DE2712344A1

DE2712344A1 - Loeslicher komplexbildner fuer die affinitaetsspezifische trennung von makromolekularen stoffen, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung

Info

Publication number: DE2712344A1
Application number: DE19772712344
Authority: DE
Inventors: Werner Prof Dr Mueller
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1977-03-21
Filing date: 1977-03-21
Publication date: 1978-09-28
Also published as: DE2712344C2; US4207200A; GB1597182A

Description

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TER MEER - MÜLLER - STEINMEISTER D-80O0 München 22 D-48OO Bielefeld

Triftstraße 4 , Siekerwall 7

• h ■

21. März 1977

Prof.Dr.Werner Müller, Rolandstraße 31, 4800 Bielefeld

Antonin Eigel, Am Meierteich 15, 4800 Bielefeld

Dr.Hans-Jürgen Schuetz, Geschwister Scholl Str.1, 4800 Bielefeld

Dr.Hans Bünemann, Am Pulverbach 8, 4803 Steinhagen

Löslicher Komplexbildner für die affinitätsspezifische Trennung von makromolekularen Stoffen, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung.

8098 jn/O 1

ILH Mt LH MULIl H ti 1 L INMLI!j 1 L H

Prof.Dr.Werner Müller
Antonin Eigel
Dr.Hans-Jürgen Schuetz
Dr.Hans Bünemann

Die vorliegende Erfindung betrifft einen löslichen Komplexbildner für die affinitätsspezifische Trennung von makromolekularen Stoffen, insbesondere Biopolymeren, wie Gemischen aus einsträngigen und/oder zweisträngigen Nukleinsäuren, insbesondere Desoxyribonukleinsäuren (im folgenden abgekürzt als DNA bezeichnet) , ein Verfahren zur Herstellung dieses Komplexbildners sowie dessen Verwendung.

Die Isolierung von einzelnen Genen oder von Sätzen gleicher Gene in repititiver Anordnung aus dem Genom eukaryotischer Zellen ist nicht nur von rein wissenschaftlichem Interesse, sondern im Hinblick auf die Gentechnologie auch von großer praktischer Bedeutung. Möglich waren solche Isolierungen nur dann, wenn sich die Basenzusammensetzung des Gens oder der Gengruppe mit ihren "Spacern" wenigstens 6 bis 7% von der mittleren Basenzusammensetzung des Gesamtgenoms unterschied. Als Trennverfahren wurden meist Cäsiumionendichtegradientenzentrifugationen mit DNA-basenspezifischen Zusätzen, wie Silber-, Quecksilberoder Platinionen oder Actinomycin, Netropsin oder dem Farbstoff "Hoechst 33258" angewendet. Diese Verfahren haben nur beschränkte Kapazität, sind teuer und zeitraubend.

Die Entwicklung von Materialien zur Affinitätschromatographie von Biopolymeren hat in den vergangenen Jahren die Isolierung einer Vielzahl von

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TtH MLtR - MULLLH - STEINMLIbIfEH

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Biopolymeren stark vereinfacht oder ihre Reindarstellung überhaupt erst ermöglicht. Bei diesen Verfahren geht man in der Regel von einem Trägermaterial aus, das nach chemischer Aktivierung mit einer Substanz umgesetzt wird, die das zu isolierende Biopolymere möglichst spezifisch bindet. Aufgrund dieser Spezifität kann das gesuchte Biopolymere im Idealfall selektiv aus einem Gemisch ähnlicher Verbindungen an das Chromatographiematerial adsorbiert und anschließend unter geeigneten Bedingungen in

reinem Zustand desorbiert werden (P.Cuatrecasas und C.B.Anfinsen, Ann.Rev.Biochem. 40 (1971) 259 bis 278).

Trotz der Fülle von Beispielen für die erfolgreiche Anwendung dieser Methode für eine Vielzahl von Biopolymeren konnte bislang kein Chromatographiematerial entwickelt werden, das eine ähnlich selektive und programmierbare Auftrennung auch für Nukleinsäuregemische ermöglicht. Eine hochauflösende Fraktionierung von Nukleinsäuregemischen im Grammaßstab ist aber eine Voraussetzung für die angesprochene Isolierung von einzelnen Genen oder von Sätzen gleicher Gene.

Bei den vorhandenen Verfahren zur Auftrennung von Nukleinsäuren mit niedrigem Molekulargewicht, zum Beispiel Transfer-Ribonukleinsäuren, wird die Auftrennung in die verschiedenen Spezies an Adsorbentien erreicht, die Ionenaustauschereigenschaften mit lipophilen Wechselwirkungen kombinieren (R.M.Kothari und V.Shankar, Journal of Chromatography 98 (1974) 44 bis 475). Dabei werden im wesentlichen die Wechselwirkungsmöglichkeiten des Trägers mit den seltenen Basen der Nukleinsäuren ausgenützt, die in den verschiedenen Transfer-Ribonukleinsäuren in unterschiedlicher Menge vorhanden sind.

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TER MEtH-MULLER-SlEINMLISIER

Da die höhermolekularen Ribonukleinsäuren und Desoxyribonukleinsäuren in der Regel keine seltenen Basen enthalten, können Methoden zu ihrer Auftrennung nur auf den folgenden Unterschiedsmerkmalen aufgebaut werden:

a) Verhältnis von Einzel- zu Doppelstrang

b) Unterschiede in der Basenzusanunensetzung

c) Unterschiede in der Basensequenz

d) Unterschiede in den Molekulargewichten e) Unterschiede in den Tertiärstrukturen.

All diese Merkmale werden tatsächlich bei den heute üblichen Fraktioniermethoden genutzt (R.M.Kothari, Chromatog.Rev.12 (1970) 127 bis 155).

Bei der wirksamsten Methode, der Fraktionierung im Salzgradienten in der Ultrazentrifuge führen Unterschiede gemäß b, c und e zu Unterschieden in der Schwebedichte für die einzelnen DNA-Spezies, die durch Zusatz von basenspezifischen Substanzen noch vergrößert werden können. Die Trennschärfe nimmt mit abnehmendem Molekulargewicht, die Kapazität mit zunehmendem Molekulargewicht ab. Bei der Adsorptionschromatographie an Hydroxyapatit erfolgt die Fraktionierung im wesentlichen gemäß a und nur in geringerem Ausmaß gemäß b, indem Guanin-Cytosinreichere Nukleinsäuren schon bei etwas geringeren

Salzkonzentrationen desorbiert werden als die Adenin-Thymin-reicheren Komponenten (W.Pakroppa und W.Müller, Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 171 (3) (1974) 699 bis 703).

Ganz analog können doppelsträngige Nukleinsäuren auch an spezifischen Protein-Kieselgur-Adsorbentien (zum

Beispiel Methyl-Serum-Albumin-Kieselgur) gemäß Unterschieden der Basenzusammensetzung fraktioniert werden,

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fc H M L L H M U L L L H ί, It: I N M i: I i> I L H

wobei wieder die Guanin-Cytosin-reicheren DNA-Spezies zuerst eluiert werden (J.D.Mandell und A.D.Hershey, Analytical Biochemistry 1 (1960) 66 bis 77; N.Sueoka und Ts'ai-Ying Cheng, J.Mol.Biol. 4 (1962) 161 bis 172). Die eigentliche Wirkungsweise dieser mehr zufällig entdeckten Adsorbentien ist nicht bekannt. Daher konnte die geringe Trennschärfe dieser Materialien trotz aller Bemühungen bis heute nicht grundsätzlich verbessert werden.

Erst in den letzten Jahren wurden bei der systematischen Untersuchung von zahlreichen Substanzen, die mit Nukleinsäuren Komplexe bilden, Verbindungen aufgefunden, die zu einer gezielten Synthese von Materialien für die Affinitätschromatographie geeignet erschienen (W.Müller und D.M.Crothers, Eur.J.Biochem. 54 (1975) 267 bis 277; W.Müller, H.Bünemann und N.Dattagupta, Eur.J.Biochem. 54 (1975) 279 bis 291 und W.Müller und F.Gautier, Eur.J.Biochem. 54 (1975) 385 bis 394). Welche Vorteile die Anwendung derartiger gut untersuchter Substanzen bei der Trennung von Nukleinsauregemischen bringt, konnte bereits an den Beispielen der kombinierten Anwendung von Hydroxyapatit und Ethidiumbromid als basenspezifischem Zusatz zur Trennung von superhelicaler und helicaler DNA (W.Pakroppa, W.Goebel und W.Müller, Analytical

Biochemistry 67 (1975) 372 bis 383) und von Hydroxyapatit in Kombination mit Phenylneutralrotderivaten als basenspezifischen Komplexbildnern bei der Trennung von doppelsträngigen DNA-Spezies demonstriert werden (W.Pakroppa und W.Müller, Proc.Nat.Acad.Sei. USA, 71 (3) (1974) 699 bis 703).

Das Auflösungsvermögen dieser zuletzt erwähnten Methoden ist mit dem eines präparativen Cäsiumchlorid-Dichtegradienten vergleichbar, das heißt DNA-Frak-

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TEFI MEER-MÜLIER-STEINMEISTER

tionen mit Unterschieden im (G + C)-Gehalt von >10% (wobei G für Guanin und C für Cytosin stehen) lassen sich voneinander trennen. Trotz hoher Kapazität hat das Verfahren den Nachteil, daß sich DNA-Gemische mit einem mittleren Molekulargewicht der Komponenten von mehr als 20 χ 10 nicht mehr gut handhaben lassen und daß der als Adsorbens verwendete spezielle Hydroxyapatit selbst hergestellt werden muß.

Seit längerem ist bekannt, daß sich Nukleinsäure-Gemische im Polyäthylenglykol-Dextran-System unter bestimmten Bedingungen in RNA und einsträngige DNA einerseits und doppelsträngige DNA andererseits auftrennen lassen. Dabei reichert sich die doppelsträngige DNA stets in der (leichteren) Polyäthylenglykolphase an, das heißt sie besitzt einen höheren Verteilungskoeffizienten als einsträngige Nukleinsäuren. Die Absolutwerte der Verteilungskoeffizienten lassen sich zwar durch Zusätze von Kalium- und Lithiumsalzen über rd. 3-4 Zehnerpotenzen variieren, eine Fraktionierung nach der Basenzusammensetzung gelingt in diesen Systemen jedoch nicht.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, einen löslichen Komplexbildner bereitzustellen, mit dem gezielt der Verteilungskoeffizient oder die Mobilität von Biopolymeren affinitätsspezifisch verändert werden kann, so daß eine basenspezifische Trennung von Biopolymeren und insbesondere von Gemischen aus einsträngigen und/oder zweisträngigen Nukleinsäuren, insbesondere von DNA-Gemischen bei hoher Kapazität erreicht werden kann.

Es hat sich nunmehr gezeigt, daß diese Aufgabe mit einem löslichen Komplexbildner gelöst werden kann, der ein lösliches Polymeres umfaßt, an das

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TEH MLLH MULLLH - ÜTLINMEIS7ER

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mindestens ein für das Biopolymere affiner Rest chemisch gebunden ist.

So hat es sich gezeigt, daß man die Verteilung von Nukleinsäuren unter Verwendung solcher löslicher Komplexbildner stark beeinflussen kann, wenn die Komplexbildner einen stark von 1 abweichenden Verteilungskoeffizienten besitzen. Dies ist bei niedermolekularen Verbindungen im Polyäthylenglykol/Dextran-System kaum anzutreffen, läßt sich aber erfindungsgemäß leicht dadurch herbeiführen, daß man den niedermolekularen, für das Biopolymere affinen Rest kovalent an geeignete Polymere bindet, vorausgesetzt, daß der für das Biopolymere affine Rest dabei seine Affinität nicht einbüßt. Verteilungskoeffizienten mit einem Wert von wesentlich größer als 1 erzielt man erfindungsgemäß durch Bindung an Polyäthylenglykol (am einfachsten durch eine Veresterungsreaktion), während Verteilungskoeffizienten mit einem Wert von wesentlich kleiner als 1 dadurch erreicht werden können, daß man den für das Biopolymere affinen Rest entweder an Dextran bindet (nach der Bromcyanmethode oder durch Veresterung) oder in lineares Polyacrylamid einbaut. Ist der für das Biopolymere affine Rest basen- oder sequenzspezifisch und bleibt diese Eigenschaft nach der Bindung an das Polymere erhalten, so lassen sich Guanin-Cytosinreiche bzw. Adenin-Thymin-reiche Nukleinsäuren sehr effektiv in der oberen bzw. der unteren Phase des Verteilungssystems anreichern.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein löslicher Komplexbildner für die affinitätsspezifische Trennung von makromolekularen Stoffen, insbesondere Biopolymeren, wie Nukleinsäuren, der gekennzeichnet ist durch ein lösliches Polymeres, an das mindestens ein für das Biopolymere affiner Rest kovalent gebunden ist.

Als lösliches Polymeres enthält der erfindungsgemäße 5 Komplexbildner vorzugsweise ein in Wasser und/oder orga-

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TEH M L ti H- M U LLf; H -SIbINMtISItEH

10

15

20

/Ti-

nischen Losungsmitteln lösliches Polymeres, wie ein Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 200 bis 40 000, vorzugsweise mit einem Molekulargewicht von etwa 6000, ein Dextran mit einem M von 3

10³ - 3-1O⁶

oder ein lineares Polyacrylamid mit einem Polymerisationsgrad von 200 - 300 (MG 14 000 - 21 000). Im Prinzip sind sämtliche wasserlöslichen, Hydroxylgruppen tragenden Polymeren geeignet. An das lösliche Polymere ist als für das Biopolymere affiner Rest vorzugsweise eine basenspezifische Gruppe für Nukleinsäuren gebunden. Diese Bindung kann durch Veresterung, durch Aufpropfen oder durch Copolymerisation oder durch Copolykondensation erreicht worden sein.

Als für das Biopolymere affine Reste können basenspezifische Gruppen verwendet werden, die in den genannten Literaturstellen beschrieben sind. Insbesondere sind Reste von Farbstoffen der folgenden allgemeinen Formeln I und II

(D

(ID

in welchen allgemeinen Formeln

X für eine CH-Gruppe oder ein Stickstoffatom, Y für ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom, eine

NH-Gruppe oder eine Gruppe der Formel \

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TER MEER ■ MÜLLER · STEINMEISTER

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- 14 -

R unabhängig voneinander Wasserstoffatome oder

Methylgruppen,

2
R ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe,

R ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe,

4
R ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe

und
A^ ein Anion, wie ein Chloranion, ein Perchlorat-

anion oder ein Oxalatanion
bedeuten, geeignet.

Erfindungsgemäß besonders bevorzugte, an das polymere Trägermaterial gebundene basenspezifische Komplexbildner sind die Reste der folgenden Farbstoffe:

1. Diamidinophenyl-indol (DAPI)

2. Malachitgrün

V₂C₂O₄ ²" (CH₃)₂N^vi^ ^^NICH^

3. Kristallviolett

N(CH₃I₂

4. Methylgrün

Cl"

* N(CH₃)]

(CH₃J₂N-

2ClQ₄"

N(CH₁J₂

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ILH MlLH MULI LH - STLINMtISTtR

27 17 3

5. Auramin

NH .C

6. Farbstoff Hoechst 33258

-OH

7. Di-tert.-butyl-proflavin

ICH₃I₃C H₂N

C(CH₃I₃

8. Di-tert.-butyl-acriflavin

(CH₃J₃C

10.

11 .

U₂N

NH₂

(ΠΙ.Ο,Ν

(MIj)₁N

N(CI I,),

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(I Ui I H MlJI I I H Sl I IUMI II. I I H

15, 16 17 18,

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12.

( Ii < Ii ι οι)«

ι λ ι ■ ί ^ ⁼ "' Alkyl, Aminoalkyl

I,ιΛ ' ' ο- '■-■ NK ιι,ι.

M₁N ^ ^N ^ Nil,

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ClVl.

(CM₁).N '-< N '^'' ^; NIl, Il

809839/01

ORIGINAL INSPECTED

ΓΕΙΙ MLLII - MUl LUH S f LINML IS I EIl

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I il \ \ ,

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25. Thion in

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ORIGINAL INSPECTED

1 Il Ml 1 M MUI I I It :, I MMMt IM I K

26. Acr Ld inoraiuje

ti

27. Pyroii in G

Μ.,Ν-^Νο^Ν,_Νι^

28. Thiopyronin

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30.

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wobe ί lh (k:n obLijt.'M Fotiiit! Lu Mt; tilt die Me t hy 1 ij tii[)[i steht.

I ι ' Π ί fl

Il H 1.11 I ft MUI Il It Ii 11 INMI KiH H

2117

10

Die ei f indungsyemäß bevorzugt e:;t on ba:ienspezi ί i sehen Gruppen sind jedoch die Kaste von Phenyl neut ral r< der Formel

rot

NH.

Cl

CH-

und Malachitgrün der Formel

N(CH

3'2

Diese Farbstoffe sind an sich bekannt und im Handel erhältlich oder können nach Verfahrensweisen hergestellt werden, die dem Fachmann geläufig und beispielsweise in den oben erwähnten Veröffentlichungen von W.Müller und D.M.Crothers (Eur.J.Diochem. 54 (1975) bis 277), W.Müller, H.Bünemann und N.Dattagupta (Eur.J.Biochem. 54 (1975) 279 bis 291) und W.Müller und F.Gautier (Eur.J.Biochem. 54 (1975) 385 bis 394) beschrieben sind.

Diese basenspezifischen Gruppen bzw. Farbstoffreste können nach Methoden, die dem Fachmann ohne weiteres geläufig sind, kovalent an das lösliche Polymere gebunden werden, beispielsweise durch Veresterung mit an dem Polymeren vorhandenen Hydroxylgruppen (PoIyäthylenglykol bzw. Dextran) über in das Farbstoffmolekül eingeführte Carboxylgruppen, durch Amid-

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bildung, durch Urethanbildung oder auch durch Copolymerisation in Abwesenheit und vorzugsweise in Gegenwart von anderen copolymerisierbaren Monomeren über copolymerisierbare Doppelbindungen, die in das Farbstoffmolekül eingeführt sind, beispielsweise eine Acrylamidgruppe, wie es für die erfindungsgemäß bevorzugten basenspezifischen Farbstoffderivate Acrylphenylneutralrot und Acrylmalachitgrün der folgenden Formeln der Fall ist.

(CH₃J₂N

CH=CH₂

CH-CH₂

N(CH₃J₂ Ct

N(CH₃I₂

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Diese basenspezifischen Farbstoffderivate können von dem Fachmann in an sich bekannter Weise durch Einführen des Acrylrestes in die genannten Farbstoffmoleküle hergestellt werden. Dies gilt auch für die weiter oben genannten Farbstoffmoleküle.

Erfindungsgemäß verwendet man als lösliches Polymeres vorzugsweise ein unvernetztes und in Wasser oder organischen Lösungsmitteln lösliches oder quellbares Polymeres, wie ein Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 200 bis 40 00O, bevorzugter mit einem Molekulargewicht von 6000, ein Dextran mit einem M von

3 6
3·10 - 3·10 oder ein lineares Polyacrylamid mit einem Polymerisationsgrad von 2OO - 300. Diese Polymeren zeigen keine starken Wechselwirkungen mit den für das Biopolymere affinen Resten und insbesondere mit den basenspezifischen Gruppen für Nukleinsäuren.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der oben definierten löslichen Komplexbildner, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den für das Biopolymere affinen Rest über eine Gruppe an das lösliche Polymere bindet, die mit einer funktioneilen Gruppe des löslichen Polymeren reagiert.

So kann man den für das Biopolymere affinen Rest durch Veresterung, durch Amidbildung, durch Urethanbildung, durch Aufpfropfen oder durch Copolymerisation oder Copolykondensation mit den für den Aufbau des löslichen Polymeren erforderlichen Ausgangsmaterialien an das lösliche Polymere binden, wozu man übliche Reagenzien und übliche Verfahrensbedingungen anwendet, bzw. die für diese Reaktionen geeigneten Gruppen in das lösliche Polymere bzw. den für das Biopolymere affinen Rest einführt.

So kann man den eine Carboxylgruppe tragenden, für das Biopolymere affinen Rest durch Veresterung mit einer Hydroxylgruppe an Polyäthylenglykol oder Dextran binden 5 oder man kann den eine copolymerisierbare Doppelbindung

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aufweisenden, für das Biopolymere affinen Rest durch Copolymerisation in lineares Polyacrylamid einbauen. Man kann auch den für das Biopolymere affinen Rest nach der Bromcyanmethode an Dextran binden.

Vorzugsweise führt man jedoch die Veresterung des eine freie Carboxylgruppe tragenden, für das Biopolymere affinen Rest mit Polyäthylenglykol mit Hilfe einer Schmelzreaktion durch, bei der man ein aliphatisches oder aromatisches tertiäres Amin, insbesondere Imidazol als Katalysator verwendet und in Gegenwart eines geeigneten Kondensationsmittels, beispielsweise in Gegenwart eines aromatischen Sulfonylchlorids, wie Toluolsulfonylchlorid, Diisopropylsulfonylchlorid oder Di-tert.-Butylsulfonylchlorid arbeitet. Weitere Beispiele für die Einführung der für das Biopolymere affinen Gruppen durch Veresterung sind die Veresterung von Polyäthylenglykol 6O00 mit p-Nitrobenzoesäure oder 4'-Carboxymalachitgrün (Chromgrün).

Für den Einbau der für das Biopolymere affinen Reste in lineares Polyacrylamid geht mein von den entsprechenden Aminoderivaten der genannten Farbstoffe aus, die sich nach Überführen in die Acrylaminoderivate mit Acrylamid zu linearen Copolymeren copolymerisieren lassen. Der Einbau eines ß-Alanylrestes zwischen die Aminofunktion und die Acrylgruppe ist zwar für die DNA-Wechselwirkung vorteilhaft, jedoch nicht unbedingt erforderlich.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen löslichen Komplexbildner lassen sich Biopolymere wie Proteine, und insbesondere DNA-Gemische spezifisch komplexieren, da die für das Biopolymere affinen Reste sich hinsichtlich der Basen (A, C, G bzw. T) bzw. der Basensequenz spezifisch an die Biopolymeren anlagern. Hierdurch kann eine spezifische Änderung der Eigenschaften der komplexierten Biopolymere in Lösung erreicht werden. So kann durch Komplexierung der Biopolymeren mit den erfindungsgemäßen löslichen Kom-5 plexbildnern eine starke Veränderung der Verteilungskoeffizienten der komplexierten Biopolymeren erreicht werden, was zur Auftrennung ausgenützt werden kann.

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Weiterhin läßt sich durch Komplexierung der Biopolymeren mit Hilfe der erfindungsgemäßen Komplexbildner der hydrodynamische Reibungswiderstand der Moleküle beeinflussen, was starke Mobilitätsänderungen mit sich bringt, die bei der Gelelektrophorese zur Trennung der Biopolymeren ausgenützt werden können.

Das Auflösungsvermögen für Nukleinsäuren, das mit Hilfe der erfindungsgemäßen löslichen Komplexbildner und insbesondere der auf der Grundlage von PoIyäthylenglykol, bei der Zweiphasenverteilung oder bei der Gelelektrophorese erreicht werden kann, ist weit größer als man es bisher mit anderen Mehotden erreichen konnte. Damit wird es möglich, die oben angesprochene Isolierung und Reindarstellung von Biopolymeren in einfacher und effektiver Weise zu erreichen.

Gegenstand der Erfindung ist daher auch die Verwendung der oben definierten löslichen Komplexbildner zur Auftrennung von Biopolymeren, insbesondere Nukleinsäuren durch Zweiphasen-Affinitätsverteilung, durch Zweiphasen-Verteilungschromatographie oder durch Gelelektrophorese, wobei die erfindungsgemäßen Komplexbildner als Mittel zur Beeinflussung des Verteilungskoeffizienten oder der Mobilität der Biopolymeren dienen.

Vorteilhafterweise verwendet man, wenn man eine Zweiphasen-Verteilungschromatographie mit Hilfe eines kontinuierlich arbeitenden Chromatographieprozesses durchführen will, Cellulose als Trägermaterial, die beispielsweise die schwerere, dextranreiche Phase des Verteilungssystems adsorptiv bzw. physikalisch bindet. Auf diese Weise kann man unter Verwendung von Cellulose sämtliche Verteilungsprozesse auf der Basis von wäßrigen Polymer-Polymer- bzw. Polymer-Salz-Systemen (siehe auch P.A.Albertson (1971) "Partition of Cells, Particles and Macromolecules" 2.Auflage, 5 Almquist und Wickseil, Stockholm), insbesondere von Polyglykol-Dextran-Systemen in säulenchromatogra-

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TEM MLTIl- MÜLLER- STtINMHISTER

phische, vielstufige Verteilungsprozesse umwandeln.

Besonders gut geeignet sind die erfindungsgemäßen löslichen Komplexbildner für die Auftrennung von Gemischen einsträngiger und/oder zweisträngiger Nukleinsäuren, insbesondere von DNA-Gemischen.

Bei der Zweiphasen-Affinitätsverteilung, der Zweiphasen-Verteilungschromatographie und der Gelelektrophorese verwendet man übliche Grundmedien, beispielsweise Phosphatpuffer oder Trispuffer mit einer Konzentration von etwa 10 mMol/1, pH und einem pH-Wert im Bereich von 4,5 - 8, wobei man für die erfindungsgemässen Komplexbildner, die als basenspezifische Gruppe den Rest von Malachitgrün enthalten, einen schwach sauren Puffer mit einem pH-Wert von 5,5 bis 6 verwendet, beispielsweise einen 0,01 molaren Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 5,5 bis 6. Als Elutionsmittel benutzt man die mobile Phase,also die polyäthylenglykolreiche Phase, die Salze als Zusätze enthalten kann, vorzugsweise Alkalimetallsalze, wie Natriumchlorid, Natriumperchlorat, Lithiumperchlorat, Kaliumchlorid, Lithiumsulfat, Kaliumacetat etc. Mit Vorteil wendet man Konzentrationsgradienten mit abfallender oder ansteigender (LiSO₄) Konzentration an.

Die für die Trennung optimalen Salzgradienten, ihre Bestandteile, Konzentrationen, pH-Werte und die dafür verwendeten Puffer können jedoch vom Fachmann ohne weiteres ermittelt werden.

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Im folgenden sei die vorliegende Erfindung weiter anhand von Beispielen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert.

In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 anhand von Kurven die Änderung der Verteilungskoeffizienten K mit der DNA-Basenzusammensetzung im Polyäthylenglykol-Dextran-System in Anwesenheit von GC-spezifischem, polyäthylenglykolgebundenem 1-Methylphenylneutralrot (KTSat = Kalbsthymus-DNA Satelliten);

Fig. 2A die 10-stufige Gegenstromverteilung von Kalbs-Thymus-DNA zur Abtrennung der GC-reichen Satellitenfraktion im Polyäthylenglykol-Dextran-System mit Polyäthylenglykol-1 -methylphenylneutralrot;

Fig. 2B die 10-stufige Gegenstromverteilung der Satellitenfraktionen 8-10 von Fig. 2A zur Auftrennung in die Komponenten der Schwebedichten 1,714 und 1,723 (Cäsiumchlorid-Dichtegradient) im Polyäthylenglykol-Dextran-System in Anwesenheit von polyäthylenglykolgebundenem 1-Methylphenylneutralrot;

Fig. 3 die Zweiphasenchromatographie von drei bakteriellen DNA unterschiedlichen GC-Gehalts im Polyäthylenglykol-Dextran-System unter Zusatz von polyäthylenglykolgebundenem 1-Methylphenylneutralrot an Cellulose.

Fig. 4 zeigt die Zweiphasenchromatographie von Kalbs-Thymus-DNA im Polyäthylenglykol-Dextran-System mit polyäthylenglykolgebundenem 1-Methylphenylneutralrot an Cellulose.

Fig. 5 zeigt das Ergebnis der Gelelektrophorese von drei bakteriellen Desoxyribonukleinsäuren in Anwesenheit von polyäthylenglykolgebundenem 1-Methylphenylneutralrot .

Fig. 6 zeigt das Ergebnis der zweidimensionalen Agarosegelelektrophorese in Anwesenheit von poly-

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äthylenglykolgebundenem 1-Methylphenylneutralrot.

Beispiel 1

Herstellung von Polyäthylenglykol-1-methyl-4'-carboxy-phenylneutralrot-Halbestern

A) 1-Methyl-4'-carboxy-phenylneutralrot (1,2-Dimethyl-3-amino-5-(4'-carboxyphenyl)-7-dimethylaminophenaziniumsalz)

Man löst 1,05 g N-Dimethylamino-anilin-dihydrochlorid in 50 ml Methanol und versetzt die Lösung in der angegebenen Reihenfolge mit 2 ml 2n-Chlorwasserstoffsäure, 0,62 ml 2,3-Dimethylanilin, 5 ml Acetatpuffer (1m an Natriumacetat und 1m an Essigsäure) und 20 ml 1/6m- Kaliumjodatlösung. Nach 7 bis 8 Minuten verdünnt man die tiefgrüne Lösung mit Methanol auf 220 ml und gibt 13,7 g p-Aminobenzoesäure zu. Nach dem Auflösen der Säure verdünnt man mit Wasser auf 320 ml, stumpft mit einer 2n-Natriumcarbonatlösung auf einen pH-Wert von 6,7 ab und erwärmt auf einer Heizplatte im Verlaufe von 30 Minuten unter Rühren auf 50⁰C. Bei dieser Temperatur gibt man weitere 10 ml 1/6m-Kaliumjodatlösung zu und erhitzt langsam unter Rühren zum Sieden. Bei einer Temperatur von etwa 70°C verfärbt sich das Reaktionsgemisch von Blau über Violett nach Rot. Das Gemisch wird auf 165 ml eingeengt (Siedetemperatur = 78⁰C) und danach 12 Stunden bei 3 bis 4⁰C aufbewahrt. Das ausgeschiedene Material wird abgesaugt, mit etwas kaltem Wasser gewaschen und über Kaliumhydroxid im Vakuum getrocknet.

Das trockene Rohprodukt wird nach dem Pulverisieren in einer Soxhlet-Extraktionsvorrichtung mit etwa 3 50 ml Aceton 6 Stunden extrahiert, um die nichtumgesetzte p-Aminobenzoesäure zu entfernen,worauf man den Rohfarbstoff mit 3 50 ml Methanol in der gleichen

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" ²⁷ " 27123U

Vorrichtung aus der Hülse löst. Nach dem Verdampfen des Methanols im Vakuum reinigt man den Rückstand chromatographisch an Polyamid (zum Beispiel SC6, < 0,07 der Firma Macherey und Nagel) in einem Chloroform/Benzol/Methanol/-Wasser-System (60/25/15/0,4, Volumen/Volumen). Das Eluat der Hauptzone wird bei einer Badtemperatur von 3 5⁰C im Vakuum zur Trockene eingedampft, worauf man den Rückstand aus reinem Äthanol oder n-Propanol umkristallisiert. Ausbeute; Etwa 700 mg (was 36% der Theorie entspricht).

B) Veresterung von 1-Methyl-4'-carboxy-phenylneutralrot mit Polyäthylenglykol (60O0 oder 10 000)

Man schmilzt 3 g Polyäthylenglykol (mit einem Molekulargewicht von 6000 oder 10 000) bei 80⁰C unter Rühren mit 3 g Imidazol zusammen und versetzt dann mit 50 mg des gemäß Stufe A erhaltenen 1-Methyl-4'-carboxyphenylneutralrots. Nachdem sich der gesamte Farbstoff gelöst hat, gibt man 600 mg p-Toluolsulfonylchlorid hinzu und erhitzt die Schmelze weitere 8 bis 12 Stunden unter Feuchtigkeitsausschluß auf 90°C. Nach Ablauf dieser Zeit sind mehr als 90% des Farbstoffs umgesetzt.

Man löst die Schmelze in der Kälte in etwa 50 ml eines O,01m-Natriumphosphatpuffers mit einem pH-Wert von 5,6. Nach 3 Stunden filtriert man bei 4⁰C und chromatographiert im gleichen Medium über chemisch vernetztem Dextran (Sephadex G25) zur Entfernung von nichtumgesetztem Farbstoff, Imidazol und Toluolsulfonsäure. Das Eluat der Hauptzone bewahrt man im Dunkeln bei 3 bis 4°C auf.

Wenn das nicht-umgesetzte Polyäthylenglykol ebenfalls entfernt werden soll (was für die meisten Anwendungszwecke nicht erforderlich ist), so extrahiert man die Lösung mit Chloroform, verdampft das Chloroform im

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27 1234*

Vakuum, löst den Rückstand in Wasser und adsorbiert den Ester an vernetztes Dextran (Sephadex G60 CM). Nach dem Auswaschen des Polyäthylenglykols mit Wasser wird der Ester mit Hilfe einer 1m-Kaliumchloridlösung desorbiert, worauf man das Eluat gegen einen Puffer mit einem pH-Wert von weniger als 7 dialysiert. Zur Gehaltsbestimmung der Lösung ermittelt man die optische Dichte der Lösung bei 555 nm in Anwesenheit von 2% Natriumdodecylsulfat. Der molare Extinktionskoeffizient des Esters beträgt in diesem Medium 53 000 (Mol" χ cm" ).

Beispiel 2

Zweiphasenaffinitätsverteilung von Gemischen doppelhelicaler Desoxyribonukleinsäuren.

Setzt man einem System aus Polyäthylenglykol-6000 und Dextran-T5OO mit abgestimmtem Kaliumchlorid- und Lithiumsulfat-Gehalt so viel polyäthylenglykolgebundenes 1-Methylphenylneutralrot (M-BNR-PEG-6000) zu, daß die Oberphase und 4 χ 10 Mol des Farbstoffs pro Liter enthält, so lassen sich in diesem Gemisch unter Ausnutzung der in Fig. 1 wiedergegebenen Verteilungskoeffizienten Desoxyribonukleinsäuren verschiedener Basenzusammensetzung trennen bzw. stark anreichern. Das gleiche Ergebnis erzielt man, wenn man dem System anstelle des CG-spezifischen Phenylneutralrot-Derivats so viel AT-spezifisches Alanylacrylamino-malachitgrün-acrylamid-Copolymer (Ala.MG·Aa-Copol.) zusetzt, daß die Konzen-

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TER MEEFl-MULLEH-SlEINMEISTER

tration des Farbstoffs in der Unterphase des Systems rund 3 χ 10~⁵ MoI pro Liter beträgt.

In beiden Fällen lassen sich durch einen Verteilungsschritt Desoxyribonukleinsäuren mit<£^(G+C)-Werten von 15 bis 20% mit mehr als 90%iger Reinheit in der Oberphase bzw. in der Unterphase anreichern. Beträgt der Unterschied in dem (G+C)-Gehalt nur 8%, so laßt sich eine Komponente in 80%iger Ausbeute mit einer Reinheit von mehr als 95% aus der Oberphase und die zweite Komponente mit einer Reinheit von 75 bis 80% aus der Unterphase gewinnen.

Die kombinierte Anwendung von GC- und AT-spezifischen Komplexbildnern ergibt noch bessere Ergebnisse.

Durch Anwendung des beschriebenen Verteilungssystems mit GC-spezifischem, polyäthylenglykolgebundenem 1-Methylphenylneutralrot in lOstufigen Gegenstromverteilungen lassen sich die GC-reichen Satelliten aus Kalbs-Thymus-DNA abtrennen (Fig. 2A ) und unter veränderten Bedingungen in ihre Hauptkomponenten zerlegen (Fig. 2B ).

Beispiel 3

Zweiphasenverteilungschromatographie von DNA-Gemischen

Die mehrstufige Verteilung von Stoffgemischen läßt sich immer dann zu einem chromatographischen Trennprozeß ausbauen, wenn es gelingt, für eine der beiden Phasen einen Träger zu finden, der die Phase genügend stark festhält.

Für das Polyäthylenglykol-Dextran-System sind bisher nur Kieselgur und Sephadex-Gele als Träger vorgeschlagen worden. Bei der Oberprüfung dieser Angaben hat sich gezeigt, daß Kieselgur die Dextranphase zu wenig bindet, um sich für größere Trennsäulen zu eignen. Spehadexgele sowie Agarose eignen sich wegen ihres unerwünschten

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Molekularsiebeffektes nicht.

Sehr gut brauchbar erwies sich nun, Cellulosepulver, insbesondere entfetteter und mit Säure gewaschener Linters (beispielsweise das von der Firma Macherey und Nagel 2200 ff erhältliche Material). Nach ausreichender Vorquellung bindet 1 g dieser Cellulose rund 1 bis 1,2 ml der Unterphase eines Systems aus Polyäthylenglykol-6000 und Dextran T40 (mit einem mittleren Molekulargewicht von 4 2 000).

Präpariert man bei einer Temperatur von mehr als 26°C aus 10 g vorgequollener Cellulose (die zur Auftrennung von 1,5 mg eines DNA-Gemisches ausreicht) in der üblichen Weise eine 2-Phasenverteilungssäule, so lassen sich daran die in den Fig.3 und 4 wiedergegebenen Auftrennungen durchführen.

Die Fig. 3 zeigt dabei die Zweiphasenchromatographie von drei bakteriellen Desoxyribonukleinsäuren unterschiedlichen G+C-Gehalts im System Polyäthylenglykol-Dextran unter Zusatz von polyäthylenglykolgebundenem 1-Methyl-phenylneutralrot .in Cellulose. (Die Zonen um 12 und 20 ml Eluatvolumen rühren von Störungen durch überschüssigen Farbstoff bzw. überschüssiger Unterphase her.)

Die Fig. 4 zeigt die Zweiphasenchromatographie von Kalbs-Thymus-DNA im Polyäthylenglykol-Dextran-System mit polyäthylengebundenem 1-Methyl-phenylneutralrot (2,2 OD₅₅₅/ml Oberphase) an Cellulose. Der Peak bei der Fraktion Nr. 20 enthält die GC-reichen Satelliten,während der Peak zwischen den Fraktionen 40 und 50 eine GC-ärmere DNA-Fraktion mit der Schwebedichte 1,705 im Cäsiumchlorid-Dichtegradienten enthält. Der Peak zwischen den Fraktionen 67 und 93 enthält die sogenannte "main-Band"-DNA.

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Wenn sich die Komponenten des DNA-Gemisches um mehr als 6% im GC-Gehalt unterscheiden, wird bei den obigen Zweiphasenverteilungen in der Oberphase ein K -Li Gradient angelegt, um eine genügend große Wanderungsgeschwindigkeit der GC- bzw. AT-ärmsten Komponenten zu erzielen.

Das Arbeiten bei Temperaturen von mehr als 26°C (die in den Fig. 3 und 4 dargestellten Läufe wurden alle bei 30⁰C durchgeführt) erwies sich als notwendig, da hierdurch eine genügend hohe Diffusionsgeschwindigkeit der DNA und eine genügend geringe Viskosität der Phasen gewährleistet wird.

Beispiel 4

Verwendung der erfindungsgemäßen polymergebundenen, basenspezifischen Komplexbildner bei der Gelelektrophorese von Nukleinsäuren.

Nukleinsäuren lassen sich durch Elektrophorese in Polyacrylamid- oder Agarosegelen nach ihrer Molekülgröße auftrennen. Die kombinierte Anwendung von beiden Gelen erlaubt unter bestimmten Bedingungen auch eine mäßige Auftrennung nach der Basenzusammensetzung. Für eine vorzugsweise nach der Basenzusammensetzung erfolgende Auftrennung eignen sich niedermolekulare, basenspezifische Komplexbildner nicht, da der Effekt der partiellen Ladungsneutralisation auf die Mobilität des Polyelektrolyten im Spannungsfeld relativ klein ist. Setzt man dem Gel jedoch einen erfindungsgemäßen basenspezifischen Komplexbildner zu, so ergibt sich eine starke Mobilitätsveränderung bei GC- bzw. AT-reichen Desoxyribonukleinsäuren, und zwar in Abhängigkeit von der Spezifität des Komplexbildners.

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Dieser Effekt läßt sich aus der starken Veränderung der hydrodynamischen Eigenschaften, die ein lineares Polymers durch die mit dem basenspezifischen Komplexbildner eingebrachten Verzweigungen erfährt, erklären.

In der Fig. 5 sind die Mobilitätsunterschiede von drei bakteriellen Desoxyribonukleinsäuren, die auf die gleiche mittlere Größe geschert worden sind (M = 7 50 000) in Agarose in Anwesenheit von polyäthylenglykolgebundenem 1-Methyl-phenylneutralrot (1,5 OD₅₅₅/ml) gezeigt. Bei den bakteriellen Desoxyribonukleinsäuren handelt es sich um folgende Materialien:
1 : DNA aus Cl. acidi urici, 34% G+C; 2 : DNA aus E. coli, 52,5% G+C; 3 : DNA aus M. luteus, 72,5% G+C.

Die Fig. 5 stellt eine UV-Fluoreszenzphotographie nach dem Anfärben der Desoxyribonukleinsäure mit Ethidiumbromid dar.

Besteht das zu analysierende Nukleinsäuregemisch aus Komponenten verschiedener Größe, so führt man zweckmäßigerweise eine Vortrennung im Rundgel ohne Komplexbildner durch, bettet das Rundgel sodann in ein Flachgel mit Komplexbildner ein und betreibt eine Elektrophorese senkrecht zur ersten Auftrennungsrichtung.

Besitzen alle Komponenten die gleiche Basenzusammensetzung, so wandern sie auf einer Geraden, die gegenüber der Richtung des eingebetteten Rundgels einen Winkel zwischen 0 und 90° bildet (siehe Fig. 6).

Komponenten, die nicht auf dieser Geraden wandern, weisen eine von dem Mittelwert abweichende Basenzusammensetzung auf.

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Ist der verwendete Komplexbildner GC-spezifisch, so sind raschere Komponenten AT-reicher und langsamere Komponenten GC-reicher als der Mittelwert.

Die Fig. 6 zeigt anhand einer UV-Fluoreszenzphotographie nach dem Anfärben der Desoxyribonukleinsäuren mit Ethidiumbromid die Auftrennung eines Eco-RI-Hydrolysats von ^-Phagen-DNA mit einem GC-spezifischen Komplexbildner. Dabei wurden die Fragmente zunächst im Rundgel in Richtung 1 der Größe nach aufgeteilt und anschließend in Richtung 2 im Flachgel in Anwesenheit des erfindungsgemäßen Adsorbens einer erneuten Elektrophorese unterworfen. Neben dem Auftreten einer normalerweise nicht sichtbaren Komponente zeigen etliche Fragmente deutliche Abweichungen von der Geraden.

Zusammenfassend ist festzustellen, daß die erfindungsgemäßen Komplexbildner hervorragend geeignet sind für die Trennung von makromolekularen Stoffen und insbesondere Biopolymeren, wie Nukleinsäuregemischen. Diese Komplexbildner lassen sich in einfacher Weise herstellen und in Bezug auf ihre Basenspezifität gezielt einstellen.

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Claims

TtH MLLFt- MULLLH- SILINMLISItH Ί ί 1 Ί :U Patentansprüche

1. Löslicher Komplexbildner für die affinitätsspezifische Trennung von makromolekularen Stoffen, insbesondere Biopolymeren, wie Nukleinsäuren, gekennzeichnet durch ein lösliches Polymeres, an das mindestens ein für das Biopolymere affiner Rest kovalent gebunden ist.

2. Komplexbildner nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er als lösliches Polymeres ein in Wasser und/oder organischen Lösungsmitteln lösliches Polymeres umfaßt.

3. Komplexbildner nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er als Polymeres ein Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 200 bis 40 000, ein Dextran oder ein lineares Polyacrylamid enthält.

4. Komplexbildner nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 6000 enthält.

5. Komplexbildner nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der für das Biopolymere affine Rest durch Veresterung, durch Aufpfropfen oder durch Copolymerisation oder Copolykondensation an das lösLiche Polymere gebunden ist.

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ORIGINAL INSPECTED

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6. Komplexbildner nach einem der vorhergehenden

Ansprüche, dadurch gekennzeichn e t, daß das lösliche Polymere als für das Biopolymere affinen Rest eine basenspezifische Gruppe für Nukleinsäuren trägt.

IO

7. Komplexbildner nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er als basenspezifische Gruppe für Nukleinsäuren den Rest eines Farbstoffs der folgenden allgemeinen Formeln I oder II trägt

(D

(II)

in welchen allgemeinen Formeln

X für eine CH-Gruppe oder ein Stickstoffatom, Y für ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom, eine NH-Gruppe oder eine Gruppe der Formel

N(R¹

8 0 9 B ) ') / Π

ORIGINAL INSPECTED

ILH Ml. LH-MULl [ M SIl INMl lü

R unabhängig voneinander Wasserstoffatome

oder Methylgruppen,
2
R ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe,

R ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe,

4
R ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe

und
Pr ein Anion, wie ein Chloridanion, ein Per-

chloratanion oder ein Oxalatanion bedeuten.

8. Komplexbildner nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß er als basenspezifische Gruppe den Rest von Malachitgrün, von Kristallviolett, von Methylgrün, von Auramin, des Farbstoffs Hoechst 33258, von Di-tert.-Butyl-proflavin, von Di-tert.-Butylacriflavin, von Diamidino-phenyl-indol (DAPI), von 1-Methylphenylneutralrot oder von Ethidiumbromid trägt.

9. Komplexbildner nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die basenspezifische Gruppe der folgenden Formel entspricht :

Cl

CH₃

10. Komplexbildner nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die basen-5 spezifischen Gruppe der folgenden Formel entspricht:

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ι..

-^- 27123U

N(CH₃)₂C1

11. Verfahren zur Herstellung des Komplexbildners nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man den für das Biopolymere affinen Rest über eine Gruppe an das lösliche Polymere bindet, die mit einer funktio

neilen Gruppe des löslichen Polymeren reagiert.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekenn zeichnet, daß man den für das Biopolymere affinen Rest durch Veresterung, durch Amidbildung, durch Urethanbildung, durch Auf

pfropfen oder durch Copolymerisation oder Copolykondensation mit den für den Aufbau des löslichen Polymeren erforderlichen Ausgangsmaterialien an das lösliche Polymere bindet.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch

gekennzeichnet, daß man den eine Carboxylgruppe tragenden, für das Biopolymere affinen Rest durch Veresterung mit einer Hydroxylgruppe an Polyäthylenglykol oder Dextran bindet.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch

gekennzeichnet, daß man den eine copolymerisierbare Doppelbindung aufweisenden/ für das Biopolymere affinen Rest durch Copolymerisation in lineares Polyacrylamid einbaut.

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15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch

gekennzeichnet, daß man den für das Biopolymere affinen Rest nach der Bromcyanmethode an Dextran bindet.

16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch

gekennzeichnet, daß man Polyäthylenglykol in einer Schmelzreaktion unter Verwendung von Imidazol als Katalysator in Gegenwart eines geeigneten Kondensationsmittels mit dem eine freie Carboxylgruppe tragenden, für das Biopolymere affinen Rest verestert.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch

gekennzeichnet, daß man als Kondensationsmittel Toluolsulfochlorid verwendet.

18. Verwendung der Komplexbildner nach den Ansprüchen 1 bis 10 zur Auftrennung von Biopolymeren, insbesondere Nukleinsäuren, durch Zweiphasen-Affinitätsverteilung, durch Zweiphasen-Verteilungschromatographie oder durch Gelelektrophorese als Mittel zur Beeinflussung des Verteilungskoeffizienten oder der Mobilität der Biopolymeren.

19. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennze ichnet, daß man die Zweiphasen-Verteilungschromatographie in Gegenwart von Cellulose als Trägermaterial durchführt.

20. Verwendung nach den Ansprüchen 18 oder 19 zur Auftrennung von Gemischen einsträngiger und/oder zweisträngiger Nukleinsäuren, insbesondere von DNA-Gemischen.

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