DE2517141C2

DE2517141C2 - Verfahren zum Messen der Verformbarkeit von mikroskopischen Objekten, insbesondere von roten Blutkörperchen und Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens

Info

Publication number: DE2517141C2
Application number: DE2517141A
Authority: DE
Inventors: Marcel Bessis; Narla Paris Mohandas
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1974-05-10
Filing date: 1975-04-18
Publication date: 1986-07-31
Also published as: FR2270557B1; US3955890A; FR2270557A1; JPS5812541B2; DE2517141A1; JPS50156495A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen der Verformbarkeit von in einer Flüssigkeit suspendierten mikroskopischen Objekten, insbesondere von roten Blutkörperchen oder anderen lebenden Zellen gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Es ist bekannt, daß die Verformbarkeit von roten Blutkörperchen eine wesentliche Rolle spielt bei und für die Erfüllung ihrer Aufgaben und für ihre Lebensdauer und daß ferner diese Verformbarkeit den Gesundheitszustand des Trägers solcher Blutkörperchen beeinflußt.

Es ist ihre Verformbarkeit, die diese Zellen, die in der Regel kreisförmig sind und einen Durchmesser von etwa 8 μ haben, befähigt, sich durch kapillare Blutgefäße hindurchzubewegen, deren Durchmesser etwa 2 bis 3 μ beträgt. Wenn ihre Verformbarkeit beeinträchtigt ist, werden die Zellen angehalten und zerstört.

Es sind bereits zahlreiche Verfahren zum Messen der Verformbarkeit von roten Blutkörperchen vorgeschlagen worden. Man kann insbesondere so arbeiten, daß der Unterdruck gemessen wird, der erforderlich ist, um einen Teil der Membran der Blutkörperchen in eine Mikropipette (Leblond R — The discocyteechinocyte transformation of the human red cell: deformability characteristics. Nouv. Rev. fr. Hemat. 12, 815. 1972) eintreten zu lassen, oder man kann die Verlängerung messen, die an einer Fläche anhaftende Zellen unter dem Einfluß einer strömenden Flüssigkeit erleiden (Bull B. — Red cell biconcavity and deformability. A macromodel based on flow chamber observations. Nouv. Rev. Fr. Hemat

ίο 12,835,1972) oder kann schließlich auch die Zeit ermitteln, die eine bestimmte Anzahl von Blutkörperchen braucht, um ein Filter mit geeichten Mikroporen zu passieren (Gregersen M. I, Bryant C. A, Hammerle W. E., Usami S, Chien S.-Flow characteristics of human erythrocytes trough polycarbonate sieves. -Science 157, 825,1967).

In dem älteren deutschen Patent 24 05 839 wird eine weitere Anordnung zum Messen der Flexibiliät von roten Blutkörperchen vorgeschlagen, bei der jedes einzel-

ne Blutkörperchen durch eine enge öffnung hindurchgedrückt wird. Während der Passage durch die enge öffnung unterbricht das rote Blutkörperchen einen optischen Lichtstrahl, so daß die Passagezeit mit Hilfe einer opto-elektrischen Meßvorrichtung automatisch bestimmt werden kann.

Abgesehen von der an zweiter und vierter Stelle genannten Meß-Methode haben alle diese Methoden den Nachteil, daß die auf die Zellen einwirkenden Kräfte nicht einwandfrei definiert sind. Bei der oben erwähnten zweiten Methode hängt die Verformung der Zellen in gewissem Umfang von der Art und Weise ab, in der sie an der Unterlage haften. Außerdem muß die Längung jeder Zelle einzeln gemessen werden. Die Gewinnung statistischer Daten über eine Zellpopulation erfordert bei den Methoden zwei und vier einen erheblichen Zeitaufwand.

Es ist ferner bekannt, zur Untersuchung der Verformungen von roten Blutkörperchen eine Flüssigkeitsprobe, in der diese Blutkörperchen suspendiert sind, zwisehen zwei koaxial liegende Wände zu bringen, die mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten um ihre gemeinsame Achse gedreht werden, etwa zwischen die Wände eines Rotations-Viskosimeters mit koaxialen Zylindern. Mit dieser Methode lassen sich die Tangentialkräfte genau bestimmen, denen die Blutkörperchen infolge des Gradienten der Drehgeschwindigkeit ausgesetzt sind. Auch hier erfolgt aber die Messung der Verformung einzeln nach Festlegung der Zelle und Beobachtung im Elektronenmikroskop und erfordert somit viel Zeit (Schmidt-Schönbein H., Wells. R — Fluid drop-like transition of erythrocytes under shear. Science 165, 288, 1969).

Schließlich wurde die mittlere Größe sehr kleiner Objekte, etwa von Staubteilchen oder Tröpfchen auch schon nach einer auf optischer Beugung beruhenden Methode bestimmt. Diese Methode wurde auch bereits zur Bestimmung des mittleren Durchmessers von roten Blutkörperchen angewendet. Diese Methode läßt sich aber nur unter statischen Verhältnissen einsetzen, wenn die untersuchten Objekte ihre Abmessungen nicht ändern und praktisch kreis- oder kugelförmig sind (A. Tzanck, M. Bessis.- Un nouvel hemo-diffractometre, — SA NG, Band XVI11, n" 2,1947, pages 71-76-).
Nun hat sich folgendes gezeigt:

Wenn eine Population mikroskopischer Objekte, die in einem Raum nach einer Zufalls-Verteilung angeordnet sind, unter der Wirkung äußerer Kräfte ihre Form und Abmessungen in statistisch übereinstimmender

Weise ändert, so spiegeln die entstehenden Beugungsringe diese Form- und Abmessungsänderungen wider. Wenn die untersuchte Probe ein Gemisch von mehreren unterschiedlichen Populationen enthält, stellen die entstandenen Ringe eine Kombination der Ringe dar,, die von jeder der Populationen einzeln hervorgerufen sein würden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Durchführung von kontinuierlich und leicht ausführbaren, genauen Messungen zu schaffen, die Aufschluß über die Verformbarkeit einer Population mikroskopischer Objekte liefern.

Gemäß der Erfindung wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß durch die Flüssigkeit ein paralleles "Lichtstrahlenbündel genau senkrecht zu dieser gemeinsamen Zylinderachse geleitet wird, daß ferner die von den mikroskopischen Objekten erzeugte Beugungsfigur optisch abgebildet wird, und daß die Formänderungen der Beugungsfigur in Abhängigkeit von der Geschwindigkeitsdifferenz der beiden Wände ermittelt werdend

Das erfindungsgemäße Meßverfahren stellt eine Kombination der Methode der Verformung durch einen Geschwindigkeits-Gradienten und der Auswertung der Beugungsfiguren dar. Auf diese Art und Weise erhält man eine genaue, einfache und kontinuierliche Messung der Verformbarkeit der untersuchten Objekte.. Da es sich hierbei um eine statistische Messung handelt, wird außerdem unmittelbar der Mittelwert für eine große Zahl von Objekten geliefert. Wenn die untersuchte Probe ein Gemisch aus mehreren Populationen von Objekten mit unterschiedlichen Merkmalen darstellt, so läßt sich das sofort aus dem Bild der Beugungsringe erkennen und man erhält schnell die für jede der Populationen kennzeichnenden Merkmale.

Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des genannten Verfahrens besteht darin, daß dieselbe aufweist einen abgeschlossenen Raum mit zwei zylindrischen, gegeneinander verdrehbaren, transparenten Koaxialwänden, ferner eine Einrichtung, mit der diesen Wänden unterschiedliche Drehgeschwindigkeiten um eine gemeinsame Achse verliehen werden, ferner eine Quelle für monochromatische kohärente Strahlung, eine Einrichtung, die ein aus dieser Quelle stammendes, paralleles Strahlenbündel herstellt und es genau senkrecht zur gemeinsamen Achse durch die Kammer richtet, und schließlich eine Einrichtung zum Beobachten und/oder Aufzeichnen der von diesen mikroskopischen Objekten im Unendlichen gelieferten Beugungsfigur;

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der in der Zeichnung schematisch dargestellten beispielsweisen Ausführungsform einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens näher erläutert.

Die einzige Figur ist ein schematischer Vertikalschnitt durch ein Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zur Ausübung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Die Vorrichtung besteht aus einem mechanischen Teil, der auf die zu untersuchenden mikroskopischen Objekte genau definierte und genau meßbare Kräfte einwirken läßt, und aus einem optischen Teil, mit dem die an diesen Objekten unter der Einwirkung von Kräften auftretende Verformung erkennbar gemacht wird.

Der mechanische Teil hat einen abgeschlossen Raum, der von einem Innenzylinder 1 und einem koaxial dazu angeordneten Außenzylinder 2 begrenzt ist. Zumindest die Seitenwände der Zylinder sind durchsichtig.

Bei der dargestellten besonders einfachen Ausführungsform ist der Innenzylinder 1 feststehend angeordnet. Der Außenzylinder 2 läßt sich mit an sich bekannten und daher nicht besonders dargestellten Mitteln in vorgegebene, einstellbare Geschwindigkeiten in Umlauf um eine, beiden Zylindern gemeinsame Achse versetzen. Es ist aber auch möglich, beide Zylinder um ihre gemeinsame Achse auf einer feststehenden Halterung mit unterschiedlichen Drehgeschwindigkeiten umlaufen zu lassen.

Der Innenzylinder kann beispielsweise einen Außendurchmesser R von etwa 25 mm erhalten.

ίο Der von den seitlichen Wänden — der Außenwand des Zylinders 1 und der Innenwand des Zylinders 2 — begrenzte Ringraum 6 hat in radialer Richtung die Breite h, die weniger als 1 mm beträgt und vorzugsweise zwischen 0,3 und 0,5 mm gewählt wird.

Das optische Meßsystem umfaßt eine Quelle für monochromatische kohärente Strahlung. Bei dem gezeichneten Ausführungsbeispiel kann das eine Laserlichtquelle sein, die ein feines Parallel-Strahlenbündel aussendet, das genau senkrecht auf die gemeinsame Achse der Zylinder 1 und 2 auftrifft.

Ein Umlenkungssystem lenkt das Strahlenbündel in Normalenrichtung auf die die beiden seitlichen Koaxialwände der beiden Zylinder, so daß es den Ringraum 6 in Richtung eines Radius durchsetzt Dieses Umlenksystern kann beispielsweise aus zwei totalreflektierenden Prismen 4 und 5 bestehen, die an einer Halterung 11 befestigt sind, die ihrerseits von dem Innenzylinder 1 getragen wird. Die Halterung 11 hat einen koaxial zu den Zylindern 1 und 2 liegenden Zylinderabschnitt 12, der das Strahlenbündel auf seiner Bahn parallel zu der Achse führt.

Schließlich enthält das optische System auch noch eine außerhalb der Zylinder gelegene Beobachtungsvorrichtung, die beispielsweise aus einem sammelnd wirkenden Objektiv 7 besteht, in dessen Brennebene die lichtempfindliche Platte einer photographischen Kamera oder ein Aufzeichnungsgerät 10 steht. Außerdem ist ein wegklappbarer Spiegel 8 vorgesehen, der das austretende Strahlenbündel auf einen Beobachtungsschirm zu richten vermag. Eine derartige Vorrichtung ermöglicht die Erzeugung einer im Unendlichen entstehenden Beugungsfigur, die im Endlichen von den mit parallelem Licht beleuchteten mikroskopischen Objekten erzeugt wird.

Die dargestellte Vorrichtung arbeitet wie folgt, wobei der Einfachheit halber angenommen wird, daß es sich bei den zu untersuchenden mikroskopischen Objekten um rote Blutkörperchen handelt:

Die die Blutkörperchen in Suspension enthaltende Blutprobe wird in den Ringraum 6 gebracht. Dazu reicht eine sehr kleine Lösungsmenge, z. B. etwa 0,2 ml, aus. Damit man nicht mit übermäßig hoher Drehgeschwindigkeit arbeiten muß, wird der Lösung zur Erhöhung der Viskosität vorzugsweise eine bestimmte Menge Glukose oder Dextran hinzugefügt. Danach wird die Lösung isotonisch gemacht und gepuffert, damit ein pH-Wert von etwa 7,4 erreicht wird.

Nun wird der Laser eingeschaltet und auf dem Schirm 9 die Beugungsfigur beobachtet. Dabei stehen die Zylinder 1 und 2 still. In den meisten Fällen besteht die Beugungsfigur aus aufeinander folgenden dunklen und hellen konzentrischen Kreisringen, die eine zentrale helle Krei£<-cheibe umgeben. Gemessen wird der Durchmesser des ersten dunklen Kreisrings.

Man versetzt sodann den Außenzylinder 2 in eine Drehung mit vorgegebener Geschwindigkeit. Im einfachsten Fall, bei dem die Probe aus einer einzigen Population von untereinander gleichen Individuen besteht.

beaobachtet man, wie die Ringe die Form von Ellipsen annehmen, an denen man beispielsweise die Länge der großen und kleinen Hauptachsen bestimmen kann. Diese Form der Beugungsfigur ist eine Folge der unter der Wirkung der Kräfte, die auf die roten Blutkörperchen von der Flüssigkeit ausgeübt werden, in der sie suspendiert sind, ebenfalls im wesentlichen elliptischen Verformung der roten Blutkörperchen.

Die Abplattung der Ellipse nimmt mit der Drehgeschwindigkeit des Außenzylinders 2 zu. Wird der Außenzylinder wieder angehalten, so nehmen die Beugungsringe wieder ihre Kreisgestalt an.

Um eine Maßzahl für die Verformbarkeit der Blutkörperchen zu gewinnen, geht man wie folgt vor:

Einerseits wird für jede Drehgeschwindigkeit die Tangentialkraft, die die Flüssigkeit wegen ihrer Viskosität und wegen des radialen Geschwindigkeitsgradienten ausübt, berechnet nach der Formel:

_ TjvNR

in welcher μ die Viskosität der Flüssigkeit und N die Umdrehung des Außenzylinders 2 in der Minute angeben.

Diese Formel ist in dem hier beschriebenen einfachen Fall anwendbar, bei dem der Innenzylinder 1 festgehalten wird. In dem allgemeineren Fall, in dem der Außenzylinder mit dem Radius R\ und der Innenzylinder mit dem Radius Ri mit den zugeordneten Drehzahlen N\ und N₂ in Drehung versetzt werden, ist die folgende Formel anzuwenden:

_ 2π
^r=^-6Ö-

Rj-N₂R₂

praktisch nicht verformbaren Individuen, stellt man fest, daß die bei ruhenden Zylindern runden Ringe bei bewegten Zylindern Kreisabschnitte und Ellipsenabschnitte aufweisen. Auf diese Weise kann man nicht nur Gemisehe von Populationen feststellen, sondern kann auch die Verformbarkeit jeder der Populationen nach der oben angegebenen Methode messen.

Es sind zahlreiche Ausführungsvarianten denkbar. So kann man beispielsweise mit zwei Laser-Lichtbündeln

ίο unterschiedlicher Wellenlänge arbeiten, um Beugungsringe zu erzeugen, die farbig erscheinen und daher leichter auszumessen sind. Die Laserstrahlungs-Quelle kann durch eine Punktlicht-Quelle mit nachgeschalteter Parallelisierungs-Optik ersetzt werden. Anstelle der Prismen 4 und 5 können auch Spiegel verwendet werden.

Andererseits ergibt sich die Verformung der Blutkörperchen folgendermaßen:

Der Ruhedurchmesser do der nicht verformten Blutkörperchen ist aus der bekannten Formel

, 1,22/i/"

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

abzuleiten, in der A die Wellenlänge des benutzten Liehtes, ao der Durchmesser des ersten dunklen Ringes und f die Brennweite des Objektives 7 ist.

Man kann andererseits die elliptisch verformten Blutkörperchen durch die Größe einer der Achsen, beispielsweise der großen Achse d„ kennzeichnen, die mit der großen Achse a„ des ersten elliptischen Beugungsringes durch eine der vorhergehenden Formel analoge Formel verknüpft ist. Auf diese Weise ergibt sich die Verformung:

Die Verformbarkeit der Blutkörperchen läßt sich durch die Beziehung zwischen der Verformung und der angewandten Kraft bei ein und derselben Drehgeschwindigkeit bestimmen. Nach dieser Methode lassen sich also die Änderungen dieser Verformbarkeit in Abhängigkeit von der einwirkenden Kraft sehr schnell ermitteln.

Wenn die Probe mehrere unterscheidbare Populationen enthält, zum Beispiel eine erste Population aus verformbaren Individuen und einer zweiten PoDulation aus

Claims

25 Yl 141 Patentansprüche:

1. Verfahren zum Messen der Verformbarkeit von in einer Flüssigkeit suspendierten mikroskopischen Objekten, insbesondere von roten Blutkörperchen, bei dem diese zwischen zwei koaxial angeordnete transparente zylindrische Wände gebracht werden und diesen Wänden um ihre gemeinsame Achse unterschiedliche Drehgeschwindigkeiten erteilt werden, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Flüssigkeit ein parallel gerichtetes Lichtstrahlen-Bündel (3) genau senkrecht zur gemeinsamen Zylinderachse geleitet wird, daß die von den mikroskopischen Objekten erzeugte Beugungsfigur optisch abgebildet wird, und daß die Formänderungen der Beugungsfigur in Abhängigkeit von dem Geschwindigkeitsunterschied der beiden koaxialen Wände (1, 2) ermittelt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in die Flüssigkeit eine die Viskosität derselben erhöhende Substanz eingegeben wird, beispielsweise Glukose oder Dextran.

3. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 oder 2, enthaltend eine abgeschlossene Kammer mit zwei zylindrischen, gegeneinander verdrehbaren, transparenten Koaxialwänden, ferner Einrichtungen, mit denen diesen Wänden unterschiedliche Drehgeschwindigkeiten um die gemeinsame Achse verliehen werden, gekennzeichnet durch eine Quelle für monochromatische kohärente Strahlung und eine Einrichtung, die ein aus dieser Quelle stammendes, paralleles Strahlenbündel (3) erzeugt und es genau senkrecht zur gemeinsamen Achse durch die Kammer (6) richtet, und schließlich durch eine Einrichtung (7,8,9,10) zum Beobachten und/oder Aufzeichnen der von den mikroskopischen Objekten im Unendlichen gelieferten Beugungsfigur.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Breite des zwischen den beiden Wänden eingeschlossenen Ringraumes in radialer Richtung maximal 1 mm beträgt.