DE2715041A1

DE2715041A1 - Verfahren zur durchfuehrung enzymatischer reaktionen

Info

Publication number: DE2715041A1
Application number: DE19772715041
Authority: DE
Inventors: Kjell Ovreeide; Francis Henry Verhoff
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1976-04-05
Filing date: 1977-04-04
Publication date: 1977-10-06
Also published as: GB1539680A; IT1073248B; DK142277A; IL51672A0; AU498187B2; JPS52122689A; ES457508A1; DE2715041C3; NL7703711A; DE2715041B2; FR2347091A1; SE7703926L; BR7702127A; BE853216A

Description

DH. ING. F.WUE8THOFF DR. E. ν. PEOHMANN DR. ING. D. BEHRENS UIPL. ING. R. GOETZ TATENTlXWlLTI

80OO MCNCEEN OO SCHWEIOERSTRASSE C TrirFOM (OSK) β·20β1 TIL» 8 24 070 TKLEOBAMMCl

1Α-49 230

Patentanmeldung

Anmelder: MILES LABORATORIES, INC.

Elkhart, Indiana 46514, USA 1127 Myrtle Street

Titel:

Verfahren zur Durchführung enzymatischer Reaktionen

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DR. ING. F.WDESTHOFF

DR. E. τ. PECHM ANK DR. ING. D. BEHRENS DIPL. ING. H. GOETZ

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1A-49 230

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung enzymatischer Reaktionen in hintereinander verbundenen enzymhaltigen Reaktionsgefäßen, das mit einem im wesentlichen konstanten Durchsatz der Ausgangsmaterialien und einer im wesentlichen konstanten Zusammensetzung des Produktes durchgeführt werden kann. Alle Reaktionsgefäße in der Reihe enthalten insgesamt ausreichend Enzym, um die gewünschten Eigenschaften des Produktes zu erzielen. Die Gesamtenzymaktivität in allen Reaktionsgefäßen in der Reihe wird im wesentlichen konstant gehalten durch Zugabe von ausreichend Enzym in ein Reaktionsgefäß in der Reihe, um die Gesamtaktivitätsabnahme in den Reaktionsgefäßen auszugleichen. Die Erfindung betrifft auch Vorrichtungen zur Durchführung derartiger enzymatischer Reaktionen.

Enzyme sind bekannte Substanzen, die allgemein angewandt werden als Katalysatoren zur Durchfuhrung spezifischer Reaktionen. Zum Beispiel katalysiert Glucoseisomerase die Isomerisierung von Glucose (Dextrose) zu Fructose. Eine Amylase katalysiert die Hydrolyse von Stärke unter Bildung von Fragmenten, die als Dextrose, Maltose und höhere Zucker identifiziert werden. Eine Glucoseoxidase kann die Oxidation von Glucose katalysieren. Eine Katalase kann die Zersetzung von Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff beschleunigen und eine Amyloglucosidase die Hydrolyse von Stärke unter Bildung von Glucose. Derartige enzymatische Reaktionen können in Reaktionsgefäßen zum ansatzweisen Arbeiten durchgeführt

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— ψ- ~

werden, indem man das Enzym in einer Lösung oder in dispergierter Form mit den anderen Reaktionsteilnehmern vermischt. Es ist jedoch bevorzugt, das Enzym auf einem geeigneten Träger zu immobilisieren und die Ausgangssubstanzen kontinuierlich durch ein Bett des immobilisierten Enzyms zu leiten unter Bildung eines Produkts, das die gewünschten Eigenschaften besitzt.

Es ist bekannt, daß das immobilisierte Enzym während längerer Verwendung einen Teil seiner ursprünglichen Aktivität verliert. Um diese verminderte Enzymaktivität auszugleichen, wurden bisher zwei allgemeine Verfahren angewandt. Mit abnehmender Enzymaktivität wurde die Durchsatzgeschwindigkeit der Ausgangssubstanzen ebenfalls verringert, um eine längere Kontaktzeit zwischen dem immobilisierten Enzym und dem umzusetzenden Material zu erreichen. Bei diesem Verfahren kann ein Produkt erzielt werden, das die gewünschte Umsetzung zeigt. Es besitzt jedoch den Nachteil, daß unter Umständen unannehmbar geringe Durchflußgeschwindigkeiten erforderlich sind.

Bei einem anderen Verfahren werden die Reaktionsbedingungen geändert, um die verringerte Enzymaktivität auszugleichen; siehe z.B. die US-PS 3 847 741, in der offenbart ist, daß immobilisierte Glucoseisomerase erhöhten Temperaturen ausgesetzt werden kann, um die sonst verringerte Enzymaktivität zu erhöhen und damit die nützliche Lebensdauer des Enzyms zu erhöhen. Dieses Verfahren besitzt den Nachteil, daß eine Änderung der Arbeitsbedingungen erforderlich ist, um eine im wesentlichen konstante Durchsatzgeschwindigkeit zu erreichen und eine im wesentlichen konstante Zusammensetzung des erhaltenen Produktes. In jedem Falle stellt dieses Verfahren nur

dar.

eine kurzzeitige Besserung da die geänderten Reaktionsbedingungen unter Umständen so streng sind, daß das Enzym zerstört wird.

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Auf dem Gebiet der Enzyme besteht daher Bedarf an einem Verfahren, das mit im wesentlichen konstanter Durchsatzgeschwindigkeit, im wesentlichen konstantem Produktausstoß und im wesentlichen konstanten Reaktionsbedingungen arbeitet. Ein derartiges Verfahren würde etwaige Abweichungen in dem Gesamtverfahren sowohl in aufwärts als auch in abwärts durchströmten Enzymreaktionsgefäßen minimieren.

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Durchführung von enzymatisehen Reaktionen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Ausgangsmaterial durch mindestens zwei, hintereinander befindliche, miteinander verbundene Reaktionsgefäße leitet, die insgesamt Enzymmaterial enthalten, das eine Gesamtaktivität ergibt, die ausreicht, um die gewünschte Produktzusammensetzung mit einer vorbestimmten Durchsatzgeschvindigkeit und unter vorbestimmten Reaktionsbedingungen zu erzeugen, und daß die Gesamtenzymaktivität in den Reaktionsgefäßen in der Reihe auf einem im wesentlichen konstanten Wert hält trotz der Verminderung der Aktivität des Enzyms mit der Zeit durch periodische oder kontinuierliche Zugabe von ausreichend Enzym in eines der Reaktionsgefäße in der Reihe, um die Verminderung der Enzymaktivität auszugleichen.

Die Erfindung umfaßt auch spezielle Vorrichtungen zur Durchführung derartiger enzymatischer Reaktionen.

Die Figur 1 ist eine schematische Darstellung verschiedener Enzymreaktionsgefäße und Leitungen und Ventile, die angewandt werden zur Durchführung einer Ausführungsform des Verfahrens, und einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei die verschiedenen Arbeitszyklen in den Unterfiguren (a) bis (g) gezeigt werden.

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Die Figur 2 ist ein Diagramm, das die Beziehung der Umlaufzeit gegen die Enzymausnutzung und Höhe der Reaktorenzymsäule zeigt, wenn das erfindungsgemäße Verfahren angewandt wird.

Figur 3 ist ein Diagramm, das die Beziehung der Arbeitszeit gegen die Enzymzugabe bei Arbeiten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren angibt.

Zur näheren Erläuterung wird das erfindungsgemäße Verfahren im einzelnen in Beziehung auf die durch Glucoseisomerase katalysierte Isomerisierung von Glucose zu Fructose beschrieben. Es ist bekannt, daß durch diese Enzymreaktion eine glucosehaltige Lösung, in der im wesentlichen der gesamte Zuckergehalt in Form von Glucose vorliegt, in eine Glucose-Fructose-Lösung umgewandelt werden kann, in der die gelösten Feststoffe ungefähr 43 bis 45 Gew.-% Fructose enthalten. Diese Umwandlung findet bei einem pH-Wert von ungefähr 7 bis 8 und einer Temperatur von ungefähr 6O°C statt.

Die für dieses Verfahren geeignete Glucoseisomerase ist bekannt und kann aus verschiedenen Quellen erhalten werden. Das Enzym kann auch nach verschiedenen bekannten Verfahren immobilisiert werden. Es ist bevorzugt, daß die Glucoseisomerase eine solche ist, die gebildet worden ist von dem Stamm Streptomyces olivaceus NRRL 3583 oder Mutanten davon, wie in

wurde

der US-PS 3 625 828 angegeben ist,und immobilisiert unter Verwendung von Glutaraldehyd, wie in der US-PS 3 779 869 angegeben.

Die als Ausgangssubstanz angewandte glucosehaltige Lösung kann irgendein bekannter Sirup sein, der erhalten worden ist durch saure oder enzymatische Umwandlung von Stärke, wie Maisstärke. Besonders ist das Ausgangsmaterial eine Lösung von niederen Zuckern, die erhalten worden sind durch Amylase und Amyloglucosidase-Umwandlung von Stärke. Diese Lösung enthält vorzugsweise ungefähr 30 Gew.-% gelöste Feststoffe,von denen 95 Gew.-96 Glucose sind.

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In der Figur 1 (a) wird das erfindungsgemäße Verfahren beschrieben anhand von zwei Enzymreaktionsgefäßen 10 und 11, die sich in Reihe hintereinander befinden. Ein drittes Reaktionsgefäß 12 kann angewandt werden, wenn eines der anderen Reaktionsgefäße zum Leeren entfernt ist. Jedes der Reaktionsgefäße ist ähnlich in der Konstruktion und besitzt ein Eintrittsventil 13» 14 bzw. 15 und ein Austrittsventil 16, 17 bzw. 18. Die Zuführung 19 für das Ausgangsmaterial steht in Verbindung mit dem Eintrittsventil 13 über Ventil und Leitung 21. Die Zuführung 19 kann angeschlossen werden an das Eintrittsventil 14 über Ventil 22 und Leitung 23. Sie kann ferner in Verbindung gebracht werden mit dem Eintrittsventil 15 über Ventil 24, Leitung 25, Ventil 26 und Leitung 27. Die Abführung 28 für das Produkt kann verbunden sein mit dem Austrittsventil 17, 18, 16 über Ventil 29, Leitung 30, Ventil 31, Leitung 32, Ventil 33, Leitung 34, Ventil 35 und Leitung 36 in Reihe und durch die parallele Leitung von Ventil 37, Leitung 38 und Ventil 39 wie aus der Zeichnung hervorgeht. Die Leitung 34 ist mit Leitung 23 über Leitung 40, Ventil 41, Leitung 42 verbunden und Leitung mit Leitung 27 über Leitung 43, Ventil 44, Leitung 45 und Ventil 46.

Zu Beginn eines ersten oder eines anschließenden ähnlichen Arbeitszyklus enthält das Reaktionsgefäß 10 ausreichend immobilisiertes Glucoseisomerasematerial 47 mit einer entsprechenden Aktivität, sodaß ein einziger Durchgang von glucosehaltiger Lösung unter geeigneten Temperatur-, pH- und Zeitbedingungen ein Produkt ergibt, das den gewünschten Fructosegehalt besitzt. Der Weg der glucosehaltigen Lösung geht durch die beiden Reaktoren 10 und 11 nacheinander. Wie aus Figur 1 (a) hervorgeht, geht dieser Weg von der Zuführung 19 zur Abführung 28 durch Ventil 20, Leitung 21,

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Ventil 13,Reaktionsgefäß 10, Ventil 16, Leitung 36, Ventil 35, Leitung 34, Leitung 40, Ventil 41, Leitung 42, Leitung 23, Ventil 14, Reaktionsgefäß 11, Ventil 17, Leitung 32, Ventil 31, Leitung 30 und Ventil 29. Zu Anfang kann das Reaktionsgefäß 11 leer sein oder eine kleine Menge an Enzymmaterial 47 enthalten, wie später näher erläutert wird.

Mit fortschreitender Isomerisierungsreaktion beginnt die Aktivität des Enzymmaterials 47 in dem Reaktionsgefäß 1O sowie etwaigen Enzymmaterials 47 in dem Reaktionsgefäß 11 abzunehmen. Periodische Zugaben von frischem Enzym 47 werden dann in den Reaktor 11 durch eine (nicht gezeigte) Zuführung vorgenommen, um die Gesamtenzymaktivität in dem Reaktionsgefäß 10 im wesentlichen auf einem konstanten gewünschten Wert zu halten. Es ist verständlich, daß eine langsame kontinuierliche Zugabe von frischem Enzym 47 zu dem Reaktionsgefäß 11 angewandt werden kann, um das gleiche Ergebnis zu erzielen. Dadurch wird es möglich, die Durchsatzgeschwindigkeit des flüssigen Materials von der Zuführung 19 bis zur Abführung im wesentlichen konstant zu halten, während im wesentlichen konstante Reaktionsbedingungen in den Reaktionsgefäßen 10 und 11 herrschen und ein im wesentlichen konstanter Produktgehalt an der Abführung 28 erhalten wird.

Gegebenenfalls kann das Reaktionsgefäß 11 ebensoviel Enzym enthalten wie der Reaktor 10. Das ist in Figur 1(b) gezeigt. Die Aktivität des Enzyms 47 in dem Reaktionsgefäß 10 hat dann deutlich abgenommen, sodaß man das Material verwerfen kann. Um das Reaktionsgefäß 10 aus der Reihe zu nehmen und ein Reaktionsgefäß 12 anzuschalten, werden die Ventile 13, 16, 22, 41, 44, 46, 15, 18 und 31 dann in die in der Figur 1(c) angegebene Stellung gebracht. Der Flüssigkeitsfluß von der Zuführung 19 zu der Abführung 28 geht dann durch Ventil 20,

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Leitung 21, Ventil 22, Leitung 23, Ventil 14, Reaktionsgefäß 11, Ventil 17, Leitung 32, Leitung 43, Ventil 44, Leitung 45, Ventil 46, Leitung 27, Ventil 15, Reaktionsgefäß 12, Ventil 18, Leitung 30 und Ventil 29. Zunächst kann das Reaktionsgefäß 12 leer sein oder eine kleine Menge Enzym 47 enthalten, wie später näher erläutert wird.

Die Zeit zwischen dem Beginn der Einspeisung von Ausgangsmaterial in die Reihe von Reaktionsgefäßen (Reaktbnsgefäß/lO) und der Füllung des Reaktionsgefäßes in der Reihe, das zunächst weniger Enzym enthält (Reaktionsgefäß 11) auf im wesentlichen gleichen Enzymgehalt wie die anderen Reaktionsgefäße, ist definiert als Arbeitszyklus. Am Ende eines Arbeitszyklus enthält das erste Reaktionsgefäß in der Reihe (Reaktionsgefäß 10) die geringste Enzymaktivität und wird zum Entleeren aus der Reihe genommen. Ein nicht gefülltes Reaktionsgefäß, das im wesentlichen weniger Enzymmaterial enthält als die anderen Reaktionsgefäße (Reaktionsgefäß 12) wird als letztes Reaktionsgefäß an die Reihe eingeschlossen. Periodische oder kontinuierliche Zugaben von Enzym werden dann zu dem neu angefügten Reaktionsgefäß 12 durch eine Zuführung für einen neuen Arbeitszyklus vorgenommen (nicht gezeigt). Das ist in den Figuren 1(c) und 1 (d) angegeben. Das Produkt wird über eine (-)Abführung aus dem Reaktionsgefäß 10 gewonnen (nicht gezeigt).

Am Schluß des zweiten Arbeitszyklus werden dieVentlle in die in Figur 1(e) angegebene Stellung gebracht, sodaß das Reaktionsgefäß 11, das am meisten verbrauchtes Enzym enthält, aus der Reihe genommen und das Reaktionsgefäß 12 als erstes Reaktionsgefäß aufgenommen werden kann, wobei das vorher entleerte Reaktionsgefäß 10 ^aIs zweites Reaktionsgefäß arbeiten kann.

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Bei dieser Anordnung geht der Flüssigkeitsstrom von der Zuführung 19 zu der Abführung 28 durch Ventil 24, Leitung 25, Ventil 26, Leitung 27, Ventil 15, Reaktionsgefäß 12, Ventil 18, Leitung 30, Ventil 31, Leitung 32, Ventil 33, Leitung 34, Leitung 40, Ventil 41, Leitung 42, Leitung 23, Ventil 22, Leitung 21, Ventil 13, Reaktionsgefäß 10, Ventil 16, Leitung 36, Ventil 39, Leitung 38, Ventil 37. Weiteres Enzym wird periodisch oder kontinuierlich zu dem neu hinzugefügten Reaktionsgefäß durch eine (nicht gezeigte) Zuführung zugegeben und aus dem Reaktionsgefäß 11 das Produkt ausgetragen.

Am Ende dieses dritten Arbeitszyklus, der in Figur 1(f) gezeigt ist, werden die Ventile in die in Figur 1(g) gezeigte Stellung gebracht, wobei das Reaktionsgefäß 12 aus der Reihe genommen wird; das Reaktionsgefäß 10 wird cfas erste Reaktiois gefäß in der Reihe und das vorher entleerte Reaktionsgefäß 11 das zweite Reaktionsgefäß. Aus dem Reaktionsgefäß 12 wird das Produkt gewonnen. Der in Figur 1(g) angegebene Flüssigkeitsstrom ist mit dem in Figur 1(a) angegebenen identisch. Die oben beschriebenen drei Arbeitszyklen können so oft, wie es erwünscht wird, wiederholt werden, um ein kontinuierliches Arbeiten zu erreichen.

Aus dem oben Gesagten geht hervor, daß Jedes Reaktionsgefäß zwei Arbeitszyklen lang sich in Arbeitsstellung befindet. Jedes zunächst leere Reaktionsgefäß wird während eines Zyklus gefüllt und dann als erstes Reaktionsgefäß in der Reihe während des nächsten Zyklus angewandt. Wenn nach dem Abschalten noch eine gewisse Restenzymaktivität in einem Reaktionsgefäß vorhanden ist, sollte das zugeschaltete Reaktionsgefäß zunächst eine gewisse Menge an Enzymaktivität enthalten, das in der Aktivität im wesentlichen gleich ist dieser Restaktivität, um die Gesamtaktivität in der Reihe auf einem im wesentlichen konstanten Niveau zu halten.

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Während bei dem oben beschriebenen Verfahren zwei Reaktionsgefäße in Reihe mit einem dritten leeren Reaktionsgefäß angewandt werden, das auf seine Verwendung wartet, ist es selbstverständlich, daß unter bestimmten Arbeitsbedingungen dieses dritte Reaktionsgefäß weggelassen werden kann. In diesem Falle kann das Reaktionsgefäß mit dem verbrauchten Enzym schnell geleert und wieder als leeres Reaktionsgefäß mit der Reihe verbunden werden oder als Reaktionsgefäß, das eine kleine Menge Enzym enthält, ohne daß die gesamte Arbeitsweise wesentlich beeinflußt wird.

In der folgenden Beschreibung werden einige der Arbeitsbedingungen quantitativ beschrieben, wie sie bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorkommen. Es hat sich z.B. gezeigt, daß immobilisierte Glucoseisomerase mit einer mittleren Stabilität ihre volle Aktivität ungefähr 20 Tage beibehalten kann. Sie nimmt dann nach 40 Tagen auf ungefähr 50 % der ursprünglichen Aktivität und nach 60 Tagen auf ungefähr 0 ab. Um die Wirkung von Enzymen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten der Aktivitätsabnahme zu zeigen bei Anwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren, wird das Verfahren jetzt anhand eines Enzyms mit mittlerer Stabilität.eines weniger stabilen Enzyms und eines stabileren Enzyms beschrieben. In einem Falle wird angenommen, daß das Enzym weniger stabil ist als der Durchschnitt und die Aktivität 20 Tage konstant bleibt und nach 40 Tagen auf 0 abnimmt. In einem anderen Falle wird angenommen, daß das Enzym stabiler ist äer Durchschnitt und die Aktivität 20 Tage konstant bleibt und nach 100 Tagen auf 0 absinkt. Bestimmte Definitionen und Arbeitsbedingungen werden ebenfalls angenommen. Die Bildungsgeschwindigkeit des gewünschten Produktes wird zu allen Zeiten als konstant angenommen. Die Durchgangsgeschwindigkeit der Ausgangssubstanz wird als konstant angenommen und die Reaktionsbedingungen bezüglich Temperatur und pH-Wert sowie die Anfangsaktivität des Enzyms pro Volumeneinheit in dem Bett werden ebenfalls als konstant angenommen. Die Enzymausnutzung wird als Einheit definiert, wenn ein Reaktionsgefäß 20 Tage arbeitet und das Enzym dann verworfen wird. Die Höhe

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der Säule oder die Tiefe des Betts aus immobilisiertem Enzym wird als Einheit definiert, wenn ein einziges Reaktionsgefäß unter den obigen Bedingungen 100 % Enzymaktivität besitzt und ein Produkt mit den gewünschten Eigenschaften bildet. Die unten diskutierten Ergebnisse beruhen alle auf der Annahme eines Gleichgewichtszustands, wie er im allgemeinen nach einigen Arbeitszyklen eintritt.

Figur 2 ist ein Diagramm, das die Beziehung von Dauer

(—bedarf) der Arbeitszyklen gegen die Enzymausnutzung una die Höhe der Enzymsäule in den anderen Reaktionsgefäßen als demjenigen, das ursprünglich weniger Enzym enthält als die anderen, zeigt. Die ausgezogenen Linien48 zeigendie Ergebnisse, wenn ein Enzym mit mittlerer Stabilität angewandt wird (die Aktivität nimmt nach 60 Tagen auf 0 ab). Die unterbrochene! Linien 49 zeigen die Ergebnisse, wenn ein stabileres Enzvm angewandt wird (Aktivität nimmt nach 100 Tagen auf 0 ab) und die unterbrochenen Linien 50 zeigen die Ergebnisse, wenn ein weniger stabiles Enzym angewandt wird (Aktivität nimmt nach 40 Tagen auf 0 ab).

Aus diesem Diagramm geht hervor, daß mit zunehmender Zeit der Arbeitszyklen die relative Enzymausnutzung abnimmt und die relative Enzymhöhe zunimmt. Typische Arbeitsbedingungen können direkt aus der Figur 2 abgelesen werden. Wenn ein Enzym mit mittlerer Stabilität bei einer Arbeitszykluszeit von Tagen angewandt werden^ oeträgt die relative Höhe der Enzymsäule 1,02 und die relative Enzymausnutzung 0,51. Wenn das weniger stabile Enzym mit der gleichen Zeit angewandt wird, beträgt die relative Höhe der Säule 1,33 und die relative Enzymausnutzung 0,67. Wenn das stabilere Enzym angewandt wird innerhalb der gleichen Zeit, beträgt die relative Enzymhöhe 0,77 und die relative Enzymausnutzung 0,39.

Die Figur 2 kann auch angewandt werden, um die Zeit der Arbeitszyklen und die relative Höhe der Enzymsäule unter neuen

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Gleichgewichtsbedingungen zu bestimmen, die erforderlich werden durch Änderungen der Enzymstabilität von Ansatz zu Ansatz, um einen konstanten Durchsatz, konstante Reaktionsbedingungen und konstante Charakteristika des austretenden Materials zu erreichen. Diese Bestimmungen zerfallen in zwei Gruppen. Erstens kann die Zykluszeit konstant gehalten werden und die relative Höhe der Enzymsäule kann unter neuen Gleichgewichtsbedingungen variiert werden. Zweitens kann die relative Höhe der Enzymsäule konstant gehalten und die Zykluszeit variiert werden. Es wird auch lediglich zur Illustration angenommen, daß die Kurven 49 und 50 die äußeren Grenzen für die Enzymstabilität darstellen.

In einem Falle z.B. wird angenommen, daß die Arbeitszykluszeit konstant gehalten wird unter Anwendung der Anordnung nach Figur 1. Wenn das frische Enzym, das in das Reaktionsgefäß 11 gegeben wird (Figur 1 (a)), z.B. weniger stabil ist als das bereits in dem Reaktionsgefäß 10 vorhandene Enzym, muß die Geschwindigkeit der Enzymzugabe zu dem Reaktionsgefäß 11 erhöht werden und die Menge an Enzymmaterial in dem Reaktionsgefäß 11 am Ende des Arbeitszyklus (Figur 1 (b)) höher sein als im Reaktionsgefäß 10. Das beruht auf der Tatsache, daß ein größeres Volumen weniger stabiles Enzym zu dem Reaktionsgefäß 11 in dem gleichen Arbeitszyklus zugegeben werden muß, um die gleiche Enzymaktivität am Ende des Zyklus zu erreichen. Wenn das frische Enzym, das in das Reaktionsgefäß 12 zugegeben wird (Figur 1 (c)), die gleiche geringere Stabilität besitzt wie das in das Reaktionsgefäß 11 zugegebene, ist die Menge an Enzymmaterial 47 in dem Reaktionsgefäß 12 am Ende des Arbeitszyklus (Figur 1 (d)) mindestens eben so hooh wie in dem Reaktionsgefäß 11 oder kann etwas höher sein. Wenn das frische Enzym, das zu dem Reaktionsgefäß 10 zugegeben wird (Figur 1 (e)), die gleiche Stabilität besitzt wie das in das Reaktionsgefäß 12 gegebene, ist die Menge an Enzymmate rial, die im Reaktionsgefäß 10 am Ende des Arbeitszyklus vorhanden ist (Figur 1 (f)), im wesentlichen die gleiche wie in dem Reaktionsgefäß 12. Solange die Ehzymstabilität

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im wesentlichen konstant bleibt, werden nach einigen Arbeitszyklen in den Reaktionsgefäßen Gleichgewichtsbedingungen erreicht. Jede Änderung in der Enzymstabilität von frisch zugegebenem Enzym führt zu neuen Gleichgewichtsbedingungen nach einigen weiteren Arbeitszyklen. Wenn das frische zugegebene Enzym stabiler ist als das vorher angewandte, muß die Zugabegeschwindigkeit für das Enzym und die Menge des in den Reaktionsgefäßen vorhandenen Enzyms aus den oben angegebenen Gründen geringer werden. Der Enzymgehalt wird verringert mit jedem neuen Reaktionsgefäß, das in die Reihe eingefügt wird,bis die Bedingungen des neuen Gleichgewichts erreicht sind.

Die Figur 2 zeigt die Gleichgewichtsbeziehungen zwischen der Zykluszeit und der Höhe der Enzymsäule. Wenn z.B. ein 40-tägiger Arbeitszyklus aufrecht erhalten werden soll, kann man aus Figur 2 ersehen, daß die Reaktionsgefäße so ausgebildet sein müssen, daß es möglich ist, mit einem weniger stabilen Enzym bei einer relativen Säulenhöhe für das Enzym von 1,33 zu arbeiten. Wenn im Mittel ein Enzym mit einer mittleren Stabilität angewandt wird, arbeitet die Enzymsäule mit einer relativen Säulenhöhe von 1,02 oder bei 77 % der maximal möglichen Arbeitshöhe. Wenn ein stabileres Enzym angewandt wird, braucht die relative Säulenhöhe nur 0,77 oder 58 % der maximalen Höhe zu betragen. Es ist selbstverständlich, daß während Übergangs- oder Nicht- Gleichgewichtsbedingungen die relative Säulenhöhe zwischen dem Maximum und dem Minimum liegt.

In einem anderen Falle wird angenommen, daß die Säulenhöhe des Enzyms konstant bleibt. Für einen 40-tägigen Arbeitszyklus z.B. erfordert eine mittlere Enzymstabilität eine relative Enzymhöhe von 1,02. Wenn ein weniger stabiles Enzym bei der gleichen Säulenhöhe angewandt wird, muß die Zykluszeit so gering werden wie 30 Tage. Wenn ein stabileres Enzym mit der gleichen Säulenhöhe angewandt wird, kann die Zykluszeit bis zu 60 Tagen erhöht werden.

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Es ist selbstverständlich, daß sowohl die Zykluszeit als auch die rebtive Tiefe des Enzymbetts in jeder gewünschten Kombination variiert werden können, um die notwendigen neuen Gleichgewichtsbedingungen zu erreichen, die durch eine Änderung der Enzymstabilität notwendig werden.

Die Figur 3 ist ein Diagramm, das die Menge an Enzym mittlerer Aktivität in Werten einer Standardsäulenhöhe pro Tag, die jeden Tag zu dem Reaktionsgefäß zugegeben werden muß, das weniger Enzym enthält als die anderen, um die Gesamtenzymaktivität der Reaktionsgefäße in der Reihe im wesentlichen konstant zu halten, darstellt. Es ist eine eigene Kurve für jede unterschiedliche Zykluszeit angegeben.

Wie oben erwähnt, sollte - wenn das zum Entleeren aus der Reihe entfernte Reaktionsgefäß noch Enzymmaterial mit einer restlichen Enzymaktivität enthält - das neu eingefügte Reaktionsgefäß einenenge an frischem Enzymmaterial enthalten, die im wesentlichen der Enzymaktivität entspricht, wie sie entfernt worden ist. Unter der Voraussetzung der Anwendung eines Enzyms mit mittlerer AktivitätsStabilität ( die über 20 Tage vollständig erhalten bleibt und die nach ungefähr 60 Tagen auf etwa 0 absinkt) gibt die folgende Tabelle die Menge an frischem Enzym in Werten einer relativei Säulenhöhe an, die in dem neuen Reaktionsgefäß enthalten sein sollte zu Beginn eines Arbeitszyklus, um die restliche Enzymaktivität in dem zu entleerenden Reaktionsgefäß auszugleichen. Die zu Beginn in dem nicht gefüllten Reaktionsgefäß vorhandene Enzymmenge hängt damit von der Dauer des Arbeitszyklus ab.

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	Tabelle	2715OA1

Zykluszeit(Tage)		Relative Säulenhöhe
20		0,38
30		0,26
40		0,13
50		0,03
60		0,0
7O	O,O

Unter Berücksichtigung der in der Tabelle angegebenen Daten und der Figur 3 sollte z.B. bei einem 20-Tage-Zyklus das neu eingefügte Reaktionsgefäß mit einer relativen Säulenhöhe an frischem Enzym von 0,38 beginnen und innerhalb eines Zeitraums von 20 Tagen eiae relative Höhe an Enzym von 25 nach und nach zugegeben werden, was zu einer Endsäulenhöhe von 0,63 führt. Das ist der selbe Wert für die Säulenhöhe an Enzym wie er in Figur 2 für einen 20-Tage-Zyklus unter Verwendung eines Enzyms mit mittlerer Stabilität angegeben ist. Die Endsäulenhöhe für das Enzym in dem neu angefügten Reaktionsgefäß am Ende des Zyklus ist damit die gleiche wie die Höhe den anderen Reaktionsgefäßm in der Reihe zu Beginn des Zyklus.

Es ist zu bemerken, daß alle oben angegebenen Daten

der Säulenhöhe für das Enzym relativ sind zu der angenommenen Standardarbeitssäule als Einheit, wobei eine einzige Säule mit 100 % Aktivität an einem bestimmten Enzym mittlerer Stabilität in einem einzigen Durchgang angewandt wird, um die gewünschten Eigenschaften Iu £?- ^es zielen. Um die spezifischen Werte für ein vorgegebenes Enzymsystem zu bestimmen, müssen die Arbeitsbedingungen experimentell bestimmt werden, um bei der speziellen angewandten Säulenhöhe des Enzyms zu dem gewünschten Produkt zu gelangen ohne Vermindung der Enzymaktivität. Dadurch erhält man die Standardsäule

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mit einer relativen Säulenhöhe von 1,0. Änderungen in der Zykluszeit und tatsächlichen Säulenhöhe an Enzym, um ähnliche Ergebnisse zu erzielen, können mit Hilfe der Figuren 2 und 3 und der oben angegebenen Tabelle bestimmt werden oder mit Hilfe ähnlicher Figuren und Tabellen, wie sie experimentell für ein bestimmtes Enzym aufgestellt werden.

Die oben angegebene Beschreibung bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem zwei Reaktionsgefäße in Reihe angewandt werden. Es können erfindungsgemäß jedoch auch drei oder mehr Reaktionsgefäße in einer Reihe angewandt werden, wobei das Enzym jeweils zu dem Reaktionsgefäß in der Reihe zugegeben wird, das zunächst weniger Enzymmaterial enthielt als die anderen. Unter den meisten Bedingungen tritt eine Abnahme der relativen Enzymausnutzung auf, wenn die Anzahl der Enzymsäulen erhöht wird. Während das tatsächliche Enzymvolumen in jeder Säule mit zunehmender Anzahl von Säulen abnimmt, wird das Gesamtenzymvolumen in allen Säulen insgesamt gröber. Der größte Unterschied in der Enzymausnutzung und dem Enzymvolumen pro Säule tritt bei kurzen Zykluszeiten, wie 10 bis 20 Tagen,auf. Die Unterschiede werden geringer, wenn die Zykluszeit auf 40 Tage oder darüber zunimmt.

Nach Figur 1 findet der Durchlauf durch die Reaktionsgefäße von oben nach unten statt. Diese Fließrichtung besitzt den Nachteil, daß eine Verzögerung auftritt in Abhängigkeit von der Enzymmenge in dem Reaktionsgefäß, das weniger Enzym enthält als die anderen Reaktionsgefäße zwischen der Zeit zu der frisches Enzym zugesetzt wird,und der Zeit.zu der eine Änderung in den Produkteigenschaften feststellbar wird. Ein alternatives Verfahren besteht darin, den Strom von unten nach oben durch die Reaktionsgefäße zu leiten. Das kann erreicht werden durch entsprechende Einstellung der Ventile. Da das Enzym von oben zu dem Enzymbett zugegeben wird, tritt im wesentlichen keine Verzögerung auf zwischen der Enzymzugabe und einer gewünschten Änderung in den Produkteigenschaften. Die Verfahrensregelung wird vereinfacht.

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Während bei der obigen Beschreibung von der Anwendung von Glucoseisomerase zur Umwandlung von Glucose in Fructose ausgegangen worden ist, ist es selbstverständlich, daß dieses Verfahren auch auf andere immobilisierte Enzymse angewandt werden kann, um andere Umsetzungen durchzuführen.

Der Durchfluß durch die in Reihe miteinander verbundenen Reaktionsgefäßen, wie er in Figur 1 gezeigt ist, führt zunächst durch ein Reaktionsgefäß, das die gewünschte Höhe des Enzymbettes besitzt, und dann durch ein Reaktionsgefäß, das weniger Enzymmaterial enthält. Es ist selbstverständlich, daß für einige Enzymsysteme es günstig sein kann, den Fluß umgekehrt zu leiten, wobei das Ausgangsmaterial zunächst
durch ein Reaktionsgefäß geleitet wird, das weniger Enzymmaterial enthält, und dann durch die Reaktionsgefäße, die
die gewünschte Höhe des Enzymbetts besitzen. Bei Systemen, die drei oder mehr enzymhaltige Reaktionsgefäße in Reihe
miteinander verbunden umfassen, kann sich das Reaktionsgefäß, das weniger Enzymmaterial enthält, auch in einer mittleren Stellung in der Reihe befinden.

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Lee rs e i t e

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Durchführung enzymatischer Reaktionen, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Ausgangsmaterial durch mindestens zwei hintereinander verbundene Reaktionsgefäße leitet, die zusammen Enzymmaterial mit einer ausreichenden Aktivität enthalten, um die gewünschte Produktzusammensetzung bei einer vorher bestimmten Durchsatzgeschwindigkeit und unter vorbestimmten Reaktionsbedingungen zu erreichen, und daß man die Gesamtenzymaktivität in den Reaktionsgefäßen auf einem im wesentlichen konstanten Wert hält durch periodische oder kontinuierliche Zugabe von Enzymmaterial zu einem/mehreren dieser Reaktionsgefäße.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eines der Reaktionsgefäße in der Reihe zu Anfang wesentlich weniger Enzymmaterial enthält als die anderen und die Zugabe zu diesem Reaktionsgefäß erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß am Ende des Arbeitszyklus das Reaktionsgefäß, das das meiste verbrauchte Enzym enthält, aus der Reihe entfernt und ein Reaktionsgefäß, das wesentlich weniger Enzymmaterial enthält, an die Reihe angefügt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß die Menge an Enzymmaterial, die in dem einen Reaktionsgefäß vorhanden ist, das wesentlich weniger Enzym enthält als die anderen, zu Beginn eines Arbeitszyklus abhängt von der Dauer des Arbeitszyklus.

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ORIGINAL

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß die Dauer des Arbeitszyklus im wesentlichen konstant gehalten wird und die Tiefe des Enzymbetts den durch Änderung der Enzymstabilität auftretenden neuen Gleichgewichtsbedingungen angepaßt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß die Tiefe des Enzymbetts in den Reaktionsgefäßen, die nicht weniger Enzymmaterial enthalten, im wesentlichen konstant gehalten wird und die Dauer des Arbeitszyklus an die Enzymstabilität angepaßt wird.

7. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 6, zur Umwandlung einer glucosehaltigen Lösung in eine fructosehaltige Lösung unter Verwendung von Glucoseisomerase.

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