DE2054948A1 - Pflanzenabbauendes Enzym - Google Patents

Description

Bereits seit langer Zeit werden vielen Verdauungspräparaten Enzyme zugesetzt mit dem Ziel, pflanzliche Nahrungsstoffe abzubauen. _N ' "

Pflanzliche Zellwände setzen sich vorwiegend aus Cellulose und verschiedenen Polysacchariden zusammen, denen man wegen ihrer noch wenig erforschten Struktur den Sammelnamen Hemicellulasen gegeben hat. Aus diesem Grunde wurden als Enzymzusätze zu den Verdauungspräparaten solche Enzymkonzentrate gewählt, die auf Cellulase- und/oder Hemicellulaseaktivität angereichert und standardisiert sind. Für die biochemische Standardisierung dienen als Substrate in allgemeinen Carboxymethylcellulose (eine chemisch substituierte, lösliche Cellulose) oder Extrakte aus Rentierflechte (Lichenin).

Carboxymethylcellulose unterscheidet sich jedoch in ihren chemischen und biochemischen Eigenschaften wesentlich von der nativen Cellulose, wie sie in der pflanzlichen Zellwand vorkommt, und Lichenin ist in der Regel kein Zellwandbestandteil höherer Pflanzen. Enzyme, die sich im Standardisierungsteet als wirksam erwiesen zeigen daher an natürlichem zerkleinertem Pflanzenmaterial nur geringe Effekte. Außerdem haben diese Enzyme ihr pH-Optimum im sauren Bereich. Bei neutralem pH, dem physiologischen Bereich des Darmes, ist ihre Wirksam-

»*«i«t-_209822/07Se

Ferner wird die Mitwirkung von pektinspaltenden Enzymen bei der Verrottung von Pflanzen diskutiert. Führt man aber Abbauversuche an Pflanzenmaterial unter physiologischen Bedingungen mit Pektinaaen durch, dann erhält man die gleichen unbefriedigenden Ergebnisse wie bei den oben angeführten Cellulasen.

Pektinasen werden durch ihre Wirkung auf lösliche Pektine charakterisiert. Dagegen sind die in der pflanzlichen Zellwand vorhandenen unlöslichen Pektinstoffe mit den übrigen PoIysaccharid-Komponenten chemisch und physikalisch vernetzt und weichen deshalb in ihren biochemischen Eigenschaften von den isolierten, löslichen Pektinen ab. Deshalb ist es verständlich, daß die bekannten Pektinasepräparate zwar gegenüber löslichen Pektinen als Substrat sehr aktiv sein können, aber Pflanzenmaterial nur mit geringer Geschwindigkeit abbauen. Demgemäß finden Pektinasen in großem Ausmaß nur technische Anwendung in der Obstsaftklärung.

Bs wurde nun überraschenderweise gefunden, daß Enzyme aus KuIturf11traten von Bacillus polymyxa (z. B. ATCC Nr. 21550 Pflanzenmaterialien, insbesondere grob 'zerkleinertes Gemüsehomogenat, unter den physiologischen Bedingungen des Darmes in ausgezeichneter Weise abbauen. Die Aktivität der Enzyme bleibt auch in Gegenwart hoher Konzentrationen von. Pankreasfermenten voll erhalten. Es zeigt sich bei näherer Untersuchung der von B. polymyxa abgeschiedenen Enzyme, daß die pflanzenzersetzende Eigenschaft im wesentlichen an die Anwesenheit von Pektinsäuretrans-Eliminasen (PATE) geknüpft ist. Unter Pektinsäure-trans-Eliminasen werden dabei solche Enzyme verstanden, die Pektin säure durch eliminatlve Abtrennung der glycosidischen Reste unter Ausbildung einer Doppelbindung spalten.

Albersheim, Neukom und Deuel (HeIv. chim. Acta k^, 1422 (196Ό)) fanden erstmals in einem kommerziellen Fruchtsaft-Klärenzynpräparat ein Enzym, welches die glycosidisch.verbundenen Galacturonsäure-Einheiten dee Pektins nicht nach dem allgemein bekannten

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hydrolytischen sondern nach dem vorerwähnten eliminativen Mechanismus spaltet. Dieses Enzym wurde von ihnen mit Pektin-trans-Eliminase bezeichnet. Nagel und Mitarbeiter fanden später ein ähnlich wirkendes Enzym in KuIturfiltraten von B. polymyxa (Nagel und Anderson, Arch. Biochem. Biophys. 112, 322 (1965)). Die genannten Autoren beschäftigen sich lediglich mit der Spaltung von Oligogalacturonsäuren und löslichen Pektinsäuren. Da diese Substrate künstliche Verseifungsprodukte sind, während die natürlicherweise im molekularen Netzwerk der pflanzlichen Zellwand verankerten Pektinstoffe als Methylester auftreten, war eine Abbauaktivität gegenüber Pflanzenmaterial nicht zu erwarten. Die gefundene unerwartet hohe Abbauwirkung auf Pflanzenmaterial ist demnach neuartig und noch nicht beschrieben worden.

Das Enzyragemisch erhält man durch Züchtung von Bacillus polymyxa. Besonders hohe Ausbeuten werden mit dem aus einer Wasserprobe vom Bodensee isoliertem Stamm K 890/3 (ATCC 21551) bzw. aus seinen Varianten, Mutanten und Revertanten auf dem üblichen biologischen Wege erzielt.

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Zur Herstellung des Enzyms züchtet man den Stamm unter submersen aeroben Bedingungen, wobei man zur Züchtung wässrige Nährmedien verwendet, die die gebräuchlichen Kohlenhydrat- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthalten. Um das Schäumen zu verhindern, empfiehlt sich der Zusatz eines Antischaummittels, vorzugsweise von PoIypropylenglykol, in einer Konzentration von 0,1 - 0,5 $ (V/v)

Die Fermentation wird in bekannter Veise im batch-Verfahreti oder kontinuierlich unter Rührung und Belüftung durchgeführt, wobei der pH-Wert die Grenzen von 5,2 und 7»8 nach unten und oben nicht überschreiten sollte, und ist in der Regel nach spätestens 72 Stunden beendet. Das Enzym ist in der Kulturlösung in' guten Ausbeuten bis zu 30 000 E/ml enthalten und kann in literaturbekannter Weise z.B. durch Aceton oder Isopropanolfällung und anschließender Trocknung als festes Rohprodukt erhalten werden. Es besitzt in getrocknetem Zustand eine Aktivität von 15OO bis 3OOO E/mg.

Der Stamm Bacillus polymyxa K 890/3 (ATCC No. 21551) ist durch folgende morphologische und physiologische Eigenschaften charakterisiert (Vergleich mit dem bekannten Stamm Bacillus polymyxa ATCC 8^2):

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Tabelle 1 Merkmal

B.polymyxa

ATCC 21551 / ATCC 842

Merkmal

B.polymyxa

ATCC 21551 / ATCC 842

Verwertung von

	Fructose	"eT	+ G
	Arabinose	He (Pepto	+ G
209822	Mannose Raffinose Mannit Stärke	φ E	+ G + G + G + G
O	Glycerin .	it Off C	+ G
759	Maltose Laktose	CQ ü	+ G + G
	Xylose	•H	+ G
	Glycose	CQ	+ G
	Sorbit	A Q	+ G
	Galaktose	CQ •H l-l	+ G
	Salicin	gai	+ G
	Inulin	U O	+ G
	Saccharose		+ G
	Rhamnose		+ G
	Dulcit	+ G

Hämoglobinspaltung

Chitinspaltung

Ce HuIo se spaltung

Wachstum bei 4 $> NaCl

Wachstum bei 5 ^ NaCl

Wachstum bei +40 C

Wachstum bei +45 C

Glucose-HpO

Voge s-Prο skauer-Reakt·

Methylrot-Reakt.

Indolreakt.

H-S-Bildung

Nitratreduktion

Citrat als C-Quelle

Harnstoff als N-Quelle

Koagulation v.Milchagar

Methylenblau-Reduktion

Vitaminbedarf

pH 4,8-7,2 5,0-8,0

CO J^ OO

Fortsetzung^von _T a b β 1 1 β 1

Merkmal

B.polyinyxa Merkmal

ATCC 21551 / ATCC 842

B,polymyxa

ATCC 21551 / ATCC 842

KJ O CD 00

Verwertung von I	N H	+ G	+ G	,0 μ	Aerobes Wachstum	+..	+
Glucose "ο	IQ	+ G	+ G	,0 ju	Anaerobes Wachstum	+ G	+ G
Saccharose ro		+ G	+ G		Antibiot.Aktivität	+	+
Glycerin . £	S:-	+ G	+ G		Pigmentbildung	-
Arabinose co	φ	+ G	+ G		Eigelbreaktion	t
Xylose jjj ^	H	+ G	+ G		Gramfärbung	■+■■ .	+
Mannit · 'ro	Φ 3.	+ G	+ G	Beweglichkeit	t	. +
Laktose fj cd		+ G	+ G	Schleimbildung	+	+
Rhamnose ^	0,	+ G	+ G	Gelatineabbau	+	+
O Sorbit Pj	2,	+ G	+ G	Cytochromoxydase		-
Pektin		7 x 0-,8-p	0,6 χ 1	Proteaseaktivität	+	+
Größe d.Sporen		5 χ 5,0 μ	2,0 χ 7	Pate	+	±
Größe d·Stäbchen		+	+	Fettabbau	+	+
Stärkeabbau		-	-	Spaltung von HpO2	+ ■	+
Harnstoffabbau			Phosphatase Lysindecarboxylase		+
Phenylalanin- deaminase

Oxy da s e

G = Gasbildung,

•ov

positiv bzw· vorhanden, , - = negativ bzw. nicht; vorhanden;,

+ = positiv unter besonderen Bedingungen

Die qualitativ und quantitativ herausragende Wirkung des Enzyms von B. polymyxa ATCC 21551 wurde in einer Versuchsanordnung gefunden, die die besonderen Bedingungen bei der Darmverdauung weitgehend imitiert. Da die pflanzliche Kost im allgemeinen in fein zerkauter Form in den Darm gelangt, wurden bei den in vitro-Versuchen die frischen und vorgekochteri Pflanzen als Homogenate eingesetzt. Im Darm wird der Speisebrei durch einen physiologischen Regelmeehanismus auf einen pH-Wert in der Nähe des Neutralpunktes eingestellt. Dem wird in der in vitro-Anordnung dadurch Rechnung getragen, daß Pflanzenhomogenate mit starken Pufferlösungen versetzt werden, die den pH-Wert bei etwa J₉O stabilisieren

Nach mehrstündiger Inkubation der Pflanzenhomogenate mit sehr geringen Konzentrationen des Enzyms aus B. polymyxa ATCC 21551 ist eine starke Zerstörung der Pflanzenpartikel feststellbar. Als Maß für die fortschreitende Auflösung der Zellwände dient das Gewicht des Trockenrückstandes der Pflanzen im Vergleich zu den Kontrollen. Hierbei wurden Gewichtsabnahmen bis 6O $ gefunden. Ebenfalls läßt sich die 'beachtliche Abnahme der elastischen Eigenschaften der Gewet>spartikel quantitativ verfolgen.

Zum Vergleich wurden eine Anzahl von Pektinasen, Cellulasen und Hemicellulasen anderer Mikroorganismen und von gebräuchlichen pektinolytischen Enzympräparaten untersucht. Hierbei ergab sich, daß das Enzym aus B. polymyxa ATCC 21551 eine Uberra-

sehende,
erneDlich stärkere Wirkung zeigt als die Vergleichspräparate. Die literaturbekannten Enzymgemische greifen vorwiegend die Mittellamelle der Zellwände an; nach Einwirkung des Enzyms aus B. polymyxa ATCC 21551 erkennt man in den mikroskopischen Bildern dagegen ein Zerfließen der gesamten Zellwand. So erklärt sich das besonders starke Absinken

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der Elastizität der Partikel. Auch die starke Gewichtsabnahme der Zellwände nach Einwirkung des Enzyms ist so zu erklären, daß sich der Abbau auf die gesamte Zellwand erstreckt und nicht nur auf die gewichtsmäßig unbedeutende Mittellamelle,

Für die Anwendung des erfindungsgemäßen Enzyms als Verdauungspräparat ist aber die Auflösung der gesamten Zellwand von prinzipieller Bedeutung, da hierdurch den natürlichen Verdauungsenzymen des Darms der Zutritt zu den Inhaltsstoffen der Pflanzenzelle erleichtert wird.

Zur Ausarbeitung und Kontrolle

der Herstellungsbedingungen für das Enzym aus B. polymyxa ATCC 21551 beschränkt man sich einfacherweise auf eine Bestimmung der PATE. Der routinemäßige Test

wird mit Pektinsäure als Substrat durchgeführt. Durch den eliminativen Spaltmechanismus entsteht eine Doppelbindung in Konjugation zur Carboxylgruppe, und die damit verbundene Absorptionssteigerung bei 235 mn wird registriert. Das pH-Optimum der Wirkung gegenüber pflanzlichen Zellwänden liegt im Bereich von pH 6-8. Die Stabilität des Enzyms in wässriger Lösung ist von pH h,0 bis 8,0 sehr gut. Gegenüber der Wirkung von Darmproteasen wie Trypsin und Chymotrypsin ist die Pektinsäure-trans-Eliminase außerordentlich beständig.

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- 9 Biochemischer Test auf PATE

Als Substrat wurde 0,1 $> Pektinsäure und 0,001 m CaCl„ in 0,1 m Tris/HCl-Puffer von pH" 8,5 verwendet. Für den Testansatz wurden 2 ml Substrat in einer 10 mm Quarzküvette mit 0,1 ml Enzymlösung in geeigneter Verdünnung vermischt und 2 Minuten bei 25 C inkubiert. Die Registrierung erfolgte im Spektrophotometer mit angeschlossenem Schreiber bei 235 mp· 1 Enzymeinheit wurde als diejenige .Enzymmenge definiert, die unter den Reaktionsbedingungen innerhalb von 10 Minuten eine Extinktionszunahme von 0,1 bewirkt. Je nach Stamm und Züchtungsbedingungen wurden in den Testansätzen 1 bis
je ml KuIturfiltrat gefunden.

den in den Testansätzen 1 bis 130=10^ Einheiten PATE

Biochemischer Test auf macerierende Wirkung

Als Substrat diente Kohlrabi (oder anderes Pflanzenmaterial), der unter Zusatz von 0,25 m Imidazolpuffer pH 7»0 homogenisiert wurde, so daß ein dickflüssiger Brei entstand. Der pH-Wert wurde mit verdünnter Natronlauge auf 7»0 korrigiert. Für den Testansatz wurden 30 Substrat mit 1 ml Enzymlösung versetzt, wobei jede Enzymprobe in mehreren Verdünnungen in getrennten Ansätzen 7 Stunden bei 37 C inkubiert wurde. Die unlöslich gebliebenen Zellwandreste wurden bei etwa 2000 g zentrifugiert und zweimal mit je 50 ml Wasser, einmal mit 50 ml Alkohol und zweimal mit je 50 ml Aceton gewaschen. Nach einfacher Lufttrocknung wurde k Stunden auf 120° C erhitzt und das Gewicht des Trockenrückstandes bestimmt» In jeder Versuchsreihe wurden 2-3 Kontrollwerte bestimmt. Die bei Enzymeinwirkung erhaltenen Gewichtsabnahmen wurden prozentual auf die Kontrollen bezogen.

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In der folgenden Tabelle II werden die Aktivitäten verschiedener bekannter Pektinase-, Heniieellulase- und Cellulase-Präparate mit Enzyiarohpulvern aus verschiedenen Bacillus polymyxa-Staiamcn verglichen. Als Testpflanze diente Kohlrabi, die Enzymkonzentrationen waren jeweils 3 mg/30 ml .und 0,3 nig/30 ml Homogenat. Fehlerbreite: + 3 % gegenüber den Kontrollen.

Enzympräparate aus

Tabelle II

.,Gewichtsabnahme des Pflanzenmaterials in %

3 mg Enzympräparat 0,3mg Enzympräpara

Aspergillus niger Aspergillus oryzae Penicillium chrysogenum Penicillium frequentans Scferotinia fructigena Bacillus mesentericus

Diverse Handelspräparate (Pektinasen, Cellulasen, Hemicellulasen) ohne Stammangaben

B. polyrayxa ATCC 21551

B. polymyxa K 890/I

B. polymyxa K 890/2

B. polymyxa K 890/4

5
6

58

53
41
2k

3 k k

30

26

15

Aus den Tabellenwerten ist die wesentlich größere Wirkung des erfindungsgemäßen B. polymyxa-Enzyms bei pH 7,0 ersichtlich.

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Die Enzymwirkung hängt nicht linear, sondern logarithmisch von der eingesetzten Enzymkonzentration ab. Daraus ergibt sich als wichtige Konsequenz für eine praktische Anwendung, daß auch noch sehr geringe Enzymkonzentrationen signifikante Abbauwirkungen zeigen. Eine abbauende Wirkung des erfindungsgemäßen Enzyms auf Pflanzenmaterialien unter Berücksichtigung der Fehlerbreite des Testsystems kann noch bei 0,003 mg/ml Gemüsehomogenat nachgewiesen werden, während diese Grenze für alle untersuchten Vergleichspräparate bei 0,1 mg/ml oder darüber liegt. Dies entspricht einem Unterschied von fast 2 Gröüenanordnungen gegenüber den verglichenen Präparaten. . ' -^-

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- 12 Beispiele

Beispiel 1

Der Stamm Bacillus polymyxa FH-K 89O/3 (ATCC 21551) wird auf Schrägagarröhrchen mit einem Nährboden folgender Zusammensetzung geimpft:

0,1	*	Hefeextrakt	- 6,8
0,1	*	Malzextrakt
1,0	*	Lösslehm
0,1	1°	Fleischextrakt
2,5	1ο	Caseinpepton
0,01		' Trypticase
0,5	1ο	Glucose
0,01		Sojaöl
0,5	1ο	Cornsteep liq.
1,0	1ο	CaCO
1,0	*	Rohrzucker
1,0		Sojamehl
1,0	1ο	Stärke
1,8	1ο	Agar pH 6,0

Das beimpfte Röhrchen wird 3 Tage bei 28 C bebrütet und danach weitere 5 Tage bei Zxmmertemperatur gehalten, bis eine vollständige Versporung eingetreten ist. Das Sporenmaterial wird mit 10 ml sterilisiertem Aquadest oder physxologischer NaCl-Lösung von dem Schrägröhrchen abgeschwemmt. 5 ml der Abschwemmung dienen zur Beimpfung eines 300 ml Erlenmeyerkolbens, der 100 ml sterilisierter Nährlösung vom pH 7 mit folgender Zusammensetzung beinhaltet:

2,0 $ Saccharose

0,4 °t> Caseinpepton

0,4 1o Fleischextrakt 0,1 # Hefeextrakt 0,1 °t> Leberextrakt ad. 1000 ml H_£0

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- i3 -

Der Kolben wird bei 2OO Upra Zk Stunden bei +30° C auf einer Schüttelmaschine geschüttelt. Dann werden je 5 dieser Vorkultur in 20 Erlenraeyerkolben, die jeweils 50 ml Nährlösung folgender Zusammensetzung enthalten, steril überführt:

0,5 ψ>	Sojamehl
0,75 #	Stärke
0,5 £	Cornsteep liq.
0,05 #	Trockenschlempe
0,005 #	Trypticase
1,0 #	Caseinpeptön
1 ,0 #	Stärkezucker
0,25 $	NaCl

ad. 1000 ml Wasser pH 7,2

Diese Kolben stellen die Hauptkultur dar und werden bei 28° C mit 200 Upm auf einer Schüttelmaschine 2 bis 3 Tage geschüttelt. Am 2. und 3. Kulturtag wird der PATE-Gehalt geprüft. Dazu wird eine Probe scharf von den Zellen und Feststoffteilen des Nährmediums abgeschleudert und mit dem Überstand im Spektrophotometer bei 235 mu die bei der Spaltung der Pektinsäure entstehenden Doppelbindungen geraessen. Eine Enzymeinheit entspricht derjenigen Enzymmenge, die unter den Reaktionsbedingungen innerhalb von 10 Minuten eine Extinktionszunahme von 0,1 bewirkt. Der Stamm Bacillus polymyxa ATCC 21551 lieferte in diesem Versuch nach 3 Tagen Hauptkultur durchschnittlich I5OO - 2000^E/ml bei einem End-pH-Wert von 7»8·

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Beispiel 2

Ansatz wie in Beispiel 1, jedoch.werden jeweils 25O ml sterilisierter Nährlösung folgender Zusammensetzung in 1 1-Erlenmeyerkolben verwendet und mit 25 ml Keimsuspension beimpft:

4,0 $ Glucose 2,0 # Sojamehl 0,2 # (NHk)₂SO.

0,75 $> CaCO₀ j

ad. 1000 ml Wasser pH 7,0

Nach 3 Tagen Schüttelkultur bei 220 upm und 28° C lieferte dieser Versuch durchschnittlich ^500 E/ml bei einem End-pH-Wert von 7,8.

Beispiel 3

Ansatz wie im Beispiel 1, jedoch wurde als Hauptkultur ein Fermentationsgefäß von 30 1 Gesamtvolumen gewählt, das mit 10 1 einer sterilisierten Nährlösung der folgenden Zusammensetzung beschickt war:

4,0 ¹Ja Saccharose

1,0 # Sojamehl

0,5 $ Ammonsulfat

1,0 <$> CaCO

1,0 ^a Cornsteep liq.

ad. 1000 ml Wasser pH 7|0

Die Sterilisationszeit für dieses Medium beträgt 1 Stunde bei 121 C und 1 atü, wobei der Zucker separat sterilisiert und nach. Erkalten dem Fermentationsgefäß*zugeführt wird * Der pH-Wert soll nach dem Sterilisieren zwischen 6,7 und

♦) steril

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7,0 liegen und wird bei Bedarf mit sterilisierter 2 η NaOH auf diesen Wert eingestellte

Beimpft wird diese Hauptstufe mit 500 ml einer unter Beispiel 1 beschriebenen und hergestellten Vorkultur.

Es wird 50 - 70 Stunden bei 28° C fermentiert. Die Be-

•^ pro

lüftung beträgt 0,85 1 Luft pro Minute und 1 Kulturlösung bei einer Rührung von ca. 200 Upm.

Durch Probeentnahme wird der Fermentationsverlauf verfolgt. Die PATE-Aktivität steigt innerhalb k8 Stunden auf durchschnittlich 30 000 E/ml. Die Kulturlösung wird abzentrifugiert und mit Aceton im Verhältnis 1 : 1,6 versetzt. Das ausgefallene Produkt wird abgeschleudert und getrocknet. Man erhält ein helles trockenes Pulver mit einer Aktivität von ca. 3°00 E/mg.

Beispiel h

TJm das Enzym auf kontinuierlichem Wege zu erhalten, wird eine Anlage benutzt, die das Prinzip des einfach homogen offenen Systems befolgt. Das Fermentationsgefäß hatte Stutzen für Substratzuführ- und KuIturlösungsabzug, für Luftein- und Luftablaß, für Lauge- und Säurezugabe, für

eine

Antischaumzugabe sowie Stutzen für 1 pH-Elektrode, einen Temperaturfühler, für die Probenahme und zum Beimpfen. Die Rührgeschwindigkeit beträgt 2^0 Upm. Die Temperatur beträgt 28 C, das Arbeitsvolumen 1,5 1· Be-

pro

lüftet wurde mit 0,5 1 Luft pro Minute und 1 Kulturlösung. Die abgepumpte Kulturlösung wird in gekühlten 500 ml-Saugflaschen aufgefangen.

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Das Fermentationsgefäß und ein 10 1 fassendes Vorratsgefäß wurden mit der wie folgt zusammengesetzten Nährlösung beschickt:

3,0	Ίο	lösliche Stärke
1,0	*	Fleischpepton
1,0		CaCO
o,5	ί>	Sojamehl
o,5	1°	Cornsteep liq.
0,5	$>	(NHi^) SO.
0,01	D 36ΟΟ Polyprop

ad. 1000 Wasser pH 7,h-

Beide Gefäße wurden 1 Stunde bei 120 C und 1 atü sterilisiert· Dann wird das Fermentationsgefäß mittels Schlauch mit dem Vorratsgefäß verbunden, und ebenso wird mit dem Auffanggefäß verfahren.

Nach Erkalten und bei einer erreichten konstanten Temperatur von 28 C wird mit 150 ml einer unter Beispiel 1 hergestellten Vorkultur beimpft. Nach 24 Stunden Kultivierung wird die Kultur durch Einschaltung einer Pumpe in eine kontinuerlich arbeitende Kultur mit konstantem Fließgleichgewicht überführt. Die Flußrate ist so eingestellt, daß alle 36 Stunden der Gefäßinhalt einmal vollständig ausgetauscht wird|

(d = 0,0296).

Die Proben wurden alle 2k Stunden auf PATE-Aktivität getestet; die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt:

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Tabelle III

2800	6,8
3900	6,k
9000	6,65
17000	6,5
I62OO	6,5
I8OOO	6,65
I8OOO	6,7
17*00	6,6
I67OO	6,5
I79OO	6,55
I63OO	\ 6,3

Stunden E/ml pH

20 24 k8 72 96 12O ihk 168 192 216 240

Nach 240 Stunden Kulturdauer wurde die Kulturlösung abgebrochen und die gesammelte Kulturlb'sung aufgearbeitet. Die Durchschnittsaktivität betrug I5OOO E/ml.

Gewinnung eines Rohpräparates

Die technische Isolierung der Enzympräparate erfolgt mit konventionellen Methoden. Am besten haben sich Fällungen mit organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol, Isopropanol, Aceton usw. bewährt. Die Aktivitätsausbeuten liegen im Bereich von 65 - 90 ^. Es werden gewichtsinäßig etwa 5 ~ 15 S helle, nicht-hygroskopische, wasser iöt.I Lclie Pulver pro Liter Kulturfiltrat gewoiimm.

BAD ORIGINAL 2/0-759

Beispiel

30 1 Kulturlösung mit 28000 E/ml (PATE) werden von der Hauptmenge unlöslicher Bestandteile durch Zentrifugation befreit. Nach einer Sterilfiltration werden die erhaltenen 26,2 1 auf pH 6,5 gestellt und auf 5° C gekühlt. Bei Zugabe von 50 1 Aceton (22 C) flockt ein.Niederschlag aus, der isoliert, zweimal mit Aceton gewaschen und bei Zinaaertemperatur getrocknet wird_e

Ausbeute: 77 #; 3Q8 g mit 21OO E/mg PATE

Reinigung durch Ammonsulfat Beispiel

10 g des erwähnten Präparates werden in %®Q ml Wasser gelöst. Nach der Sättigung mit Aoasonsulfat wird der pH-Wert 4,5 eingestellt. Nach 1 Stunde wird der Niederschlag abgeschleudert und in 50 ml Wasser aufgenommen» Mach etwa I5-stündiger Dialyse gegen Wasser und anschließender Gefriertrocknung ergibt sich ein helles* wasserlösliches Pulver.

Ausbeute: 57 #; 63O mg mit 19O<9öE/mg PATE

Weitere Reinigung

Mit Hilfe bekannter säulonchr-omatographischer Methoden (z.B. Sephadex, Ionenaustauscher und Ilydroxylapatit) konnte das durch Ammonsulfat füllung gewonnene Präparat abermals auf das bis 1^-fache gereinigt worden, so daß v. L110 Ge sam tre LnLgUiIg bis auf das etwa 1 ;i5-f acht; gelang.

BAD ORIGINAL

2 0ΊΗ :''./ / Π /Bf)

Claims (3)

Patentansprü ehe

1) Verfahren zur Herst ellung eines Enzympräparates mit hohem Anteil an Pektinsäure-trans-Eliminase durch aerobe Züchtung von Bacillus polymyxa in einem üblichen Nährmedium und Isolierung des Enzyms aus der KuI tür lösung».

2) Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus polymyxa K 89O/3, ATCC 21551 verwendet.

3) Verwendung des nach Anspruch 1 und 2 hergestellten Enzyms als Zusatz zu Verdauungspräparaten.

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