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Verfahren zur quantitativen Lactat-Bestimmung und Reagens hierfür.
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Die Lactat-Bestimmung im Blut, Serum oder Plasma ist wichtig zur Einstellung
und Therapiekontrolle von Diabetikern.
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Erhöhte Lactat-Gehalte treten auch bei Schock, Myokardinfarkt, Uraemie,
Leukaemie und Leberzirrhose auf. Die Lactat-Bestimmung ist daher ein unentbehrliches,
diagnostisches Hilfsmittel.
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Es sind bereits verschiedene Methoden zur spezifischen L-Lactat-Bestimmung
bekannt. Sie beruhen auf der überführung des Lactats in Pyruvat in Gegenwart von
Lactat-Dehydrogenase (LDH) und des Coenzyms Nikotinamid-adenin-dinucleotid (NAD)
unter Reduktion des letzteren und Bildung von NADH.
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Gebildetes NADH kann optisch direkt oder unter Zwischenschaltung eines
Redoxfarbstoffes bestimmt werden.
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Die L-Lactat-Bestimmung hat nun in vielen Fällen klinisch die Bedeutung
einer Notfall-Untersuchung, bei der möglichst kurze Bestimmungszeiten erforderlich
sind. Beispielsweise kann bei der Biguanidtherapie des Diabetes Mellitus eine Lactacidose
auftreten, die zum Tode führen kann. Für
derartige Fälle ist eine
Schnellbestimmung des Lactats dringend erforderlich.
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Ein Nachteil des oben beschriebenen Verfahrens unter Verwendung von
LDH liegt jedoch darin, daß die Bestimmung erhebliche Zeit benötigt, im allgemeinen
mehr als eine Stunde, da gegen das chemische Gleichgewicht der von der LDH katalysierten
Reaktion gemessen werden muß.
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Man hat daher schon verschiedentlich versucht, die Dauer der Bestimmung
abzukürzen. So ist es bekannt, der oben angegebenen Reaktion eine zweite Reaktion
nachzuschalten, bei welcher gebildetes Pyruvat mit Glutamat in Gegenwart von Glutamat-Pyruvat-Transaminase
(GPT) umgesetzt wird unter Bildung von Alanin und X-Ketoglutarat. Hierdurch wird
zwar das chemische Gleichgewicht verbessert, die Messung dauert jedoch immer noch
mehr als eine halbe Stunde und ist daher für eine Notfalluntersuchung nicht geeignet.
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Andere bekannt Vorschläge gehen dahin, durch Zusatz von Hydrazin als
Ketonfänger das Gleichgewicht zu verschieben oder NAD durch Acetylpyridin-adenin-dinucleotid
(APAD) zu ersetzen (H.U. Bergmeyer: Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie,
Weinheim, Bd. II (1974) Seiten 1510 bis 1526).
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Auch wurde versucht, LDH aus Rinderherz einzusetzen und die Reaktionstemperatur
auf 450zu erhöhen (Klin, Biochem.7, 94 (1974) All diesen Verfahren gemeinsam ist
jedoch der Nachteil, daß die Verringerung der Bestimmungsdauer nicht ausreicht,
um den klinischen Bedürfnissen zu entsprechen.
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Der folgenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
zur quantitativen Lactat-Bestimmung zu finden, welches eine wesentlich verkürzte
Bestimmungsdauer aufweist und vorzugsweise höchstens 10 min für die Bestimmung benötigt.
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Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur
quantitativen Bestimmung von L-Lactat durch Umsetzung mit NAD in Gegenwart von LDH
unter Bildung von NADH und Pyruvat, Umsetzung des letzteren mit Glutamat in Gegenwart
von GPT unter Bildung von Alanin und ;r-Ketoglutarat in alkalischer gepufferter
Lösung und Messung des gebildeten NAD, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die
Umsetzung in Gegenwart von wenigstens 0,1 Mol/l Carbonat oder Bicarbonat durchgeführt
wird.
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Die Erfindung beruht auf der überraschenden Auffindung der Tatsache,
daß Carbonat und Bicarbonat-Ionen die Glutamat-Pyruvat-Transaminase erheblich zu
aktivieren vermögen und dadurch eine entscheidende Verschiebung des Gleichgewichtes
in der kombinierten Reaktion mit LDH und GPT möglich machen.
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Dem erfindungsgemäßen Verfahren liegen folgende Reaktionen zugrunde:
1 Lactat + NAD+
Pyruvat + NADH + 2 Pyruvat + Glutamat
L-Alanin + o(-Ketoglutarat Da gemäß Reaktion 1 H+-Ionen gebildet werden wird im
alkalischen Medium gearbeitet.
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Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise in einer Lösung
gearbeitet, die wenigstens 0,4 Mol/l an Carbonat oder Bicarbonat-Ionen ist. Beste
Ergebnisse werden erhalten, wenn direkt in 0,45 bis 0,60 Mol/lCarbonatpuffer gearbeiet
wird. Hierbei hat es sich als besonders günstig erwiesen, bei pH-Werten zwischen
9,5 und 10,5 zu arbeiten, während bisher die gekoppelte Reaktion mit LDH und GPT
bei pH 8,9 durchgeführt wurde.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl im Vollblut nach Enteiweißung
mit z.B. Perchlorsäure als auch im Serum bzw. im Plasma durchgeführt werden.
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Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann so erfolgen,
daß der Reagentienmischung, die alle Reagentien außer den Enzymen enthält, enteiweißtes
Blut, Serum oder Plasma zuyesetzt wird. Danach wird der Ansatz geteilt.
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Der einen Hälfte werden die Enzyme zugesetzt, die zweite Hälfte dient
als Probenleerwert. Nach 10 min wird die Extinktion in der Probe und dem Probenleerwert
gemessen Die zur Berechnung der Lactatkonzentration erforderliche Extinktionsdifferenz
erhält man nach Abzug der Extinktion des Probenleerwertes von der Extinktion der
Probe.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht nur einfach und rasch durchführbar,
sondern zeichnet sich auch noch durch große Genauigkeit und Richtigkeit aus. Die
Präzisibn in der Serie beträgt + 2 %, die von Tag zu Tag ebenfalls -+2 %.
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In Kontrollseren wird der Lactatgehalt zu 99 % wiedergefunden.
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Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in der hierdurch
geschaffenen Möglichkeit zur Verringerung des Enzymverbrauchs zu sehen. So beträgt
die Mindestmenge des ziemlich teuren GPT pro ml Testvolumen nur noch 2,U gegenüber
4 U beim bekannten Verfahren. Die Mindestmenge an LDH bei dieser GPTHMenge beträgt
30 U/ml.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur Durchführung
des oben beschriebenen Verfahrens. Das erfindungsgemäße Reagens enthält LDH, GPT,
NAD und Glutamat und ist gekennzeichnet durch einen Gehalt an 0,45 bis 0,6 Mol/l
Carbonatpuffer pH 9,5 bis 10,5.
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In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße
Reagens aus 0,5 bis 0,6 Mol/l Carbonatpuffer pH 9,5 bis 10,5 sowie 50 - 150 m Mol/l
Glutamat 3 - 10 m Mol/l NAD und' 20 - 60 U LDH, 2 bis 4 U GPT je ml Pufferlösung.
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Zweckmäßig enthält ein derartiges Reagens als Stabilisator auch2 bis
30 m Mol Alkaliazid je Liter Pufferlösung.
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Für eine Einzelbestimmung wird im allgemeinen 5 ml des oben beschriebenen
Reagens verwendet. Das Reagens weist in gemischtem Zustand bei 4 0C eine Haltbarkeit
von wenigstens einem Tag auf. Um längere Lagerstabilität zu erzielen werden zweckmäßig
die Enzyme getrennt aufbewahrt und das fertige Reagens durch ihre Zumischung jeweils
nur für einen Tagesbedarf hergestellt.
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Außer der Bestimmung von L-Lactat läßt sich das Verfahren der Erfindung
auch zur Bestimmung von L-Alanin anwenden.
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Im letzteren Fall verlaufen die Reaktionen umgekehrt, wie in H.U.
Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim, Bd. II (1974)
Seite 1727, beschrieben.
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Bei dem zugrundeliegenden bekannten Verfahren dauert die Bestimmung
je nach L-Alanin-Konzentration 30 bis 60 min, wobei 10 U GPT pro ml Testvolumen
eingesetzt werden müssen.
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Erfindungsgemäß läßt sich dafür die Reaktionszeit auf die Hälfte verringern.
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Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung weiter: Beispiel: Es
werden 5 ml eines Reaktionsgemisches verwendet, das 0,5 Mol/l Carbonat-Puffer, pH
= 10,0, 100 m Mol/l Glutåm.at, 15 m Mol/l Natriumazid und 5 m Piol/l NAI) enthält.
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Dazu werden pipettiert 0,1 ml Serum oder Plasma oder 0,2 ml Vollblut
(1 + 1 enteiweißt mit 1 N Perchlorsäure).
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Von dieser Mischung werden 2,5 ml in ein zweites Gefäß abpipettiert
und dazu 0,05 ml Enzym-Lösung bestehend aus 54-138U LDH und 5 bis 10 U GPT in 50
µl 3,2 M Ammoniumsulfatlösung gegeben. Der Rest der Mischung verbleibt im ersten
Gefäß. Nach 10 min wird der Inhalt des ersten Gefäßes = Proben-Leerwert in eine
Küvette mit 1 cm Schichtdicke übergeführt und die Extinktion bei Hg 365 nm, Hg 334
nm oder 340 nm gemessen. In der gleichen Küvette wird die Extenktion des Inhalts
des zweiten Gefäßes = Probe gemessen. Die Extinktion des Proben-Leerwertes wird
von der Extinktion der Probe abgezogen.
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AE Probe -E Proben-Leerwert AE geht in die Berechnung ein.
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Die Berechnung lautet, wenn als Probe Serum oder Plasma eingesetzt
und die Extinktionsmessung bei Hg 365 nm durchgeführt wurde: mMol Lactat/l = iE
. 52,02 . 1000 3,3 . 10» Wenn Vollblut nach Enteiweißung eingesetzt wurde mMol Lactat/l
= ÄB . 49,06 . 1000 3 3,3. 10 52,02 bzw. 49,06 ist der Verdünnungsfaktor der Probe
im Bestimmungsansatz.
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3,3 . 10 cm2/mMol ist der Extinktionskoeffizient von NADH bei Hg
365 nm.