¹ Se wurde durch, präparative Schicht-

809828/0950

280078Q

Chromatographie (Anachem Silicagel GF, Chloroform) isoliert. Der radioaktive Hauptbandbereich wurde autoradiographisch lokalisiert (R_f 0,55); er wurde von der Platte entfernt, und das Produkt wurde durch Extraktion mit Äthylacetat (3x4 ml) isoliert. Das Lösungsmittel wurde abgedampft, Äthanol (5 ml) und Kaliumhydroxid (100 mg) in Wasser (1 ml) wurden zugesetzt, und die Lösung wurde unter Rückfluß 3 h erhitzt und abkühlen gelassen. Die Lösung wurde mit konzentrierter Salzsäure angesäuert und unter vermindertem Druck eingeengt. Äthanol (1 ml) wurde dem Rückstand zugesetzt, die Lösung wurde filtriert und das Produkt durch präparative Schichtchromatographie (Anachem Silicagel GP, Chloroform/Methanol 12:1) isoliert. Der gewünschte Bandbereich (R^ 0,20) wurde autoradiographisch lokalisiert, von der Platte entfernt, und das Produkt wurde durch Extraktion mit Äthanol isoliert. Verdampfen des Lösungsmittels ergab 3«-Hydroxy-24-(carboxymethylseleno)-5ß-cholan-Se (0,8 mCi).

TI₁C (Merck Kieselgel 60 ?n<=A ^m* Pick^orrce^k^Afe^kanol 15:1)

Hauptkomponente (94 %) R^ 0,25, fiel mit dem nicht-radioaktiven Standard zusammen.

IR-SOektrum

Vmax: 3400, 2930, 2855, 1700, 1445, 1373, 1105, 1028 cm"¹

iv) 3«-Acetoxy-24-(carboxymethylseleno)-5ß-cholan-äthyl-

ester

Nicht-radioaktiver 3<*-Acetoxy-24-( carboxymethylseleno)-5ßcholan-äthylester (160 mg) wurde nach der unter 6 (iii) angegebenen Methode aus 3*-Acetoxy-24-;jod-5ß-cholan (200 mg), Natriumborhydrid (32 mg) und Äthylselenocyanatoacetat (74,7 mg) hergestellt.

IR-Spektrum

: 2925, 2855, 1733, 1445, 1375, 1360, 1238, 1100, 1023 cm"¹

809828/09 5 0

NMR-Spektrum (220 MHz. GDCl,)

' τ 5,29 (iH,m,C₅-Proton), τ 5,83 (2H,q,Äthyl-CH₂), τ 6,86 (2H,S,C₂₆-Protonen), τ 7,98 (3H,S,Acetat-Protonen), τ 8,72 (3H,q,Äthyl-CH₅), τ 9,0 (6H,1s + 1d, C_ig-Protonen + C₂.j-Protonen), τ 9,36 (3H,S, C₁₈-PrOtonen).

ν) 3tf-Hydro>ry--24-(carboxymethylselen.o)-5ß-cholan ·

Hydrolyse von 3tf-Acetoxy-24-(carboxymethylseleno)-5ßcholan-äthylester nach der Methode 6 (iii) ergab 3rt~Hydroxy-24-(carboxymethylseleno)-5ß-cholan, Schmp. 117 121⁰C.

IR-Spektrtun

Vmax: 3440, 2920, 2855, 1705, 1443, 1372, 1270, 1165, 1105, 1026 cm"¹

Beispiel 7

Herstellung von 23-(Carboxymethylseleno)-24-nor-5ßcholan-3.7,12-trion-'^Se

i) 23-Jod-24-nor-5ß-cholan-3,7«12-trion

5ß-Cholansäure-5,7,12-trion wurde in 23-Jod-24-nor-5ßcholan-3,7,12-trion nach der unter 4 (ü) beschriebenen Methode überführt. Die Mengen der verwendeten Reagentien waren wie folgt: 5ß-Cholansäure-3,7,12-trion (2 g) in Tetrachlorkohlenstoff (200 ml), Bleitetraacetat (2,3 g), Jod (1,2 g) in Tetrachlorkohlenstoff (100 ml). Das Produkt wurde nacheinander aus Äthanol und Petroläther (60-80°)-Äthylacetat umkristallisiert, Schmp. 256-25-7°C.

TLC (Merck Kieselgel 60

Hauptkomponente R_£ 0,36 (vgl. 5ß-Cholansäure-3,7,12-trion, R_f 0,08 in diesem System).

IR-Spektrum

Vmax: 2960, 2930, 1727, 1708, 1472, 1438, 1392, 1382,

809828/0950

1304, 1280, 1226 cm"¹
ii) 23-(Carboxymethylseleno)~24-nor-5ß-cholan-3,7,12-

trion-⁷⁵Se

Eine äthanolische lösung von Äthyl-selenocyanatoacetat- ^Se (15,3 mg, 8,8 mCi) vnirde nach der -unter 2 (ii) beschriebenen Methode hergestellt; sie wurde zu einer lösung von Natriumborhydrid (6,6 mg) in Äthanol (1 ml) bei 0° gegeben. Nach 20-minütigem Rühren bei 0° vnirde Aceton (1 ml) zugesetzt, dann 23-Jod-24-nor-5ß-cholan-3,7,12-trion (39 mg) in Tetrahydrofuran (1 ml). Das Reaktionsgemisch vnirde bei Raumtemperatur 16 h gerührt. Die lösung vnirde eingeengt, Chloroform (2 ml) vnirde zugesetzt, und nach dem Filtrieren vnirde die lösung auf konzentriert und auf eine Siliciumdioxid-Platte (Anaehem, 1mm) gebracht, die in Chloroform/Methanol 20:1 entwickelt wurde. Drei radioaktive Hauptbandbereiche wurden autoradiographisch lokalisiert (R_f-V/erte 0,33, 0,49 und 0,69); sie wurden getrennt von der Platte entfernt, und die radioaktive Komponente wurde jeweils durch Extraktion mit Äther/Äthanol (10:1) isoliert. Eine Untersuchung der getrennten Komponenten' durch Dünnschichtchromatographie (Merck Kieselgel .Chloroform) und durch IR-Spektroskopie zeigte, daß die Komponente mit R₄, 0,49 der gewünschte 23-(Carboxymethylseleno)-

75

24-nor-5ß-cholan-3,7>12-trion-äthylester- Se war, die Komponente mit R^ 0,33 war ein Gemisch von zwei nicht identifizierten Verbindungen und die Komponente mit R_f 0,69 war kein Steroid.

23-(Carboxymethylseleno)-24-nor-5ß-cholan-3,7,12-trionäthylester- ^Se (2,05 mCi) wurde in Äthanol (5 ml) gelöst, und 10 %lge Kaliumcarbonatlösung (1 ml) vnirde zugesetzt. Die lösung vnirde 2 h auf Rückfluß erwärmt, gekühlt und tinter vermindertem Druck abgedampft. V/asser (4 ml) vnirde zugesetzt, etwas unlösliches Material wurde abfiltriert, und die lösung wurde mit konzentrierter Salzsäure angesäuert

809828/0950

■und lyophilisiert. Chloroform (0,5 ml) wurde dem Rückstand zugesetzt, und das Produkt wurde durch präparative Schichtchromatographie (Anachem Silicagel GP, 1 mm, Chloroform/Methanol 10:1) isoliert. Der radioaktive Hauptbandbereich wurde autoradiographisch lokalisiert (R- 0,32), von der Platte entfernt, und das Produkt wurde durch Extraktion mit Methanol isoliert. Verdampfen des Lösungsmittels ergab 23-(Caxboxymethylseleno)-24-nor-5ß-cholan-3,7, 12-trion ⁷⁵Se (1,5 mCi).
TLC (Merck Kieselgel 60 ^ ₂5V Chloroform/Methanol 20;1) Hauptkomponente > 95 %, B._£ 0,31

IR-Spektrum

7 max: 2965, 2895, 1717, 1475, 1428, 1395, 1275, 1118 cm"¹

Beispiel 8

Herstellung von 3«,12et~Mhydroxy-23-(carboxymethylseleno)-24-nor-5ß-cholan

i) 3a(«12<x-Diformoxy-23-nod-24-nor-5ß-cholan

3«,12Ä-Diformoxy-5ß-cholansäure wurde aus Desoxycholsäure (25 g) und 100 % Ameisensäure (100 ml) nach der unter 4 (i) beschriebenen Methode hergestellt. Das Produkt wurde aus Äthanol umkristallisiert und ergab farblose Kristalle (17,5 g), Schmp. 197-199⁰C.

$oc_t 1 üoc-Difonnoxy-^ß-cholansäure (4 g) wurde in 3*, 12ä-D1-formoxy-23-3od-24-nor-5ß-cholan nach der zuvor unter 4 (ii) beschriebenen Methode überführt, wozu Bleitetraacetat (4,0 g) und Jod (1,9 g) verwendet wurden. Das Rohprodukt wurde aus Äthanol umkristallisiert und lieferte farblose Kristalle, Schmp. 123-125⁰C (3,1 g).

IR-Spektrum

"vmax: 2940, 2865, 1723, 1447, 1383, 1205, 1190, 1180 cm"¹

809828/0950

NMR-S-pektrum (220 MHz. CDCl^)

τ 1,89 und 1,98 (2H, zwei Singuletts, 3- und 12-Formiat-Protonen), τ 4,75 (1H,S,C₁₂-PrOton), τ 5,19 (ΙΗ,ιη,Ο^- Proton), τ "6,71 (1H,m,C₂₅-PrOtOn), τ 6,96 (1H,q,C₂₅« Proton), τ 9,06 (3H,S,C₁₉-Protonen), τ 9,16 (3H,d,C₂₁-Protonen), τ 9,22 (3H,S,C₁₈-Protonen), τ 7,95 - 9,15 (24H, Steroid-Kern).

ii) 3oc, 12*-Dihydroxy-23-(carboxymethyltelluro)-24-nor- ¹³

y
5ß-eholan-^123mTe

^^m-Tellur (6 mg, 5 mCi) wurde in konzentrierter Salzsäure (2 ml) und Wasserstoffperoxid (100 Vol., 2 Tropfen) gelöst, Telluroxid (23 mg, inaktiv) wurde zugesetzt, und die erhaltene Lösung wurde mit Wasser (32 ml) verdünnt. Metallisches Tellur wurde mit Schwefeldioxid-Gas ausgefällt, zweimal mit V/asser und dann mit Äthanol gewaschen und schließlich im Vakuum getrocknet.

Zu metallischem Tellur (24,6 mg, 5 mCi) in einem Reaktionskorben mit 15 ml flüssigem Ammoniak wurde Natrium (4,4 mg) gegeben, wobei der Kolben mit einer Vakuumleitung verbunden und zur Atmosphäre über eine Carbosorb/Aktivkohle-Falle belüftet war. Das Reaktionsgemisch wurde 5 min gerührt, um Dinatriunditellurid- ^^mTe zu erhalten, und dann wurde Jodessigsäure (35,8 mg) zugesetzt. Das Ammoniak konnte abdampfen, . uncLJ3puren f lüchtigeiLMaterialsLwurden unter ver- __ mindertem Druck entfernt.

Der Rückstand wurde erneut in Äthanol (20 ml) und Dimethylformamid (10 ml) gelöst und unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Natriumhydroxid (0,1 g) in Wasser (3 ml) und Dithiothreitol (50 mg) in Wasser (2 ml) wurden zugesetzt. Nach 20 min wurde 3cc,12cr-Diformoxy-23-;jod-24-nor~5ß-cholan in Dimethylformamid (2 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei 60° und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.

I09828/095Ö

^ υ C7 8 Q

-U-

Die lösungsmittel wurden im Vakuum abgedampft und der Rückstand in Chloroform (2 ml) gelöst und dann durch präparative Schichtchromatographie an Cellulose (Avicel P, Butanol/tfasser/Essigsäure 60:25:15) gereinigt. Der aktive Bandbereich mit R_f 0,9-0,96 wurde autoradiographisch festgestellt, von der Platte entfernt und in Chloroform hinein extrahiert. Abdampfen des Chloroforms ergab einen Rückstand von 350 γΰ± (7 %)·

Cellulose (Butanol/Wasser/Essigsäure 60:25:15) Hauptkomponente (> 95 %) R_f 0,95

IR-Spektrum

ν max: 2950, 2920, 2860, 1725, 1450, 1385, 1125, 1070, 1035, 875, 790, 740 cm""¹

iii) 3d, 12o(-Dihydroxy-23-(carboxymethyltelluro)-24-nor-5ß-cholan

Diese Verbindung wurde wie unter 8 (ii) hergestellt. Tellur (59 mg), Natrium (11,5 mg), Jodessigsäure (84 mg), Natriumhydroxid (0,2 g), Dithiothreitol (100 mg) und 3*,-12flC-Diformoxy-23-ood-24-nor-5ß-cholan (190 mg) wurden verwendet.

Ausbeute 30 mg (16 %)

IR-SOektrum

vmax: 2940, 2860, 1725, 1450, 1385, 1130, 1070, 875, 790 cm"¹

NMR-Spektrum (CD₅OD) (220 Mz)

τ 6,05 (1H,S,C₁₂-PrOton), τ 8,97 (3H,d,C₂^Protonen), τ 9,08 (3H,S,C₁₉-Protonen), τ 9,28 (3H,S,C₁₈-Protonen),

809828/0950

Claims (9)

1. Patentansprüche

   1« Verfahren zur Untersuchung von Körperfunktionen eines Säugetiers, dadurch gekennzeichnet, daß in das lebende Säugetier ein ^-Strahlen emittierendes, radioaktives, mit Se oder Te markiertes Derivat einer Gallensäure oder einer Aminosäure-Verbindung von dieser (Gallensäuresalz) oder eine Stoffwechsel-Vorstufe eingeführt und nach dem Ablauf einer geeigneten Zeitspanne die Verteilung der Radioaktivität bestimmt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Untersuchung der Darmfunktion eines Säugetieres, dadurch gekennzeichnet, daß das ^-Strahlen emittierende, radioaktive, mit Se oder Te markierte Derivat einer Gallensäure oder deren Salzes oder Stoffwechsel-Vorstufe dem lebenden Säugetier oral verabreicht und nach dem Ablauf einer geeigneten Zeitspanne die Verteilung der Radioaktivität bestimmt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verteilung der Radioaktivität durch Körperzählung bestimmt wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verteilung der Radioaktivität durch Faeces-Zählung

   bestimmt-wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 zur Untersuchung der Leberfunktion eines Säugetiers, dadurch gekennzeichnet, daß dem lebenden Tier das /■-Strahlen emittierende, radioaktive, mit Se oder Te markierte Derivat einer Gallensäure oder deren Salzes oder Stoffwechsel-Vorstufe intravenös verabreicht undnach dem Ablauf einer geeigneten Zeitspanne die Verteilung der Radioaktivität bestimmt wird.

   809828/09&Ü

   ORIGINAL EWSPECTED
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Gallensäure oder deren Salz oder Stoffwechsel-Vorstufe mit '^Se oder *^mTe markiert wird.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 Ms 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Gallensäure oder deren Salz in 19-Stellung markiert wird.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Gallensäure oder deren Salz in der CL,,-Seitenkette markiert wird.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als markierte Gallensäure 3#,12a:-Dihydroxy-22-

   nc

   (carboxymethyl- Se-seleno)-23,24-bisnor-5ß-cholan verwendet wird.

   8098?8/09S0