-
"Trägerenzym" Die Erfindung bezieht sich auf Trägerenzyme.
-
Enzyme sind allgemein bekannte Katalysatoren. Üblicherweise sind sie
wasserlöslich. Es gibt bereits verschiedene Söglichkeiten der Immobilisierung von
Enzymen auf Trägern. Trägerenzyme sind vorteilhaft, weil sie zur Katalysierung von
Reaktionen in Reaktorsystemen mit kontinuierlicher Strömung verwendet werden können
und weil sie wieder verwendet weraen können und das fertige Produkt enzymfrei ist,
da nämlich das Trägerenzym leicht vom fertigen Produkt abgetrennt werden kann.
-
Gemäß der Erfindung wird nunmehr ein Trägerenzym vorgeschlagen, welches
aus einem aktiven Enzym besteht, das kovalent oder ionisch mit der Oberfläche eines
Trägers verbunden ist, wobei zumindest die Oberfläche des Trägers aus einem Polycarbonamid
besteht, das eine unausgewogene Konzentration an Endgruppen aufweist, derart, daß
ein Überschuß von Aminendgruppen gegenüber Carboxylendgruppen oder ein Überschuß
von Carboxylendgruppen gegenüber Aminendgruppen von mindestens 100 quivalenten je
106 g Polyearbonamid vorhanden ist.
-
Die Verwendung eines Polycarbonamids mit einer unausgewogenen Konzentration
an Endgruppen besitzt den Vorteil, daß eine höhere Konzentration an Enzym gebunden
werden kann.
-
tZeiterhin wird dadurch eine hohe Konzentration an Endgruppen erzielt,
ohne daß man ein Polyamid mit niedrigem Molekulargewicht verwenden muß, das aufgrund
dieses niedrigen Molekulargewichts eine schlechte Abriebbeständigkeit aufweist.
-
Das aktive Enzym kann von irgendeiner geeigneten tierischen, pflanzlichen
oder mikrobiologischen Quelle stammen. Beispiele für Enzyme, die gemäß der Erfindung
verwendet werden können, sind Penicillinamidase, Glucoseoxydase, Glucoseisomerase,
Ribonuclease, Trypsin, Ficin, Subtilisin, Catalase, Pepsin, Papain, Carboxypeptidase,
Rennin und Chymotrypsin. Gemische von Enzymen können ebenfalls verwendet werden.
Viele dieser Enzyme sind im Handel erhältlich.
-
Das Enzym kann an das Polycarbonamid direkt oder indirekt über eine
Zwischengruppe gebunden sein. Die Zwischengruppe kann sich beispielsweise von einer
difunktionellen Verbindung ableiten, wie z.B. von einem Dialdehyd, einem Bisamidester,
einem monomeren Polyisocyanat oder einem Disulfonylhalogenid.
-
Beispiele für Dialdehyde sind Glyoxal, Glutaraldehyd, Malonaldehyd
und Bernsteinaldehyd.
-
Beispiele für monomere Polyisocyanate sind Xylylendiisocyanat, Toluol-2,4-diisocyanat,
Diphenylmethan-4,4'-diisocyanat, 3-Methyldiphenylmethan-4,4'-diisocyanat, 1,1-Bis-(4-isocyanatophenyl)-cyclohexan,
m-Phenylendiisocyanat, p-Phenylendiisocyanat, Chlorophenylen-2,4-diisocyanat, Naphthalin-1,5-diissocyanat,
Diphenyl-4,4'-diisocyanat, 3,3-Dimethylpehnyl-4,4'-diisocyanat und Diphenyläther-4>4'-diisocyanat.
-
Beispiele für Bisamidoester sind diejenigen, die sich von Dicarbonsäuren
mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen, wie z.B.
-
Dimethyladipimat, ableiten beispiele für Disulfonylhalogenide sind
lQaphthalin-1,5-disulfonylchlorid, Naphthalin-1,6-disulfonylchlorid, Naphthalin-2,5-disulfonylchlorid
und Benzol-1,3-disulfonylchlorid.
-
Der Träger kann irgendeine geeignete Form aufweisen, wie z.B. die
Form von Teilchen, Perlen, Fasermaterialien, Schaummaterialien oder porösen Materialien.
Zumindest die Oberfläche des Trägers muß aus einem Polycarbonamid mit einer unausgewogenen
Konzentration an Aminendgruppen und Carboxylendgruppen bestehen. Es kann aber auch
der gesamte Träger aus dem unausgewogenen Polycarbonamid bestehen.
-
Geeignete Polycarbonamide sind beispielsweise -diejenigen, die durch
Polykondensation eines Diamins und einer Dicarbonsäure erhalten werden. Beispiele
für solche Polycarbonamide sind
Poly(hexamethylenadipamid, Poly(decamethylenadipamid),
Poly(hexamethylensebacamid) und Mischpolymere davon.
-
Die unausgewogene Konzentration an Amin- und Carboxylendglurpen kann
dadurch erreicht werden, daß man einen überschuß an Diamin oder Dicarbonsäure bei
der Polymerisatiori des Polycarbonamids verwendet. Alternativ kann die unausgewogene
Konzentration an Endgruppen dadurch erreicht we raen, daß man eine herkömmliche
Polycarbonamidopolymerisatlon ausfahrt und gegen Ende der Polymerisation ein Mittel
zugibt, das dazu fähig ist, beispielsweise Carboxylendgruppen in Aminendgruppen
umzuwandeln.
-
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutern.
-
Beispiel 1 5240 Teile Hexamethylendiammoniumadipat, 162,4 Teile Hexarethylendiamin
und 5792 Teile Wasser wurden in einen Autoklaven aus rostfreiem Stahl eingebracht,
der verschlossen, evakuiert und mit Stickstoff gefüllt und 70 min unter einem Druck
von 17,5 at auf 21800 erhitzt wurde. Der Druck wurde durch langsames Ablassen von
Dampf auf 17,5 at gehalten, währenddessen die Temperatur während weiterer 70 min
auf 214000 angehoben wurde. Der Druck im Autoklaven wurde dann langsam während einer
Stunde auf atmosphärischen Druck abgesenkt, währenddessen die Temperatur auf 2780C
angehoben wurde. Diese Temperatur wurde weitere 35 min aufrechterhalten.
-
Das resultierende Polyamid wurde in Wasser extrudiert. Nach einem
Trocknen und Mahlen hatte das Polymer eine relative Viskosität von 6,0 und enthielt
392,7 Aminendgruppenäquivalente und 13,5 Carbonsäureendgruppenäquivalente Je 106
g Polymer.
-
Der Ausdruck "relative Viskosität", wie er hier verwendet wird, ist
das Verhältnis der dynamischen Viskosität einer 8,4-igen (G/G) Lösung des Polyamids
in einer 90%igen (G/G) Ameisensäurelösung zur dynamischen Viskosität der Ameisensäure
lösung, wobei die Bestimmungen bei 25 0C durchzuführen sind.
-
0,5 g Nylonteilchen (53-1251u) wurden in 25 ml einer 2%igen wäßrigen
gepufferten Lösung von Glutaraldehyd suspendiert, und die suspension wurde 13 min
bvei 1°C gerührt. Das Nylon wurde mehrere Male mit 0,05m Phosphatpuffer bei einem
pH von 7,0 gewaschen und dann in 10 ml des gleichen Puffers, der ß-Gylactosidase
enthielt, suspendiert. Nach 2 1/2 st bei 1°C wurde das Nylon durch Filtration gewonnen
und mit Phosphatpuffer, hierauf mit Puffer der 1M NaCl enthielt und nochmals mit
Puffer gewaschen.
-
Das fJylon-ß-galactosidasederivat enthielt 0,8 mg Protein/ g Nylon
und hatte eine Aktivität von 16,7/u-Mol/min/g Nylon, enn die Bestimmung bei 37 0C
unter Verwendung von o-Nitrophenylgalactosidase ausgeführt wurde.
-
Beispiel 2 52140 Teile Hexamethylendiammoniumadipat, 116 Teile Hexamethylendiamin
und 5750 Teile Wasser wurden wie in Beispiel 1 in einen Autoklaven eingebracht.
Der Behälter wurde verschlossen, evakuiert, mit Stickstoff gefüllt und 75 min auf
210°C und unter einem Druck von 17,5 at erhitzt. Der Druck wurde durch langsames
Dampfablassen auf 17,5 at gehalten, währenddessen die Temperatur während weiterer
75 min auf 2400C gesteigert wurde. Der Druck im Autoklaven wurde dann langsam
während
1 st auf atmosphärischen Druck herabgesetzt, währenddessen die Temperatur auf 2760C
gesteigert wurde. Diese Temperatur wurde weitere 35 min aufrechterhalten. Das resultierende
Polyamid wurde als Band aus dem Autoklaven extrudiert.
-
Nach dem Abschrecken, Schnitzeln, Trocknen und Mahlen besaß das Polyraer
eine relative Viskositat von 114,8 und enthielt 270,5 Aminendgruppenäquivalente
und 15,5 Carbonsuureendgruppen-(cuivalente Je 106 g Polymer.
-
Nylonteilchen verschiedener Teilchengrößenfraktionen wurden wie oben
mit Glutaraldehyd behandelt und dann in einer Lösung von Glucoseoxydase und Catalase
in einem 0,05m Phosphatpuffer mit pH 7,0 suspendiert. Nach 2 st bei 100 wurde das
Nylonderivat mit Phosphatpuffer vom pH 5,9, dann mit Puffer, der 1M NaGl enthielt,
und abschließend wieder mit Puffer gewaschen.
-
Die Nylon-Glucoseoxydase/Catalase-Präparate wurden bei einem pH von
5,9 und 300C untersucht. Die Aktivitäten waren wie folgt: Teilchengröße Aktivität
Cu-Mol Glucose hydrolysiert/min/g Nylon 850-355µ 0,17 855-125Xu °,37 377- 0µ 1,16
Beispiel 3 Das Polyamid von Beispiel 1 wurde in flüssigem Stickstoff abgekühlt,
in einem Mischer gemahlen und trocken in die
folgenden Größenbereiche
gesiebt: (I) #53µ (II) 53 bis 125/u (III) 125 bis 212/u (IV) 212 bis 300µ 5 g gemahlene
Nylonteilchen wurden in 25 ml einer eigen wäßrigen Pufferlösung von Glutaraldehyd
(pH 7,0) suspendiert, worauf die Suspension 30 min bei 1 0C gerührt wurde. Das Nylon
wurde durch Filtration abgetrennt, mehrere iV'ale mit 0,01 ni Phosphatpuffer mit
pH 6,4 gewaschen und dann erneut n 22 ml der gleichen Pufferlösung suspendiert,
welcher 3 1 einer Lösung zugegeben worden waren, die Glucoseoxydase und Catalase
(Gluco-R, Sturge Chemicals) enthielt. Nach 2 st bei 1°C wurde das Nylon/Enzym-Präpart
durch Filtration abgetrennt, mit Pufferlösung, dann mit 1 m NaCl und dann zweimal
mit weiterer Pufferlösung gewaschen. Das immobilisierte Enzym wurde dann bei 30
0C auf Glucoseoxydaseaktivität untersucht. Es wurden die folgenden Resultate erhalten:
Teilchengröße Aktivität (µ-Mol/min/g Nylonträger) # 53µ 5,5 53 - 125 1,35 125 -
212/u 0,75 212 - 300µ 0,5 Vergleichsbeispiel Beispiel 3 wurde wiederholt, außer
daß das Polyamid aus Poly(hexamethylenadipamid) mit einer relativen Viskosität
von
38,6 und 94,1 Aminendgruppenäquivalenten und 48,0 Carbonsäurenedgruppenäquivalanten
je 106 g Polymer bestand.
-
Es wurden bei den Versuchen die folgenden Resultate erhalten: Teilchengröße
Aktivität (m-Mol/min/g Nylonträger) #53µ 1,45 53-125µ 1,0 125 - 212/u °,5 212 -
300/u 0,3 Dies zeigt, daß die Enzymaktivität schlechter ist, wenn das Polyamid einen
Überschuß von nur 46,1 Aminendgruppen gegenüber Carboxylendgruppen aufweist.
-
eispiel 4 g g der gemahlenen Polyamidteilchen von Beispiel 1 wurden
in 5 ml eines 0,1 m Phosphatpuffers mit pH 7,0 suspendiert, er 10% (G/V) Glutaraldehyd
enthielt. Die Suspension wurde 1 st bei 1 0C gerührt. Das Nylon wurde durch Filtration
abgetrennt, dreimal mit der Pufferlösung gewaschen und dann erneut in 5 ml der gleichen
Pufferlösung suspendiert. Nach Zusatz von 5 mg Alkoholdehydrogenase (Böhringer Ltd.)
wurde die Suspension 18 st bei 1 0C gerührt. Nach dem Waschen des Puffers rnit 1
m NaCl und weiterer Pufferlösung wurde das immobilisierte Enzympräparat bei 300C
und pH 6,5 in Gegenwart von 0,2 M Äthanol, 0,05 M Semicarbvazid#HCl und 10-3 M NAD
untersucht. Die Aktivität war 13µ-Mol/min/g Nylon.