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Unlöslich gemachte Glucoseisomerase.
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Die vorliegende erfindung bezieht sich auf eine unlöslich gemachte
Glucoseisanerase und insbesondere auf eir1e Glucoseisomerase, die durch Absorption
an ein Ionenaustausherharz gebunden ist, wobei das Produkt in unlöslich ge machter
Form vorliegt.
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Es ist bereits bekannt, daß Glucose durch Glucoseisomerase - ein Enzym,
das Glucose in Fructose umwandeln kann und umgekehrt - in Fructose umgewandelt werden
kann. Diese Glucoseisomerase ist in vielen Mikroorganismen festgestellt worden,
wie z.B. Streptomyces flavovirens, Streptomyces achromogenes, Streptomyces echinatus,
Streptomyces Albus, Aerobacter cloacae, Bacillus megaterium, Acetobactsr suboxydans,
Bacillus fructose und Lactobacillus fermenti, und für besondere Zwecke ein aus Streptomvces
erhaltenes Enzym.
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Glucoseisomerase ist in Wasser löslich; wo daher die Umwandlung von
Glucose in Fructose enzymatisch erfolgt, wird das Enzym zweckmäßig einer entsprechen~
den Behandlung unterworfen, damit man eine als Katalysator in fester Form verwendbare,
unlöslich gemachte Glucoseisomerase erhält. Es sind bereits verschiedene derartige
Behandlungsverfahren vorgeschlagen worden. So werden
z.B. glucoseisomerasehaltige
mikrobiale Zellen bei besonderer Temperatur zur Erzielung einer intrazellularen
Fixierung der Isomerase behandelt (vgl. z.B.
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die US-PS 3 694 314) oder Glucoseisomerase, die aus Zellen isoliert
ist, wird auf einem Anionenaustauscher, wie DEAE-Sephadex (vgl. J.ofSoc.of Japan
Foodstuff Tndustry 14,12, Seite 539-540 (1967)) oder DEAE-Cellulose (vgl. die US-PS
3 708 397) adsorbiert. Diese Verfahren haben jedoch z.B. die folgenden inhärenten
Nachteile: die nach dem erstgemannten Verfahren unlöslich gemachte Glucoseisomerase
benötigt eine lange Zeit für die Umwandlung der Glucose in Fructose und die Produktlösung
ist stark gefärbt, wodurch komplizierte Reinigungs- und Entfärbungsbehandlungen
notwendig sind, so daß dieses Verfahren wirtschaftlich unvorteilhaft ist. Dagegen
sind die im letzteren Verfahren genannten DEAE-Sephadex and DEAE-Cellulose unlösliche
Träger, quellen jedoch in Wasser und werden massiger; dies ergibt nicht nur eine
geringere Adsorption von Isomerase pro Volumeneinheit Träger, sondern bewirkt einen
wesentlichen Druckabfall und Verlust während des Durchganges der Glucoselösung durch
eine gefüllte Kolonne, so d&S auch dieses Verfahren unvorteilhaft ist.
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Ein weiterer Versuch der Verwendung eines synthetischen Anionenaustauscherharzes
als Träger zur Adsorption der Glucoseisomerase in unlöslich gemachter Form, z.B.
die US-PS 3 788 945, beschreibt ein poröses Anionenaustauscherharz, wie "Amberlite
IRA938" zur Absorption der Glucoseisomerase, wodurch die Glucose isanerisiert wird.
DnochEat ein Ionenaustauscherharz weniger Neigung, in Wasser zu quellen, so daß
man bei Verwendung desselben als Träger für die Isomerase erwarten kann, die Isomexwat
ion in wirksamerer Weise durchführen zu können. Die auf einem üblichen Ionenaustauscherharz
zu adsorbierende Isomeraseauch menge ist jedoch gering, uns das Ausmaß der Isomerasebewahrung
auf dem Harz ist gering. Somit ist das bekannte Verfahren, in welchem die Isomerase
durch Adsorption auf einem Ionenaustauscherarz unlöslich gemacht wird, großtechnisch
nicht zufriedenstellend.
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Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung einer auf
einem Ionenaustauscherharz adsorbierten und an dieses gebundenen, unlöslich gemachten
Glucoseisomerase, die zahlreiche Vorteile aufweist: z.B. wird (1) mehr Isomerase
auf den Ionenaustauscherharz adsorbiert, (2) zeigt sich eine höhere Enzym aktivität
des Produktes in der Isomerisation, (3) wird eine höhere Beständigkeit wegen Brechen
und Verformung erzielt und (4) erreicht man einen geringeren Druckverlust, wenn
die Glucoselösung durch die Kolonne läuft, die die unlöslich gemachte Isomerase
enthält.
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Ein weiteres Ziel ist die Schaffung einer unlöslich gemachten Glucoseisomerase
aus einer an ein poröses Anionenaustauscherharz mit einer Porosität von mehr als
4,5 %, insbesondere 7-50 % und vorzugsweise 7-20 , gemessen nach dem Verfahren mit
wässriger Dextranlösung, und einer Ionenaustauschkapazität von 0,035-0,3 meq/ccm
Harz, vorzugsweise mehr als 0,05 meq/ccm Harz, insbesondere 0,05-0,1 m&q/ccm
Harz, gemessen nach dem Polyanionsalz-Zersetzungsverfahren, adsorbieten und begundenen
Glucoseisot-irase.
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Die Bestimnungsverfahren mit der wässrigen Dextranlösung und der Polyanionsalz-Zersetzung
sind wie folgt: Verfahren mit wässsiger Dextranlösung In eine ummantelte Kolonne
von 11 mm innerem Durchmesser wurden 67 ccm SO4-Anionenaustauscherharz mit einem
Hohlraumverhältnis in nassem Zustand von 33 % zur Bildung eines Harzbettes gegeben,
das zur Entfernung von überschüssigem Wasser auf einer Temperatur von 500C. gehalten
wurde. Dann wurde eine 1,5 gew.-ige wässrige Dextranlösung mit einem gewichtsmaß'igen
durchschnittlichen Molekulargewicht (usw) von 2 000 000, bestimmt durch ein Lichtstreuungsverfahren,
-1 bei einer Raumgeschwindigkeit (SV) von 0,4 std geleitet, und es wurden jeweils
2 g des Ausflusses fraktioniert. Die Konzentration jeder Ausflußfraktion wurde mittels
eines Refraktometers gemessen. Die Quotienten, erhalten durch
Dividieren
dcs Ausflußvolumens (Vf) durch das Volumen des Harzbettes (Vb) und die Quotienten,
erhalten durch Dividieren der Dextrankonzentration jeder Ausflußfraktion (C) durch
die ursprüngliche Dextrankonzentration von 1,5 Gew.-% (Co) wurden zur Bildung einer
Kurve auf die HorizontalT bzw. Vertikalachse aufgetragen.
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Das obige Verfahren wurde unter Verwendung einer 1,5-gew.-gigen wässrigen
Dextranlösung mit einem gewichtsmäßigen durchschnittlichen Molekulargewicht von
10 000, bestimmt durch Lichtstreuungsverfahren, zur Erzielung einer Kurve wiederholt.
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Dann wurde die Porösität bestimmt, indem man die Differenz zwischen
den Werten von Vf/Vb an der. Punkten, wo C/Co für jede wässrige Dextranlösung mit
dem Molekulargewicht von 10 000 und 2 000 000 0,5 beträgt, durch den Faktor 0,67
dividierte; gewöhnlich wird die Porösität als Prozentsatz ausgedrückt, so daß der
wie oben bestimmte Wert.mit 100 multipliziert wird.
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In der vorliegenden Anmeldung wurde die Porösität des Harzes unter
Verwendung einer Kiriyama Kolonne (erhältlich von der Kiriyama Seisakusho, Japan)
mit DEXTRAN T2000 mit einem durchnittlichen gewichtsmäßigen Molekulargewicht von
2 000 000 und DEXTRAN T10 mit einem durchschnittlichen gewichtsmäßigen Molekulargewicht
von 10 500 (jeweils messen nach dem Lichistreuungsverfahren) erhältlich von der
Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden, einem Eintauehflüssigkeitsrefraktometer,
Typ T, von der Karl Zeiss AG bestimmt.
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Es wird darauf hingewiesen, daß beim Messen der Harzporösität eine
Abweichung im Molekulargewicht des Dextrans um + 10 46 von den obigen Werten die
Ergebnisse nicht beeinflußt; je enger die Molekulargewichtsverteilung, umso bessere
Ergebnisse erzielt man, wobei jedoch wenig oder praktisch keine Wirkung bei unterschiedlicher
Verteilung festgestellt wurde.
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Polyanionsalz-Zersetzunsverfahren Eine gegebene Menge Polystyrol mit
einem zahlenmigen durchschnittlichen Molekulargewicht (Rn) von 10 000, gemessen
durch Dampfdruckverfahren, und einem Mw/Mn-Wert unter 1,06, erhalten durch Dividieren
des durch Lichtstreuungsverfahren bestimmten gewichtsmäßigen durchschnittlichen
Molekilargewichtes durch das zahlenmäßige durchschnittliche Molekulargewicht, wurde
mit dem 10-fachen Gewicht an 98-giger Schwefelsäure und dem O,O1-Fachen an Silbersulfat
als Katalysator 5 Stunden bei 1000C. sulfoniert. Das Reaktionsprodukt wurde durch
Zugabe von wässrigem Ammoniak neutralisisrt, das Wasser unter Vakuum entfernt und
das erhaltene feste Produkt dann mit Methanol extrahiert. Das Methanol wurde unter
Vakuum vom Extrakt entfernt, wodurch man Ammoniumpoly styrolsulfonat erhielt. 1
g Ammoniumpolystyrolsulfonat wurde in entmineralisiertem Wasser zur Bildung von
1 1 einer wässrigen Lösung gelöst. Diese wurde 5 Stunden durch eine ummantelte Kolonne
von 8 mm innerem Durchmesser, die mit 10 ccm eines auf 25°C. gehaltenen OH-Anionenaustauscherharzes
gefüllt war, bei einer Geschwindigkeit von 100 ccm/std hindurchgeleitet. Der Ausfluß
aus der Kolonne in einer Menge von 500 ccm wurde mit 1/lON Salzsäure unter Verwendung
von Methylorange als Indikator titriert. Der Quotient aus dem Dividieren der zum
Titrieren erforderlichen Salzsäuremenge (ccm) durch 100 ist die Ionenaustauschkapazität
(meq/ccm Harz) Zum Messen der Ionenaustauschkapazität wurde "Mono-Disperse Polystyrene
Standard" (iw = 10 000 und iw/Mn 1,06) von der Firma Pressure Chemical Co., Ltd.,
verwendet. Eine Abweichung des durchschnittlichen Molekulargewichtes um + 10 r vom
oben genannten Bereich beeinflußte die Ergebnisse nicht wesentlich.
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Obgleich der Menhanismus, nach welchem die Glucoseisomerase auf einem
makroprösen Ionenaustauscherharz adsorbiert und die Enzymwirksamkeit bewahrt wird,
nicht ganz klar ist, wird angenommen, daß die physikalische Adsorption des Harzes
in den Makroporen und eine bestimmte chemische Bindekraft zwischen Anionenasutaschergruppen
und dem verwendeten Enzym eine synergistische Wirkung ergeben. Diese Vermutung wird
bestätigt durch die Tatsache, daß Glucoseisomerase kaum auf einem Ionenaustauscherharz
vom üblichen Gel-Typ ohne Makroporen adsorbiert wird, und weiter kann ein Harz mit
Makroporen, jedoch ohne lonenaustauschgruppen nur eine geringe Enzymmenge adsorbieren,
so daß die Enzymwirksam keit langsam ist. So sind vermutlich die auf dem Anionenaustauscherharz
adsorbierte Glucoseisomerasemenge und das Ausmaß der von der adsorbierten Isomerase
bewahrten Wirksamkeit abhängig vom Volumen der Makorporen, die die Adsorption der
Isomerase bestimmen und der Anzahl von lonenaustauschergruppen in den Makroporen.
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Die durch wässrige Dextranlösung gemessene Porösität entspricht dem
Gesamtvolumen an Makroporen mit einer spezifischen Größe, in welche das Dextran
mit einem iw von 10 000 eindringen, jedoch das Dextran mit Mw 2 000 000 nicht eindrigen
kann; diese Porösität hat eine enge Beziehung zu der auf dem Ionenaustauscherharz
adsorbierbaren Clucoseisomerasemenge, weshalb die Adsorption der Glucoseisomerase
vermutlich nur oder hauptsächlich in solchen Makroporen einer spezifischen Größe
erfolgt. Es wird weiter angenommen, daß die nach dem Polyanionsalz-Zersetzungsverfahren
bestimmte Ionenaustauscherkapazität der Ionenaustauscherkapazität an allen Oberflächen
dieser spezifischen Makroporen entspricht.
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Ein übliches Anionenaustausche rharz, hergestellt durch Mischpolymerisieren
eines Vinylmonomeren, wie Styrol, mit einem vernetzbaren Monomeren, wie Divinylbenzol,
und anschließende Einführung von Anionenaustauschergruppen, hat auch einige Mikroporen;
daher kann ein polymeres Material vermutlich nur
die äußeren Oberflächen,
jedoch nicht die inneren Oberflächen der Mikroporen berühren. Daher sind die oben
genannte Porösität und Ionenaustauschkapazitat eines solchen üblichen, gelartigen
Anionenaustauscberharzes wesentlich geringer als bei den erfindungsgemäßen Harzen.
Im Gegensatz dazu ist das erfindungsgemäß verwendete Anionenaustauscherharz makroporös
und hat ein großes inneres Oberflächengebiet.
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Das makroporöse Anionenaustauscherharz wird nach jedem bekannten Verfahren
hergestellt; so werden z.B. ein Vinylmonomeres und ein vernetzbares Monomeres in
Anwesenheit jedes Materials, das- durch ein Lösungsmittel entfernbar ist undan der
Reaktion nicht teilnimmt, wie Polystvntl mischpolymerisiert, worauf nach beendeter
Polymerisation das erhaltene Harz zum Extrahieren des Poly styrols mit einem Lösungsmittel
behandelt wird; anschließend werden die Anionenaustauschergruppen eingeführt. Das
so hergestellte Anionenaustauscherharz hat gewöhnlich Makroporen mit einem Radius
zwischen etwa 10i104 AO. Es wird bemerkt, daß unter erzen Poren die kleineren Poren
keine Glucoseisomerase adsorbieren können, während größere Poren, deren innere Oberfläche
derjenigen eines gelartigen Austauchsharzes ähnlich ist, ebenfalls nicht an der
Adsorption teilnehmen. Dies geht aus der Tatsache hervor, daß bestinnte Anionenaustauscherharze
mit einer nach dem Quecksilbereindringungsverfahren gemessenen höheren Porösität
nicht notwendigerweise eine höhere Adsorptionsfähigkeit für die Isokönnen merase
zeigen. Dennoch/ gewöhnlich die Porengröße und das Gesamtporenvolumen der Makroporen
in einem Anionenaustauscherharz in Abhängigkeit von den Herstellungsbedingungen,
wie der Menge an vernetzbarem Monomeren und der Menge und dem Molekulargewicht des
anfänglich zur Polymerisationsmis chung zugefügten Polymersates, variieren, so daß
es schwierig ist, die endgültige Beziehung zwischen Porengröße und Gesamtporenvolumen
zu den Herstellungsbedingungen zu bestimmen.
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Es ist zweckmäßig, durch Versuche die optitnalen Bedingungen zur Herstellung
des günstigsten Harzes zu bestimmen, wobei verschiedene Harze bei unters edlichen
Herstellungsbedingungen hergestellt -and ihre Porösität und Anionenaustauscherkapazität
dann nach dert obigen Verfahren gemessen werden.
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Zur Einführung von Anionenaustauschergruppen in das Grundharz ist
es zweckmäßig, dieses zur Einführung von Chlormethylgruppen zu behandeln, woran
sich die Behandlung mit verschiedenen Aminverbindungen, wie aliphatische Amine z
z.B.
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Trimethylamin, Dimethyläthanolamin, Äthylendiamin, Diäthylentriamin
und Triäthyltetramin, und cyclische Amine, wie Pyrrolidin, Morpholin und Piperidin,
anschließt. Bei Verwendung eines schwachen basischen Amins wird jedoch festgestellt,
daß die Neigung zu einer gewissen Freisetzung der adsorbierten Isomerase vom Harz
besteht, so daß es zweckmäßig ist, ein tertiäres Amin, wie Trimethylamin und Dimethyläthanolamin,
zur Umwandlung des Harzes in ein quaternäres Ammoniummaterial zu verwenden.
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Erfindungsgemäß ist jede übliche Glucoseisomerase verwendbar, die
in Zellen von Actinomyceten, wie Streptomyces, z.B. St. phaeochromogenus, St. fradiae,
St.
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roseochromogenes, St. olivaceus, St. californicus, St. vanaceus und
St. albus, gebildet werden. Die Extraktion der Glucoseisomerase aus den mikrobialen
Zellen kann durch geeignete bekannte Verfahren, wie Ultraschallbehandlung, Druckbehandlung,
mechanische BehandLung, Autolyse und Enzymbehandlung mit Lysozym, erfolgen, wobei
insbesondere die Extraktion mit Lysozym bevorzugt wird, weil eine höhere Extraktion
der Glucoseisomerase aus den Zellen, eine kürzere Extraktionszeit und eine geringere
Menge von Verunreinigungen in der extrahierten Lösung erzielt werden.
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Die Glucoseisomerase wird auf den M akroporen des Ionenaustauscherharzes
laach jedem geeigneten, zur Behandlung eines Ionenaustauscherharzes geeigneten Verfahren
adsorbiert. Die einfachste Weise besteht im Eintauchen des Anionenaustauscherharzes
in eine wässrige Lösung der aus den mikrobialen Zellen extrahierten Glucoseisomerase
für eine zur Adsorption der Isomerase ausreichende Zeit (wahlweise unter Ruhren)
und anschließenden Waschen mit Wasser, wobei es zwecknaßig ist, die wässrige Glucoseisomeraselösung
aufwärts durch eine mit dem Anionenaustauscherharz gefüllte Kolonne zu leiten und
zurückzuführen, um die Harzteilchen zwecks Adsorption zu verwirbeln.
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Erfindungsgemäß können Bedingungen angewendet werden, die die Glucoseisomerase
nicht wesentlich inaktivieren, wie z.B. ein pH-Wert von 5,5-9,5, eine Temperatur
von 0-600C. und eine Dauer von 2-18 Stunden, wobei jedoch die Zeit in Abhängigkeit
von der Konzentration der HarzauSschlämmung, der Konzentration der Glucoseisomerase
und der verwendeten Menge der Isomeraselösung variieren kann. Zur Adsorption der
Glucoseisomerase kann jedes Anionenaustauscherharz, z.B. das freie Harz oder seine
Salztyp, verwendet werden, wobei das Harz mit einer wässrigen Lösung z.B. von Schwefelsäure,
Salzsäure, Phosphorsäure und Essigsäure vorbehandelt ist, um es in ein zur wirksamen
Adsorption der Isomerase fähigen Salzmaterial umzuwandeln.
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Das erfindungsgemäße Anionenaustauscherharz besitzt eine hohe Adsorption
5 fähigkeit für Glucoseisomerase. Die auf den Harz adsorbierte Glucoseisomerasemenge
liegt über 400U, insbesondere 700-3000U und vorzugsweise 1000-2000 U, Isomerase
pro ccm nasses Harz und kann in manchen Fällen noch höher sein. Je höher allgemein
die adsorbierte Isomerasemenge ist, umso höher ist auch die Wirksamkeit der unlöslich
gemachten Isomerase, während eine Verminderung des Ausmaßes der Bindung der Isomerase
eintreten kann, wenn sich die Menge der adsorbierten Isomerase erhöht. Die optimale
Menge an adsorbierter Isomerase
wird daher unter Berücksichtigung
des Ausmaßes an Bindung, des Maßes an Wirksamkeitsbewahrung und der Lebensdauer
des Produktes bestimmt.
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Die so hergestellte, unlöslich gemachte Glucoseisomerase besitzt zahlreiche
Vorteile, die es ermöglichen, die Isomerisation von Glucose in Fructose auf großtechnischer
Basis wirksamer zu machen; so ergibt sich z.B. eine höhere Wirksamkeit zur Isomerisation
von Glucose, wenig oder kein Wirksamkeitsverlust über eine lange Zeit, keine merkliche
Freisetzung der Isomerase aus dem Trägerharz und keine oder nur sehr geringe Verfärbung
des erhaltenen Produktes. Die Isomerisation erfolgt zweclolig in einem System mit
fixiertem Bett. Da die jedoch erfindungsgemäße, unlöslich gemachte Isomerase/eine
hohe mechanische Festigkeit hat und leicht aus einer Aufschlämmung abgetrennt werden
kann, kann sie auch in einem Wirbelbettsystem, Übertragungsbettsystem oder absatzweisen
System mit Rühren verwendet werden.
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Wenn sich die Aktivität der erfindungsgemäßen unlöslich gemachten
Glucoseisomerase nach langer Verwendungsdauer verringert, ist eine Regenerierung
leicht möglich, indem man die Isomerase vom Harz durch Behandlung mit einer wässrigen
Salzlösung, z.B. wässrigem Natriumchlorid, freisetzt und anschließend frische Isomerase
auf dem Harz adsorbiert, wodurch man eine unlöslich gemachte Glucoseisomerase ohne
Wirksamitsverlust erhält.
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Die erfindungsgemaße unlöslich gemachte Glucoseisomerase enthält große
Mengen an durch das Harz adsorbierter und an dieses gebundener Isomerase und kann
auf eine hohe Aktivität aktiviert werden. Die Verwendung dieser Isomerase bei der
Glucoseisomerisation bringt daher die folgenden Vorteile (1) es ist weniger Anionenaustauscherharz
für eine gegebene Fructosemenge erforderlich; (2) es werden höhere Raum-Zeit-Ausbeuten
erzielt1 (3) aufgrund der kürzeren Verweilzeit der Glucoselösung in der Kolonne
wird weniger Verfärbung und eine Verringerung des pH-Wertes des Produktes erreicht;
und (4) der Druckabfall in der
Kolonne wird vermindert. Somit eignet
sich die erfindungsgemäßen unlöslich gemachte Glucoseisomerase für die Umwandlung
von Glucose in Fructose.
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Die folgenden Beispiele veranschaulIchen die vorliegende Erfindung,
ohne sie zu beschränken.
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In den Beispielen wurde der Wirksamkeitstiter der extrahierten Glucoseisomerase
und unlöslich gemachten Glucoseisomerase, das Ausmaß der Wirksamkeitsbewahrung und
das Ausmaß an gebundener Isomerase wie folgt bestimmt: 1. Wirksamkeitstiter der
extrahierten Glucoseisomerase 0,2 ccm 1M wässrige D-Glucoselösung, 0,2 ccm 0,05M
wässrige MgSO4.7H2O Lösung, 0,2 ccm 0,5M wässrige Phosphotpufferlösung (pH = 7,2)
und eine wässrige Lösung extrahierter Glucoseisomerase wurden zu einer wässrigen
Lösung gemischt, die mit Wasser auf 2 ccm verdünnt wurde. Die Mischung wurde zwecks
Umwandlung 60 Minuten auf ?o0C. gehalten, worauf die Umwandlung durch Zugabe von
2 ccm 0,5N Perchlorsäure beendet wurde. Die gebildete Fructosemenge wurde durch
das Cysteincarbazol-Verfahren bestimmt. Der durch Divioiren der gebildeten Fructosemenge
durch die Menge der extrahierten Glucoseisomeraselösung erhaltene Wert ist der Wirksamkeitstiter,
dessen Einheit mit "U" abgekürzt wird.
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2. Wirksamkeitstiter der unlöslich gemachten Glucoseisoermase Zu 10
ccm einer wässrigen Lösung, die O,1M Glucose, 0,005M MgS04.7H20 und O ,O5M Phosphatpuffer
enthielt, wurde eine gegebene Menge an unlöslich gemachter Glucoseisomerase zugefügt
und die so erhaltene Mischung langsam 60 Minuten zwecks Umwandlung bei 70°C. gerührt.
Dann wurde die unlöslich gemachte Isomerase von der umgesetzten Lösung abgetrennt,
und die gebildete Fructosemenge wurde nach dem Cysteincarbazol-Verfahren bestimmt.
Der Aktivitätstiter wurde wie oben berechnet.
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Die Einheit "U" bedeutet die Glucoseisomerasemenge, die unter den
angegebenen Bedingungen 1 mg Fructose produzieren kann.
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3. Ausmaß an gebundener Glucoseisomerase Der Gesamttiter der zur Absorption
auf einem Anionenaustauscherharz zu verwendenden Glucoseisomeraselösung wurde bestimmt
und mit "A" bezeichnet. Nach Adsorption der Glucoseisomerase auf dem Anionenaustauscherharz
wurde das Harz abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Dann wurde der Gesamttiter
des kombinierten Filtrates und Waschwassers gemessen; dieser Wert wurde mit "B"
bezeichnet.
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Der Ausmaß an gebundener Glucoseisomerase (DBG) wurde nach der folgenden
Gleichung bestimmt: DEG = A - B x 100 (%) B 4. Ausmaß der Wirksamkeitbewahrung von
unlöslich Remachter Isomerase Der Wirksamkeitstiter von unlöslich gemachter Glucoseisomerase
wurde wie unter 3.) gemessen und durch den Wirksamkeitstfter der auf dem Harz zu
adsor bierenden extrahierten Glucoseisaneraselösung dividiert. Der Quotient wurde
mit 100 multipliziert und gibt das Ausmaß an Wirksamkeitsbewahrung, ausgedrückt
in %.
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B e i s p i e 1 1 bis 12 600 g Glucoseisomerase "NAGASE" (erhältlich
von der Nagase Sangyo Kabishiki Kaisha, Japan, und hergestellt aus St. phaeochromogenus)
wurden in 700 ccm entmineralisiertem Wasser suspendiert. Nach Zugabe von 80 mg kristallinem
Eiweißlysozym wurde die Suspension 45 Stunden bei 400C. gerührt und dann zur Erzielung
einer extrahierten Glucoseisomeraselösung zentrifugiert. Der Wirksamkeitstiter der
extrahierten Lösung betrug, wie festgestellt wurde, 200 U/ccm.
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Dann wurden jeweils 50 ccm der extrahierten Lösung (Gesamtwirksamkeitstiter
= 10 000 TJ) mit den in Tabelle 1 genannten Anionenaustauscherharzen in einem
nassen
Bettvolumen von 10 ccm gemischt und die Mischung 6 Stunden bei 500C.
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zwecks Adsorption der Isomerase auf den Harz zur Bildung unlöslich
gemachter Glucoseisomerse gerührt.
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Die Eigenschaften der unlöslich gemachten Isomerase sind in Tabelle
1 aufgeführt, die auch Vergleichsbeispiele enthält.
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In Beispiel 7 und 8 und in Vergleichsbeispiel A bis E wurden handelsübliche
Anionenaustauscherharze verwendst.
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Mit Ausnahme von Beispiel 4 waren die verwendeten Anionenaustauscherharze
durch Suspensionspolymerisation mit einer Suspension aus Styrol, D ivinylbenzol,
Polystyrol und Toluol in Wasser und Benzoylperoxid als Katalysator hergestellt worden,
worauf die Teilchen des Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisates einer Chlormethylierung
und Einführung der in Tabelle 1 genannten Anionenaustauschergruppen unterworfen
wurden.
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Das Harz von Beispiel 4 wurde hergestellt durch Polymerisieren einer
Mischung aus Styrol, Divinylbenzol und n-Hetpan unter Verwendung von Benzoylperoxid
als Katalysator; so erhielt man Teilchen eines Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisates,
die einer Chlormethylierung und Einführung der Anionenaustauschergruppen unterworfen
wurden.
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Die in Tabelle 1 genannten Harzarten S04 , PO4-, OH, Cr und CH3COO
bedeuten, daß die Anionenaustauscherharze mit 2N-Schwefelsäuze, lN-Phosphorsäure,
2N Natriunhydroxid, 2N-Salzsäu und iN-Essigsäure behandelt worden waren.
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Die Porösität des verwendeten Anionenaustauscherharzes wurde nach
dem wässrigen Dextranlösungsverfahren bestimmt. Kurven, die die Beziehung zwischen
C/Co und Vf/Vb der Dextrane mit Molekulaggewichten von 10 000 und 2 000 000 zeigen,
sind in der beigefügten Zeichnung dargestellt.
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Tabelle 1 Beisp. Eigenschaften des Ionenaustauscherharzes Ausmaß
an Anionenaustauschergruppe gesamte Ionen- Porösität Versetzung austauscher-$ kapazität
meq/ccm 1 10 Trimethylammonium 0,79 10,4 2 10 " 0,95 - 10,0 3 10 " 0,79 19,4 4 15
11 0,57 19,4 5 25 " 0,67 7,5 6 25 Dimethyläthanolammonium O,60 13,0 7 - Trimethylammonium
1,03 16,4 8 - Dimethyläthanolammonium " 16,4 9 10 Trimethylammonium 0,79 10,4 10
10 " " " " 11 10 " Is n 12 10 " " " V.B.A++ - Dimethyläthanolammonium 1,01 8,7 B
- " 0,91 15,7 C - Trimethylammonium 0,54 0,7 D 8 " >1,3 0 E 10 " >1,3 3,0
+ = Gewichtsprozentsatz an Divinylmonomeren, bezogen auf das Gesamtgewicht aus Vinylmonomeren
und Divinylmonomeren =Vergleichsbeispiele
unlöslich gemachte Ionenaustauscher-
Art des Glucoseisanerase kapazität Grundharzes gebunden Wirksamkeits- Remerkungen
mem/cm % bewahrung, % 0,074 SO4 99,9 91,0 0,088 " 99,7 92,1 0,039 n 93,7 88,2 0,061
" 99,8 91,5 0,070 " 96,3 91,1 0,096 ist 99,9 88,5 0,038 " 46,7 78,9 Amberlite IRA
900 0,042 " 72,3 61,7 Amberlite IRA93 0,074 PO4 99,5 88,0 " OH- 95,0 80,2 Cl 100,0
90,3 CH3COO- 82,4 84,7 0,028 SO4 0 - Amberlite IRA-910 0,027 " 0 - Amberlite IRA-911
0,034 " 10 45 Amberlite IRA-938 0,028 n O - Diaion SA Nr. 100 0,030 n 7 - Diaion
PA-320 3 e i 5 p i e 1 13 Ein Glucoseisomerase produzierender Stamm von Streptomyces
albus YT Nr. 5, als FERM-P-No. 463 beim Fermentation Research Institute, Japan,
hinterlegt, wurde auf 80 ccm eines Kulturmediums aus einer wässrigen Lösung mit
1 Gew.-% Polypepton, 0,3 Gew.-% K2HP04, Q,1 Gew.-% MgSO4 und 1 Gew.-% Xylose geimpft
und 3 Stunden bei einem pH-Wert von 7 und einer Temperatur von 300C. bebrütet.
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Dann wurden 25 ccm des Kulturmediums in 50 ccm eines Kulturmediums
aus einer wässrigen Lösung aus 3 Gew.-% Weizenkleine, 2 Gew. - Maisweichflüssigkeit,
0,1 Gew.-% MgS04.7H20 und 0,024 Gew.-% CoCl2.6H2O übergeführt und weitere 30 Stunden
bei 30°C. gezüchtet. Dann wurde die Kultur zum Sammeln der Zellen zentrifugiert,
aus diesem wurde nach Waschen mit Wasser die Glucoseisomerase
nach
dem Verfahren von Beispiel 1 extrahiert.
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Die extrahierte Isomerase wurde gemäß Verfahren von Beispiel 1 auf
dem Harz adsorbiert. In der unlöslich gemachten Isomerase betrug die gebundene Isomerase
99,2 % und die Wirksamkeitsbewahrung 88,8 %.
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B e i s p i e l 14 Zellen von Streptomyces olivaceus wurden 10 Minuten
mit Wellen von 10 Kilohertz unter Verwendung eines Ultraschallgenerators vom Typ
N-50-3 (von der Toyo Riko Seisakusho, Japan erhältlich) ultraschallbehandelt, wodurch
man eine extrahierte Glucoseisomeraselösung erhielt. 100 ccm dieses Extraktes mit
einem Gesamtwirksamkeitstiter von 500 U wurden mit 4 ccm des in Beispiel 4 verwendeten
Harzes gemischt und die Mischung 15 Stunden bei 500C. gerührt.
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Die so erhaltene unlöslich gemachte Glucoseisomerase hatte ein Ausmaß
an gebundere Isomerase von 90 % und eine Wirksamkeitsbewahrung von 87 %.
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3 e i 5 p i e 1 15 Eine gemäß Beispiel 1 erhaltene extrahierte Glucoseisomeraselösung
mit einem Wirksamkeitstiter von 200 U/ccm und einem Volumen von 120 ccm und 10 ccm
des in Beispiel 3 verwendeten Anionenaustauscherharzes wurden gemischt und 6 Stunden
bei 250C. gerührt. Die so erhaltene unlöslich gemachte Glucoseisomerase hatte ein
Ausmaß an gebundener Isomerase von 91 % und einen Wirksam~ keitstiter von 2026 U/ccm
bei einer Wirksamkeitsbewahrung von 94 g.
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3 e i 5 p i e 1 16 Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch 190 ccm
einer extrahierten Isomeraselösung (260 U/ccm) und 10 ccm Harz gemischt und 18 Stunden
bei 50 0C.
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gerührt wurden.. Das Ausmaß an gebundener Isomerase betrug 95,4 %,
der Wirksamkeitstiter der unlöslich gemachten Glucoseisomerase war 2400 U/ccm und
die Wirksamkeitsbewahrung 66,2 .