DE2722921B2 - Züchten von tierischen und humanen Gewebezellen und Vorrichtung dafür - Google Patents
Züchten von tierischen und humanen Gewebezellen und Vorrichtung dafürInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Züchten von tierischen und humanen
Gewebezellen in einem geschlossenen Behältnis, in dem sie in einer Nährsubstratlösung in Suspension gehalten
werden, unter Zufuhr eines sauerstoffhaltigen Gases.
Bei der Züchtung von tierischen und humanen Gewebezellen werden die Zellen in der Regel in einer
iluiden Nährsubstratlösung suspendiert gehalten, wobei zugleich die für das Wachstum erforderlichen Parameter, wie Temperatur, Sauerstoffkonzentration usw.,
eingestellt werden.
Wenn die die Gewebezellen enthaltende fluide Nährsubstratlösung in einem Behältnis ruhig steht, so
setzen sich die Zellen wegen ihres größeren spezifischen Gewichts am Behältnisboden ab bzw. lagern sich an den
Behältniswänden an, was infolge der sich ergebenden hohen Zelldichte zur Folge hat, daß die Diffusion zum
Nährstoffnachschub nicht ausreicht und die Zellen absterben. Es muß deshalb für eine ständige Aufrechterhaltung der Suspension gesorgt werden. Dies wird
bisher dadurch erreicht, daß die Nährlösung durch mechanische Rührer, Magnetrührer oder Vibrationsmischer unter Sauerstoffzufuhr in Bewegung versetzt wird.
Die bekannten Vorrichtungen arbeiten zufriedenstellend, solange es sich um relativ kleine Behältnisse und
Fluidmengen handelt Probleme ergeben sich jedoch, wenn die Züchtung in größerem Maßstab durchgeführt
werden soll. Zunächst übt bei den bekannten Rührern, Mischern und dgl. das Rührorgan, z. B. ein Rührblatt,
relativ groß Scherkräfte auf die Zellen aus, was zu starken mechanischen Zellschädigungen und damit zu
schlechten Wachstumsraten führt. Außerdem haben größere Vorrichtungen den Nachteil eines relativ
großen apparativen Aufwandes zum Bewegen des ?.ühr- bzw. Mischorganes, wobei als nachteilig bei
mechanischen Rührern noch hinzukommt, daß die Rührerwelle aus dem Behältnis herausgeführt werden
muß, d. h. eine Schmierung erfordernde Wellenlagerung vorgesehen werden muß, wodurch eine Sterilhaltung
des Behältnisinhaltes nur mit Schwierigkeiten erreicht werden kann. Schließlich muß bei größeren Behältnissen und Behältnisinhalten Sauerstoff zwangsweise
durch Einleiten eines sauerstoffhaltigen Gases zugeführt werden, wodurch sich in Verbindung mit der
Wirkung des Rührers, Mischers od. dgl. in der Regel eine beträchtliche Schaumbildung ergibt, weil alle
Nährlösungen für Zetlkulturen eiweißhaltig sind.
Es ist auch bekannt, Gewebezellen auf einer Trägeroberfläche in Form einer Schicht aufzubringen
und diese durch die Nährsubstratlösung langsam hindurchzuführen. Als Trägeroberflächen können z. B.
Glasrohre dienen. Die erforderliche Apparatur ist im Vergleich zur Leistung verhältnismäßig groß.
Es ist ferner bei der aeroben Züchtung von Mikroorganismen bekannt, einen Fermentor einzusetzen, der als sogenannter Schlaufenreaktor ausgebildet
ist. Der Fermentor ist in zwei Abteilungen unterteilt, und zwar in ein Steigrohr und in ein Fallrohr. Im
Steigrohr wird bei höherem Dr:ck Luft und/oder Sauerstoff zugeführt und aufgelöst und im Fallrohr bei
niedrigem Druck Kohlendioxyd, das während der Fermentierung erzeugt wird, abgeführt, wobei außerdem Oxydationswärme abgeleitet wird. Im Fallrohr
wird gegenüber dem Steigrohr eine relative niedrige Strömungsgeschwindigkeit aufrechterhalten. Das Gas
wird zur Erzielung einer starken Turbulenz mit einer hohen, vorzugsweise 0,5 bis 2 m/sec betragenden
Strömungsgeschwindigkeit eingeblasen, so daß die die Mikroorganismen und die Nährsubstanz enthaltende
Flüssigkeit durch das Einblasen aufgeschäumt wird. Dieses Verfahren eignet sich nicht für die Züchtung von
tierischen und humanen Gewebezellen (AT-PS 2 95 447).
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Züchten vor.
tierischen und humanen Gewebezellen zu schaffen, bei welchen die vorstehend geschilderte Gefahr der
Zerstörung von Zellsubstanz bei ausreichender Sauerstoffversorgung vermieden ist und die sich für
Gewebezellkulturen in beliebiger Größe eignen.
Ein diese Aufgabe lösendes Verfahren ist im Patentanspruch I und die zur Ausübung dieses
Verfahrens geeignete Vorrichtung im Patenanspruch 2 gekennzeichnet. Eine vorteilhafte Ausgestaltung des
Züchtungsbehältnisses ist im Anspruch 3 angegeben. Die Durchflußquerschnitte in den beiden Zonen
unterschiedlichen hydrostatischen Druckes sollen etwa gleich gewählt werden.
Durch die Erfindung wird erreicht, daß praktisch
keine mechanische Schädigung der hochempfindlichen Gewebezellen auftreten kann und eine Schaumbildung
im wesentlichen hintangehalten wird. Eine gleichmäßige, im wesentlichen turbulenzfreie Suspension wird über
das gesamte Behältnis aufrechterhalten. Die Umwälzströmungsgeschwindigkeit ist an allen Stellen des
Behältnisses im wesentlichen gleich groß. Da das zugeführte Ge j gleichzeitig als Antriebsmittel und als
Träger für den erforderlichen Austausch von Sauerstoff und Kohlendioxyd dient, kann ein ausreichender
Stoffaustausch ohne Schwierigkeiten gewährleistet werden. Ein wesentlicher Vorteil besteht darin, daß sich
die Verfahrensweise auf beliebig große Behältnisinhalte anwenden läßt
In günstiger Weise wird das sauerstoffhaltige Gas als
Nährsubstratlösung in Form von Gasblasen zugeführt, deren Größe einstellbar ist.
Bei einer zweckmäßigen Ausführungsform der Vorrichtung sind das Behältnis und die Leiteinrichtung
im wesentlichen zylindrisch ausgebildet und die Leiteinrichtung ist in einem solchen Abotand vom
Boden und von der Seitenwandung des Behältnisses angeordnet, daß innerhalb und außerhalb der Leiteinrichtung
im wesentlichen gleich große Strömungsquerschnitte vorhanden sind.
Bewährt hat sich eine Ausgestaltung, bei der die Gaszuführeinrichtung eine im Boden des Behältnisses
vorgesehene Lochplatte aufweist, deren Löcher innerhalb der Projektion des Umkreises der Leiteinrichtung
liegen, wobei die Lochplatte zwei bis zehn, am besten vier öffnungen, insbesondere mit einem Durchmesser
von 0,5—5,0 mm, am günstigsten 1,5 mm, aufweist
Die Erfindung ist mit vorteilhaften Ausgestaltung an mehreren Ausführungsbeispielen anhand einer Zeichnung
näher erläutert, in der zeigt
F i g. 1 eine schematische Ansicht einer Vorrichtung gemäß der Erfindung,
F i g. 2 einen vergrößerten Längsschnitt durch einen
Teil der Voi dichtung nach der Linie 2-2 in F i g. 2,
F i g. 3 und 4 in schematischer Darstellung abgewandelte
Ausführungsformen der Vorrichtung gemäß der Erfindung, und
F i g. 5 ein Diagramm, welches die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens veranschaulicht.
Die in Fig. 1 gezeigte Vorrichtung weist einen aufrecht stehenden, zylindrischen Behälter 1, z. B. aus
Glas, auf, der an seiner Unterseite durch einen Boden aus einer äußerer Ringscheibe und einer mittigen
Lochplatte 2 und an meiner Oberseite durch einen Deckel 3 verschlossen ist. Unterhalb der Lochplatte 2 ist
ein Zylinuerraum 4 kleineren Durchmessers ais der Behälter 1 und etwa mit dem Durchmesser der
Lochplatte 2 vorgesehen, der mit einer nicht gezeigten Quelle für unter Druck siebendes sauerstoffhaitiges Gas
in Verbindung steht
Wie Fig.2 zeigt, ist der Zylinderraum 4 nach unten
hin durch eine Metallplatte 5 abgeschlossen, welche ein Anschlußstück 6 für eine zur Druckgaswelle führenden
Druckgaszufuhrleitung enthält und an der zugleich über einen mittigen Bolzen 7 die Lochplatte verankert ist.
Im Behälter 1 ist eine im wesentlichen zylindrische Leiteinrichtung 8 angeordnet, deren Durchmesser so
gewählt ist, daß die Querschnittsfläche der Leiteinrichtung etwa halb so groß wie die gesamte Querschnittsfläche
des Behälters 1 ist Die Leiteinrichtung 8 wird vom oberen Deckel 3 getragt Λ und ist so angeordnet, daß sie
mit dem Boden und der Wandung des Behälters I im wesentlichen gleich große Strömungsquerschnitte begrenzt
An der Außenseite des Behälters 1 ist im unteren Abschnitt desselben eine Heizwicklung 9 vorgesehen. In
dem Deckel 3 ist schließlich ein Gasauslaß 10 j angeordnet
Im Betrieb der Vorrichtung wird der Behälter 1 mit einer Zellen in Suspension enthaltenden Nährsubstratlösung
so hoch gefüllt daß der Fluidspiegel in einem etwa dem Abstand der Leiteinrichtung vom Behälterbo-
iii den entsprechenden Abstand vom oberen Ende der
Leiteinrichtung liegt. Durch die Lochplatte 2 wird Sauerstoff und Kohlendioxyd enthaltendes Gas, dessen
Zusammensetzung in Abhängigkeit vom Stoffbedarf der Kultur laufend eingeregelt wird, nur mit einem solchen
ι", Druck eingeblasen, der erforderlich ist, um das Gewicht
■ der Fluidsäule über den Löchern 2' der Lochplatte 2 zu überwinden und das Fluid in eine Zirkulationsbewegung
zu versetzen. Das zugeführte sauerstoffhaltige Gas wird von dem nn der Lochplatte 2 vorbeiströmenden Fluid in
gleich große Blasen zerteilt dy im Inneren der
Leiteinrichtung unter Sauerstoffabgabe aufsteigen und einen Auftrieb der Nährsubstratlösung bewirken.
Infolge der erläuterten und dargestellten Ausbildung und Anordnung der Leiteinrichtung 8 wird eine
gleichmäßige Zirkulationsströmung erzielt die im Inneren der Leiteinrichtung aufwärts und an der
Außenseite der Leiteinrichtung abwärts gerichtet ist. Die Gasblasen treten aus dem Fluidspiegei infolge der
rehti' geringen Strömungsgeschwindigkeit nahezu
in ohne Schaumbildung aus.
Die Löcher 2' der Lochplatte 2 sind beim gezeigten Beispiel auf einem Kreis angeordnet der innerhalb der
Projektion des Umkreises der Leiteinrichtung 8 liegt Die Anzahl und Größe der Löcher wird bei vorgegebe-
r> nem Gasdruck je nach der gewünschten Gasblasengröße
bzw. der durchzusetzenden Gasmenge gewählt
Wie aus Fi g. 1 ersichtlich ist, besteht die Leiteinrichtung
8 beim dargestellten Beispiel aus zwei unter Bildung einer ringförmigen Austrittsöfnnung 11 ineinandergreifenden
Abschnitten, die miteinander über Stege 12 verbunden und von der Behälterwandung im Abstand
gehalten sind. Diese Konstruktion ermöglicht es, bei einem Chargenwechsel einen Teil, z. B. die Hälfte, der
Kultur bzw. der Nährsubstratlösung abzuziehen und dabei den Vorrichtungsbetrieb mit verringerter Behälterfüllhöhe
aufrechtzuerhalten.
Es kann beispielsweise die Lochplatte ringförmig ausgebildet und so angeordnet sein, daß die Strömung
an der Außenseite der Leiteinrichtung aufwärts
51» gerichtet ist, d. h. die Zirkulationsströmung umgekehrt
wird. Die Lochplatte 2 kann aber auch bezüglich des Behälters exzentrisch angeordnet und die Leiteinrichtung
8 als eine den Behälter mit Abstand vom Boden vertikal durchsetzende Trennwand ausgebildet sein, wie
j > dies schematisch in F i g. 3 gezeigt ist.
Eine andere Ausführungsform der Vorrichtung ist in F i g. 4 dargestellt Bei dieser weist der Behälter 1 einen
in der Seitenansicht im wesentlichen U-förmigen, z. B. durch ein Rohi mit Kreisquerschnitt gebildeten
mi Behältertei! auf. Die Rohrinnenseite bildet die Leiteinrichtung
8 und die Lochplatte 2 mündet in e'nen der vertikalen Rohrschenkel aus.
Das in Fig.5 dargestellte Diagramm erläutert die
Wirkungsweise der Vorrichtung nach den Fi g. 1 und 2.
πι Die durch Kreise bezeichneten Kurvenabschnitte
veranschaulichen das Zellwachstum, z. B. von iymphoblastoiden Zellen, über der Zeit, wobei jedoch durch
Pfeile Entnahmen aus der Zellkultur angedeutet sind.
Claims (3)
1. Verfahren zum Zuchten von tierischen und humanen Gewebezellen in einem geschlossenen
Behälter, in dem sie in einer Nährsubstratlösung in Suspension gehalten werden, unter Zufuhr eines
sauerstoffhaltigen Gases, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in dem Behälter nur
durch die Gaszufuhr so in einer eine Umwälzströmung ausführenden Suspension gehalten werden,
daß die Suspension durch die Gaszufuhr in einer Zirkulationsbewegung zwischen zwei Zonen geringfügig unterschiedlichen hydrostatischen Drucks zu
einer Umwälzströmung mit einer Geschwindigkeit veranlaßt werden, die ausreicht, um ein Absetzen der
Zellen aus der Suspension zu vermeiden.
2. Vorrichtung zur Ausübung des Verfahrens nach Anspruch I1 bestehend aus einem Behältnis zur
Aufnahme von in einer flüssigen Nährsubstratlösung suspendieren Zellen, wobei im Behältnis eine in die
fluide Nähisubstratlösung eingetauchte Leiteinrichtung für eine Zirkulationsbewegung der Nährsubstratlösung angeordnet ist und auf deren einer Seite
eine Einrichtung in das Behältnis mündet, mit welcher in die Nährsubstratlösung sauerstoffhaltiges
Gas einbiasbar ist und das Behältnis und die Leiteinrichtung zylindrisch ausgebildet sind und die
Leiteinrichtung in einem solchen Abstand vom Boden und von der Seitenwandung des Behältnisses
angeordnet ist, daß innerhalb und außerhalb der Leiteinrichtung im wesentlichen gleich große Strömungsquerschnitte vorhanden sind, dadurch gekennzeichnet, daß d.e Gatiuführungseinrichtung
eine im Boden des Behältnisses (1) vorgesehene Lochplatte (2) aufweist, deren L.cher (2") innerhalb
der Projektion des Umkreises der Leiteinrichtung (8) liegen.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Behältnis (1) einen in der
Seitenansicht im wesentlichen U-förmigen, durch ein Rohr gebildeten Behältnisteil aufweist, wobei die
Rohrinnenseite die Leiteinrichtung (8) bildet, und die Lochplatte (2) in einen der vertikalen Rohrschenkel
ausmündend ist.
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