DE2709877A1 - Neue tetradecapeptide und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

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6CHLEIi:.; J,:!WiRSTa CDOO .V.ÜNCKEN 40

X-4840

Eli Lilly and Company/ Indianapolis, Indiana, V.St.A.

Neue Tetradecapeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung

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Die Erfindung bezieht sich auf die Tetradecapeptide L-AIa-Y-L-Cys-L-Lys-Z-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH, Formel (I), worin Y D-AIa, D-Ser oder D-VaI und Z L-Asn oder L-AIa bedeuten, und ihre pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie dabei gebildete Zwischenprodukte.

Somatostatin, das auch als die Somatotropinfreisetzung inhibierender Faktor bekannt ist, ist ein Tetradecapeptid der Formel L-Ala-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-

I (

L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH. Dieses Tetradecapeptid wurde aus Schafhypothalamusextrakten isoliert, und seine Wirkung ist die einer Inhibierung der Sekretion von Wachstumshormon (GH) , das auch als Somatotropin bekannt ist, vergleiche P. Brazeau, W. Vale, R. Burgus, N. Ling, M. Butcher, J. Rivier, und R. Gullemin, Science, 179, 77 (1973).

D-Trp -Somatostatin ist von J. Rivier, M. Brown und W. VaIe in Biochemical and Biophysical Research Communications, Bd. 65, Nr. 2, S. 746 - 751 (1975) beschrieben.

Die Struktur der erfindungsgemäßen Tetradecapeptide der Formel I unterscheidet sich von der von Somatostatin durch die Gegenwart eines D-Tryptophanrestes in Stellung 8 anstelle eines L-Tryptophanrestes und weiterhin durch die Gegenwart eines D-Alanin-, D-Serin- oder D-Valinrestes in Stellung 2 anstelle eines Glycinrestes und/oder durch die Gegenwart eines L-Alaninrestes in Stellung 5 anstelle eines L-Asparaginrestes. Der Einfachheit halber werden die Tetradecapeptide der Formel I als

2 8 2 5 8

D-AIa , D-Trp -Somatostatin; D-AIa ,L-AIa _#D-Trp -Somatostatin;

2 8 2 8

D-Ser ,D-Trp -Somatostatin und D-VaI ,D-Trp -Somatostatin bezeichnet .

Die während des Verfahrens zur Herstellung der Tetradecapeptide der Formel I gebildeten Zwischenprodukte haben die Formel R-L-AIay-L-Cys (R₁) -L-Lys (R₂) -Z-L-Phe-L-Phe-D-Trp(R₅)-L-Lys (R₂) -L-Thr (R₃) L-Phe-L-Thr(R₃)-L-Ser(R₄)-L-Cys(R₁)-X, Formel II; worin bedeuten:

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- f-

Y D-AIa, D-Ser(R₄) oder D-VaI,

Z L-Asn oder L-AIa,

R Wasserstoff oder eine alpha-Amino-Schutzgruppe,

R₁ Wasserstoff oder eine Thio-Schutzgruppe,

R₂ Wasserstoff oder eine epsilon-Amino-Schutzgruppe,

R_ und R- Wasserstoff oder eine Hydroxyschutzgruppe,

R. Wasserstoff oder eine Formylgruppe und

X eine Hydroxylgruppe oder die Gruppe

·= »_N^^. Harz

in der "Harz" für Polystyrol steht,

wobei die einzelnen Reste R, R-, R₂, R-, R. und R₅ Wasserstoff bedeuten, wenn X eine Hydroxylgruppe ist, und die anderen oben angegebenen Bedeutungen haben, wenn X für die Gruppe

-0-CH₂-

steht.

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Das Verfahren zur Herstellung der neuen Tetradecapeptide der Formel I ist dadurch gekennzeichnet, daß das entsprechende geradkettige Tetradecapeptid der Formel III, H-L-Ala-Y-L-Cys-L-Lys-Z-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH, worin Y und Z die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit einem Oxydationsmittel umgesetzt wird. Durch diese Umsetzung werden die beiden Sulfhydrylgruppe in eine Disulfidbrücke übergeführt.

Pharmazeutisch annehmbare nichttoxische Säureadditionssalze sind Salze mit organischen oder anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Sulfonsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Bromwasserstoff säure, Glykolsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Bernsteinsäure, Essigsäure, Salpetersäure, Benzoesäure, Ascorbinsäure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure und Propionsäure. Die bevorzugten Säureadditonssalze sind die mit Essigsäure hergestellten. Alle diese Salze können nach üblichen Methoden erhalten werden.

Im Rahmen der Erfindung bevorzugte Zwischenprodukte der Formel II sind:

R-L-Ala-D-Ala-L-Cys(R₁)-L-Lys(R₃)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp(R₅)-L-Lys(R₃)-L-Thr(R₃)-L-Phe-L-Thr(R₃)-L-Ser(R₄)-L-Cys(R_x)-X;

R-L-Ala-D-Ala-L-Cys(R₁)-L-Lys(R₃)-L-Ala-L-Phe-L-Phe-D-Trp(R₅)-L-Lys(R₃)-L-Thr(R₃)-L-Phe-L-Thr(R₃)-L-Ser(R₄)-L-CyS(R₁J-X;

R-L-Ala-D-Ser(R₄)-L-Cys(R₁)-L-Lys(R₃)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp(R₅)-L-Lys(R₂)-L-Thr(R₃)-L-Phe-L-Thr(R₃)-L-Ser(R₄)-L-

R-L-Ala-D-Val-L-Cys(R₁)-L-Lys(R₃)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp(R₅)-L-Lys(R₃)-L-Thr(R₃)-L-Phe-L-Thr(R₃)-L-Ser(R₄) -

L-cys (R₁J-X. 709837/0861

Besonders bevorzugte Zwischenprodukte sind die folgenden:

H-L-Ala-D-Ala-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH;

H-L-AIa-D-Ala-L-Cys-L-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH;

N-(BOC)-L-Ala-D-Ala-L-(PMB)Cys-L-(CPOC)Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-(CPOC)Lys-L-(BzI)Thr-L-Phe-L-(BzI)Thr-L-(BzI)Ser-L-(PMB)Cys-O-

°*Κ2? ^IIarz ■·

N-(BOC)-L-Ala-D-Ala-L(PMB)Cys-L-(CPOC)-Lys-L-Ala-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-(CPOC)Lys-L-(BzI)Thr-

L-Phe-L-(BzI)Thr-L-(BzI)Ser-L-(PMB)Cys-O- /*⁼~^_: Harz

H-L-Ala-D-Ser-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH;

N-(BOC)-L-AIa-D-(BzI)Ser-L-(PMB)Cys-L-(CBzOC) Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-(CBzOC)Lys-L-

(BzI)Thr-L-Phe-L-(BzI)Thr-L-(BzI)Ser-L-(PMB) - s^m=-⁹\s' Harz

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H-L-Ala-D-Val-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH; und

N-(BOC)-L-AIa-D-VaI-L-(PMB)Cys-L-(CBzOC)Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-(For)Trp-L-(CBzOC)Lys-L-(BzI) -

Thr-L-Phe-L-(BzI)Thr-L-(BzI)Ser-L-(PMB)Cys-O-/^#=5!*- Harz

Die oben zur Definition der Zwischenprodukte angegebenen Formeln enthalten auch die Schutzgruppen für Amino-, Hydroxy- und Thio-(sulfhydryl-)-Funktionen. Die Eigenschaften der hierin definierten Schutzgruppen sind zwei verschiedene: Als erstes verhüten die Schutzgruppen, daß ein in einem bestimmten Molekül vorhandener reaktionsfähiger Teil eine Reaktion eingeht, während das Molekül Bedingungen unterworfen wird, die zu einer Zerstörung des sonst reaktionsfähigen Teils führen können; zweitens sind die Schutzgruppen so beschaffen, daß sie sich unter Rückbildung des ursprünglichen aktiven Teils und unter Bedingungen leicht entfernen lassen, die andere Teile des Moleküls nicht in unerwünschter Weise beeinflussen oder verändern. Für diese Zwecke geeignete Gruppen, d. h. Gruppen zum Schutz von Amino-, Hydroxy- und Thiogruppen, sind allgemein bekannt, und der Fachmann ist mit ihnen und Verfahren zu ihrer Anwendung aus der umfangreichen einschlägigen Literatur vertraut. Es sei hier nur auf Protective Groups in Organic Chemistry, M.F.W. McOmie, Editor, Plenum Press, New York, 1973, verwiesen.

In den obigen die Zwischenprodukte definierenden Formeln bedeutet R entweder Wasserstoff oder eine alpha-Aminoschutzgruppe. Die in Betracht kommenden alpha-Aminoschutzgruppen sind auf dem Peptidgebiet allgemein bekannt. Viele davon sind in Kapitel 2 des oben zitierten Werks im einzelnen aufgeführt.

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Beispiele für solche Schutzgruppen sind: Benzyloxycarbonyl, p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, o-Chlorbenzylpxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarboyl, o-Brombenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl (BOC), tert.-Amyloxycarbonyl, 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl (BpOC), Adamantyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl, Cycloheptyloxycarbonyl, Triphenylmethyl (Trityl) und p-Toluolsulfonyl. Die bevorzugte alpha-Aminoschutzgruppe ist tert.-Butyloxycarbonyl.

R. bedeutet entweder den Viasserstoff der Sulfhydrylgruppe des Cysteine oder eine Schutzgruppe für den Sulfhydrylsubstituenten. Viele solcher Schutzgruppen sind in Kapitel 7 des oben zitierten Werkes angegeben. Beispielhafte geeignete derartige Schutzgruppen sind p-Methoxybenzyl, Benzyl, p-Tolyl, Benzhydryl, Acetaraidomethyl, Trityl, p-Nitrobenzyl, tert.-Butyl, Isobutyloxymethyl und die verschiedenen Tritylderivate. Bezüglich weiterer Gruppen wird beispielsweise auf Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, "Sythese von Peptiden", Bd. 15/1 und 15/2, (1974), Stuttgart, verwiesen. Die bevorzugte Sulfhydrylschutzgruppe ist p-Methoxybenzyl.

R_ bedeutet Wasserstoff an der epsilon-Aminofunktion des Lysinrestes oder eine geeignete epsilon-Aminoschutzgruppe. Beispiele für solche Schutzgruppen sind die oben in Verbindung mit der alpha-Aminoschutzgruppe aufgeführten. Sehr typische Gruppen dieser Art sind Benzyloxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, o-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, o-Brombenzy loxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl, Cycloheptyloxycarbonyl und p-Toluolsulfonyl.

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Wie im folgenden noch eingehender dargelegt, erfolgt bei dem Verfahren zur Herstellung der Tetradecapeptide der Formel I periodische Abspaltung der alpha-Aminoschutzgruppe von der endständigen Aminosäure der Peptidkette. Die einzige Bedingung, die die epsilon-Aminoschutzgruppe an dem Lysinrest zu erfüllen hat, ist deshalb die, daß sie von solcher Art sein muß, daß sie unter den Bedingungen, die zur selektiven Abspaltung der alpha-Aminoschutzgruppe angewandt werden, nicht abgespalten wird. Die entsprechende Wahl der alpha-Amino- und der epsilon-Aminoschutzgruppen liegt im Rahmen des durchschnittlichen Wissens und Könnens eines Peptidchemikers und hängt von den Unterschieden im Grad der Abspaltbarkeit der einzelnen Schutzgruppen ab. So sind Gruppen wie 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl (BpOC) und Trityl sehr labil und können schon in Gegenwart einer schwachen Säure abgespalten werden. Zur Abspaltung anderer Gruppen, wie tert.-Butyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl, ist eine mäßig starke Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, Trifluoressigsäure oder Bortrifluorid in Essigsäure erforderlich. Noch stärker saure Bedingungen sind nötig, um andere Schutzgruppen, wie Benzyloxycarbonyl, Halogenbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, Cycloalkoxycarbonyl und Isopropyloxycarbonyl abzuspalten. Die Abspaltung der letztgenannten Gruppen erfordert drastisch saure Bedingungen, zum Beispiel die Verwendung von Borwassserstoff, Fluorwasserstoff oder Bortrifluoracetat in Trifluoressigsäure. Unter den stärker sauren Bedingungen werden selbstverständlich auch die labileren Gruppen abgespaltn. Bei der Wahl der einzelnen Aminoschutzgruppen muß daher berücksichtigt werden, daß die Schutzgruppe an der alpha-Aminofunktion in Verbindung mit den Spaltungsbedingungen, die zur selektiven Entfernung allein der Schutzgruppe an der alpha-Aminofunktion angewandt werden, labiler ist als die epsilon-Aminoschutzgruppe. Deshalb ist R- vorzugsweise o-Chlorbenzyloxycarbonyl oder Cyclopentyloxycarbonyl, und in Verbindung damit ist die alpha-Aminoschutzgruppe der Wahl zur Verwendung für die einzelnen Aminosäuren, die an die Peptidkette angefügt werden, vorzugsweise tert.-Butyloxycarbonyl.

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Die Gruppen R- und R. bedeuten Wasserstoff oder Schutzgruppen für die alkoholischen Hydroxylgruppen von Threonin und Serin. Viele solcher Schutzgruppen sind in Kapitel 3 des oben zitierten Werks beschrieben. Einzelne Beispiele für solche Schutzgruppen sind C₁-C₄-AIkYl, wie. Methyl, Äthyl und tert.-Butyl; Benzyl; substituiertes Benzyl, wie p-Methoxybenzyl, p-Nitrobenzyl, p-Chlorbenzyl und o-Chlorbenzyl; C.-C^-Alkanoyl, wie Pormyl, Acetyl und Propionyl; und Triphenylmethyl (Trityl). Wenn R₃ und R- Schutzgruppen sind, dann ist die Schutzgruppe der Wahl in beiden Fällen Benzyl.

Die Gruppe R₅ bedeutet Wasserstoff oder eine Formylgruppe, die eine Schutzgruppe für die NH-Gruppe des Tryptophanrests darstellt. Die Verwendung einer solchen Schutzgruppe bleibt dem Belieben überlassen, weshalb R- genausogut Wasserstoff (N-ungeschützt) wie die Formylgruppe (N-geschützt) sein kann.

Die Gruppe X steht am Carboxylende der Tetradecapeptidkette und kann Hydroxyl sein, so daß sich eine freie Carboxylgruppe ergibt. X kann aber auch den festen Harzträger darstellen, an den das Carboxylende des Peptids während seiner Synthese gebunden ist. Dieses feste Harz kann durch folgende Formel wiedergegeben werden:

^Ha"

-0-CH —·_χ ^ ,·

In allen oben angegebenen Formeln stehen R, R₁, R_, R^, R₄ und R- für Wasserstoff, wenn X eine Hydroxylgruppe bedeutet. Wenn X dem festen Harzträger entspricht, dann sind die Reste R, R₁, R₂ 1 R3 und R^ Schutzgruppen.

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Es werden folgende Abkürzungen, von denen die meisten allgemein bekannt sind und gemeinhin benutzt werden, verendet:

AIa - Alanin

Asn - Asparagin

Cys - Cystein

GIy - Glycin

Lys - Lysin

Phe - Phenylalanin

Ser - Serin

Thr - Threonin

Trp - Tryptophan

VaI - Valin

DCC - N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid

DMF - Dimethylformamid

BOC - tert.-Butyloxycarbonyl

PMB - p-Methoxybenzyl

CBzOC - o-Chlorbenzyloxycarbonyl

CPOC - Cyclopen;yloxycarbonyl

BzI - Benzyl

For - FormyI

BpOC - 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl

Die Wahl der bei der Herstellung der Verbindungen der Formel I • zu verwendenden Schutzgruppen gehört zwar zum Durchschnittswissen jedes synthetisch arbeitenden Peptidchemikers, doch soll noch einmal darauf hingewiesen werden, daß sich die Wahl der Schutzgruppen nach den einzelnen aufeinanderfolgenden Reaktionen, die durchgeführt werden müssen, richtet. So muß die Schutzgruppe der Wahl eine Gruppe sein, die gegenüber den bei der nachfolgenden Stufe der Reaktionsfolge angewandten Reagentien und Bedingungen stabil ist. Beispielsweise muß, wie bereits oben bis zu einem gewissen Grad erörtert, die jeweils verwendete Schutzgruppe so beschaffen sein, daß sie unter den Bedingungen intakt bleibt, die bei

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der Abspaltung der alpha-Aminoschutzgruppe des endständigen Aminosäurerests des Peptidfragments zur Vorbereitung der Anknüpfung des nächstfolgenden Aminosäurefragments an die Peptidkette angewandt werden. Bei der Auswahl der Schutzgruppe ist ferner zu berücksichtigen, daß sie während des Aufbaus der Peptidkette intakt bleiben muß und sich nach Abschluß der Synthese des gewünschten Tetradecapeptids leicht entfernen läßt. Alle diese Forderungen sind aber dem durchschnittlichen Peptidchemiker vertraut und geläufig.

Wie aus dem bereits Gesagten klar geworden sein dürfte, kann das Tetradecapeptid der Formel I durch Festphasensynthese hergestellt werden. Diese Synthese besteht aus einem stufenweisen Aufbau der Peptidkette, der am C-Ende der Peptidkette beginnt. Zunächst wird Cystein durch Umsetzung von aminogeschütztem S-geschütztem Cystein mit einem chlorine thylierten Harz oder einem hydroxymethyliertem Harz mit seiner Carboxylfunktion mit dem Harz verknüpft. Die Herstellung eines Hydroxymethylharzes ist von Bodansky et al. in Chem. Ind. (London), Bd. 38, S. 1597 - 1598 (1966) beschrieben. Das chlormethylierte Harz ist im Handel erhältlich (Lab Systems, Inc., San Mateo, California, V.St.A.).

Zum Verknüpfen des C-Endes des Cysteins mit dem Harz wird das geschützte Cystein zunächst in sein Cäsiumsalz übergeführt. Diesas Salz wird dann nach der Methode von B. F. Gisin, HeIv. Chim. Acta, Bd. 56, S. 1476 (1973) mit dem Harz umgesetzt. Das Cystein kann aber auch durch Aktivierung seiner Caboxylfunktion nach bekannter Arbeitsweise mit dem Harz verknüpft werden. Beispielsweise kann man das Cystein in Gegenwart einer die Carboxylgruppe aktivierenden Verbindung, wie Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) mit dem Harz umsetzen.

Nach dem Verbinden der freien Carboxylgruppe des Cysteins mit dem Harzträger besteht der übrige Anteil des Aufbaus des Peptids in stufenweisem Anbau jeder Aminosäure an das N-Ende der Peptidkette. Diese Anfügung einer Aminosäure erfordert eine

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Abspaltung der alpha-Aminoschutzgruppe von der Aminosäure, die den N-Endteil des Peptidfragments darstellt, und danach das Anknüpfen des nächstfolgenden Aminosäurerests an das nun freie und reaktionsfähige N-Endteil. Die Abspaltung der alpha-Aminoschutzgruppe erfolgt in Gegenwart einer Säure, wie Bromwasserstoff säure, Chlorwasserstoffsäure, Trifluoressigsäure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Essigsäure unter Bildung des entsprechenden Säureadditionssalzes. Bei einer anderen bekannten Methode zur Abspaltung der Aminoschutzgruppe wird Bortrifluorid verwendet. Beispielsweise wird durch Bortrifluoriddiäthylätherat in Eisessig das aminogeschützte Peptidfragment in einen BF.,-Komplex übergeführt, der dann durch Behandlung mit einer Base, wie wäßrigem Kaliumbicarbonat, in das entblockierte Peptidfragment umgewandelt werden kann. Jede dieser Methoden kann angewandt werden, solange man darauf achtet, daß so gearbeitet werden muß, daß die Abspaltung der endständigen alpha-Aminoschutzgruppe ohne Einfluß auf die anderen an der Peptidkette vorliegenden Schutzgruppen bleibt. Zu diesem Zwecke ist es bevorzugt, die Abspaltung der Schutzgruppe am N-Ende mittels Trifluoressigsäure zu bewirken. Im allgemeinen wird die Abspaltung bei einer '
führt.

einer Temperatur von etwa O C bis Zimmertemperatur durchge-

Das nach der Abspaltung am N-Ende erhaltene Produkt liegt gewöhnlich in Form eines Säureadditionssalzes mit der Säure vor, die zum Abspalten der Schutzgruppe verwendet wurde. Das Produkt kann dann durch Umsetzung mit einer schwachen Base, zum Beispiel einem tertiären Amin, wie Pyridin oder Triäthylatnin, in die freie Aminoverbindung übergeführt werden.

Die Peptidkette ist dann in dem Zustand, in dem sie mit der nächstfolgenden Aminosäure umgesetzt werden kann. Dies kann nach jeder der verschiedenen bekannten Arbeitsweise geschehen. Zur Anlagerung der nächstfolgenden Aminosäure an das N-Ende der Peptidkette wird eine Aminosäure verwendet, die eine freie

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Carboxylgruppe aufweist, aber an der alpha-Aminofunktion sowie an etwa vorhandenen anderen aktiven Stellen geschützt ist. Die Aminosäure wird Bedingungen unterworfen, die die CarboxyIfunktion für die Anlagerungsreaktion aktivieren. Eine solche Aktivierungsnaßnahme, die. bei der Synthese angewandt werden kann, b;»3teht in der überführung der Aminosäure in ein gemischtes Anhydrid. Die freie CarboxyIfunktion der Aminosäure wird durch Umsetzung mit einer anderen Säure, zum Beispiel in Form ihres Säurechlorids, aktiviert. Beispiele solcher Säurechloride, die zur Ausbildung des gemischten Anhydrids verwendet werden können, sind Chlorameisensäureäthylester, Chlorameisensäurephenylester, Chlorameisensäure-sec.-butylester, Chlorameisensäurebutylester und Pivaloylchlorid..

Eine andere Methode der Aktivierung der Carboxylfunktion der .Aminosäure für die Anlagerung ist die der überführung der Aminosäure in ein aktives Esterderivat. Beispiele für solche aktiven Ester sind ein 2,4,5-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, p-Nitrophenylester und ein mit 1-Hydroxybenztriazol oder N-Hydroxysuccinimid gebildeter Ester. Eine weitere Methode zur Verknüpfung des C-Endes der Aminosäure mit dem Peptidfragment besteht darin, daß die Anlagerungsreaktion in Gegenwart wenigstens einer äquimolaren Menge Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) durchgeführt wird. Diese letztgenannte Methode wird für die Herstellung des Tetradecapeptids der Formel II, worin X

Harz

bedeutet, bevorzugt.

Wenn dann die gewünschte Aminosäuresequenz vorliegt, kann das Peptid von dem Harzträger entfernt werden. Hierzu wird das geschützte Harzträger-Tetradecapeptid mit Fluorwasserstoff behandelt. Dadurch wird das Peptid von dem Harz abgespalten. Außerdem werden dadurch jedoch alle noch vorhandenen Schutzgruppen

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an den reaktionsfähigen Stellen der Peptidkette sowie die alpha-Aminoschutzgruppe abgespalten, die an der Aminosäure am N-Ende vorliegt. Bei Verwendung von Fluorvasserstoff zur Abspaltung des Peptids von dem Harz sowie zur Entfernung der Schutzgruppen ist es bevorzugt, die Reaktion in Gegenwart von Anisol durchzuführen. Es hat sich gezeigt, daß die Gegenwart von Anisol die mögliche Alkylierung bestimmter, in der Peptidkette vorliegender Aminosäurereste inhibiert. Außerdem ist es bevorzugt, die Spaltung in Gegenwart von A'thylmercaptan durchzuführen. Das Äthylmercaptan dient zum Schutz das Indolrings des Tryptophanrestes und erleichtert außerdem die überführung der blockierten Cysteinreste in ihre Thiolformen. Falls R₅ eine Formylgruppe ist, fördert die Gegenwart von A'thylmercaptan außerdem die Abspaltung der Formylgruppe durch Fluorwasserstoff.

Das nach der Abspaltungsreaktion erhaltene Produkt ist ein geradkettiges Peptid mit 14 Aminosäureresten. Zur Erzielung des Endprodukts der Formel I muß das geradkettige Tetradecapeptid Bedingungen unterworfen werden, die zu seiner Oxydation führen, indem die beiden im Molekül vorliegenden Sulfhydrylgruppen, je eine an den Cysteinylanteilen, in eine Disulfidbrücke übergeführt werden. Dies kann durch Behandeln einer verdünnten Lösung des linearen Tetradecapeptids mit einem Oxydationsmittel, zum Beispiel Jod oder Kaliumferricyanid, erreicht werden. Der pH-Wert der Mischung liegt dabei im allgemeinen zwischen etwa 2,5 und 9,0, vorzugsweise zwischen etwa 7,O und 7,6. Die Konzentration der Lösung ist im allgemeinen nicht höher als etwa 0,4 mg Peptid/ml Lösung und liegt vorzugsweise bei etwa 50 ,ug/ml.

Die Verbindungen der Formel I können an warmblütige Säugetiere einschließlich Menschen in beliebiger Weise verabreicht werden, zum Beispiel oral, sublingual, subkutan, intramuskulär und intravenös. Die Verabreichung dieser Verbindungen inhibiert die Freisetzung von Wachstumshormun. Diese inhibitorische Wirkung ist in den Fällen von Vorteil, in denen das behandelte Lebewesen wegen einer übermäßigen Sekretion von Somatotropin

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einer therapeutischen Behandlung bedarf; eine derartige Sekretion ist mit krankhaften Zuständen, zum Beispiel juvenilem Diabetes und Acromegalie, verbunden. Die Verabreichung dieser Verbindungen führt außerdem zur Inhibierung der Sekretion von Magensäure, was in solchen Fällen von Vorteil ist, in denen das behandelte Lebewesen einer therapeutischen Behandlung von Ulcera bedarf; zur Inhibierung von exocriner Pankreassekretion, was für die Behandlung von Pankreatitis von Bedeutung ist; zur Inhibierung der Sekretion von Insulin und Glucagon und zur Verminderung der Darmmotilität, die bei der Gastrointestinalradiologie eine Rolle spielt. Der Dosierungsbereich für die sublinguale oder orale Verabreichung liegt vorzugsweise bei etwa 1 bis 100 mg/kg Körpergewicht und Tag. Bei intravenöser, subkutaner oder intramuskulärer Verabreichung liegen die Dosen im allgemeinen zwischen etwa 10 .ug und 1 mg/kg Körpergewicht und Tag und vorzugsweise zwischen etwa 50 und 1OO .ug/kg Körpergewicht und Tag. Es ist selbstverständlich, daß die Dosierung innerhalb eines weiten Bereichs schwankt, weil sie sich nach dem jeweils zu behandelnden Zustand und seinem Schweregrad richtet.

Die. Verbindungen der Formel I können auch in der Form von Tabletten, die andere unschädliche Bestandteile enthalten, verabreicht werden. Inerte Verdünnungsmittel oder Träger, zum Beispiel Magnesiumcarbonat oder Lactose, können zusammen mit herkömmlichen Zerfallniitteln, zum Beispiel Maisstärke und Alginsäure, und Gleitmitteln, wie Magnesiumstearat, verwendet werden. Die Menge des Trägers oder Verdünnungsmittels kann etwa 5 bis 95 %, vorzugsweise etwa 50 bis 85 %, des fertigen Präparats ausmachen. Auch Aromastoffe können verwendet werden, die das fertige Präparat für die Verabreichung geschmacklich verbessern.

Für die intravenöse Verabreichung der Verbindungen der Formel I können hierfür geeignete Träger verwendet werden, zum Beispiel isotone Kochsalzlösung oder Phosphatpufferlösung.

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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1

N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-cysteinyl(S-p-methoxybenzyl) methyliertes Polystyrolharz

Zu einer Suspension von 20,0 g chlormethyliertem Polystyrolharz (Lab Systems, Inc., 0,75 mMol/g) in 150 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) werden 3,7 g (7,8 mMol) des Cäsiumsalzes von N-tert.-Butyloxycarbonyl-(s-p-methoxybenzyl)-cystein gegeben. Die Mischung wird bei Zimmertemperatur 3 Tage gerührt. Dann wird das Harz abfiltriert und nacheinander mit DMF, einer Mischung aus 90 % DMF und 10 % Wasser und wieder mit DMF gewaschen. Das in DMF suspensdierte Harz wird mit einer Lösung von 5,5 g Cäsiumacetat in warmem DMF versetzt. Die Mischung wird über Nacht bei Zimmertemperatur, 8 Stunden bei 50 ⁰C, über Nacht bei Zimmertemperatur, 8 Stunden bei 50 C und drei Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wird das Harz abfiltriert und nacheinander mit DMF, einer Mischung aus 90 % DMF und 10 % Wasser, DMF, einer Mischung aus 90 % DMF und 10 % Wasser, DMF und 95-prozentigem Äthanol gewaschen. Danach wird das Harz im Vakuum bei 50 C getrocknet, wodurch das in der Überschrift genannte Produkt erhalten wird, das 0,45 % Stickstoff (O,32 mMol/g) und 0,80 % Schwefel (0,25 mMol/g) enthält.

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Beispiel 2

tert.-butyloxycarbonyl-L-alanyl-D-alanyl-L-(S-p-methoxybenzyl)-cysteinyl-L-(eyelopentyloxycarbonyl)-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-(N-cyclopentyloxycarbonyl)-lysyl-L-(O-benzyl)-threonyl-L-phenylalanyl-L-(O-benzyl)-threonyl-L-(O-benzyl)-seryl-L-(S-p-methoxybenzyl)-cysteinylmethyliertes Polystyrolharz

In ein Reaktionsgefäß werden 16,26 g des nach Beispiel 1 erhaltenen Produkts gegeben. Zur Anfügung jeder einzelnen Aminosäure an das Peptid wird eine Folge der Schutzgruppenentfernung, Neutralisation und Anknüpfung durchgeführt. Die ganze Anlagerungsfolge wird in einem automatischen Peptidsynthetisiergerät (Beckman 990) durchgeführt, wobei die einzelnen Aminosäuren in das Reaktionsgefäß eingeführt werden. Die verwendeten Aminosäuren und die Reihenfolge ihrer Anwendung sind wie folgt:

(1) N-tert.-Butyloxycarbonyl-(O-benzyl)-L-serin,

(2) N-tert.-Butyloxycarbonyl-(O-benzyl)-L-threonin,

(3) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin,

(4) N-tert.-Butyloxycarbonyl-(O-benzyl)-L-threonin,

(5) N^alpha-tert.-Butyloxycarbonyl-N^epsiIon-cyclopentyloxycarbonyl-L-lysin,

(6) N^alpha-tert.-Butyloxycarbonyl-D-tryptophan,

(7) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin,

(8) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin,

(9) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparagin-p-nitropheny!ester,

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(10) N^alpha-tert.-Butyloxycarbonyl-N^epsilon-cyclopentyloxycarbonyl-L-lysin,

(11) N-tert.-Butyloxycarbonyl-(S-p-methoxybenzyl)-L-cystein,

(12) N-tert.-Butyloxycarbonyl-D-alanin und

(13) H-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanin.

Schutzgruppenentfernung, Neutralisation, Anlagerung und erneute Anlagerung zur Einführung jeder einzelnen Aminosäure in das Peptid wird folgendermaßen durchgeführt: (1) drei Waschen (10,0 ml/g Harz) mit Chloroform jeweils 3 Minuten, (2) Entfernung der BOC-Gruppe durch zweimaliges jeweils 20 Minuten langes Behandeln mit 10,0 ml/g Harz einer Mischung aus 30 % Trifluoressigsaure, 65 % Chloroform und 5 % Triäthylsilan, (3) zwei Wäschen (10,0 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Chloroform, (4) eine Wäsche (10,0 ml/g Harz) von 3 Minuten mit Methylenchlorid,

(5) drei Waschen (10,0 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Butylalkohol und 1O % tert.-Amylalkohol,

(6) drei Wäschen (10,0 ml/g) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid, (7) Neutralisation durch drei Behandlungen von je 3 Minuten mit 10,0 ml/g Harz mit 3-prozentigem Triäthylamin in Methylenchlorid, (8) drei Wäschen (10,0 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid, (9) drei Waschen (10,O ml/g Harz) von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Butylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol, (10) drei Wäschen (10,0 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid, (11) Zugabe von O,8 mMol/g Harz der geschützten Aminosäure und von 0,8 mMol/g Harz an NfN'-Dicyclohexylcarbodiiinid (DCC) in 10,0 ml/g Harz Methylenchlorid und anschließendes Mischen während 120 Minuten, (12) drei Wäschen (10,0 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid, (13) drei Wäschen (10,0 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Butylalkohol und 1O % tert.-Amy!alkohol, (14) drei Wäschen (10,0 ml/g Harz) von je 3 Minuten

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mit Methylchlorid, (15) Neutralisation durch drei Behandlungen von je 3 Minuten mit 10,0 ml/g Harz eines 3-prozentigen Triäthylamins in Methylenchlorid, (16) drei Waschen (1O,O ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid, (17) drei Waschen (10,0 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Butylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol, (18) drei Waschen (10,0 ml/g Flarz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid, (19) drei Waschen (1O,O ml/g Harz) von je 3 Minuten mit DMF, (20) Zugabe von 0,8 mMol/g Harz der geschützten Aminosäure und 0,8 mMol/g Harz an Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 10,0 ml/g Harz einer 1:1-Mlschung von DMF mit Methylenchlorid und anschließendes Mischen während 120 Minuten, (21) drei Waschen (10,0 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit DMF, (22) drei Wäschen (10,0 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid, (23) drei Wäschen (10,0 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Butylalkohoi und 10 % text.-Amylalkohol, (2 4) drei Wäschen (10,0 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid, (2 5) Neutralisation durch drei Behandlungen von je 3 Minuten mit 10,0 ml/g Harz eines 3-prozentigen Triäthylamins in Methylenchlorid, (26) drei Waschen (10,0 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid, (27) drei Wäschen (10,0 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Butylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol und (28) drei Wäschen (10,0 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid.

Mit Ausnahme des Asparaginrestes wird jede Aminosäure durch die vorstehend beschriebene Folge von Maßnahmen eingeführt. Der Asparaginrest wird über seinen aktiven p-Nitrophenylester eingeführt. Dabei wird die Stufe 11 folgendermaßen modifiziert: (a) drei Waschen (7,5 bis 15 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit DMF, (b) Zugabe von 1,0 mMol/g Harz des p-Nitrophenylesters von N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparagin in 7,5 bis 15 ml/g Harz einer 1:1-Mischung von DMF mit Methylenchlorid und anschließendes Mischen während 720 Minuten und (c) drei Wäschen (7,5 bis 15 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit DMF. Die Stufe (20) wird genauso geändert mit der Ausnahme, daß in der Stufe (b) eine 3:1-Mischung von DMF mit Methylenchlorid verwendet wird.

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Die Aminosäureanalyse des Produkts unter Verwendung von Lysin als Standard ergibt folgende V7erte: Asn 1 ,01 , 2Thr 2,02, Ser 0,96, 2AIa 2,24, 3Phe 2,85, 2Lys 2,00, Trp 0,57. Cystein wurde nicht bestimmt, da es durch die Analysenmethode zerstört wird.

Beispiel 3

L-Alanyl-D-alanyl-L-cysteinyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cystein

Zu einer Mischung von 10 ml Anisol mit 10 ml Äthylmercaptan werden 2,25 g des nach Beispiel 2 erhaltenen geschützten Tetradecapeptidharzes gegeben. Die Mischung wird in flüssigem Stickstoff gekühlt, und dann werden 40 ml flüssiger Fluorwasserstoff durch Destillation eingeführt. Man läßt die gebildete Mischung sich auf 0 C erwärmen und rührt 1,5 Stunden. Dann wird der Fluorwasserstoff abdestilliert und Äther zu der hinterbleibenden Mischung gegeben. Die gebildete Festsubstanz wird abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das Produkt wird getrocknet, und das von Schutzgruppen befreite Tetradecapeptid wird mit 1m Essigsäure von dem Harz extrahiert. Die Essigsäurelösung wird unmittelbar danach im Dunkeln zur Trockne lyophylisiert. Der erhaltene weiße Feststoff wird in einer Mischung aus 15 ml 1 m Essigsäure und 5 ml Eisessig suspendiert. Die Reinigung des Produkts erfolgt durch Chromatographie an einer Sephadex G-25 F-Säu-Ie. Die Bedingungen der Chromatographie sind folgende: Lösungsmittel, von Gas befreite 0,2 m Essigsäure, Säulengröße 7,5 χ 150 cm, Temperatur 26 ⁰C, Fließgeschwindigkeit 700 ml/Stunde, Fraktionsvolumen 24,5 ml.

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Durch Auftragen der Absorption bei 2 80 m,u jeder Fraktion gegen die Nummer der Fraktion erhält man zwei Hauptspitzen mit mehreren kleineren Spitzen. Es werden 4 Fraktionsvereinigungen vorgenommen. Die Fraktionen, die vereinigt werden, und ihre Austrittsvolumina sind wie folgt:

Fraktionen 127 bis 189 (3087 - 46 30 ml)

Fraktionen 190 bis 199 (4631 - 4875 ml)

Fraktionen 200 bis 212 (4876 - 5194 ml)

Fraktionen 213 bis 310 (5195 - 7595 ml)

Die vier Proben werden im Dunkeln zur Trockne lyophylisiert. Die UV-Spektroskopie zeigt, daß die dritte Probe (140,4 mg) das beste Produkt ist.

Beispiel 4

2 8 Oxydation zu D-AIa , D-Trp -Somatostatln

18 mg des nach Beispiel 3 erhaltenen reduzierten D-AIa ,

D-Trp -Somatostatins werden in 70 ml 1 m Essigsäure gelöst. Das UV-Spektrum der so erhaltenen Lösung ergibt eine Konzentration von 200 .ug/ml. Die Lösung wird mit 210 ml destilliertem Wasser verdünnt, so daß eine Konzentration von 50 »ug/ml erhalten wird. Zur Einstellung des pH-Werts der Mischung auf 8,1 wird konzentriertes Ammoniumhydroxid zugegeben. Die Lösung wird 24 Stunden im Dunkeln bei Zimmertemperatur gerührt, wonach eine Ellman-Titration zeigt, daß die Oxydation vollständig ist. Die Mischung wird mit 3 ml Eisessig angesäuert und zur Trockne lyophilisiert.

Die erhaltene Festsubstanz wird in 5 ml von Sauerstoff befreiter 0,2 m Essigsäure gelöst. Die Lösung wird an einer Sephadex G-25 F-Säule adsorbiert. Die Bedingungen der Chromatographie sind folgende: Lösungsmittel, von Sauerstoff befreite 50 %-ige Essigsäure, Säulengröße 5,0 χ 90 cm, Temperatur 26 ⁰C, Fließgeschwindigkeit 343 ml/Stunde, Fraktionsvolumen 20 ml.

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Durch Auftragen der Absorption jeder Fraktion bei 280 m,u gegen die Fraktionsnummsr werden zwei große Spitzen erhalten. Die erste Spitze entspricht aggregierten Formen des Produkts, und die zweite Spitze entspricht gutem monomeren Produkt. Das Produkt der zweiten Spitze wird gesammelt, mit destilliertem Wasser verdünnt und zur Trockne lyophylisiert. Der erhaltene Feststoff wird in 12 ml von Gas befreiter 0,2 m Essigsäure gelöst, und die Lösung wird auf eine Cephadex G-25 F-Säule aufgebracht. Die Chromatographiebedingungen sind folgende: Lösungsmittel: entgaste 0,2 m Essigsäure; Säulengröße: 5,0 x 150 cm; Temperatur: 26 ⁰C; Flii 516 ml/h; Fraktionsvolumen: 17,2 ml.

5,0 χ 150 cm; Temperatur: 26 ⁰C; Fließgeschwindigkeit:

Durch Auftragen der Absorption bei 280 m.u jeder Fraktion gegen die Nummer der Fraktion erhält man eine große Spitze mit einigen niedrigen Schultern. Die UV-Spektroskopie zeigt, daß die große Spitze dem Produkt in guter Beschaffenheit entspricht. Die Fraktionen 150 bis 173 werden vereinigt (Austrittvolumina von 2 563 bis 29 77 ml) und im Dunkeln zur Trockne lyophylisiert. Auf diese Weise werden 44,56 mg des ge-

2 8 wünschten Produkts der Formel I, D-AIa , D-Trp -Somatostatin erhalten. Das Produkt wird mit einer Probe des gleichen Produkts vereinigt, das bei einer parallel durchgeführten Oxy-

2 dation unter Verwendung des gleichen reduzierten D-AIa ,

D-Trp -Somatostatins erhalten worden ist.

Optische Drehung /alpha/^ = -39,9° (1%, Essigsäure).

Aminosäureanalyse: AIa + D-AIa_{1 gQ} Cys_{Q 89} LyS_{1 Q} Asn_{Q Q} ^PheO,96 ^PheO,96 ^D"^TrP0,96 ^³I ,0 ^ThrO,89 ^PheO,96 ^ThrO,89 ^SerO,79

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Beispiel 5

N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-(D-(O-benzyl)-seryl-L-(S-pmethoxybenzyl) -cysteinyl-L-(N^{eps on}-o-chlorbenzyloxycarbonyl) lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-(formyl)-tryptophyl-L-(N^{ep n}-o-chlorbenzyloxycarbonyl)-lysyl-L-(O-benzyl)-threnoyl-L-phenylalanyl-L-(O-benzyl-threnoy1-L-(O-benzyl)-seryl-L-(S-p-methoxybenzyl)-cysteinyl-methyliertes Polystyrolharz

1O,O g des nach Beispiel 1 erhaltenen Produkts werden in das Reaktionsgefäß eines automatischen Peptidsynthetisiergeräts (Beckman 990) gegeben, und 11 der restlichen 13 Aminosäuren werden unter Verwendung dieses Geräts angefügt). Das erhaltene geschützte Dodecapeptidharz wird in drei gleiche Teile aufgeteilt, und einer dieser Teile wird zur Anfügung der letzten zwei Reste verwendet. Die verwendeten Aminosäuren und die Reihenfolge ihrer Anwendung sind wie folgt:

(1) N-tert.-Butyloxycarbonyl-(O-benzyl)-L-serin,

(2) N-tert.-Butyloxycarbonyl-(O-benzyl)-L-threonin,

(3) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin,

(4) N-tert.-Butyloxycarbony1-(O-benzyl)-L-threonin,

(5) N^alpha-tert.-Butyloxycarbonyl-N^epsilon-o-chlorbenzyloxycarbony1-L-lysin,

(6) N^{a p a}-tert.-Butyloxycarbonyl-N-formyl-D-tryptophan,

(7) N-tert.-Butyloxycarbony1-L-phenylalanin,

(8) N-tert.-Butyloxycarbony1-L-phenylalanin,

(9) N-tert.-Butyloxycarbony1-L-asparagin-p-nitrophenylester,

(10) N^alpha-tert.-Butyloxycarbonyl-N^epsilon-o-chlorbenzyloxycarbony 1-L- lysin,

(11) N-tert.-Butyloxycarbonyl-(S-p-methoxybenzyl)-L-cystein,

(12) N-tert.-Butyloxycarbonyl-(O-benzyl)-D-serin und

(13) N-tert.-Butyloxycarbony1-L-alanin.

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Schutzgruppenentfernung, Neutralisation, Anlagerung und erneute Anlagerung zur Einführung jeder einzelnen Aminosäure in das Peptid wird folgendermaßen durchgeführt: (1) drei Wäschen (10 ml/g Harz) mit Chloroform jeweils 3 Minuten, (2) Entfernung der BOC-Gruppe durch zweimaliges jeweils 20 Minuten langes Behandeln mit 10 ml/g Harz einer Mischung aus 29 % Trifluoressigsäure, 48 % Chloroform, 6 % Triäthylsilan und 17 % Methylenchlorid, (3) zwei Waschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Chloroform, (4) eine Wäsche (10 ml/g Harz) von 3 Minuten mit Methylenchlorid, (5) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Butylalkohol + 10 % tert.-Amylalkohol, (6) 3 Waschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid, (7) Neutralisation durch drei Behandlungen von je 3 Minuten mit 10 ml/g Harz von 3-prozentigem Triäthylamin in Methylenchlorid, (8) drei Waschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid, (9) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Butylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol, (10) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid, (11) Zugabe von 1,0 mMol/g Harz der geschützten Aminosäure und von 1,0 mMol/g Harz an Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 10 ml/g Harz Methylenchlorid und anschließendes Mischen während 120 Minuten, (12) drei Waschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid, (13) drei Waschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Butylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol, (14) drei Waschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid, (15) Neutralisation durch drei Behandlungen von je 3 Minuten mit 10 ml/g Harz eines 3-prozentigen Triäthylamins in Methylenchlorid, (16) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid, (17) drei Waschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Butylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol, (18) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid, (19) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit DMF,

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(20) Zugabe von 1,0 mMol/g Harz der geschützten Aminosäure und 1,0 mMol/g Harz an !!,N'-Dicyclohexylcarbodiitnid (DCC) in 10 ml/g Harz einer 1:1-Mischung von DMF mit Methylenchlorid und anschließendes Mischen während 120 Hinuten, (21) drei Waschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit DMF, (22) drei Waschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid, (23) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Butylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol, (24) drei Waschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid,

(25) Neutralisation durch drei Behandlungen von je 3 Minuten mit 10 ml/g Harz eines 3-prozentigen Triäthylamins in Methylenchlorid, (26) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je 3-Minuten mit Methylenchlorid, (27) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Dutylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol und (28) drei Waschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit Methylenchlorid.

Mit Ausnahme des Asparaginrestes wird jede Aminosäure durch die vorstehend beschriebene Folge von Maßnahmen eingeführt. Der Asparaginrest wird über seinen aktiven p-Nitrophenylester eingeführt. Dabei wird die Stufe 11 folgendermaßen modifiziert: (a) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit DMF, (b) Zugabe von 1,0 mMol/g Harz des p-Nitrophenylesters von N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparagin in 10 ml/g Harz einer 1:3 Mischung von DMF mit Methylenchlorid und anschließendes Mischen während 720 Minuten und (c) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je 3 Minuten mit DMF. Die Stufe (20) wird so geändert, daß der p-Nitrophenylester von N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparagin in einer 3:1 Mischung von DMF mit Methylenchlorid verwendet und anschließend 720 Minuten gemischt wird.

Das fertig ausgebildete Peptidharz wird im Vakuum getrocknet. Ein Teil davon wird durch Erwärmen in einer Mischung aus konzentrierter Salzsäure und Dioxan (1:1) zum Sieden unter Rück-

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fluß während 21 Stunden hydrolysiert. Die Aminosäuraanalyse das Produkts unter Verwendung von Lysin als Standard ergibt folgende Werte: Asn 1,17, 2Thr 2,28, 2Ser 2,12, AIa 1,22, 3Phe 2,94, 2Lys 2,00, Trp 0,74.

Die Tryptophanhydrolysemischung wird mit Dimethylsulfoxid versetzt. Cystein wird nicht bestimmt, da es durch die Analysenmethode zerstört wird.

Beispiel 6

L-Alanyl-D-seryl-L-cysteinyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cystein

Zu einer Mischung von 5 ml Anisol mit 5 ml Äthylmercaptan werden 2,805 g (Substitutionswert 0,149 mMol/g) des nach Beispiel 5 erhaltenen geschützten Tetradecapeptidharzes gegeben. Die Mischung wird in flüssigem Stickstoff gekühlt, und dann werden 56 ml flüssiger Fluorwasserstoff durch Destillation eingeführt. Man läßt die gebildete Mischung sich auf 0 ⁰C erwärmen und rührt 2 Stunden. Dann wird der Fluorwasserstoff abdestilliert und Äther wird zu der hinterbleibenden Mischung gegeben. Die Mischung wird auf 0 C abgekühlt und die gebildete Festsubstanz wird abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das Produkt wird getrocknet, und das von Schutzgruppen befreite Tetradecapeptid wird mit 1m Essigsäure und einer kleinen Menge Eisessig von dem Harz extrahiert. Die Essigsäurelösung wird danach im Dunkeln zur Trockne lyophylisiert. Der erhaltene weiße Feststoff wird in einer Mischung aus 10 ml entgaster 0,2 m Essigsäure und 4 ml Eisessig suspendiert. Die Suspension wird erwärmt, wobei jedoch keine vollständige Lösung erfolgt. Nach Abfiltrieren vom Unlöslichen wird das klare, schwachgelbe FiI-trat auf eine Sephadex G-25 F-Säule aufgebracht. Die Bedingungen

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der Chromatographie sind folgende: Lösungsmittel, von Gas befreite 0,2 m Essigsäure, Säulengröße 7,5 χ 150 cm, Temperatur 26 ⁰C, Fließ«
volumen 22,O ml.

tür 26 ⁰C, Fließgeschwindigkeit 629 ml/Stunde, Fraktions-

Durch Auftragen der Absorption bei 2 80 m,u jeder Fraktion gegen die Nummer der Fraktion erhält man eine Hauptspitze mit einer darauf folgenden Schulter. Die UV-Spektroskopie zeigt, daß die Hauptspitze gutes Produkt ist. Die Fraktionen, die vereinigt werden, und ihre Austrittsvolumina sind wie folgt:

Fraktionen 235 bis 260 (5148 - 5720 ml, Spitze = 5496 ml).

Diese vereinigten Fraktionen umfassen die nachfolgende Schulter nicht. Die UV-Spektroskopie zeigt, daß 2 37 mg des Produkts vorliegen (Ausbeute 34/0 %). Eine Ellman-Titration ergibt einen Gehalt an freiem Sulfhydryl von 82,4 % der Theorie.

Beispiel

2 8 Oxydation zu D-Ser , D-Trp -Somatostatin

572 ml (Theorie 2 37 mg Produkt) der Lösung des reduzierten D-Ser~-D-Trp -Somatostatins (nach Beispiel 6) werden mit 120 ml 0,2 m Essigsäure und 4040 ml destilliertem Wasser verdünnt, so daß eine Konzentration von 50 -ug/ml erhalten wird. Zur Einstellung des pH-Werts der Mischung auf 6,8 wird konzentriertes Ammoniumhydroxid zugegeben. Die Lösung wird 41 Stunden im Dunkeln bei Zimmertemperatur gerührt, wonach eine Ellman-Titration zeigt, daß die Oxydation vollständig ist.

Die Mischung wird im Vakuum auf ein Volumen von etwa 10 ml eingeengt. Das Konzentrat wird mit 10 ml Eisessig verdünnt und dann an einer Sephadex G-25 F-Säule chromatographiert. Die Bedingungen der Chromatographie sind folgende: Lösungs-

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mittel, von Gas befreite 50 %-ige Essigsäure, Säulengröße 5,0 x 90 cm, Temperatur 2 6 ⁰C, Fl:
Stunde, Fraktionsvolumen 16,3 ml.

5,0 x 90 cm, Temperatur 26 ⁰C, Fließgeschwindigkeit 252 ml/

Durch Auftragen der Absorption jeder Fraktion bei 2 80 m.u gegen die Fraktionsnummer werden zwei große Spitzen erhalten. Die erste Spitze entspricht monomerem Produkt. Das Material der zweiten Spitze (Fraktionen 5 4 bis 68, 890 - 1142 ml) wird gesammelt und im Dunkeln zur Trockne lyophylisiert. Der erhaltene Feststoff wird in 15 ml entgaster 0,2 m Essigsäure gelöst und auf eine Sephadex G-2 5 F Säule aufgebracht. Die Bedingungen der Chromatographie sind: Lösungsmittel, entgaste 0,2 m Essigsäure; Säulengröße: 5,Ox 150 cm; Temperatur: 26 ⁰C; Fließgeschwindigkeit: 477 ml/h; Fraktionsvolumen: 16,7 ml.

Durch Auftragen der Absorption jeder Fraktion bei 280 m ,u gegen die. Fraktionsnummer erhält man eine große Spitze mit einer Schulter an der Frontseite. Die US-Spektroskopie zeigt an, daß die Hauptspitze gutem Produkt entspricht. Die Fraktionen bis 170 (Austrittsvolumen von 2572 bis 2839 ml, Spitze = 2664 ml) werden vereinigt und im Dunkeln zur Trockne lyophylisiert. Die UV-Spektroskopie ergibt 70,2 mg des gewünschten Produkts (Ausbeute ausgehend von der reduzierten Form: 29,6 %).

Optische Drehung ^alpha/_ = -4 3,4 ° (1 %, Essigsäure) . Aminosäureanalyse: AIa₀₉₉ 2Se^ _6Q

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Die vorstehenden Ergebnisse sind als Verhältnisse zu (AIa + Lys)/3 -1,0 ausgedrückt. Es werden die folgenden drei Hydrolysen von 21 Stunden Dauer durchgeführt:

(1) in Gegenwart von Dimethylsulfoxid zur Oxydation von Cystein zu Cysteinsäure;

(2) Thioglycolsäure wird abgefangen;

(3) ohne Mittel zum Abfangen oder Oxydieren.

Alle oben angegebenen Werte sind Mittelwerte der drei Hydrolysen mit Ausnahme der folgenden:

Cys und Ser; nur (1) und (3);

D-Trp; nur (2);

Phe; nur (2) und (3).

Beispiel 8

N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-D-valyl-L-(S-p-methoxybenzyl)-cysteinyl-L-(N ^ -o-chlorbenzyloxycarbonyl)-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-(formyl)-tryptophyl-L-(N^{ep n}-o-chlorbenzyloxycarbonyl)-lysyl-L-(O-benzyl)-threonyl-L-phenylalanyl-L-(O-benzyl)-threonyl-L-(O-benzyl)-seryl-L-(S-pmethoxybenzyl)-cysteinyl-methyliertes Polystyrolharz

10,0 g des nach Beispiel 1 erhaltenen Produkts werden in das Reaktionsgefäß eines Beckman 990 Peptidsynthetisiergeräts eingebracht/ und 11 der restlichen 13 Aminosäuren werden unter Verwendung dieses automatischen Geräts angefügt. Das erhaltene geschützte Dodecapeptidharz wird in drei gleiche Teile aufgeteilt, und unter Verwendung eines dieser Teile werden die letzten beiden Reste angefügt. Die verwendeten Aminosäuren sowie die Reihenfolge ihrer Anfügung sind wie folgt:

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(1) N-tert.-Butyloxycarbonyl-(O-benzyl)-L-serin,

(2) N-tert.-Butyloxycarbonyl-(O-benzyl)-L-threonin,

(3) N-tert.-Butyloxycarbony1-L-phenylalanin,

(4) N-tert.-Butyloxycarbonyl-(O-benzyl)-L-threonin,

(5) N^alpha-tert.-Butyloxycarbonyl-N^epsilon-o-chlorbenzyloxycarbony 1-L- Iy s in,

(6) N ^p -tert.-Butyloxycarbonyl-(N-formyl)-D-tryptophan,

(7) N-tert.-Butyloxycarbony1-L-phenylalanin,

(8) N-tert.-Butyloxycarbony1-L-phenylalanin,

(9) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparagin-p-nitrophenylester,

(10) N^alpha-tert.-Butyloxycarbonyl-N^epsilon-o-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysin,

(11) N-tert.-Butyloxycarbony1-(S-p-methoxybenzyl)-L-cystein,

(12) N-tert.-Butyloxycarbony1-D-valin und

(13) N-tert.-Butyloxycarbony1-L-alanin.

Die Reihenfolge der Entfernung der Schutzgruppen, Neutralisation, Anfügung und erneuten Anfügung für die Einführung jeder Aminosäure in das Peptid ist wie folgt:

(1) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit Chloroform,

(2) Entfernung der BOC-Gruppe durch zweimalige Behandlung von je 20 Minuten mit 10 ml/g Harz einer Mischung aus 29 % Trifluoressigsäure, 48 % Chloroform, 6 % Triäthylsilan und 17 % Methylenchlorid. _ - _ ■-

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~~ 27U9877

(3) zwei Wäschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit Chloroform,

(4) eine Wäsche (10 ml/g Harz) von drei Minuten mit Methylenchlorid,

(5) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Butylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol ,

(6) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit Mathylenchlorid,

(7) Neutralisation durch drei Behandlungen von je drei Minuten mit 10 ml/g Harz 3-prozentigen Triäthylamins in Methylenchlorid,

(8) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit Methylenchlorid,

(9) drei Waschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Butylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol,

(10) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit Methylenchlorid,

(11) Zugabe von 1,0 mMol/g Harz der geschützten Aminosäure und 1,O mMol/g Harz N,N'-Dicyclihexylcarbodiimid (DCC) in 10 ml /g Harz Methylenchlorid und anschließendes Mischen während 120 Minuten,

(12) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit Methylenchlorid,

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~ * ~ 27U9877

(13) drei Waschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Butylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol /

(14) drei Waschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit Methylenchlorid,

(15) Neutralisation durch drei Behandlungen von je drei Minuten mit 10 ml/g Harz 3-prozentigem Triäthylamin in Methylenchlorid,

(16) drei Waschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit Methylenchlorid,

(17) drei Waschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Butylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol,

(18) drei Waschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit Methylenchlorid,

(19) drei Waschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit DMF,

(20) Zugabe von 1,0 mMol/g Harz der geschützten Aminosäure und 1,0 mMol/g Harz N^'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 10 ml/g Harz einer 1:1-Mischung aus DMF und Methylenchlorid und anschließendes Mischen während 120 Minuten,

(21) drei Waschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit DMF,

(22) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit Methylenchlorid,

(23) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Butylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol,

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27U9877

(24) drei Wäschen (1O ml/g Harz) von je drei Minuten mit Methylenchlorid,

(25) Neutralisation durch drei Behandlungen von je drei Minuten mit 10 ml/g Harz 3-prozentigem Triäthylamin in Methylenchlorid,

(26) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit Methylenchlorid,

(27) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit einer Mischung aus 90 % tert.-Butylalkohol und 10 % tert.-Amylalkohol und

(28) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit Methylenchlorid.

Die. obige Behandlungsfolge wird zur Anfügung jeder Aminosäure mit Ausnahme des Asparaginrests angewandt. Dieser Rest wird über seinen aktiven p-Nitrophenylester angefügt. Dabei wird Stufe 11 zu folgender Dreistufenfolge modifiziert:

(a) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit DMF,

(b) Zugabe von 1,0 mMol/g Harz des p-Nitrophenylesters von N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparagin in 10 ml/g Harz einer 1:3-Mischung aus DMF und Methylenchlorid und anschließendes Mischen für 720 Minuten und

(c) drei Wäschen (10 ml/g Harz) von je drei Minuten mit DMF.

Auch die Stufe 20 wird derart modifiziert, daß der p-Nitrophenylester von N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparagin in einer 3:1-Mischung aus DMF und Methylenchlorid verwendet und anschließend 720 Minuten gemischt wird.

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Das fertige. Peptidharz wird im Vakuum getrocknet. Ein Teil des Produkts wird durch 72-stündiges Sieden unter Rückfluß in einer 1:!-Mischung aus konzentrierter Salzsäure und Dioxan hydrolysiert. Die Aminosäureanalyse des erhaltenen Produkts unter Verwendung von Lysin als Standard liefert folgende Ergebnisse: Asn 1,25, 2Thr 2,64, Ser 1,16, AIa 1,30, VaI 1,14, 3Phe 3,66, 2Lys 2,00, Trp 0,77.

Diroethylsulfoxid wird zu dem Tryptophanhydrolysegemisch gegeben. Cystein wird nicht bestimmt, da es bei der Analysenmethode zerstört wird.

Beispiel 9

L-Alanyl-D-valyl-L-cysteinyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cystein

Zu einer Mischung aus 5 ml Anisol und 5 ml Äthylmercaptan werden 2,70 g (Substitutionswert 0,151 mMol/g) des nach Beispiel 8 erhaltenen geschützten Tetradecapeptidharzes gegeben. Die Mischung wird in flüssigem Stickstoff gekühlt, und 54 ml flüssiger Fluorwasserstoff werden durch Destillation eingeführt. Man läßt sich die erhaltene Mischung auf 0 °C erwärmen und rührt 2 Stunden. Dann wird der Fluorwasserstoff abdestilliert, und Ähter wird zu der hinterbleibenden Mischung gegeben. Die Mischung wird auf 0 ⁰C abgekühlt, und die gebildete feste Substanz wird abfiltriert und mit Äther gewaschen. Das Produkt wird getrocknet, und das ungeschützte Tetradecapeptid wird aus der Harzraischung unter Verwendung von 1 m Essigsäure extrahiert. Die Essigsäurelösung wird sofort im Dunkeln zur Trockne lyophylisiert. Der erhaltene weiße Feststoff wird in einer Mischung aus 10 ml entgaster 0,2 m Essigsäure und 4 ml Eisessig suspendiert. Die Suspension wird erwärmt, doch erfolgt keine vollständige Lösung. Nach Abfiltrieren des Unlöslichen wird das klare schwachgelbe Filtrat auf eine Sephadex G-25 F-Säule aufgebracht. Die Bedingungen der

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Chromatographie sind: Lösungsmittel: entgaste 0,2 m Essigsäure; Säulengröße: 7,5 χ 150 cm; Temperatur: 26 ⁰C; Fließgeschwindigkeit: 628 ml/h; Fraktionsvolumen: 22,0 ml.

Durch Auftragen der Absorption jeder Fraktion bei 2 80 m.u gegen die Fraktionsnummer erhält man eine große breite Spitze mit einer anschließenden Schulter. Die UV-Spektroskopie zeigt an, daß es sich bei der Hauptspitze um gutes Produkt handelt. Die Fraktionen, die vereinigt wurden, und ihre. Austrittsvolumina sind folgende:

Fraktionen 233-262 (5104-5764 ml, Spitze « 5499 ml)

Die vereinigten Fraktionen umfassen nicht die nachfolgende Schulter. Die UV-Spektroskopie zeigt die Gegenwart von 176 mg Produkt (Ausbeute 25,7 %). Eine Ellman-Titration eines Anteils ergibt einen freien Sulfhydrylgehalt von 76,7 % der Theorie.

Beispiel 10

2 8 Oxydation zu D-VaI ,D-Trρ -Somatostatin

2 8 660 ml der Lösung des reduzierten D-VaI ,D-Trp -Somatostatins (theoretisch 176 mg), die nach Beispiel 9 erhalten worden ist, wird mit destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 50 .ug/ml verdünnt. Zur Einstellung des pH-Werts der Mischung auf 6,7 wird konzentriertes Ammoniumhydroxid zugegeben. Die Lösung wird 64 Stunden bei Zimmertemperatur im Dunkeln gerührt, wonach eine Ellman-Titration die Vollständigkeit der Oxydation anzeigt.

Die Mischling wird im Vakuum auf ein Volumen von etwa 10 ml eingeengt. Das Konzentrat wird mit 10 ml Eisessig verdünnt und dann an einer Sephadex G-2 5 F-Säule entsalzen. Die Bedingungen der Chromatographie sind folgende: Lösungsmittel: entgaste 50-prozentige Essigsäure; Säulengröße: 5,0 χ 90 cm; Temperatur: 26 '
17,0 ml.

tür: 26 ⁰C; Fließgeschwindigkeit: 255 ml/h; Fraktionsvolumen:

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27Ü9877

Die gegen die Fraktionsnummer aufgetragene Absorption jeder Fraktion bei 280 m,u ergibt zwei große Spitzen. Die erste Spitze entspricht den aggregierten Formen des Produkts, und die zweite Spitze entspricht monomerem Produkt. Das Material der zweiten Spitze (Fraktionen 48-65, 799-1105 ml) wird gesammelt und im Dunkeln zur Trockne lyophylisiert. Die erhaltene feste Substanz wird in 15 ml entgaster 0,2 m Essigsäure gelöst und auf eine Sephadex G-25 F-Säule aufgebracht. Die Bedingungen der Chromatographie sind folgende: Lösungsmittel: entgaste 0,2 m Essigsäure; Säulengröße: 5,0 χ 150 cm; Temperatur: 26 ⁰C; Fießgeschwindigkeit: 503 ml/h; Fraktionsvolumen: 17,6 ml.

Die Absorption jeder einzelnen Fraktion bei 2 80 m.u wird gegen die Fraktionsnummer aufgetragen und ergibt eine große Spitze mit einer Schulter an der Frontseite. Die UV-Spektroskopie ergibt, daß der Hauptteil der Spitze gutem Produkt entspricht. Die Fraktionen 149 bis 165 (Austrittsvolumina von 2605-2904 ml, Spitze = 2652 ml) werden vereinigt und im Dunkeln zur Trockne lyophylisiert. Die UV-Spektroskopie ergibt 55,6 mg des gewünschten Produkts (Ausbeute, bezogen auf die reduzierte Form: 31,6 %)

Die erhaltene feste Substanz wird in 6 ml 50-prozentiger Essigsäure gelöst und erneut an einer Sephadex G-2 5 F-Säule chromatograhiert. Die Bedingungen der Chromatographie sind folgende: Lösungsmittel: entgaste 50-prozentige Essigsäure; Säulengröße: 2,5 χ 180 cm; Temperatur: :
Fraktionsvolumen: 8,98 ml.

2,5 χ 180 cm; Temperatur: 2 6 ⁰C; Fließgeschwindigkeit: 53,9 ml/h;

Die Absorption jeder Fraktion bei 2 80 m.u wird gegen die Fraktionsnummer aufgetragen und ergibt eine große Spitze. Die mittleren Anteile dieser Spitze (Fraktionen 55 bis 61, 485-548 ml, Spitze = 531 ml) werden gewonnen und im Dunkeln zur Trockne lyophylisiert. Die UV-Spektroskopie zeigt das Vorliegen von 49,2 mg Produkt in der Probe (Rückgewinnung 88,5 %).

Optische Drehung /alpha/ = -52,2° (1 %, Essigsäure).

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* 27U9877

Aminosäureanalyse: Ala 0,98, VaI 0,80, 2Cys 1,76, 2Lys 2,02, Asn 1,0, 3Phe 2,85, Trp 1,03, 2Thr 1,86, Ser 0,78.

Die vorstehenden Ergebnisse sind als Verhältnisse zu (AIa + Lys)/3 =1,0 ausgedrückt. Es werden folgende zwei 21-stündige■Hydrolysen durchgeführt:

(1) in Gegenwart von Dimethylsulfoxid zur Oxydation von Cystein zu Cysteinsäure;

(2) ohne Abfang- oder Oxydationsmittel.

Der Trp-Wert wird durch UV-Spektroskopie ermittelt. Alle anderen oben angegebenen Werte sind Mittelwerte der beiden Hydrolysen mit Ausnahme von Phe, das nur aus der zweiten Hydrolyse ermittelt wird.

2 8

D-AIa , D-Trp -Somatostatin wird auf seine Wirksamkeit der Inhibierung der Magensäuresekretion geprüft. 12 bis 16 cm große Ochsenfrösche werden durch Zerschneiden des Rückenmarks getötet. Die Magenschleimhaut wird von den Muskelschichten befreit und der Länge nach in zwei Teile zerschnitten, die in voneinander getrennten Kammern aus Acrylkunststoff befestigt werden. Die ausgesetzte Sekretionsfläche beträgt 2,85 cm , und das Volumen jeder Hälfte der Kammer 5 ml. Die zum Befeuchten der Schleimhaut verwendeten Lösungen sind die gleichen wie die von Durbin et al., Biochemica et Biophysics, Acta, Bd. 321, S. 553 - 560 (1973) verwendeten, mit der Ausnahme, daß die Serumflüssigkeit Natriumdihydrogenphosphat in einer Konzentration von 1 mMol enthält. Beide Seiten der Kammer werden mit einer Mischung aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid belüftet. Unter Aufrechterhaltung eines pH-Werts der Sekretionslösung von 4,5 wird die Säuresekretionsgeschwindigkeit verfolgt.

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Eine Konzentration von 1 χ 10 Mol/Liter Pentagastrin auf der serösen Seite des Gewebes dient zur Stimulierung der Säuresekretionswirkung. Die seröse Flüssigkeit wird alle 40 Minuten erneuert, um eine Erniedrigung der Pentagastrinkonzentration durch enzymatische Hydrolyse der Peptidbindungen zu verhindern. Die Zugabe der zu prüfenden Verbindung erfolgt durch Einbringen in die seröse Flüssigkeit jedesmal, wenn die Benetzungslösung gewechselt wird.

Spontane Säureausscheidungen infolge der pentagastrinstimulierten Sekretion, die zu einer Säurebildung von nicht weniger als 8 Mikroäquivalenten/Stunde führen, dienen als Kontrollen. Die Wirkung der Inhibierung der Magensäuresekretion wird als Prozentsatz der Inhibisrung ausgedrückt, die auf die Kontrollzeiträume vor dem Einführen der zu prüfenden Verbindung in den serösen Puffer bezogen ist. Nur eine der Hälften der Mangenschleimhaut wird mit der Testverbindung behandelt, während die andere Hälfte als Kontrolle dafür dient, daß das Gewebe dauernd lebend bleibt. Nach dem Einstellen einer gleichbleibenden Sekretion wird die Testverbindung der Nährlösung in einer Menge zugegeben, mit der eine Inhibitorkonzentration von 1 χ 10~ Mol/Liter erreicht wird. Die Säure wird kontinuierlich auf pH 4,5 titriert, und das alle 20 Minuten eingesetzte Volumen von 12,5 mMol Natriumhydroxid dient zur Bestimmung der Säuresekretionsgeschwindigkeit. Die Ergebnisse sind als Mikroäquivalente sekretierter Säure pro Stunde ausgedrückt.

Unter Anwendung dieser Bewertungsmethode erzeugt Somatostatin selbst eine prozentuale Inhibierung der MagensäureSekretion von

2 8

54,64 + 6,05, wohingegen D-AIa , D-Trp -Somatostatin eine prozentuale Inhibierung der Magensäuresekretion von 78,10 + 6,21 erzeugt.

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D-Ser ,D-Trp -Somatostatin und D-VaI ,D-Trp -Somatostatin werden unabhängig voneinander auf ihre in vivo-Inhibierung der Magensäuresekretion an Hunden geprüft. Bei 2 Gruppen von je 6 Hunden mit chronischer Fistel und Heidenhain-Beutel wird durch Infusion des C-abgeschlossenen Tetrapeptide von Gastrin bei einer Konzentration von 0/5 .ug/kg und Stunde Magensalzsäuresekretion induziert. Jeder Hund dient als seine eigene Kontrolle, indem er an einem einzelnen Tag nur das Tetrapeptid erhält. An einem anderen Tag erhalten die Hunde das Tetrapeptid, und eine Stunde nach der stetigen Sekretion

2 8
von HCl wird D-Ser , D-Trp -Somatostatin bei 0,20 /ug/kg und Stunde eine Stunde infusiert, und der anderen Gruppe von Hunden

2 ft werden eine Stunde lang 0,2 5 /Ug/kg D-VaI ,D-Trp -Somatostatin infusiert. Das Sammeln von Magensäureproben wird mit Zwischenräumen von 15 Minuten weitere 1,5 Stunden fortgesetzt. Die Proben werden mit einem automatischen Titriergerät auf pH 7 titriert. Die höchste inhibitorische Wirkung des D-Ser , D-Trp -Somatostatins wird gegen die Dosiswirkungskurve von Somatostatin extrapoliert, und die relative Wirkungsstärke des Analogons zu der von Somatostatin wird als prozentuale Aktivität ausgedrückt.

2 8
D-Ser ,D-Trp -Somatostatin inhibiert die durch das C-abgeschlossene Tetrapeptid von Gastrin induzierte Säuresekretion in gleichbleibendem Zustand um 73,5 + 4,3 %. Diese Wirkung ist der von 0,545 #ug/kg und Stunde von Somatostatin äquivalent. Sie beträgt somit 273 % der Wirkung von Somatostatin. In gleicher

2 Weise wird die maximale inhibitorische Wirkung von D-VaI ,D-Trp Somatostatin gegen die Dosiswirkungskurve von Somatostatin extrapoliert, und die relative Wirkungsstärke des Analogons im Vergleich zu der von Somatostatin wird als prozentuale Wirkung aus-

2 8
gedrückt. D-VaI ,D-Trp -Somatostatin inhibiert die durch das C-abgeschlossene Tetrapeptid von Gastrin induzierte Säuresekretion in konstant bleibendem Zustand um 61,9 + 3,4 %. Diese Wirkung ist der von 0,324 ,ug/kg und Stunde Somatostatin äquivalent und beträgt somit 130 % der von Somatostatin.

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2 8 2 8

D-Ser , D-Trp -Somatostatin und D-VaI , D-Trp -Somatostatin werden auch auf ihre Wirkung auf die Darmmotilität an bei Bewußtsein befindlichen Hunden geprüft. Zwei Gruppen von je drei Hunden mit intraluminalen Kathetern in Antrum, Duodenum und Pylorus werden eingesetzt. Druckänderungen im Darmlumen erscheinen auf einem Visicorder unter Verwendung von Dehnungsmessern und Kleinstlichtstrahlgalvanometern. Nach dem Einstellen einer gleichbleibenden Zustandskontrolle erfolgt 10 Minuten

2 8 lange intravenöse Infusion von D-Ser ,D-Trp -Somatostatin an

2 8 eine Gruppe von Hunden und von D-VaI ,D-Trp -Somatostatin an eine andere Gruppe von Hunden. Beide Verbindungen erhöhen zunächst den intraluminalen Druck im Pylorus und senken ihn dann, wohingegen der Druck im Duodenum und im Antrum während der ganzen Prüfung erniedrigt bleibt. Die minimale wirksame Dosis, die zur Erhöhung des Pylorusdrucks und zur Erniedrigung des Duodenum- und Antrumdrucks erforderlich ist, liegt bei größer als O,05

2 8 bis kleiner als 0,125 ,ug/kg und 10 Minuten für D-Ser ,D-Trp Somatistatin und bei größer als 0,125 bis kleiner als 0,25 /Ug/kg

2 8

und 10 Minuten für D-VaI ,D-Trp -Somatostatin. Diese Werte stehen einer minimalen wirksamen Dosis von 0,125 bis 0,25 /Ug/kg und 10 Minuten für Somatostatin selbst gegenüber.

OQ Ο Q

D-Ser ,D-Trp -Somatostatin und D-VaI ,D-Trp -Somatostatin inhibieren außerdem die Pankreassekretion. Bei zwei Gruppen von je drei Hunden mit Pankreas- und Gesamtmagenfisteln wird die Pankreassekretion durch Infusion von Sekretin bei 2 Einheiten/kg und Stunde und von Cholecystokinin bei 0,45 Einheiten/kg und Stunde und die Magensalzsäuresekretion durch Infusion von Tetragastrin bei 0,5 /Ug/kg und Stunde induziert. Nach dem Einstellen eines gleichbleibenden Zustands erhält jeder Hund in einer

ο ο

Gruppe D-Ser , D-Trp -Somatostatin eine Stunde lang in einer Menge von 0,2 ,ug/kg, und jeder Hund in der anderen Grupoe er-

2 ' 8

hält D-VaI , D-Trp -Somatostatin eine Stunde in einer Menge von 0,25 ,ug/kg. Die Spitzeninhibitorwirung, ausgedrückt als prozentuale Veränderung gegenüber der Kontrolle, beträgt für Gesamt-

2 8
protein -76 % für D-Ser ,D-Trp -Somatostatin und -72 % für

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2 8
D-VaI ,D-Trp -Somatostatin. Dies entspricht dem inhibitorischen Effekt, der durch Verabreichung von etwa 0,5 bis 0,6 .ug/kg und Stunde Somatostatin erzielt wird.

2 8 2 8

D-Ser ,D-Trp -Somatostatin und D-VaI ,D-Trp -Somatostatin werden auch auf ihre Wirksamkeit hinsichtlich der Freisetzung von Wachstumshormon geprüft. Die hierfür angewandte Arbeitsweise wird unter Verwendung von männlichen Spraque-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 100 bis 12Og (Laboratory Supply Company, Indianapolis, Indiana) durchgeführt. Der Test ist eine Modifikation der Methode von P. Brazeau, W. VaIe und R. Guilleman, Endocrinology, Bd. 94, S. 184 (1974). Bei dieser Prüfung werden für jede Verbindung fünf Gruppen von je 8 Ratten eingesetzt. An alle Ratten wird intraperitoneal Natriumpentobarbital verabreicht, um die Wachstumshormonsekretion zu stimulieren. Für jede Verbindung dient eine Gruppe als Kontrolle und erhält nur Salzlösung. Zwei der Gruppen für jede Verbindung erhalten Somatostatin, die eine 2 ,ug/Ratte subkutan und die andere 50 /ig/Ratte subkutan. Die beiden anderen Gruppen für jede Ver-

2 8 2 8

bindung erhalten D-Ser ,D-Trp -Somatostatin bzw. D-VaI ,D-Trp Somatostatin, eine Gruppe 2 .ug/Ratte subkutan und die andere Gruppe 50 .ug/Ratte subkutan. Die Serumkonzentration an Wachstumshormon wird 20 Minuten nach der gleichzeitigen Verabreichung von Natriumpentobarbitan und Testverbindung bestimmt. Das Ausma3 der Inhibierung der Serumwachstumshormonsekretion wird dann bezüglich der Kontrollgruppen ermittelt, und die relativen

2' 8 2 8

Wirksamkeiten von D-Ser ,D-Trp -Somatostatin, D-VaI ,D-Trp Somatostatin und Somatostatin selbst werden verglichen.

2 8 Bei einer Dosis von 2 ,ug/Ratte hat D-Ser ,D-Trp -Somatostatin

die gleiche Wirkung auf die Wachstumshormonsekretion wie Somatostatin, dessen Wirkung im Bereich von 0 bis 45 % Inhibierung der Wachstumshormonsekretion gegenüber einer Kontrolle liegt. In einer Dosis von 50 ^ug/Ratte inhibiert D-Ser²,D-Trp⁸-Somatostatin die Wachstumshormonsekretion um 66 % gegenüber der Kontrolle. Bei einer Dosis von 2 .ug/Ratte inhibiert

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2 8

D-VaI ,D-Trp -Somatostatin die Zunahme der Wachstumshormonsekretion um 21 % gegenüber der Kontrolle, wohingegen Somatostatin keine Wirkung auf die. Zunahme der Wachstumshormonsekre-

2 tion hat. In einer Dosis von 50 »ug/Ratte inhibiert D-VaI ,

8
D-Trp -Somatostatin die Zunahme der Wachstumshormonsekretion um 88 % gegenüber der Kontrolle. Somatostatin führt zu einer Inhibierung von 64 bis 80 %.

2 8 2 8

D-Ser ,D-Trp -Somatostatin und D-VaI ,D-Trp -Somatostatin werden noch auf ihre in vivo-Aktivität der Inhibierung der Glucagon- und Insulinsekretion nach Stimulierung mit L-AIanin geprüft. Normale mischrassige Hunde beiderlei Geschlechts werden über Nacht ohne Futter belassen. Nach Abnehmen einer Blutprobe zur Kontrolle wird mit der intravenösen Infusion

2 8

von Salzlösung, Somatostatin, D-Ser ,D-Trp -Somatostatin bzw.

2 8
D-VaI ,D-Trp -Somatostatin begonnen. 30 Minuten später wird L-Alanin zusätzlich intravenös 15 Minuten lang verabreicht.

2 8 Die Infusion von Salzlösung, Somatostatin, D-Ser ,D-Trp -

2 8
Somatostatin bzw. D-VaI ,D-Trp -Somatostatin wird nach dem Ende der L-Alanininfusion noch 15 Minuten fortgesetzt. Die Infusion von L-Alanin verursacht einen abrupten Anstieg der Serumkonzentration von Glucagon und Insulin, die nach dem Ende der L-Alanininfusion auf die Kontrollkonzentration absinkt. Der vorstehend beschriebene Versuch zeigt, daß die

2 8 minimal wirksame Konzentration von D-Ser ,D-Trp -Somatostatin etwa 25 ng/kg/min und die minimal wirksame Konzentra-

2 8
tion von D-VaI ,D-Trp -Somatostatin etwa 194 ng/kg/min beträgt, wohingegen die minimal wirksame Konzentration von Somatostatin 100-200 ng/kg/min beträgt.

2 8
D-VaI ,D-Trp -Somatostatin wird auch bezüglich seiner in vivo-Wirksamkeit der Inhibierung der Glucagonsekretion nach dem Stimulieren mit Insulin bewertet. Normale mischrassige Hunde beiderlei Geschlechts werden über Nacht ohne Futter belassen. Nach dem Entnehmen von Kontrollblutproben wird mit einer intravenösen

2 8

Infusion von Salzlösung, Somatostatin bzw. D-VaI ,D-Trp -Somatostatin begonnen. Nach 15 Minuten werden intravenös 0,3 Einheiten/kg Insulin injiziert. Die Infusion von Salzlösung, Somatostatin bzw. der Testverbindung wird zwei Stunden fortgesetzt,

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und während des gesamten Tests v/erden zu verschiedenen Zeitpunkten Blutproben entnommen. Die Gesamtdosis des Somatostatins bzw. der Testverbindung liegt im Bereich von 120 bis 260 .ug/Hund (0,07 bis 0,13 ,ug/kg/min). Die Verabreichung von Insulin führt zu einer Verminderung der Glycosekonzentration im Blut und einer Erhöhung der Glucagonkonzentration im Serum. Die Infusion von Somatostatin blockiert die Erhöhung der Glucagonkonzentration im Serum, hat aber keinerlei Einfluß auf die Verringerung der Glucosekonzentration im Blut.

2 8 Wenn zum Vergleich anstelle von Somatostatin D-VaI , D-Trp Somatostatin mit einer Geschwindigkeit von 0,109 .ug/kg/rain infusiert wird, ergibt sich eine teilweise Inhibierung des Anstiegs der Glucagonkonzentration im Serum, der durch Insulinhypoglykämie verursacht war.

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Claims (15)

Patentansprüche

1. Verbindung der Formel

H-L-Ala-Y-L-Cys-L-Lys-Z-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-

Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH, Formel I,

worin Y D-AIa, D-Ser oder D-VaI und Z L-Asn oder L-AIa bedeuten, und ihre pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß in ihrer Formel Y D-AIa und Z L-Asn bedeutet.

3. Verbindung nach Anspruch 1/ dadurch gekennzeichnet , daß in ihrer Formel Y D-Ser und Z L-Asn bedeutet.

4. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß in ihrer Formel Y D-VaI und Z L-Asn bedeutet.

5. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das entsprechende geradkettlge Tetradecapeptid der Formel III,

H-L-Ala-Y-L-Cys-L-Lys-Z-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH,

worin Y und Z die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben, mit einem Oxydationsmittel umgesetzt wird.

709837/0861 original inspected

6. Zwischenprodukt für das Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch die Formel

R-L-Ala-Y-L-Cys(R₁)-L-Lys(R₂)-Z-L-Phe-L-Phe-D-Trp(R₅)-L-Lys(R₃) L-Thr(R₃)-L-Phe-L-Thr(R₃)-L-Ser(R₄)-L-CyS(R₁)-X, Formel II,

worin bedeuten:

Y D-AIa, D-Ser(R₄) oder D-VaI,

Z L-Asn oder L-AIa,

R Wasserstoff oder eine alpha-Amino-Schutzgruppe,

R₁ Wasserstoff oder eine Thio-Schutzgruppe,

R_ Wasserstoff oder eine epsilon-Amino-Schutzgruppe,

R, und R., Wasserstoff oder eine Hydroxyschutzgruppe,

R₅ Viasserstoff oder eine Formylgruppe und

X eine Hydroxylgruppe oder die Gruppe

in der "Harz" für Polystyrol steht,

wobei die einzelnen Reste R, R₁, R-/ R₃* R₄ und R₅ Wasserstoff bedeuten, wenn X eine Hydroxylgruppe ist, und die anderen oben angegebenen Bedeutungen haben, wenn X für die Gruppe

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-0-CH ~

Harz

steht.

7. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß in ihrer Formel X eine Hydroxylgruppe bedeutet.

8. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß in ihrer Formel R eine tert.-Butyloxycarbony!gruppe bedeutet.

9. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dai
p-Methoxybenzy!gruppe bedeutet.

kennzeichnet , daß in ihrer Formel R₁ eine

10. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß in ihrer Formel R_ eine Cyclopentyloxycarbony!gruppe bedeutet.

11. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß ii
benzyloxycarbony!gruppe bedeutet.

kennzeichnet , daß in ihrer Formel R_ eine o-Chlor-

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-Xf -

12. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß in ihrer Formel R, und R. Benzy!gruppen bedeuten.

13. Verbindung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß in ihrer Formel Y D-AIa und Z L-Asn bedeuten.

14. Verbindung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß in ihrer Formel Y D-Ser und Z L-Asn bedeuten.

15. Verbindung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß in ihrer Formel Y D-VaI und Z L-Asn bedeuten.

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