DE2302099A1

DE2302099A1 - Verfahren zur herstellung von trans4-n-propyl-l-prolin und trans-4-aethyl-lprolin

Info

Publication number: DE2302099A1
Application number: DE2302099A
Authority: DE
Inventors: Malcom Edward Bergy; Bruce Wenzel Churchill; Brenda Joyce Rakow
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1972-01-24
Filing date: 1973-01-17
Publication date: 1973-08-02
Also published as: JPS5631119B2; JPS5581585A; NL7300743A; GB1401711A; AU5077173A; US3753859A; CH582240A5; FR2169139B1; CA984777A; BE794451A; FR2169139A1; JPS5741234B2; AU466195B2; JPS4882086A; NL175070C; NL175070B

Description

RECHTSANWÄLTE

DR. JUR. DHL -CHEM. V/ALTER BEIL

AtfRtU H-Jiii^Jea

DR. JUS. üi:■' ,..- .... ;,..-*. woLFF 2302099

dr. J-J^. h.v. .:,.... uu, i6.Jan.iC73

FRANKTl¹Si AM MAiN-HOCHSf "

JUftlOHSlKASifcSJ

Unsere Mr/ 18 399

The Upjohn Company
Kalamazoo, IJich., USA

Verfahren zur Herstellung von trans-4-n-Propyl-juprolin und trans-4-£"thyl-l-proiin.

Lincomycin ist ein Antibiotikum, welches durch ein £errnentatives Verfahren unter Verv/endung- des Mikroorganismus Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis erhältlich ist. In .der US-PS 3 o36 912 werden Fermentation und Aufarbeitung von lincomycin, das bisher unter der Bezeichnung Lincolnensin bekannt war; beschrieben, lincomycin B, eine Stickstoffbase mit der Summenfonsel Ο.^Η,ρ^ο^β³'^wirö gleichzeitig bei der fermentativen Lincomycinherstellung gebildet. Die US-PS 3 359 164 beschreibt die Gewinnung von Lincomycin B aus 1-incoiaycin-Gärbrü.hen der in der US-P3 3 oS6 912 beschriebenen Art. Obgleich Lincomycin und Lincomycin B gegenüber praktisch dem gleichen Spektrum an liikroorganismen wirksam sind, ist die Wirksamkeit des Lincomycin B bekanntlich wesentlich geringer als die des Lincomycins. Lincomycin stellt daher das bevorzugte Antibiotikum dar.

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Aus der US-PS (US-Patentanmeldung Nr. 67 966 von

28. August 197o) ist bekannt, dato der Einsatz einer wirksamen Menge der Aminosäurejßropylprolin in einem Lincomycin-ITermenta- ■ tionsmedium, beis^ie~s|lweise der in der U3-PS 3 086 912 beschriebenen Art, die Menge an Lincomycin B in der IPennentationsbrühe vermindert. Diese Verminderung des Lincomycin B-Gehalts in der Fermentationsbrühe erleichtert die Gewinnung von Lincomycin und führt zu höheren Ausbeuten an lincomycin aus den genannten Brühen.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist die Verwendung einer neuen Mutante von Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis in einer gesteuerten Fermentation, wobei man hauptsächlich trans-4-n-Propyl-L-prolin (das auch als Propylprolin bekannt ist zusammen mit geringen Mengen (7-9/£ der Gesamt-Proline) trans-4--£th;yl-L-prolin erhält. Diese aminosäuren sind brauchbar als Zwischenprodukte zur Herstellung antimikrobiell wirksamer Lincomycinanaloga (siehe U3-P3 3 33o 992).

Der zur Herstellung von trans-4-n-Propyl-L-prolin und trans-4-Äthyl-L-prolin gemäß vorliegender Erfindung verwendete Pilz ist der Streptomyces lincolnensis, Stamm BAB-3· Sin Charakteristikum dieses Stammes ist die Produktion der genannten Aminosäuren, üine Subkultur des lebenden Organismus kann auf Anfrage beim Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Services, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois,.U.S.A., erhalten werden. Die Hinterlegungsnunimer lautet NERL 5321. ,

Streptomyces lincolnensis Stamm BA3-3 wurde mit der Stammkultur Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis, NRRL 2936 verglichen.

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Beide Kulturen besitzen ein ereme-farben bis rosa bis graues Luf twachstuci, sie sind Melanin-positiv und haben lange geade Sporophoren, welche rechteckige glatte Sporen mit Leinwandbindungs-ähnlicher Überflächenstruktur tragen.

Die Kulturen zeigen gleiches Verhalten bezüglich der Asämilation von Kohlenstoffverbindungen wie von kason et al. angegeben (s. Mason, D.J., A. Dietz und C.DeBoer (1962) Lincomycin, A new Antibiotic, I. Discovery and Biological Properties. Antimicrobial Agents and Chemotherapy-1962, S. 554-559)· Die Staimnkultur zeigt eine braune Unterseite auf synthetischem Medium mit i)-j?ructose, D-Glucose, Sucrose, Lactose, Raffinose, Inulin und Glycerin, was bei der Itutante nicht der Fall ist.

In dem von Shirling und Gottlieb (s. Shirling, E.B. und D. Gottlieb (1966) Methods for Characterization of Streptomyces Species, Int. J. System, Bacteriol. J_6:313-34o) angegebenen synthetischen Medium wuchsen beide Kulturen ' im negativen Vergleichsversuch (ohne Zusatz von Kohlenstoffverbindungen) sowie im D-Glucose-Vergleicn? Das⁰., ach st um war stark auf dem synthetischen Kediuia mit 1-Arabinose, Sucrose, D-IIylose, Inosit und iiaffinose und gut mit D-Kannit, D-j?ructose und Hhamnose; die Ergebnisse auf Cellulose sind zweifelhaft. Die Kulturen unterschieden sich in der Färbung ihres Wachstums auf den genannten Kohlenstoffverbindungen, wie in tabelle I angegeben.

Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis NRRL 2936 produzierte das Antibiotikum Lincomycin, während die Mutante Streptomyces lincolnensis Stamm BAB-3 trans-4-n-Propyl-L-prolin und trans-4-Athyl-L-prolin erzeugt.

Die Charakteristika von Streptomyces lincolnensis BAB-3 WRRL 5321 werden in filgender Tabelle angegeben:

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Tabelle I

Y/achstumsunterschiede von S. lincolnensis-Kulturen auf einigen Kohlenstoffverbindungen in synthetischem lledium

Kohlenstoff- S.lincolnensis S.lincolnensis var lincolnensis verbindung BAB-3 NRHL 29 36

D-Glücose

Sucrose
D-Mannit
D—Fructose

Rhamnose
Raffinose

rosa Luftwachsturn, braune Unterseife

Gelbe Unterseite kein Pigment

rosa Luftwachstum, kein Pigment

rosa Luftwachstum kein Pigment

kein Pigment

grün-graues vegetatives V/achstUm

Melanin-positiv

braune Unterseite Melanin-positiv

grün-graues vegetatives. V/a c hs turn

grün-graues vegetatives Wachstum

Melanin-positiv

grün-graues vegetatives Wachstum

Melanin-positiv

Eelanin-positiv

Shirling, E.B., und D. Gottlieb (1966) Methods for Characteriation of Streptomyces Species, Int.J.System. Bacteriol. " 16:313-340.

Wan erhält trahs-4-n-Propyl-L-prolin und trans-4-Athyl-L-prölin gemäß vorliegender Erfindung, indem man den neuen lviik ro Organismus in wässrigem Nährmedium unter submers-aeroben Bedingungen züchtet. Selbstverständlich können zur Herstellung begrenzter Lengen auch Öberflächenkultüren, z.B. flaschen, verwendet werden. Der Organismus wird in einem Nähnnediuia gezüchtet, welches eine Kohlenstoffquelle, z.B. ein assimilier-

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-ο-

bares Kohlehydrat, und eine Stickstoffquelle, z.B. eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder Proteinmaterial, enthält. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind z.B. Glucose, Rohzucker, Sucrose, Glycerin, Stärke, kaisstärke, Lactose, Dextrin, belasse und dgl. Bevorzugte Stickstoffquellen sind z.B. Corn Steep Liquor, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Ifilehfeststoffe/j ^uo;jabobnenmehl, Baumwollsamenmehl, Maismehl,· üilchfeststoffe, mit Pancreas verdautes Casein, Brennereifeststoffe, tierische Peptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenschnitzel und dgl. Zweckmäßig werden Gemische dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen eingesetzt. Der Zusatz von Spurenmetallen wie Zink, Magnesium, Hangan, Kobalt, Eisen und dgl. ist gewöhnlich nicht erforderlich, da man mit Leitungswasser und ungereinigten Komponenten die Medien zusammenstellt.

Me Produktion von trans-4-n-Propyl-L-prolin und trans-4-Äthyl-L-prolin erfolgt im erfindungsgemäiaen Verfahren bei einer beliebigen Temperatur, die zu einem befriedigenden Vv^rachstum des neuen Mikroorganismus führt, beispielsweise zwischen etwa 13 und 4o C und vorzugsweise zwischen etwa und 32°Ü. Gewöhnlich wird eine optimale Produktion an trans-4-n-Propyl-L-prolin und trans-4-Äthyl-L-prolin innerhalb etwa 2 bis 11 Tagen erhalten. Das Medium kann basisch bleiben oder während der Fermentation sauer werden· Der Bnd-pH-Vert hängt zum Teil von den gegebenenfalls vorhandenen Puffern und zum Seil vom Ausgangs-pH-Yiert des Kulturmediums ab.

Wird das wachstum in großen Gefäßen oder Tanks durchgeführt, so verwendet man vorzugsweise die vegetative und nicht die Sporenform des Mikroorganismus zur Inokulierung, um einen spürbaren Zeitverlust bis zur Produktion von. trans-4-n-Propyl-L-prolin und trans-4-Äthyl-L-prolin und damit verbundene schlechtere Ausnutzung der Anlage zu vermeiden. Es empfiehlt

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sich somit, ein vegetatives Inokulira in einer Hährbrühenkuitur herzustellen, indem man diese Brühenkul'tur mit einer Portion aus einer Boden- oder Schrägnährkultur inokuliert. Sobald ein junges aktives vegetatives Inokulum auf diese v»eise sichergestellt wurde, wird es aseptisch in groiae Behälter oder x'anks überführt. Das zur Herstellung des vegetativen Inokulums verwendete Medium kann gleich oder verschieden von dem bei der Produktion von trans-4-n-Propyl-L-proiin und trans-4-Athyl-L-prolin verwendeten Kedium sein, solange es nur derart beschaffen ist, daa ein gutes V.achstum des Mikroorganismus erzielt wird. Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus kann auch in den in der US-PS 3 086 912 beschriebenen Medien und unter den dort angegebenen Bedingungen gezüchtet werden.

Die Verbindungen trans-4-n-Propyl-L-prolin und trans-4-Ä'thyl-i,-prolin werden isoliert, indem man zunächst die Fermentationsbrühe filtriert oder zentrifugiert, um Itycel und ungelöste Feststoffe zu entfernen, worauf man die filtrierte Brühe an einer harzgefüllten Säule adsorbiert. Hierzu können nicht-ionische (bevorzugt) wie auch kationische Austauscherharze verwendet werden. Sowohl Carbonsäure- wie Sulfonsäureharze kommen infrage (geeignete nicht-ionische Harze sind Harze enthaltend ein nicht-ionisches makroporöses, mit Divinylbnezol vernetztes Polystyrol. Nicht-ionische Harze dieser Art sind unter den Handelsbezeichnungen "Amberiite XAD-1 und XAD-2" erhältlich und in der US-PS 3 515 717 beschrieben. Geeignete Carbonsäureharze sind z.B. Polyacrylsäureharze, die durch Mischpolymerisation von Acrylsäure und Divinylbenzol nach dem Verfahren von Kunin, Ion Exchange Resins, 2. Aufl. (1958), S. 87» John wiley and Sons, Inc. erhalten werden. Carbonsäure-Kationenaustauscherharze dieser Art sind unter den Handelsbezeichnungen "Amberlite IHC-50" und "Zeokarb 226" erhältlich. Geeignete SuIfonsäureharze sind z.B. am Kern

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_ ¹J _ ·

sulfonierte und mit Divinylbenzol vernetzte Polystyrolharze, die nach dem von Kunin, loc. cit., S. 34 beschriebenen Verfahren erhalten werden kennen. Sulfonierte Kationenaustauscherharze dieser Art sind unter den Handelsbezeichnungen "Dowex-50", "Amberlite IE-12Ü¹¹, "Naleite HUR", "Chempro G-20", "Permutit Q" und "Zeokarb 225" erhältlich).

Gemäß einer bevorzugten Arbeitsweise werden trans-4-n-Propyl-L-prolin und trans-4-A"thyl-L-prolin aus der filtrierten Gärbrühe mit "Amberlite XaD-2" (nicht-ionisches Harz) extrahiert und mit Aceton und nasser im Verhältnis 1:1 eluiert. Die Eluierung kann durch üiinnschichtenchromatographie wie nachstehend beschrieben verfolgt v/erden, dann werden an trans-4-n-Propyl-L-proiin oder trans-4-Äthyl-L-prolin reiche Fraktionen ausgewählt, vereinigt, zu einer wässrigen Phase eingeengt und gefriergetrocknet. Diese rohen iroekenpräparate könne zur Inhibierung der Bildung von Lincomycin B bei einer Lineomycin-Fermentation verwendet werden. Gegebenenfalls können sie durch Verteilungschromatographie an "Dicalite 4200" mit dem Lösungsmittelsystem Methylethylketon/ V/asser weiter gereinigt werden, wobei man den Verlauf diinnsehichtenehromatographisch verfolgt. Die die Propyl- oder Äthylproline enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und getrocknet und die Trockenrückstände werden zur Kristallisation mit absolutem Äthanol vermischt.

Bei der Aufarbeitung unter Verwendung von Kationenaustauscherharz v/erden die Propyl- und Äthylproline aus der filtrierten Gärbrühe oder anderen wässrigen Lösungen mit Kationenharzen wie "Dowex 50-X12" (Dow Chemical Co., Kidland, Michigan) absorbiert und mit einer basischen Lösung eluiert, beispielsweise mit 5oⁱ;iiger Ammoniumhydroxydlösung bei einem pH von etwa 11, wobei der Verlauf durch Dunnsehichtenchroinatograinm verfolgt wird. Ausgewählte Eluatfraktionen können gegebenen-

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falls weiter gereinigt werden, beispielsweise durch Ohromatographieren an ".Dicalite" und Kristallisation, wie oben beschrieben.

i¹rans-4-n-Prop;y^rl-l-proiin und trans-4-Äthyl-L-prolin können, beispielsweiee in Säuleneluaten, du<rch Dünnschichtenchromato- _y graphie wie folgt nachgewiesen werden: Platten von 1o χ 2o cm werden aus Silikagel Ηϊρ^. (lierek A.G. Darmstadt) hergestellt. Die zu untersuchenden Lösungen werden unter Stickstoff zur l'rockene eingeengt, in der geringsten kenge kethanol gelöst und aufgetropft. Die Platten wprden mit einem 75:25-Gemisch aus 95/^S^eni Äthanol und V/asser behandelt, getrocknet und wie beim- Aminosäurenachweis mit liinhydrin besprüht. Zum Vergleich werden Standardflecke verwendet, die bekannte Lengen trans-4-n-Propyl-L-prolin oder trans-4-Äthyl-L-prolin enthalten und die Eeurteilung der unbekannten Konzentrationen erlauben.

trans-4-n-Propyl-l-prolin und trans-4-Äthyl-L-prolin können auch durch Dampfphasenchromatographie bestimmt werden. Zu einer trockenen Probe, die etwa 5 mg G-esamt-proline enthält, wird 1 ml der inneren Standardlösung (1 ml Eexadecan in 2oo ml Pyridin) und 1 ml iJjO-Sistrimethylsilylacetaniid-lösung (Pierce Chemical "Co-., üoekford, 111) zugegeben, dann Iäi3t man unter gelegentlichem Schütteln 3o Minuten bei .Raumtemperatur stehen. Die bilylierung ist beendet, sobald die Probe vollständig gelöst ist, und die silylierten Verbindungen sind mindestens 24 Stunden beständig. Das silylierte Gemisch wird in einem Gaschromatographen (i¹ und Iu kodell 4o2) mit i'lainmionisationsdetektor chromatographiert unter Verwendung einer ID-GIassäule von 1So cm χ 3 inn» die mit 37^ OV-1 auf Gas Chrom Q (TeilchengröJie o,15-o,o7 mm.), gepackt ist,' Ofenteniperatur 110⁰C, Plash-jJrhitzer und Detektor 14o°C.

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Zur Kalibirierung werden Yergleichsmessungen durchgeführt. Die dampfphasenchromatographische Analyse ist am zuverlässigsten bei relativ gereinigten Lösungen.

Das erfindungsgemäfie Verfahren, das zwar im einzelnen am Beispiel des neuen Mikroorganismus ötreptomyces lineolnensis Stamm BAB-3, RRBL 5321 beschrieben wurde, ist jedoch nicht auf diesen Mikroorganismus oder auf Mikroorganismen, die durch die angegebenen Kultureigenschaften vollständig beschrieben werden, beschränkt. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung anderer Stämme oder Iviutanten des genannten Mikroorganismus, die nach bekannten Methoden erhalten werden können, beispielsweise indem man den neuen kikrοOrganismus einer Röntgenstrahlung oder Ultraviolettstrahlung aussetzt, oder der Einwirkung von Stickstofflost, Phagen oder dgl. unterwirft. In den folgenden Beispielen beziehen sich sämtliche Prozentangaben auf das Gewicht und die Lösungsmittelanteile auf das Volumen, falls nichts anderes gesagt wird.

Beispiel 1

Ein Schrägnährboden von Streptomyces lincolnensis Stamm BAB-3, UEKL 5321 wird zur Inokulierung einer Serie von 5oo ml— Erlenmeyerkolben verwendet, von denen jeder 1oo ml Impfmedium aus folgenden Komponenten enthält:

Yeaäolac⁺ 1o g

Grlucose-nonohydrat 1o g

HZ-Ämine B⁺⁺ 5g

Leitungswasser auf 1 1

⁺ Yeastolae ist ein Proteinhydrolysat aus Hefezellen, Ver-

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- ίο -

trieb A.E. otaley Manufacturing(Jo., Decatur, Illinois. llZ-Ämlne B ist enzymatisch verdautes Casein (Sheffield's)

Der pH-v/ert bei der Vorsterilisierung des Impfmediums wird auf 7,3 eingestellt. Die Züchtung erfolgt während 2 Tagen bei 28°G auf einer (xunap-Schüttelmaschine mit 25o UpM.

Inokulum des obigen Impfmediums (5 ml) werden jeweils in 5oo El-ErlBnmeyerkolben zugegeben, von denen jeder 1oo ml. .folgenden -ienaentationsmediums enthält:

Black 3trap-Melasse	6o g/l
Hi-Stärke⁺	6o/ g/l
Pharmamedia ⁺	25 g/l
CaGO₃	6 g/l
KpSO (techn.) TT +++ Uc on	2 g/l
Leitungswasser	1 ml/1
Eest

Maismehl, Hersteller Illinois Cereal IvJills, inc., Paris, Illinois.

⁺⁺ Baumwollsamenciehl -technischer Qualität, Hersteller 'trader's Oil fcill Company, j'ort worth, Texas.

⁺⁺ Polyalkylenglycol-SchauEverhiiter, Vertrieb durch Union Carbide Corp., Chemicals Division, I0421 \v. 7 kile iioad, Detroit, Michigan 43221.

Die Kolben werden 7-11 Tage auf einer Gump-Schüttelmaschine bei 28°C und 25o UpM gehalten.

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Beispiel 2

Die gesamte Brühe einer BAB-3-Fermentation (siehe oben) wird auf pH 6 eingestellt und unter Zusatz eines Filterhilfsmittels filtriert. Der Filterkuchen wird mit etwa i/io Volumen »»asser gewaschen, »»aschlösung und klares Filtrat werden vereinigt. Die vereinigte Brühe wird durch eine Säule mit "Amberlite XAD-2"-Harz (o,33 1 Harz/l Brühe) mit einer DurchfiuiSgesehwindigkeit von o,5 Harzvolumen pro Stunde geleitet, dann wird die Säule mit Luft durchblasen, aber nicht gewaschen, -anschließend wird mit 1:1 Aceton-Wasser eluiert, wobei die obige Durchfluügeschwindigkeit engewandt una^a^nns^^obenchromatographisdh verfolgt wird. Auf diese ».eise ergeben 1o 1 G-ärbrühe aus einer BAa3-3-2ankfermentation eine ausgeschöpfte Brühe mit nur Spuren an Propylproiin, während das gefriergetrocknete iSluat (84»2 g) an dieser substanz reich ist.

Das gefriergetrocknete Konzentrat wird an einer "Dicalite 42üü"-oäule chromatographiert unter Verwendung von 4o g Dicalite pro G-ramm trockenem Konzentrat. Lan stellt sodann ein Gemisch aus 1o Volumenteilen Lethyläthylketon und 2 Volumenteilen »vasser her und zerlegt dieses, in die beiden Phasen. Die Säule wird vorbereitet, indem man das Dicalite mit einer solchen Menge der oberen Phase vermischt, daß nach Zusatz der unteren Phase Fließfähigkeit entsteht, v/orauf man die untere Phase (etwa o,4 ml/g Dicalite) zusetzt, packt und ablaufen läßt. Das gefriergetrocknete Konzentrat wird in der unteren Phase gelöst (1 g/3 ml), mit Dicalite (2 g/Έΐ der zum.Auflösen verwendeten unteren Phase) und zur Erzielung von Fließfähigkeit ausreichenden Lengen oberer Phase vermischt, sorgfältig auf die Säule gegossen und ablaufen gelassen. Die Säule wird mit frischer oberer Phase bei einer Flieiigeschwindigkeit von etwa 4oo ml/Std./kg Dicaliteschicht entwickelt. Fraktionen von

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etwa 1 1 auf je 2 kg Dicalitescnicht werden entnommen und dünnschichtenchromatographisch untersucht, ausgewählte Fraktionen (in diesem Pail an trans-4-n-Propyl-L-prolin reiche Praktionen) werden zur wässrigen Lösung eingeengt und gefriergetrocknet.

Das resultierende gereinigte Konzentrat wird in der geringstmöglichen Volumenmenge absoluten Äthanols suspendiert und die Peststoffe v/erden mit der geringstmöglichen Kenge absoluten Äthanols gewaschen. Die gewaschenen Kristalle werden unter Erwärmen aus absolutem Äthanol umkristallisiert.

Eigenschaften von trans-4-n-Propyl-l-prolin :

Parbei - weiß
Kohlenstoff: 6o

Wasserstoff: 9

Stickstoff: 3

Suiamenf ormel: C_OH_HE-;

J(H₂O): -51⁰

/^7|⁵(5KHC1): -28°

Schmelzpunkt: 226,3-227,o°C

UV (HpO): keine ilaxima bei 2oo-4oo m/U

Bassenspektruin: Iu+: 157

112: Ivl-f- - C

lonenbruchstüeke: 69: ii+ -00„H - C₂E₇ ·

Titration: nicht titrierbar.

Beispiel 3

Wiederholt man das Verfahren von Beispiel 2, jedoch unter Auswahl und Weiterverarbeitung der an trans-4-Äthvl-L-prolin reichen i'raktionen, die nach den vorstehend beschriebenen iiests

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ermittelt werden können, so erhält man das gereinigte trans-4-Äthyl—L-prolin.

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Claims

-η-

Patentansprüche

\ΛΪ Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von trans-4-n-Propyl-1-prolin und trans-4-Äthyl-l-prolin, dadurch gekennzeichnet, dai3 man Streptomyees Lincolnensis Stanm JBAB-3 mit den charakterisierenden Eigenschaften von UERL 5321 oder Jiutanten davon in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet.

.2. Verfahren nach .Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das v/ässrige Nährmedium eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und für assimilierbaren Stickstoff enthält.

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daJ3 man trans-4-n-Propyl-L-prolin und trans-4--h-th^l-I.-prolin aus der jtf'ermentationsbrühe isoliert.

4· Verfahren zur Isolierung von trans-4-n-Propyl-L-prolin aus einem trans-4-n-Propyl-L-prolin und trans-4-Äthyl-L-prolin enthaltenden Gemisch, dadurch gekennzeichnet, daii man das Gemisch einer Harzabsorption unterwirft, mit einem organischen Lösungsmittel, in welchem die Proline löslich sind, eluiert, die Eluate chromatographisch reinigt und gesonderte Fraktionen· der genannten Proline isoliert.

5- Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Harz ein nicht-ionisches makroporöses Copolymer aus mit Hivinylbenzol vernetzten! Styrol und als Lösungsmittel Aceton/vvasser im Verhältnis 1:1 verwendet.

6; Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das trane~4-n-Propyl-L-prolin und tranc--4--'i-thyl-L- prcl:^rn enthaltende Harzeluat durch eine Chromatographiersäule mit

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Diatoineenerde leitet und die Säule mit der oberen Phase eine3 Lösungsinittelgemischs aus tlethylathylketon und wasser im Verhältnis 1o:2 entwickelt, wobei man die Proline in gesondertei Fraktionen erhält.

7. Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von trans-4-n-Propyl-L-prolin, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces lincolnensis Stamm BAB-3 mit den charakterisierenden Eigenschaften von NEIiL 5321 oder dessen Mutanten in einem wässrigen ITährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das trans-4-n-Propyl-L-prolin aus der j?ermentationsbrühe isoliert.

9· Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von trans-4-^ Äthyl-L-prolin, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces lincolnensis Starcm BA3-3 mit den■charakterisierenden Eigenschaften von ITItKL 5321 oder Mutanten davon in einen wässrigen Hährmediun unter aeroben Bedingungen züchtet.

1o. Verfahren nach Anspruch 9>. dadurch gekennzeichnet, daß man das trans-4-Äthyl-L-prolin aus der Fermentationsbrühe isoliert.

Für: -The Upjöhri XT<pf>any

Kalamazoo,-Mf/ch.., V.St.A.

(Dr. H.IJ* Wolff) Rechtsanwalt

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