DE2300478C3 - Verfahren zur aeroben Züchtung von Hefen in synthetischen Medien - Google Patents

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Bisher werden derartige Züchtungen in synthetischen Medien, die alle erforderlichen Nährstoffe enthalten. von denen Kalium und Phosphoroxid im Form von Kaliumdihydrogenphosphat und Stickstoff in Form eines Ammoniumsalzes einer starken Mineralsäure vorhanden sind, so durchgeführt, daß die zur Neutralisation der aus dem Ammoniumsalz bei der Hefeproteinsynthese frei werdenden Mineralsäure und zur Aufrechterhaltung des festgelegten optimalen pH-Wertes erforderliche Base gemeinsam mit der Kohlenstoffquelle zudosiert wird. Die gleichzeitig dosierte Zugabe von Base und Kohlenstoffquelle wird dabei mittels eines auf den optimalen pH-Wert eingestellten Regel-pH-Meters gesteuert. Von diesem pH-Meter wird ein Impuls für die Zudosierung geliefert, wenn der pH-Wert des Kulturmediums unter den eingestellten Sollwert absinkt.

Dabei wird die Tatsache ausgenutzt, daß die dem Verbrauch an Ammoniumionen aus dem Salz der starken Mineralsäure entsprechende Menge der freigesetzten Säure der gebildeten Hefenmenge mit einem bestimmten Gehalt an stickstoffhaltigen Stoffen proportional ist. Dieser Menge ist auch die äquivalente Menge der Base, die zur Regelung des pH-Wertes des Kulturmediums auf den Optimalwert angewandt wird, nrnnoriional. Wenn nun der durchschnittliche Stickstoffgehalt der gebildeten Hefemasse und der Ausbeute-KoefßzienA der Kultur bekannt sind, kann das Verhältnis von zudosierter Basemenge zur optimalen Menge an zuzusetzender Kohlenstoffquelle errechnet werden. Infolgedessen kann man durch parallele Zudosierung von Base und Kohlenstoffquelle im Verlauf der Züchtung den optimalen pH-Wert und die optimale Menge an kohlenstoffhaltigen Nänrstoffen aufrechterhalten.

Eine optimale Regelung der Zufuhr der Kohienstoffquelle ist jedoch nur dann zu erreichen, wenn das erforderliche Mengenverhältnis von Base und Kohlenstoffquelle richtig bestimmt wird, was nur bei gut erforschten und beherrschten Kultivierungsprozessen, bei denen ein stabiler Stickstoffgehalt in der erzeugten Biomasse und konstante Werte für den Ausbeutekoeffizienten erzielt werden, möglich ist. Bei weniger bekannten Kultivierungen, für die es nicht möglich ist. im voraus ein entsprechendes Verhältnis von Base und Kohlenstoffquelle genau /u bestimmen, kann es zur Erschöpfung oder zur Überdosierung der Kohlenstoffquelle kommen. Wenn keine Kohlenstoffquelle vorhanden ist, hört nun der Kultivierungsprozeß auf. während ein Überschuß an Kohlenstoffquelle zur Bildung von unerwünschten Metaboliten und Herabsetzung der Ausbeute führen kann.

Wenn die Kultivierung in solchen Fällen unter Anwendung des obenerwähnten Verfahrens durchgeführt wird, reagiert das pH-Meter bei Erschöpfung der Kohlenstoffquelle nicht und die Zudosierung setzt aus. Demzufolge hört natürlich auch der Kultivierungsprozeß wegen Abwesenheit von kohlenstoffhaltigen Nährstoffen auf. Das bisherige Verfahren mit einstigem Regel-pH-Meter kann daher für Züchtungen, bei denen sich der pH-Wert bei mangelnder Kohlenstoffquelle nicht in einer solchen Form ändert, auf die das Regel-pH-Meter ansprechen würde, nicht angewandt werden.

In Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Kulturmedien wird nämlich der Mangel an kohlenstoffhaltigen Nährstoffen in manchen Fällen dadurch merkbar, daß das Absinken des pH-Wertes aufhört und in anderen Fällen dadurch, daß der pH-Wert des Kulturmediums heftig ansteigt.

Die angeführten Nachteile beseitigt das erfindungsgemäße Verfahren.

Die Erfindung ist im Patentanspruch 1 definiert.

Die Patentansprüche 2 und 3 stellen vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung dar.

So kommt es z. B. bei der Züchtung der Hefe Candida utilis in einem Medium mit synthetischem Äthanol in dem Augenblick, in dem die Mikroorganismen das Äthanol verbrauchen bzw. aufbrauchen, zum raschen Ansteigen des pH-Wertes. Innerhalb einiger Minuten steigt der pH-Wert bis um 0,6 an. Bei diesem Kulturtyp wird zur Zudosierung der Kohlenstoffquelle das pH-Meter für zweiseitige Regelung mit einem eingestellten engen Regelbereich von 0,1 bis 0,6 pH, vorzugsweise 0,3 pH, benutzt.

Wenn der pH-Wert unter den unteren Wert des eingestellten Bereichs absinkt, wird eine Lösung der Base, am besten Ammoniak, oder eine Lösung der Base sowie die Kohlenstoffquelle zudosiert, wobei das Verhältnis der Menge der Kohlenstoffquelle zur Menge der Base niedriger ist, als dem aus dem vorausgesetzten Stickstoffgehalt in der Biomasse und dem Ausbeutekoeffizienten errechneten Verhältnis entspricht (vgl. hierzu den Patentanspruch 1). Bei Abwesenheit bzw.

Aufbrauch der Kohlenstoffquellc steigt nun der pH-Wert rasch an, und beim Oberschrehen der oberen Grenze des eingestellten pH-Bereichs wird die Kohlenstoffquelle zudosiert Durch Zugabe der Kohlenstoffquelle wird die Biosynthese der Eiweißstoffe wiederhergestellt, der pH-Wert sinkt rasch zum unteren Wert des eingestellten Bereichs ab, und der Prozeß wiederholt sich.

Als Beispiel für einen anderen Kulturtyp, bei dem es im Fall mangelnder Kohlenstoffquelle nicht zu einem raschen Anstieg des pH-Wertes, sondern nur zum Ausbleiben des Absinkens dieses Wertes kommt, kann die Züchtung der Hefe Candida lipolytica in einem Medium mit isolierten n-AJkanen dienen. Für diesen zweiten Kuliurtyp wird zur automatischen Zudosierung der Kohlenstoffquelle ein pH-Meter für einseitige Regelung mit angeschlossenem, durch einen Auöenimpuls aus dem pH-Meter gesteuerten Zeitschalter angewandt

Bei Anwesenheit der Kohlenstoffquelle im Nährmedium hat der pH-Wert infolge der Biosynthese der Eiweißstoffe und des allmählichen Verbrauchs der NH₄ ⁺-Ionen aus dem Ammoniumsalz der starken Mineralsäure eine sinkende Tendenz. Beim Absinken des pH-Wertes unter den eingestellten Wert wird die Lösung der Base, am besten des Ammoniaks oder die Lösung der Base sowie die Kohlenstoffquelle zudosiert wobei das Verhältnis der Menge der Kohlenstoffquelle zur Menge der Base wiederum niedriger ist. als es dem aus dem vorausgesetzten Stickstoffgehalt in der Biomasse und dem Ausbeutekoeffizienten errechneten Verhältnis entspricht (vgl. hierzu Patentanspruch 1)

Nach dem Aufbrauchen der Kohlenstoffquelle hört die Synthese der Eiweißstoffe sowie das Absinken des pH-Wertes auf, und der pH-Weri stabilisiert sich auf einen Wert der nur unbedeutend höher ist ah der auf dem pH-Meter eingestellte Wert. Mit dem Zeitgeber wird die Zeit von der letzten Zudosierung der Base gemessen; wenn es innerhalb von 1 bis 10 min, vorzugsweise innerhalb von 1.5 bis 2 min. nicht zu einer weiteren Zudosierung der Lösung der Base (gegebenenfalls Zudosierung der Base und der Kohlenstoffquelle) kommt, gibt der Zeitschalter einen Impuls zur Zudosierung der Kohlenstoffquelle.

Durch die Zugabe der Kohlenstoffquelle wird die Synthese der Eiweißstoffe rasch wiederhergestellt (nach 25 bis 50 see), der pH-Wert sinkt unter den eingestellten Wert, und es beginnt wiederum die Zudosierung der Lösung der Base, gegebenenfalls auch der Kohlenstoffquelle.

Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es allgemein für die Mehrzahl der Kulturtypen angewandt werden kann, ohne daß es zu Störungen bei der Zudosicrung der kohlenstoff- bzw. stickstoffhaltigen Nf*»rstoffe und zum Stillstand des Kultivierungsprozesses kommt.

Das neue Verfahren zur Züchtung von Hefen mit automatischer Zudosierung der Kohlenstoffquelle wird durch nachfolgende Beispiele erläutert.

Beispiel 1

In einem Laborgärgefäß mit einem Gesamtinhalt von 301 und einem Nutzinhalt von 15 I wurde eine einmalige Zuflußkultivierung der Hefe Candida lipolytica in einem Medium mit isolierten Paraffinen durchgeführt. Der Gärbottich war mit mechanischen Rührern versehen, die Geschwindigkeit der Sauerstoffauflösung betrug ■>«n mnl/l . h Die isolierten Paraffine enthielten 99,5Gew.-% n-Alkane, wobei die Kohlenwasserstoffe mit Cm bis C₁₇ mit einem spezifischen Gewicht von 0,77 g/ml überwogen.

Das für den vorausgesetzten Zuwachs der Hefen-Trockensubstanz von 10 g/l angewandte Grundmedium enthielt im Liter:

4g(NH₄)₂SO₄,
0.SgKH₂PO₄,
0,25gMgSO₄-7H₂O.
0,0IgZnSO₄ -7H₂O.

Zu den 151 des im Gärgefäß befindlichen Grundmediums mit einem pH-Wert Sfon 4,5 wurden ein Inokulum, das einer Anfangskonzentration der Hefen-Trockensubstanz von 2 g/l entsprach, sowie 10 g n-Alkane zugegeben, die für den Beginn des biosynthetischen Vorganges notwendig sind. Dann begann die eigentliche Züchtung bei einer Temperatur von 34 bis 35" C und einem pH-W^rt von 4,5.

Zur Regelung des pH-Wertes und automatischen Zudosierung der n-Alkane wurde ein pH-Meter für einseitige Regelung (durch Zugabe der Base) mit einem eingestellten pH-Wert von 4,5 benutzt. Bei Absinken des pH-Wertes des Medium:, unter den Wert von 4,5. setzte ein vom pH-Meter abgegebener Impuls die gekoppelten Dosierer für Ammoniaklösung und isolierte n-Alkane in Tätigkeit.

Die erforderliche Menge Ammoniak und isolierter n-Alkane wurde für einen Zuwachs der Hefe-Trockensubstanz von 10 g/l im Verlauf des gesamten Kultivierungsprozesses, für einen vorausgesetzten Stickstoffgehalt in der Trockensubstanz der Biomasse von 9,5% und für einen Ausbeute-Koeffizienten von I errechnet. Für die direkte Zudosierung mittels des pH-Meters wurden 80% der errechneten Menge der n-Alkane und die gesamte errechnete Ammoniakmenge benutzt. Das Ammoniak wurde mit Wasser auf das mit dem Volumen der n-Alkane übereinstimmende Volumen verdünnt und die gekoppelten Dosierer wurden so eingestellt, daß sie beim Absinken des pH-Wertes unter den Wert von 4,5 gleiche Volumen Ammoniaklösung sowie der isolierten n-Alkane zudosierten.

An das pH-Meter war ein elektronischer, durch einen Ausgangsimpuls aus dem pH-Meter betätigter Zeitschalter zur Messung der seit der letzten Zudosierung abgelaufenen Zeit angeschlossen. Wenn nun innerhalb von 90 Sekunden keine weitere Zudosierung erfolgte, wurde vom Zeitelement ein Impuls zur öffnung des Ventils abgegeben, das ?ur Regelung des Ergänzungs-Zuflusses der isolierten n-Alkane Hi?nte. Für d>e Ergänzungs-Dosierung wurden ungefähr 20% der errechneten erforderlichen Menge der n-Alkane angewandt. Der Zeitschalter wurde erst nach einigen Ammoniakzugaben, die den Beginn des Hefenwachstums signalisierten, in Tätigkeit gesetzt.

Die Kultivierung wurde nach 6,5 Stunden beendet, in welcher Zeit der vorausgesetzte Zuwachs der Hefe-Trockensubstanz erreicht wurde. Im reifen Medium waren 188 g Hefe-Trockensubstanz enthalten, was einem Ausbeutekoeffizienten von 1,05 entspricht. Die erzeugte Biomasse enthielt in der Trockensubstanz 9,0% N, 6,2% Rohlipide und 0,25% restliche Kohlenwasserstoffe.

Beispiel 2

Die Züchtung der Hefe Candida utilis auf synthetischem Äthanol als Kohlenstoffquelle wurde im gleichen

Gärgefäß und unter Anwendung des gleichen Grundmediums wie im Beispiel 1 durchgeführt. Das angewandte rohe synthetische Äthanol enthielt 90VoL%. d. h. 85,7 Gew.-% ÄthanoL

Zu 15 Litern Grundmedium wurde das Inokulum in einer der Anfangskonzentration von 2 g Hefe-Trockensubstanz in einem Liter und 15 ml synthetischem Äthanol entsprechenden Menge zugegeben. Dann wurde mit der eigentlichen Züchtung bei 30⁰C begonnen, bei der der pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 4,8 aufrechterhalten wurde. Zur Regelung des pH-Wertes und zur automatischen Steuerung des Syntheseäthanol-Zuflusses wurde das pH-Meter für zweiseitige Regelung mit eingestelltem Regelbereich von 4.5 bis 4,8 angewandt Bei Absinken des pH-Wertes unter den Wert von 4,5 wurde über das pH-Meter (Lzw. unter der Kontrolle des pH-Meters) eine Mischfösung von Äthanol und Ammoniak zudosiert.

Die erforderliche Ammoniak- und Syntheseäthanolmenge wurde für einen Zuwachs der Hefc-Trockcnsubstanz von 10g/l, d.h. 150g. aus dem vorausgesetzten Stickstoffgehalt in der Trockensubstanz der Biomasse von 10% und dem AusbeutckoeJTizienten von 0.65 er-echnet. Für die Zubereitung der Äthanol-Ammoniaklösung wurden 80% der errechneten Menge des Syntheseäthanols und die ganze errechnete Ammoniakmenge verwendet.

Der Mangel an Kohlenstoffqudle im Medium äußerte sich durch einen raschen Anstieg des pH-Wertes auf einen Wert von 4.8 innerhalb 2 bis 4 Minuten nach der letzten Zudosierung. worauf vom pH-Meter dann ein

ίο Impuls zum Öffnen des »Säure«-Ventils, über das dem Medium Ergänzungs-Synthescäthanol zudosiert wurde, abgegeben wurde. Nach Zugabe des Syntheseäthanols sank der pH-Wert des Mediums innerhalb 60 bis 90 Sekunden wieder auf den Wert von 4.5, und die Zudosierung der Äthanol-Ammoniak-Mischung wurde

wieder aufgenommen. Im Verlaufe der Züchtung

wurden durch das »Säure«- Ventil ungefähr 20% der errechneten Menge des Syntheseäthanols zudosiert.

Die Züchtung wurde nach 6 Stunden beendet. Ils

jo wurde eine Ausbeute von 64% Trockensubstanz der Biomasse aus 100 g absolutem Äthanol erreicht; die Hefe-Trockensubstanz enthielt 10.2% N.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur aeroben Züchtung von Hefen in synthetischen Medien, die alle erforderlichen Nährstoffe enthalten, von denen Kalium und Phosphoroxid in Form von Kaliumdihydrogenphosphat und der Stickstoff in Form von Ammoniumsalz einer starken Mineralsäure vorhanden sind mit automatischer Aufrechterhaltung des optimalen pH-Wertes im Kulturmedium durch fortlaufende Zudosierung der anorganischen Base, vorzugsweise von Alkalihydroxid oder Ammoniak, und der optimalen Menge der kohlenstoffhaltigen Nährstoffe durch laufende Zudosierung der Kohlenstoffquelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Base sowie die Kohlenstoffquelle, letztere in einer 20% unter derjenigen Menge liegenden Menge, die dem aus dem durchschnittlichen Stickstoffgehalt in der erzeugten Hefebiomasse und dem Ausbeutekoeffizienten des Kultivierungsprozesses errechneten Verhältnis von Base und Kohlenstoffquelle entspricht, zudosiert wird, wenn der pH-Wert des Kulturmediums unter den festgelegten Wert oder unter die untere Grenze des festgelegten geregelten Bereichs absinkt, dessen Breite 0.1 bis 0,6 pH beträgt, und daß die restliche Kohlenstoffquelle zudosiert wird, wem. das Absinken des pH-Wertes nach Ablauf einer Zeitspanne von 1 bis 10 min nach der letzten Zudosierung der Base ausbleibt bzw. über dem festgelegten Wert aufhört oder wenn der pH-Wert des Kulturmediums die obere Grenze des geregelten Bereichs überschreitet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zeitspanne 90 bis 120 see beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Breite 0.3 pH beträgt.