DE202016008594U1 - Neue pharmazeutische Zusammensetzung umfassend Partikel umfassend einen Komplex eines doppelsträngigen Polyribonukleotids und eines Polyalkylenimins - Google Patents

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Abstract

Eine wässrige Zusammensetzung umfassend ein oder mehr Partikel, wobei
(a) jedes Partikel einen Komplex von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder ein Salz oder Solvat davon, und mindestens ein Polyalkylenimin, oder ein Salz und/oder Solvat davon, umfasst, wobei
(i) das doppelsträngige Polyribonukleotid eine Polyinosin-Polycytidylsäure [Poly(I:C)] ist,
wobei mindestens 60% des doppelsträngigen Polyribonukleotids mindestens 850 Basenpaare haben, mindestens 70% des doppelsträngigen Polyribonukleotids zwischen 400 und 5000 Basenpaare haben, und zwischen 20% und 40% des doppelsträngigen Polyribonukleotids zwischen 400 und 850 Basenpaare haben; und
(ii) das Polyalkylenimin mindestens 95% lineare Polyethylenimine umfasst,
wobei das durchschnittliche Molekulargewicht des linearen Polyalkylenimins zwischen 17 und 23 kDa ist und der Polydispersitätsindex < 1,5 ist, und
wobei das Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoff des Polyalkylenimins zu der Anzahl von Molen von Phosphor des doppelsträngigen Polyribonukleotids in der Zusammensetzung zwischen 2,5 und 5,5 ist; und
(b) die Partikel einen z-gemittelten Durchmesser, gemessen nach ISO 22412, von zwischen 30 nm und 150 nm haben.

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassend Partikel, die durch Polyribonukleotide und Polymere gebildet werden, ihre Herstellung und ihre medizinische Verwendung.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Verwendung synthetischer Analoga von doppelsträngiger RNA (dsRNA), die virale dsRNA nachahmen, ist in den vergangenen Jahren für die spezifische Aktivierung des Immunsystems gegen Tumoren erforscht worden, mit dem Umfang der Hemmung von Krebszellwachstum und der Induktion von Apoptose. Insbesondere wurde doppelsträngige Polyinosin-Polycytidylsäure (Poly(I:C) oder pIC genannt) als ein Typ von dsRNA mit verschiedenen Effekten von therapeutischem Interesse gegen verschiedene Krebse (wie Melanom, Hepatom, Kolon-, Magen- und Mundhöhlenkarzinom, Zervixkrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Harntrakttumore, Lungen- und Prostatakrebs) und ihre Metastasen charakterisiert, auf Weisen, die abhängig oder unabhängig sein können von Immunsystemaktivierung, durch natürliche Killerzellen und/oder dendritische Zellen vermittelte Aktivitäten und/oder Veränderungen der Tumorgenexpression und der Mikroumgebung (Hafner A et al., 2013).
  • Leider sind diese anfänglichen präklinischen Befunde in klinischen Studien mit nackten Poly(I:C)-Molekülen schlecht oder gar nicht bestätigt worden, die seine niedrige Stabilität, schlechte Homogenität, unvorhersagbare Pharmakokinetik und beschränkte Antitumoreffekte zeigten, auf Grund einer Vielfalt von Mechanismen wie schlechte zelluläre Aufnahme oder Abbau durch zytosolische RNasen (Hafner A et al., 2013). Tatsächlich kann es, um einen wirksamen therapeutischen oder prophylaktischen Effekt zu erzielen, notwendig sein, dass die Moleküle unmittelbar vor oder kurz vor der Verwendung neu aufgelöst werden, in Formulierungen mit niedrigen Konzentrationen verfügbar sind, und/oder häufig verabreicht werden (z.B. alle 2 Stunden).
  • In den letzten Jahren hat es bedeutende Fortschritte in der Formulierung von Poly(I:C)-Molekülen mit immunomodulatorischen und/oder therapeutischen Eigenschaften gegeben. Verschiedene Verfahren zur Herstellung und Formulierung von Poly(I:C)-Molekülen als Pulver und/oder integriert in Polymer-basierten Mikropartikeln mit oder ohne Targetinggruppen und zusätzliche chemische Linker sind offenbart worden ( CN103599071 ; CN102988303 ; WO2004045491 ; WO2008057696 ; WO2013164380 ; WO2015067632 ; WO2014057432 ; WO2014165296 ; Schaffert D et al., 2011; WO2015173824 ; Kabilova T et al., 2014; Kübler K et al., 2011; Palchetti S et al., 2013; Saheki A et al., 2011). Poly(I:C)-Moleküle sind formuliert worden mit Trägerpolymeren und in Formaten, die zur nasalen Verabreichung geeignet sind ( WO2013164380 ), mit Polylysin und Carboxymethylzellulose stabilisiert worden ( WO2005102278 ), mit mit kationischen Lipiden beschichteten Calciumphosphat-Nanopartikeln, Liposomen oder anderen vesikulären Strukturen eingekapselt worden (Chen L et al., 2013; US2009117306 ; US2011003883 , oder zusammen mit einzelsträngiger RNA und mit kationischen Peptiden wie Protamin ( WO2013087083 ). Alternativ sind Poly(I:C)-Moleküle auch auf festen Partikeln und Trägern wie Eisenoxid-Nanopartikeln immobilisiert worden, mit oder ohne Mittel, die helfen würden, Poly(I:C)-Moleküle in spezifische Zellen oder Gewebe zu lenken (McBain S et al., 2007; Cobaleda-Siles M et al., 2014).
  • Manche Publikationen offenbaren weiter verschiedene ternäre oder quaternäre Komplexe in Submikrometer-Bereich, die gebildet werden von Polymeren, Poly(I:C) und/oder doppelsträngiger DANN, mit oder ohne andere Komponenten und genspezifisch (Kurosaki T et al., 2009; WO2013040552 ,; WO2013063019 ,; Tutin-Moeavin I et al., 2015). Jedoch haben diese Ansätze das Ziel, Mittel bereitzustellen, die im Wesentlichen DNA in die Zelle einbringen, während sie ihre Lebensfähigkeit erhalten, und nicht das selektive Töten von Krebszellen.
  • Die Fallstricke, die die klinische Entwicklung von Poly(I:C)-Molekülen als ein Medikament und seine Erfüllung der regulatorischen Erfordernisse behindern, könnten überwunden werden durch die Herstellung strukturell komplexer Antikrebs-Komplexe umfassend Poly(I:C)-Moleküle zusammen mit Medikamentenverabreichungssystemen zur Krebstherapie, die oft auf kationischen Polymeren wie Chitosan, Polyethylenimin (PEI), Poly-L-Lysin, Polymethacrylaten, Imidazol- und Cyclodextrin-haltigen Polymeren, Poly(beta-Aminoester)n und verwandten Dendrimeren basieren. Diese polymeren Systeme (auch Polyplex genannt) sind strukturell und funktionell verschieden von Lipid-basierten Systemen (auch Lipoplex genannt) und Hybridsystemen (auch Lipopolyplex genannt), die ähnlich für die lokale oder systemische Verabreichung von Nukleinsäuren verwendet werden (Bilensoy E, 2010; Germershaus O und Nultsch K, 2015). Unter Polyplex ist PEI ein kationisches Polymer von besonderem Interesse, das auf der Ebene von linearer/verzweigter Struktur und Größe, chemischer Verknüpfung, Abbaubarkeit und Derivatisierung modifiziert werden kann (Islam M et al., 2014) und das, im Unterschied zu Lipoplex-Internalisierung durch Zellen, sowohl durch Clathrin-vermittelte als auch Caveolae-vermittelte Endozytose internalisiert wird (Shabani M et al., 2010).
  • Dieser therapeutische Ansatz, der die Herstellung und die Verabreichung von mit PEI assoziierten Poly(I:C)-Molekülen bedingt, ist in der Literatur durch das BO-110 genannte Mittel veranschaulicht worden (Pozuelo-Rubio M et al., 2014; Tormo D et al., 2009; WO2011003883 ). Dieser Komplex, auch identifiziert als [pIC]PEI, vermittelt nicht nur duale Einleitung von Autophagie und Apoptose in mehreren Krebszelllinien vom Melanom- und anderen Tumortypen (wie Gliomen und Karzinomen), sondern hat auch keine oder beschränkte Wirkung auf die Lebensfähigkeit normaler Zellen wie Melanozyten. BO-110 hemmt Melanomwachstum in Tiermodellen zur Demonstration antitumoraler und antimetastatischer Wirkungen in vivo, sogar in schwer immunkompromittierten Mäusen. Außerdem stimuliert ein ähnliches [pIC]PEI-basiertes Mittel die Apoptose in Pankreasleiter-Adenokarzinomzellen ohne normale Pankreasepithelzellen zu beeinträchtigen, und in vivo Verabreichung von [pIC]PEI hemmte Tumorwachstum in Tumor-Tiermodellen (Bhoopathi P et al., 2014). Ein weiterer Effekt von BO-110-Verabreichung ist in einem Modell von Endometriose charakterisiert, wo ein solches Mittel Angiogenese und Zellproliferation verringert und Apoptose verstärkt (Garcia-Pascual C und Gomez R, 2013).
  • Daher stellen BO-110 und ähnliche [pIC]PEI-Mittel, die doppelsträngige Polyriboneukleotide umfassen, eine neue Antikrebs-Strategie mit einem breiten Wirkungsspektrum dar, auf Grund der kombinierten Aktivierung von Autophagie und Apoptose, autonom und selektiv in Tumorzellen, während sie die Lebensfähigkeit normaler Zellen verschiedener Linien erhalten. Jedoch muss BO-110, wie andere auf doppelsträngigen Polyribonukleotiden basierende Mittel, die demonstrierte Wirksamkeit in verschiedenen präklinischen Modellen haben, wenn sie mit Trägern assoziiert sind, in Formulierungen bereitgestellt werden, die unter verschiedenen Lagerbedingungen stabil sind, einheitlich hergestellt und dimensioniert sind.
  • Tatsächlich stellt der Stand der Technik keine geeignete Lehre zur Lösung von Problemen bezüglich der wirksamsten Kombination struktureller und biophysischer Kriterien bereit, die die Herstellung Poly(I:C)-haltiger Zusammensetzungen zur Behandlung von Krebs erlauben. Regulierungsagenturen verlangen auch, dass die Spezifikationen für Reproduzierbarkeit, Lagerung und Gleichmäßigkeit der Größe und Konzentration Poly(I:C)-haltiger Partikel, die in Zusammensetzungen zur Verwendung in Menschen enthalten sind, strikt befolgt werden. Daher werden Mittel, Zusammensetzungen und verwandte Prozesse, die doppelsträngige Polyribonukleotidmoleküle wie Poly(I:C)-Moleküle in höheren, wohlkontrollierten Konzentrationen bereitstellen, immer noch benötigt, um ihr ausgiebiges Potenzial und klinische Entwicklung als ein Medikament (insbesondere gegen Krebs) zu ermöglichen, während Therapietreue von Patienten verbessert wird und die Häufigkeit der Dosierung doppelsträngiger Polyribonukleotidmoleküle mit wohldefinierten Sicherheitsspielräumen und therapeutischen Wirkungen verringert wird.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung umfassend Partikel, wobei
    1. (i) jedes jener Partikel einen Komplex von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und mindestens einem Polyalkylenimin, oder einem Salz und/oder Solvat davon, umfasst;
    2. (ii) mindestens 95%, oder mindestens 90%, jener Partikel einen Durchmesser von weniger als oder gleich 600 nm, vorzugsweise weniger als oder gleich 300 nm (zum Beispiel zwischen 140 und 250 nm), haben;und
    3. (iii) jene Partikel einen z-gemittelten Durchmesser von weniger als oder gleich 200 nm, vorzugsweise weniger als oder gleich 150 nm haben, insbesondere wie gemäß ISO 22412 gemessen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine wässrige Zusammensetzung umfassend Partikel, wobei
    1. (i) jedes jener Partikel einen Komplex von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und mindestens einem linearen Polyalkylenimin, oder einem Salz und/oder Solvat davon, umfasst, wobei jenes doppelsträngige Polyribonukleotid Polyinosin-Polycytidylsäure [Poly(I:C)] ist und das durchschnittliche Molekulargewicht jenes linearen Polyalkylenimins zwischen 17 und 23 kDa ist;
    2. (ii) mindestens 90% jener Partikel eine monomodale Durchmesserverteilung von unter 300 nm haben;
    3. (iii) jene Partikel einen z-gemittelten Durchmesser von weniger als oder gleich 150 nm haben, wie gemäß ISO 22412 gemessen; und
    4. (iv) jene Zusammensetzung ein Zeta-Potenzial gleich oder über 30 mV hat, gemäß ISO 13099.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung umfassend Partikel wie hierin offenbart, wobei:
    1. (i) jedes jener Partikel durch Herstellen eines Komplexes von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und mindestens einem linearen Polyalkylenimin, oder einem Salz und/oder Solvat davon, gebildet wird, wobei jenes doppelsträngige Polyribonukleotid Polyinosin-Polycytidylsäure [Poly(I:C)] ist und das durchschnittliche Molekulargewicht jenes linearen Polyalkylenimins zwischen 17 und 23 kDa ist;
    2. (ii) mindestens 90% jener Partikel einen monomodale Durchmesser von unter 300 nm haben;
    3. (iii) jene Partikel einen z-gemittelten Durchmesser von weniger als oder gleich 150 nm haben, wie gemäß ISO 22412 gemessen; und
    4. (iv) jene Zusammensetzung ein Zeta-Potenzial gleich oder über 30 mV hat, gemäß ISO 13099;
    wobei jene Partikel so gebildet werden, dass das Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoff von jenem Polyalkylenimin zur Anzahl von Molen von Phosphor von jenem doppelsträngigen Polyribonukleotid in jener Zusammensetzung gleich oder größer als 2,5 ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, die durch die Lyophilisierung der wässrigen Zusammensetzung wie hierin offenbart erhältlich ist.
  • Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung wie hierin offenbart zur Verwendung als ein Medikament.
  • Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung wie hierin offenbart zur Verwendung in der Behandlung einer Zellwachstumsstörung, die durch abnormales Wachstum menschlicher oder tierischer Zellen gekennzeichnet ist.
  • Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung einen Prozess zur Herstellung einer Zusammensetzung wie hierin offenbart, der
    1. (i) Herstellung einer wässrigen Lösung von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und einer wässrigen Lösung von mindestens einem Polyalkylenimin, oder einem Salz oder Solvat davon, wobei jede oder beide Lösungen optional weiter einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, organisches Lösungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans umfassen;
    2. (ii) unabhängiges Filtrieren jeder Lösung durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von weniger oder gleich 500 nm, um sterilisierte Lösungen zu bilden;
    3. (iii) Mischen der resultierenden sterilisierten Lösungen in einer Mischkammer, um eine wässrige Zusammensetzung durch Zugabe von einer jener Lösungen zur anderen Lösung in jener Mischkammer, optional durch Injektion, mit einer Rate von mehr als oder gleich 1ml/min, oder durch gleichzeitige Zugabe jeder jener Lösungen zur Mischkammer, optional durch Injektion, mit einer Rate von mehr als oder gleich 1 ml/min, zu bilden; und optional
    4. (iv) Filtrieren der resultierenden wässrigen Zusammensetzung durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von weniger als oder gleich 600 nm, um ein Filtrat zu bilden, oder Zentrifugieren der resultierenden wässrigen Zusammensetzung bei mehr als oder gleich 2240 m/s2, um einen Überstand zu bilden; und/oder
    5. (v) Lyophilisieren der resultierenden wässrigen Zusammensetzung, des Filtrats oder Überstands; umfasst.
  • Vorzugsweise betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Zusammensetzung umfassend Partikel, wobei:
    1. (i) jedes jener Partikel einen Komplex von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und mindestens einem Polyalkylenimin, oder einem Salz und/oder Solvat davon, umfasst, wobei
      1. (a) jenes doppelsträngige Polyribonukleotid Polyinosin-Polycytidylsäure [Poly(I:C)] oder Polyadenyl-Polyuridylsäure [Poly(A:U)] ist, wobei mindestens 60% jenes doppelsträngigen Polyribonukleotids mindestens 850 Basenpaare haben, mindestens 70% jenes doppelsträngigen Polyribonukleotids zwischen 400 und 5000 Basenpaare haben, und zwischen 20% und 45% jenes doppelsträngigen Polyribonukleotids zwischen 400 und 850 Basenpaare haben; und
      2. (b) jenes Polyalkylenimin mindestens 95% Polyethylenimine umfasst, wobei das gewichtsgemittelte Molekulargewicht jenes Polyalkylenimins zwischen 17 und 23 kDa ist und der Polydispersitätsindex < 1,5 ist, und wobei das Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoff von jenem Polyalkylenimin zur Anzahl von Molen von Phosphor von jenem doppelsträngigen Polyribonukleotid in jener Zusammensetzung zwischen 2,5 und 5,5 ist;
    2. (ii) mindestens 99% jener Partikel einen Durchmesser von weniger als oder gleich 600 nm haben; und
    3. (iii) jene Partikel einen z-gemittelten Durchmesser von zwischen 30 nm und 150 nm haben.
  • Bevorzugter betrifft die vorliegende Erfindung auch eine wässrige Zusammensetzung, die Partikel umfasst, wobei:
    1. (i) jedes jener Partikel einen Komplex von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und mindestens einem Polyalkylenimin, oder einem Salz und/oder Solvat davon, umfasst, wobei
      1. (a) jenes doppelsträngige Polyribonukleotid Polyinosin-Polycytidylsäure [Poly(I:C)] ist, wobei mindestens 60% jenes doppelsträngigen Polyribonukleotids mindestens 850 Basenpaare haben, mindestens 70% jenes doppelsträngigen Polyribonukleotids zwischen 400 und 5000 Basenpaare haben, und zwischen 20% und 45% jenes doppelsträngigen Polyribonukleotids zwischen 400 und 850 Basenpaare haben; und
      2. (b) jenes Polyalkylenimin Polyethylenimin (PEI) ist, wobei das gewichtsgemittelte Molekulargewicht jenes PEI zwischen 17,5 und 22,6 kDa ist und der Polydispersitätsindex < 1,5 ist, und wobei das Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoff von jenem Polyalkylenimin zur Anzahl von Molen von Phosphor von jenem doppelsträngigen Polyribonukleotid in jener Zusammensetzung zwischen 2,5 und 4,5 ist;
    2. (ii) mindestens 99% jener Partikel einen Durchmesser von weniger als oder gleich 500 nm haben;
    3. (iii) jene Partikel einen z-gemittelten Durchmesser von zwischen 60 nm und 130 nm haben; und
    4. (iv) jene Partikel einen Durchmessermedian (D50%) von zwischen 75 nm und 150 nm haben.
  • Weitere Ausführungsformen, die die Herstellung solcher Zusammensetzungen in der Form von BO-11X-Formulierungen, ihre Merkmale, ihre Analyse und ihre Verwendungen betreffen, werden in der Ausführlichen Beschreibung und den Beispielen unten bereitgestellt.
  • Figurenliste
    • 1: Funktionale Aktivität einzelner BO-111-Präparate nach Filtration oder Zentrifugation durch Analyse von Zelltod in Melanomzellen SK-Mel-103 nach einer 48-Stunden-Exposition. (A) Poly(I:C)-Moleküle werden mit PEI assoziiert, um BO-111-Komplexe gemäß der Beschreibung der 2-Fläschchen-Herstellunsprozessierung in Beispiel 1 zu bilden, und die resultierende Lösung wird entweder mittels Membran mit verschiedenen Porengrößen filtriert (und dann Verwenden der Durchflusslösung für zellbasierte Tests) oder bei verschiedenen Geschwindigkeiten zentrifugiert (und dann Verwenden des Überstands für zellbasierte Tests), so dass einzelne BO-111-Präparate erzeugt werden, von denen jedes Poly(I:C)-basierte Komplexe mit einer homogeneren, niedrigeren Größe enthält, die als Z-Durchschnitt (hydrodynamischer Durchmesser, ausgedrückt als d.nm) bestimmt wird. Qualitativ ähnliche Daten wurden durch Testen von Zelltod bei 24 Stunden erzeugt. Daten über Zelltod werden mit nicht mit BO-111 behandelten Proben verglichen. (B) Dosis-Antwort-Aktivität eines BO-111-Präparats, das durch Filtrieren durch einen 0,8 µm Filter erhalten wird (schraffierte Balken), verglichen mit dem entsprechenden nicht filtrierten BO-111-Präparat (weiße Balken). Da Zentrifugation oder Filtration zu etwas Verlust an Poly(I:C) auf Grund der Sedimentierung bzw. Retention größerer Komplexe führt, wurde die Menge an Poly(I:C) in jedem einzelnen BO-111-Präparat durch spektrophotometrische Analyse bei einer Wellenlänge von 260 nm quantifiziert, um die Wirkungen eines solchen Präparats auf Zellen durch entsprechendes Verdünnen des anfänglichen Präparats bei der geeigneten Konzentration korrekt zu bestimmen. Qualitativ ähnliche daten wurden durch Testen von Zelltod bei 12, 24 und 36 Stunden erzeugt. Zelltod wird durch Trypanblau-Test wie in der Literatur beschrieben bestimmt. Standardabweichung wird unter Verwendung von Triplikatdaten für jede Bedingung desselben Experiments berechnet.
    • 2: Wirkungen von PEI-Merkmalen auf funktionale Aktivität von BO-111, wie mittels desselben zellbasierten Tests und BO-111 Konzentration von 1 bestimmt. (A) Einzelne BO-111-Präparate wurden durch Verwendung kommerzieller JetPEI-Präparate, die lineare Polymere mit verschiedenem Molekulargewicht enthalten (ausgedrückt in Kilodalton; NT: Kontrolle, nicht behandelte Zellen; solche JetPEI-Präparate weisen eine monomodale Verteilung mit Polydispersitätsindex unter 1,5 auf, insbesondere zwischen 1,1 und 1,4). (B) Einzelne BO-111-Präparate wurden durch Modifizieren des N/P-Verhältnisses (von 1,2 bis 5,3) erhalten, das berechnet wird als: µl PEI × 150 nM/µg Poly(I:C) × 3 nmol, wobei 150 nM sich auf die Konzentration von Stickstoffresten in PEI bezieht und 3 nmol sich auf die Anzahl der Nanomole von anionischem Phosphat pro 1 µg Poly(I:C) bezieht. Der pharmakologische Effekt jeder Kombination wird durch Vergleichen der Zelltod-Prozentsätze in sowohl Melanomzellen als auch Melanozyten (Kontrollzellen; NT: Kontrolle, nicht behandelte Zellen) bestimmt. Dasselbe Poly(I:C)-Präparat wie in 1 beschrieben wurde für alle BO-111-Präparate, die in (A) und (B) beschrieben sind, verwendet, aber anstatt die „Schnellpipettierungs“-Methode anzuwenden, wurde die Poly(I:C)-Lösung schnell mittels einer Spritze in das Fläschchen injiziert, das PEI-Lösung enthielt, was die Mischungsgeschwindigkeit erhöhte (zumindest soweit sie visuell bestimmt werden kann). Standardabweichung wird unter Verwendung von Triplikatdaten für jede Bedingung desselben Experiments berechnet.
    • 3: Analyse von Poly(I:C)-Molekülen in BO-111-Präparaten mittels Elektrophorese. (A) Nicht markierte Präparate anfänglicher Poly(I)- oder Poly(I:C)-Moleküle werden mit wachsenden Mengen von BO-111-Präparaten in Agarosegel 0,8% verglichen (1 Stunde Elektrophorese). Die Molekülgröße von Poly(I:C)-Molekülen wird durch Vergleich mit Größenmakern bestimmt. (B) Radioaktiv markierte Poly(I:C)-Moleküle werden mit nicht markiertem Poly(I:C) und einem BO-111-Präparat umfassend dasselbe radioaktiv markierte Poly(I:C) verglichen, mittels eines Agarosegels 1% (1 Stunde Elektrophorese), das einem photographischen Film exponiert wird. Die Poly(I:C)-Moleküle mit den verschiedenen BO-111-Präparaten, die in Tafel (A) nicht sichtbar sind, erscheinen in Tafel (B) als in der Vertiefung des Agarosegels blockiert, da sie mit JetPEI-bildenden Partikeln assoziiert sind, die das elektrische Feld (wegen ihrer Größe und/oder Ladungsverteilung) nicht durch das Agarosegel bewegen kann. (C) Nicht markierte Poly(I:C)-Moleküle werden mit einzelnen BO-111-Präparaten, die durch Modifizieren des N/P-Verhältnisses erhalten wurden (1,2, 3 und 5,3; dieser Wert wird wie in 2 berechnet), in Agarosegel 0,8% verglichen (1 Stunde Elektrophorese). Jede Probe wird entweder nicht behandelt (C+) oder mit einem spezifischen Abbauenzym (RNAse; Rnase A: 5 µg/ml über 30 Minuten) behandelt, bevor sie auf das Agarosegel geladen wird, um die Stabilität von Poly(I:C)-Molekülen in verschiedenen BO-111-Präparaten auszuwerten. Die Poly(I:C)-Moleküle erscheinen unempfindlich gegen ein solches Enzym, wenn sie mit JetPEI bei höheren N/P-Verhältnissen (größer oder gleich 3) komplexiert sind, und ein Schmier von Poly(I:C)-Molekülen erscheint freigesetzt, wenn das N/P-Verhältnis unter 3 ist. In Tafeln (A) und (C) wird die Molekülgröße von Poly(I:C)-Molekülen durch Vergleich mit einem Größenmarker bestimmt.
    • 4: Größenverteilung von BO-111-Komplexen in Präparaten, die durch den 2-Fläschchen-Herstellungsprozess erhalten wurden, wie durch Vergleich der Signalintensität mittels dynamischer Lichtstreuung mittels z sizer nano ZS-Technologie bestimmt. (A) Vergleich der Partikeldurchmesserverteilung wurde unter Verwendung dreier verschiedener unter Verwendung desselben Herstellungsprozesses erhaltener BO-111-Chargen bestimmt. (B) Vergleich einzelner BO-111-Präparate bei Exposition (oder nicht, als KONTROLLE bezeichnete Probe) an eine Inkubation bei Raumtemperatur mit Rühren über 30 Minuten. (C) Vergleich einzelner BO-111-Präparate bei Exposition (oder nicht, als KONTROLLE bezeichnete Probe) an eine Inkubation bei 50 °C über einen Zeitraum von 30 Minuten. (D) Vergleich einzelner BO-111-Präparate, Kontrollherstellung wie in Beispiel 1 und Probe „Langsame Mischung“ vorgeschlagen, ausgewertet durch Triplikatprofile, die durch den Tropfen-für-Tropfen-Ansatz unter Verwendung einer verringerten Mischungsgeschwindigkeit erhalten wurden. Partikelgröße wird unter Berücksichtigung von Partikeldurchmesser in Nanometern (d.nm) ausgewertet.
    • 5: Schema der GMP-Herstellung von BO-11X-Verbindungen, wie durch BO-112 veranschaulicht. (A) Flussdiagramm, das die Hauptschritte zur Herstellung von BO-112-Verbindungen als ein GMPbefolgendes, pharmazeutisches Präparat umfassend Poly(I:C)-Moleküle, kommerzielle JetPEI-Präparate und Glucose zusammenfasst. (B) Permeationschromatogramme für BO-112-, JetPEI- und Glucoseproben, die durch Refraktionsindexdetektion (RI) analysiert werden. Das BO-112-Signal überlappt mit dem Glucosesignal, während der charakteristische Gipfel des freien JetPEI bei Retentionsvolumen 13,75 ml verschwand, was andeutet, dass alles anfängliche JetPEI in BO-112 eingegliedert wurde. (C) Modifikation der BO-112-Verbindungsverteilung auf Grund von erhöhter Mischungsgeschwindigkeit während des Herstellungsprozesses bei niedriger (unter 100 rpm) oder hoher (über 100 rpm, bis zu 550 rpm) Injektionsgeschwindigkeit, wo 550 rpm die Referenzgeschwindigkeit für die Mischung von Lösungen im BO-112-Herstellungsprozess ist, das heißt zum Erhalten von Partikeln mit z-gemitteltem Durchmesser (d.nm) von um 100 nm bis hinunter zu 73 nm, 54 nm oder weniger (funktionale BO-112-Präparate weisen einen mittleren Durchmesser zwischen 30 nm und 150 nm auf; Partikeldurchmesser ist wie in vorherigen Figuren in d.nm definiert).
    • 6: Strukturelle Analyse verschiedener Poly(I:C)-Formulierungen. (A) Die Molekülgröße verschiedener Präparate wird in Agarosegel unter Verwendung von Größenmarkern bestimmt. (B) Größenverteilung von BO-112-Komplexen wird mit drei Poly(I:C)-haltigen kommerziellen Produkten verglichen (Poly-ICLC, LyoVec-HMW und LyoVec-LMW; Partikelgröße ist wie in vorherigen Figuren in nm definiert).
    • 7: Änderungen in der Größenverteilung nach Lagerung bei -20 °C wird bestimmt für BO-112 (A), Poly-ICLC (B), LyoVec-HMW (C) und LyoVec-LWM (D), wie durch Vergleich der Signalintensität mittels Nanosizer-Technologie bestimmt (Partikelgröße ist wie in vorherigen Figuren in nm definiert).
    • 8: Effekt verschiedener Poly(I:C)-Formulierungen auf Zelllebensfähigkeit in zwei verschiedenen Krebszellmodellen. BO-112 wird verglichen mit unbehandelten Zellen und mit mit Poly-ICLC, LyoVec-HMW und LyoVec-LMW behandelten Zellen verglichen, wobei jede Formulierung bei den angegebenen Konzentrationen getestet wird, die gemäß Komplexgewicht bestimmt wurden, aber mit einem ähnlichen Gehalt an Poly(I:C)-Molekülen in entweder einem Melanom- (A) oder Pankreaskrebs- (B) Zellmodell. Die Zelllebensfähigkeitsdaten wurden unter Verwendung des Kristallviolett-Testverfahrens nach 24 Stunden erzeugt. (C) Effekt verschiedener Poly(I:C)-Formulierungen auf Signalmoleküle von therapeutischem Interesse. Interferon-beta- (IFN-beta-) Expression wurde mittels RT-qPCR-Verfahren in SK-MEL-103-Zellen bestimmt, die BO-112, Poly-ICLC (oder nicht behandelt, NT) über 8, 16 und 24 Stunden ausgesetzt wurden. BO-112- und Poly-ICLC-Formulierungen wurden bei einer Konzentration verwendet, die einen ähnlichen Gehalt an Poly(I:C)-Molekülen ergab.
    • 9: Effekt von linearem PEI allein, Poly(I:C) und zwei verschiedenen PEI/Poly(I:C)-Formulierungen (BO-110 und BO-112;) auf die Lebensfähigkeit normaler, primärer Melanozyten (Präparate #1 und #2) und vier Krebszelllinien, der die spezifische Zytotoxizität solcher PEI/Poly(I:C)-Formulierungen gegen Krebszelllinien zeigt. Der in Präparaten von Behandlung mit nur Poly(I:C), BO-110 und BO-112 verwendete verabreichte Poly(I:C)-Gehalt ist identisch.
    • 10: Effekt von BO-112-Verabreichung in einem Tiermodell für humanen Krebs. (A) Zeitleiste, die den Behandlungsplan zeigt. Alle Mäuse wurden an Tag 0 subkutan mit murinen B16-F10-Melanomzellen injiziert. Nach Randomisierung von Mäusen in fünf Gruppen, die Tumoren ähnlicher durchschnittlicher Größe (80-100 m3) aufwiesen, an Tag 7 wurden die Tiere mit BO-112-Formulierung (Doppelkreise) durch Injektion direkt ins Tumorgewebe (i.t. Behandlung) bei 3 verschiedenen Konzentrationen in Gruppen 2, 3 und 4 (G2, G3, G4) oder, in den zwei verbleibenden Gruppen (G1 und G5), nur mit Vehikel behandelt. An den folgenden Behandlungstagen (10, 14, 17, 21 und 24) erhielten alle Gruppen außer G1 intraperitoneale (i.p.) Verabreichung eines murinen anti-PD-L1-Antikörpers (150 µg/Dosis) zusätzlich zur intratumoralen Verabreichung von BO-112-Formulierung bei derselben Konzentration von Tag 7. Überleben wurde täglich beobachtet, und die Mäuse wurden als tot bewertet, wenn sie verstorben vorgefunden wurden oder wenn das Tumorvolumen die maximal erlaubte Größe erreichte. Beobachtung wurde nach der letzten Behandlung bis Tag 45 fortgesetzt, als die letzte Maus starb und das Experiment beendet wurde. (B) Überlebenskurve, die die Kontrollgruppen G1 und G5 mit den drei Gruppen vergleicht, in denen die BO-112-Formulierung mit den angegebenen Konzentrationen verabreicht wurde. Beim Vergleich der Gruppen gab es einen statistischen Unterschied (p < 0,0001, Log-rank Mantel-Cox-Test) zwischen den Kontrollgruppen und den Testgruppen, wobei G4 den stärksten Anstieg des Überlebens verglichen mit Vehikel und anti-PD-L1 allein zeigte.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung umfassend Partikel, wobei
    1. (i) jedes jener Partikel einen Komplex von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und mindestens einem Polyalkylenimin, oder einem Salz und/oder Solvat davon, umfasst;
    2. (ii) mindestens 95%, oder mindestens 90%, jener Partikel einen Durchmesser von weniger als oder gleich 600 nm, vorzugsweise weniger als oder gleich 300 nm haben; und
    3. (iii) jene Partikel einen z-gemittelten Durchmesser von weniger als oder gleich 200 nm, vorzugsweise weniger als oder gleich 150 nm haben, insbesondere wie gemäß ISO 22412 gemessen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine wässrige Zusammensetzung umfassend Partikel, wobei
    1. (i) jedes jener Partikel einen Komplex von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und mindestens einem linearen Polyalkylenimin, oder einem Salz und/oder Solvat davon, umfasst, wobei jenes doppelsträngige Polyribonukleotid Polyinosin-Polycytidylsäure [Poly(I:C)] ist und das durchschnittliche Molekulargewicht jenes linearen Polyalkylenimins zwischen 17 und 23 kDa ist;
    2. (ii) mindestens 90% jener Partikel eine monomodale Durchmesserverteilung von unter 300 nm haben;
    3. (iii) jene Partikel einen z-gemittelten Durchmesser von weniger als oder gleich 150 nm haben, wie gemäß ISO 22412 gemessen; und
    4. (iv) jene Zusammensetzung ein Zeta-Potenzial gleich oder über 30 mV hat, gemäß ISO 13099.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung umfassend Partikel wie hierin offenbart, wobei:
    1. (i) jedes jener Partikel durch Herstellung eines Komplexes von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und mindestens einem linearen Polyalkylenimin, oder einem Salz und/oder Solvat davon, gebildet wird, wobei jenes doppelsträngige Polyribonukleotid Polyinosin-Polycytidylsäure [Poly(I:C)] ist und das durchschnittliche Molekulargewicht jenes linearen Polyalkylenimins zwischen 17 und 23 kDa ist;
    2. (ii) mindestens 90% jener Partikel einen monomodale Durchmesser von unter 300 nm haben;
    3. (iii) jene Partikel einen z-gemittelten Durchmesser von weniger als oder gleich 150 nm haben, wie gemäß ISO 22412 gemessen; und
    4. (iv) jene Zusammensetzung ein Zeta-Potenzial gleich oder über 30 mV hat, gemäß ISO 13099;
    wobei jene Partikel so gebildet werden, dass das Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoff von jenem Polyalkylenimin zur Anzahl von Molen von Phosphor von jenem doppelsträngigen Polyribonukleotid in jener Zusammensetzung gleich oder größer als 2,5 ist.
  • Die Partikel, die aus jenen Komplexen bestehen und durch diese gebildet werden, können zusätzliche Merkmale gemäß der folgenden Offenbarung aufweisen, so dass in weiteren Ausführungsformen jene Partikel weitere Bestandteile wie etwa Hilfsstoffe wie Mannitol oder Glucose, oder die Abwesenheit weiterer Elemente, wie etwa auf Krebs gerichtete Funktionalität oder andere Gruppen und Linker umfassen können. Zusätzliche Merkmale können in weiteren bevorzugten Ausführungsformen definiert werden, wenn die Partikel in den Zusammensetzungen bereitgestellt und analysiert werden [d. h. in den flüssigen (wässrigen) oder lyophilisierten Formulierungen], wie wenn sie als mit einer monomodalen Größenverteilung innerhalb spezifischer Bereiche, zum Beispiel zwischen 30 nm und 150 nm, definiert sind, oder wenn die Zusammensetzung durch die Abwesenheit einzelsträngiger Polyribonukleotidmoleküle gekennzeichnet ist (wie durch einen geringen oder fehlenden hyperchromen Effekt festgestellt). Weitere Merkmale wie gemäß international anerkannten Standards definiert, die für regulatorische Zulassung und/oder Good Manufacturing Processes erforderlich sind, sind im Folgenden offenbart.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung haben mindestens 40% der in jener Zusammensetzung enthaltenen doppelsträngigen Polyribonukleotide mindestens 850 Basenpaare und mindestens 50% der in jenen Partikeln enthaltenen doppelsträngigen Polyribonukleotide haben zwischen 400 und 5000 Basenpaare. Darüber hinaus können die in den Komplexen enthaltenen doppelsträngigen Polyribonukleotide spezifische Längenbereiche aufweisen, die durch ihre Herstellungsverfahren und/oder gemäß der gewünschten Verwendung definiert sind. Zum Beispiel können mindestens 40%, 50%, 60% oder jeder andere höhere Prozentsatz der in jenen Partikeln enthaltenen doppelsträngigen Polyribonukleotide mindestens 850 Basenpaare und mindestens 50%, 60%, 70% oder dergleichen aufweisen ein anderer höherer Prozentsatz der in jenen Partikeln enthaltenen doppelsträngigen Polyribonukleotide kann zwischen 400 und 5000 Basenpaare aufweisen. Zusätzliche Bereiche, die in jenen Partikeln enthaltene doppelsträngige Polyribonukleotide definieren können, sind:
    1. (i) zwischen 5% und 60% (und vorzugsweise zwischen 10% und 30%) der doppelsträngigen Polyribonukleotidmoleküle mit weniger als 400 Basenpaaren;
    2. (ii) zwischen 20% und 45% (oder zwischen 15% und 30%, aber vorzugsweise zwischen 20% und 30%) der doppelsträngigen Polyribonukleotidmoleküle mit zwischen 400 und 850 Basenpaaren;
    3. (iii) zwischen 20% und 70% (und vorzugsweise zwischen 50% und 60%) der doppelsträngigen Polyribonukleotidmoleküle mit zwischen 850 und 5000 Basenpaaren; und/oder
    4. (iv) zwischen 0% und 10% (und vorzugsweise 1% oder weniger) der doppelsträngigen Polyribonukleotidmoleküle mit mehr als 5000 Basenpaaren.
  • Somit haben in einer bevorzugteren Ausführungsform der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung mindestens 50% der in jener Zusammensetzung enthaltenen doppelsträngigen Polyribonukleotide mindestens 850 Basenpaare und mindestens 60% der in jener Zusammensetzung enthaltenen doppelsträngigen Polyribonukleotide haben zwischen 400 und 5000 Basenpaare. Noch bevorzugter haben mindestens 60% der in jener Zusammensetzung enthaltenen doppelsträngigen Polyribonukleotide mindestens 850 Basenpaare, mindestens 70% jener in jener Zusammensetzung enthaltenen doppelsträngigen Polyribonukleotide haben zwischen 400 und 5000 Basenpaare und zwischen 20% und 45% jener doppelsträngigen Polyribonukleotide haben zwischen 400 und 850 Basenpaare. Noch bevorzugter haben mindestens 60% der in jener Zusammensetzung enthaltenen doppelsträngigen Polyribonukleotide mindestens 850 Basenpaare, mindestens 70% jener in jener Zusammensetzung enthaltenen doppelsträngigen Polyribonukleotide haben zwischen 400 und 5000 Basenpaare, zwischen 20% und 30% jener doppelsträngigen Polyribonukleotide haben zwischen 400 und 850 Basenpaare und zwischen 10% und 30% jener doppelsträngigen Polyribonukleotide haben weniger als 400 Basenpaare.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das doppelsträngige Polyribonucleotid vorzugsweise Polyinosin-Polycytidylsäure- [Poly(I:C)-] Moleküle oder Polyadenyl-Polyuridylsäure- [Poly-(A:U)-] Moleküle. Bevorzugter ist das doppelsträngige Polyribonucleotid Polyinosin-Polycytidylsäur-e [Poly(I:C)-] Moleküle. Jene doppelsträngigen Polyribonukleotidmoleküle umfassen beispielsweise Stränge von Poly(I) und Poly(A), die mit Poly(C) bzw. Poly(U) paaren, wodurch doppelsträngige Polyribonukleotide gebildet werden, wobei jeder Strang bis zu 5% Ribonukleotide, die sich von der Mehrheit der Ribonukleotide in jenem Strang unterscheiden, umfassen kann, und/oder bis zu 5% fehlgepaarte Basenpaare umfassen kann, bevorzugter bis zu 1% Ribonukleotide, die sich von der Mehrheit der Ribonukleotide in jenem Strang unterscheiden, und/oder bis 1% fehlgepaarte Basenpaare umfassen kann. Abhängig von dem ausgewählten Polyribonukleotid und/oder dem Prozess zur Erzeugung jener Komplexe kann eine Fraktion der in dem Komplex enthaltenen Polyribonukleotide auch einzelsträngige (d. h. nicht gepaarte) Polyribonukleotide umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Gehalt an freiem, einzelsträngigem Polyribonukleotid in diesen Partikeln und den Zusammensetzungen auf der Grundlage der Hyperchromizität (oder des hyperchromen Effekts) bewertet. Dieser Effekt beruht auf der Zunahme der optischen Dichte (Absorption) doppelsträngiger Polynukleotide, wenn diese Duplexstruktur denaturiert wird. Die UV (Ultraviolett)-Absorption von Polynukleotiden wird erhöht, wenn die zwei Einzelstränge getrennt werden, entweder durch Wärme oder durch Zugabe von Denaturierungsmittel oder durch Erhöhung des pH-Werts. Hyperchromizität kann daher verwendet werden, um die Strukturen von Poly(I:C)- oder Poly(A:U)-Molekülen in den Partikeln zu überprüfen, wenn sich die Temperatur (oder eine andere Bedingung) ändert, wodurch die Trennung zwischen Poly(I)-Strängen und Poly(C)-Strängen in Poly(I:C)-Molekülen bzw. die Trennung zwischen Poly(A)-Strängen und Poly(U)-Strängen in Poly(A:U)-Molekülen bestimmt wird. Vorzugsweise ist ein solcher Gehalt an einzelsträngigen Poly(I)-Molekülen und Poly(C)-Molekülen oder einzelsträngigen Poly(A)-Molekülen und Poly(U)-Molekülen in den Partikeln so niedrig wie möglich, wie durch Messen der Lichtabsorption im Wellenlängenbereich von 260 nm unter Verwendung von Standardausrüstung und -protokollen bestimmt. Zum Beispiel kann dieser Effekt unter Verwendung eines Spektrophotometers und gemäß der European Pharmacopoeia (2,2,25; Absorption spectrophotometry, ultraviolet and visible) gemessen werden. Insbesondere zeigen die hierin offenbarten Zusammensetzungen weniger als 20% Zunahme der Absorption bei 260 nm zwischen 20 °C und 80 °C, vorzugsweise weniger als 10%, bevorzugter weniger als 5%, noch bevorzugter weniger als 1% Zunahme der Absorption bei 260 nm zwischen 20 °C und 80 °C. Alternativ zeigen die hierin offenbarten Zusammensetzungen eine Erhöhung der Transmission zwischen Raumtemperatur und 40 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80 °C und 90 °C um weniger als 0,2. Dieser Wert kann gemessen werden als die Absorption bei 260 nm (A) oder die Transmission (1/A) bei Raumtemperatur und dann Berechnen der Differenz zum jeweiligen Wert der Absorption oder Transmission bei den oben erwähnten höheren Temperaturen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist das Polyalkylenimin oder ein Salz und/oder Solvat davon, linear, verzweigt und/oder dendritisch, bevorzugter ist jenes Polyalkylenimin ein lineares Polyalkylenimin. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist jenes Polyalkylenimin ein Homo-Polyalkylenimin oder Hetero-Polyalkylenimin. Das polykationische Homo- oder Heteropolymer umfasst vorzugsweise eine sich wiederholende Einheit gebildet durch eine Aminogruppe und mindestens einen Spacer mit zwei Kohlenstoffatomen, und umfasst somit lineare oder verzweigte und/oder dendritische Homo-Polyalkylenimin- oder Hetero-Polyalkylenimin-Polymere. Beispiele für Polyalkylenimine sind Polyethylenimin, Polypropylenimin, Polybutylenimin und Polypentylenimin, gemischte Polymere jeglicher dieser Homopolymere oder jegliche kommerziell erhältliche oder anderweitig offenbarte Derivate. Dieses Polyalkyleniminpolymer ist vorzugsweise wasserlöslich. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist jenes Polyalkylenimin ein wasserlösliches lineares Homo-Polyalkylenimin oder Hetero-Polyalkylenimin. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform umfasst jenes Polyalkylenimin insbesondere ein wasserlösliches lineares Homo-Polyalkylenimin, bevorzugter umfasst es mindestens 75% lineare Polyethylenimine, noch bevorzugter 95% lineare Polyethylenimine. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist jenes Polyalkylenimin Polyethylenimin (auch bekannt als PEI). Somit ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform jenes Polyalkylenimin ein lineares Polyethylenimin.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist das gewichtsgemittelte Molekulargewicht des Polyalkylenimins zwischen 17 und 23 kDa, noch bevorzugter zwischen 17,5 und 22,6 kDa, und hat einen Molekulargewichts-Polydispersitätsindex von < 1,5. Jenes gewichtsgemittelte Molekulargewicht und jener Polydispersitätsindex wurden für den Polyalkylenoxid-Vorläufer jenes Polyalkylenimins gemäß ISO 16014:2012 bestimmt, vorzugsweise durch Gelpermeationschromatographie (GPC) gemäß ISO 16014-2:2012. Der Polydispersitätsindex wird berechnet als Mw/Mn (gewichtsgemitteltes Molekulargewicht/anzahlgemitteltes Molekulargewicht) und ist unter 1,5.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist das Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoff jenes Polyalkylenimins zur Anzahl von Molen von Phosphor jenes doppelsträngigen Polyribonukleotids in der Zusammensetzung gleich oder größer als 2,5, bevorzugter zwischen 2,5 und 5,5, noch bevorzugter zwischen 2,5 und 4,5, weiterhin bevorzugt zwischen 2,5 und 3,5. Dieses Verhältnis ist für die Bildung der Partikel in der Zusammensetzung und die Bereitstellung von Zusammensetzungen mit den gewünschten Wirkungen und Eigenschaften besonders wichtig.
  • Daher betrifft die vorliegende Erfindung, wie oben erwähnt, eine wässrige Zusammensetzung umfassend Partikel wie hierin offenbart, wobei:
    1. (i) jedes jener Partikel durch Herstellen eines Komplexes von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und mindestens einem linearen Polyalkylenimin, oder einem Salz und/oder Solvat davon, gebildet wird, wobei jenes doppelsträngige Polyribonukleotid Polyinosin-Polycytidylsäure [Poly(I:C)] ist und das durchschnittliche Molekulargewicht jenes linearen Polyalkylenimins zwischen 17 und 23 kDa ist;
    2. (ii) mindestens 90% jener Partikel einen monomodale Durchmesser von unter 300 nm haben;
    3. (iii) jene Partikel einen z-gemittelten Durchmesser von weniger als oder gleich 150 nm haben, wie gemäß ISO 22412 gemessen; und
    4. (iv) jene Zusammensetzung ein Zeta-Potenzial gleich oder über 30 mV hat, gemäß ISO 13099;
    wobei jene Partikel so gebildet werden, dass das Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoff von jenem Polyalkylenimin zur Anzahl von Molen von Phosphor von jenem doppelsträngigen Polyribonukleotid in jener Zusammensetzung gleich oder größer als 2,5 ist, bevorzugter zwischen 2,5 und 5,5, noch bevorzugter zwischen 2,5 und 4,5, weiterhin bevorzugt zwischen 2,5 und 3,5. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird jene Zusammensetzung durch Herstellen eines Komplexes aus mindestens 0,5 mg Polyinosin-Polycytidylsäure [Poly(I:C)] pro ml des Gesamtvolumens (d. h. Endvolumens) der Zusammensetzung, bevorzugter aus mindestens 2,0 mg Poly(I:C) pro ml des Gesamtvolumens der Zusammensetzung, gebildet wird. So ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das doppelsträngige Polyribonukleotid Polyinosin-Polycytidylsäure [Poly(I:C)] oder Polyadenyl-Polyuridylsäure [Poly(A:U)], wobei mindestens 60% jener doppelsträngigen Polyribonukleotide mindestens 850 Basenpaare (bp) haben, mindestens 70% jener doppelsträngigen Polyribonukleotide zwischen 400 und 5000 Basenpaare haben und zwischen 20% und 45% jener doppelsträngigen Polyribonukleotide zwischen 400 und 850 Basenpaare haben; und das Polyalkylenimin mindestens 95% Polyethylenimine umfasst, wobei das gewichtsgemittelte Molekulargewicht des Polyalkylenimins zwischen 17 und 23 kDa liegt und der Polydispersitätsindex <1,5 ist, und wobei das Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoffs jenes Polyalkylenimins zur Anzahl von Molen von Phosphor jenes doppelsträngigen Polyribonukleotids, die zur Bildung der Zusammensetzung verwendet werden (d. h. das Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoff jenes Polyalkylenimins zur Anzahl von Molen von Phosphor des doppelsträngigen Polyribonukleotids, die zur Bildung der Partikel verwendet werden), zwischen 2,5 und 5,5 ist.
  • In einer noch bevorzugteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das doppelsträngige Polyribonukleotid Polyinosin-Polycytidylsäure [Poly(I:C)], wobei mindestens 60% der Poly(I:C)-Moleküle mindestens 850 Basenpaare haben, mindestens 70% jener Poly(I:C)-Moleküle zwischen 400 und 5000 Basenpaare haben, zwischen 20% und 30% jener Poly(I:C)-Moleküle zwischen 400 und 850 Basenpaare haben und zwischen 10% und 30% jener Poly(I:C)-Moleküle weniger als 400 Basenpaare haben; und das Polyalkylenimin Polyethylenimin ist, wobei das gewichtsgemittelte Molekulargewichts des Polyalkylenimins zwischen 17,5 und 22,6 kDa ist und der Polydispersitätsindex <1,5 ist (wie zwischen 0,1 und 0,6, in der Zusammensetzung gemessen), und wobei das Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoff jenes Polyethylenimins zur Anzahl von Molen von Phosphor jenes Poly(I:C), die zur Bildung der Zusammensetzung verwendet werden (d. h. das Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoff jenes Polyalkylenimins zur Anzahl von Molen von Phosphor des doppelsträngigen Polyribonukleotids, die zur Bildung der Partikel verwendet werden) zwischen 2,5 und 4,5 ist.
  • In der vorliegenden Erfindung werden der z-gemittelte Durchmesser und der Polydispersitätsindex der Durchmesser der in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthaltenen Partikel, durch Techniken der dynamischen Lichtstreuung (DLS) bestimmt, basierend auf der Annahme, dass die Teilchen isotrop und sphärisch geformt sind. Insbesondere bezieht sich der z-gemittelte Durchmesser (zeta-gemittelte Durchmesser) auf den intensitätsgewichteten arithmetischen mittleren hydrodynamischen Durchmesser jener Teilchen, wie gemäß Industriestandard ISO 22412:2008 bestimmt. Darüber hinaus liefert der Industriestandard ISO 22412:2008 ein Maß für die Verteilung des Partikeldurchmessers (Größe) in Form eines Polydispersitätsindexes und ermöglicht die Berechnung der als D50% (der maximale Teilchendurchmesser, unter den 50% der Probenintensität fallen, auch bekannt als der Median des Durchmessers), D90% (der maximale Teilchendurchmesser, unter den 90% der Probenintensität fallen), D95% (der maximale Teilchendurchmesser, unter den 95% der Probenintensität fallen) und D99% (der maximale Teilchendurchmesser, unter den 99% der Probenintensität fallen) bekannten Perzentile (D-Werte). Somit ist es, basierend auf der in ISO 22412 vorgestellten Methodik, möglich, sicherzustellen, dass mindestens 95% (D95) oder vorzugsweise 90% (D90) der in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthaltenen Partikel einen Durchmesser von weniger als oder gleich 600 nm, bevorzugter weniger als oder gleich 300 nm haben, und dass die Partikel einen z-gemittelten Durchmesser von weniger als oder gleich 200 nm, bevorzugter weniger als 150 nm haben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung haben jene Partikel eine monomodale Durchmesserverteilung, insbesondere im oben angegebenen Submikrometerbereich. Tatsächlich umfasst in einem Aspekt die wässrige Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung Partikel, wobei mindestens 90% jener Partikel eine monomodale Durchmesserverteilung unter 300 nm haben, wobei jene Partikel einen z-gemittelten Durchmesser von weniger als oder gleich 150 nm haben, wie gemäß ISO 22412 gemessen. Partikel (oder ihre Aggregate) mit einer Größe über solchen Werten (z. B. im Mikrometerbereich, wie etwa über 10 µm), die noch vorliegen können (aber in jedem Fall unter den in der European Pharmacopoeia angegebenen Grenzen), können durch Filtration entfernt werden, am Ende der Herstellung und/oder kurz vor der Verabreichung (zum Beispiel durch 0,8-Mikrometer-Filter). Somit können alle oder eine große Mehrheit der in dieser Zusammensetzung enthaltenen Partikel eine monomodale Durchmesserverteilung in der Zusammensetzung aufweisen, die, wie in den Beispielen gezeigt, während ihrer Herstellung erzeugt wird und aufrechterhalten und gemäß der gewünschten Verwendung und/oder Lagerung angepasst werden kann.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung haben mindestens 95% oder 90% jener Partikel einen Durchmesser von weniger als oder gleich 600 nm (d. h. der maximale Partikeldurchmesser, unter den 95% oder 90% der Probenintensität fällt Ü D95% oder D90% = 600 nm), überschreiten bevorzugter nicht den Durchmesser von 500 nm, überschreiten noch bevorzugter nicht den Durchmesser von 400 nm und überschreiten noch bevorzugter nicht den Durchmesser von 300 nm. Innerhalb solcher Grenzen haben noch bevorzugter mindestens 99% jener Partikel einen Durchmesser von weniger als oder gleich 600 nm, haben noch bevorzugter mindestens 99% jener Partikel einen Durchmesser von weniger als oder gleich 500 nm, haben viel bevorzugter mindestens 99% jener Partikel einen Durchmesser von weniger als oder gleich 400 nm und überschreiten noch bevorzugter nicht den Durchmesser von 300 nm. Auf der anderen Seite haben jene Partikel in einer bevorzugten Ausführungsform einen Median des Durchmessers (D50%) zwischen 75 und 150 nm, bevorzugter zwischen 80 und 130 nm, und einen D90% von zwischen 140 und 250 nm, bevorzugter zwischen 170 und 240 nm.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung haben jene Partikel einen z-gemittelten Durchmesser unter 150 nm, und bevorzugter in Bereichen umfasst von 30 nm und 150 nm (wie etwa noch bevorzugter zwischen 50 nm und 150 nm, zwischen 75 nm und 150 nm, zwischen 50 nm und 100 nm, zwischen 100 nm und 150 nm, oder zwischen 60 nm und 130 nm). Bevorzugter haben jene Partikel der wässrigen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine monomodale Durchmesserverteilung zwischen 30 nm und 150 nm.
  • Somit haben in am allermeisten bevorzugten Ausführungsformen: (i) mindestens 99% der in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthaltenen Partikel einen Durchmesser von weniger als oder gleich 600 nm, wobei jene Partikel einen z-gemittelten Durchmesser von zwischen 30 nm und 150 nm haben; und (ii) mindestens 99% der in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthaltenen Partikel einen Durchmesser von weniger als oder gleich 500 nm, wobei jene Partikel einen z-gemittelten Durchmesser von zwischen 60 nm und 130 nm haben und einen Median des Durchmesser zwischen 75 und 150 nm haben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist jene Zusammensetzung durch Lyophilisieren der hierin offenbarten wässrigen Zusammensetzungen erhältlich. Somit kann die Zusammensetzung der Erfindung eine wässrige oder eine lyophilisierte Zusammensetzung sein. Somit kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung (hierin BO-11X-Formulierung, wobei X eine ganze Zahl sein kann, so dass eine BO-11X-Formulierung zum Beispiel eine BO-111- und eine BO-112-Formulierung umfasst) in einer festen (als eine lyophilisierte oder hoch konzentrierte Form der Partikel), halbfesten (als ein Gel) oder flüssigen Form bereitgestellt werden, ist aber als eine flüssige Zusammensetzung bevorzugt (wie eine wässrige Zusammensetzung oder andere Art von Partikelsuspension, die injiziert oder inhaliert werden kann). Die BO-11X-Formulierung kann als solche verwendet, transportiert und gelagert werden, oder kann verwendet werden, um eine lyophilisierte Form für spezifische Verwendungen, Transport, Lagerung, Verabreichung mit anderen Verbindungen und/oder weitere technische Erfordernisse zu erhalten. Hinsichtlich Lyophilisierungsprozess und -ausrüstung können klassische Gefriertrocknungs- und neuere Verfahren (wie Elektrogefrieren, Ultraschall-kontrolliert oder Eisnebel) zur Handhabung und Herstellung der BO-11X-Formulierungen angepasst werden, auch durch Änderung von Parametern wie pH, Trockenluftgeschwindigkeit, Zeit, Feuchtigkeit, Druck und Temperatur.
  • Daher umfasst in einer am meisten bevorzugten Ausführungsform die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung Partikel, wobei:
    1. (i) jedes jener Partikel einen Komplex von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und mindestens einem Polyalkylenimin, oder einem Salz und/oder Solvat davon, umfasst, wobei
      1. (a) jenes doppelsträngige Polyribonukleotid Polyinosin-Polycytidylsäure [Poly(I:C)] oder Polyadenyl-Polyuridylsäure [Poly(A:U)] ist, wobei mindestens 60% jenes doppelsträngigen Polyribonukleotids mindestens 850 Basenpaare haben, mindestens 70% jenes doppelsträngigen Polyribonukleotids zwischen 400 und 5000 Basenpaare haben, und zwischen 20% und 45% jenes doppelsträngigen Polyribonukleotids zwischen 400 und 850 Basenpaare haben; und
      2. (b) jenes Polyalkylenimin mindestens 95% Polyethylenimine umfasst, wobei das durchschnittliche Molekulargewicht jenes Polyalkylenimins zwischen 17 und 23 kDa ist und der Polydispersitätsindex < 1,5 ist, und wobei das Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoff von jenem Polyalkylenimin zur Anzahl von Molen von Phosphor von jenem doppelsträngigen Polyribonukleotid in jener Zusammensetzung (d. h. wobei das Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoff von jenem Polyalkylenimin zur Anzahl von Molen von Phosphor von jenem doppelsträngigen Polyribonukleotid, die zur Bildung jener Partikel verwendet wurden) zwischen 2,5 und 5,5 ist;
    2. (ii) mindestens 99% jener Partikel einen Durchmesser von weniger als oder gleich 600 nm haben, vorzugsweise mindestens 95% jener Partikel einen Durchmesser von weniger als oder gleich 400 nm haben; und
    3. (iii) jene Partikel einen z-gemittelten Durchmesser von zwischen 30 nm und 150 nm haben.
  • In einer anderen am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine wässrige Zusammensetzung umfassend Partikel, wobei:
    1. (i) jedes jener Partikel einen Komplex von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und mindestens einem Polyalkylenimin, oder einem Salz und/oder Solvat davon, umfasst, wobei
      1. (a) jenes doppelsträngige Polyribonukleotid Polyinosin-Polycytidylsäure [Poly(I:C)] ist, wobei mindestens 60% jenes doppelsträngigen Polyribonukleotids mindestens 850 Basenpaare haben, mindestens 70% jenes doppelsträngigen Polyribonukleotids zwischen 400 und 5000 Basenpaare haben, und zwischen 20% und 45% jenes doppelsträngigen Polyribonukleotids zwischen 400 und 850 Basenpaare haben; und
      2. (b) jenes Polyalkylenimin Polyethylenimin (PEI) ist, wobei das gewichtsgemittelte Molekulargewicht jenes PEI zwischen 17,5 und 22,6 kDa ist und der Polydispersitätsindex < 1,5 ist, und wobei das Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoff von jenem Polyalkylenimin zur Anzahl von Molen von Phosphor von jenem doppelsträngigen Polyribonukleotid in jener Zusammensetzung (d. h. wobei das Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoff von jenem Polyalkylenimin zur Anzahl von Molen von Phosphor von jenem doppelsträngigen Polyribonukleotid, die zur Bildung jener Partikel verwendet wurden) zwischen 2,5 und 4,5 ist;
    2. (ii) mindestens 99% jener Partikel einen Durchmesser von weniger als oder gleich 500 nm haben, vorzugsweise mindestens 95% oder 90% jener Partikel eine monomodale Durchmesserverteilung unter 300 nm haben;
    3. (iii) jene Partikel einen z-gemittelten Durchmesser von zwischen 60 nm und 130 nm haben; und
    4. (iv) jene Partikel einen Durchmessermedian (D50%) von zwischen 75 nm und 150 nm haben.
  • Die BO-11X-Formulierungen können in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung als Zusammensetzungen bereitgestellt werden, die weiter einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff, organisches Lösungsmittel und/oder Adjuvans [wie Glycerin, Ethanol, Glucose oder Mannitol, vorzugsweise Glucose oder Mannitol, bevorzugter in einer Konzentration von zwischen 1 und 10% (Gewicht/Volumen)] umfassen [d. h. wobei jene Zusammensetzung durch zusätzliches Hinzufügen von Glucose oder Mannitol in einer Konzentration von zwischen 1 und 10% (Gewicht/Volumen) gebildet wird], der am besten geeignet ist für die bevorzugte Endform (wie etwa flüssig oder lyophilisiert), Verwendungen, Transport, Lagerung, Verabreichung mit anderen Verbindungen und/oder weitere technische Erfordernisse. In einer bevorzugteren Ausführungsform umfasst jene Zusammensetzung weiter mindestens eine Verbindung ausgewählt aus einer organischen Verbindung, einer anorganischen Verbindung, einer Nukleinsäure, einem Aptamer, einem Peptid oder einem Protein.
  • In einem Aspekt hat die wässrige Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ein Zeta-Potenzial gleich oder über 30 mV, vorzugsweise zwischen 35 und 50 mV oder zwischen 38 und 45 mV, noch bevorzugter zwischen 40 und 45 mV, gemäß ISO 13099.
  • In einer anderen Ausführungsform der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist jene Zusammensetzung eine wässrige Zusammensetzung, die:
    1. (i) einen pH zwischen 2 und 4;
    2. (ii) eine Osmolarität zwischen 200 und 600 mOsm/kg;
    3. (iii) eine spezifische optische Drehung zwischen +1500 und +3750 Grad.ml.g-1.dm-1 bei einer Wellenlänge von 589 nm bei 20 °C, wenn jene wässrige Zusammensetzung 5 % (Gewicht/Volumen) D-Glucose in Wasser umfasst, verglichen mit Wasser; und/oder
    4. (iv) ein Zeta-Potenzial größer als oder gleich 30 mV (zum Beispiel zwischen 35 und 50 mV) hat.
  • In einer noch bevorzugteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist jene Zusammensetzung eine wässrige Zusammensetzung, die:
    1. (i) einen pH zwischen 2 und 4;
    2. (ii) eine Osmolarität zwischen 200 und 600 mOsm/kg; und/oder
    3. (iii) ein Zeta-Potenzial größer als oder gleich 30 mV (zum Beispiel zwischen 35 und 50 mV) hat.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist jene Zusammensetzung eine wässrige Zusammensetzung umfassend Glucose und Mannitol, die:
    1. (i) einen pH zwischen 2 und 4; und/oder
    2. (ii) eine Osmolarität zwischen 200 und 600 mOsm/kg hat.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist jene Zusammensetzung eine wässrige Zusammensetzung umfassend Glucose, die:
    1. (i) einen pH zwischen 2,7 und 3,4;
    2. (ii) eine Osmolarität zwischen 200 und 340 mOsm/kg; und/oder
    3. (iii) ein Zeta-Potenzial zwischen 35 und 50 mV oder zwischen 38 und 45 mV, noch bevorzugter zwischen 40 und 45 mV hat.
  • In einer alternativen, weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist jene Zusammensetzung eine wässrige Zusammensetzung umfassend Mannitol, die:
    1. (i) einen pH zwischen 2,7 und 3,4;
    2. (ii) eine Osmolarität zwischen 200 und 600 mOsm/kg; und/oder
    3. (iii) ein Zeta-Potenzial zwischen 35 und 50 mV oder zwischen 38 und 45 mV, noch bevorzugter zwischen 40 und 45 mV hat.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die hierin berichteten Osmolaritätswerte strenggenommen Osmolalitätswerte, aber da die Dichte von Wasser (dem Lösungsmittel, in der die wässrigen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung hergestellt werden) sich bei 20 °C 1,00 g/ml annähert, werden diese Begriffe austauschbar verwendet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezieht sich Raumtemperatur auf eine Temperatur zwischen 20 und 25 °C.
  • In der vorliegenden Erfindung wird das Zeta-Potenzial gemäß ISO 13099, vorzugsweise 13099-2:2012 gemessen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung wie hierin offenbart zur Verwendung als ein Medikament. Analog betrifft die vorliegende Erfindung daher auch die Verwendung der Zusammensetzung wie hierin offenbart zur Herstellung eines Medikaments. Diese Verwendung kann erreicht werden durch Bereitstellen der Zusammensetzung als flüssige (wässrig) oder lyophilisierte Zusammensetzung, wobei Poly(I:C)-Moleküle und die Partikel, die es umfassen, in einer hochstabilen Form und in hoher Konzentration vorliegen {z. B. wobei jene Zusammensetzung gebildet wird durch Herstellen eines Komplexes unter Verwendung von mindestens 0,5 mg, 0,7 mg/ml, 0,9 mg/ml, bis zu 2,0 mg Polyinosin-Polycytidylsäure [Poly(I:C)] oder Polyadenyl-Polyuridylsäure [Poly(A:U)] oder mehr pro ml des Gesamt- (d. h. End-) Volumens jener Zusammensetzung.
  • Diese Zusammensetzungen sind besonders angepasst zur direkten Verabreichung an Krebszellen, zum Beispiel mittels intratumoraler oder peritumoraler Injektion in Haut oder ein inneres Organ oder Gewebe umfassend solche Tumoren und Krebszellen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist jenes Medikament injizierbar. In einer bevorzugteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist jenes Medikament eine injizierbare, wässrige Zusammensetzung, die optional einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff und/oder Adjuvans umfasst. Diese injizierbare, wässrige Zusammensetzung kann als solche bereitgestellt werden oder nach Verdünnen eines konzentrierten Präparats von Poly(I:C)- oder Poly(A:U)-Molekülen (bei einer betreffenden Konzentration von mindestens 0,5 mg Poly(I:C) oder Poly(A:U)/ml des Gesamtvolumens der herzustellenden Zusammensetzung oder mehr, wie festgelegt, wenn die Partikel hergestellt werden, in Bezug auf das jeweilige Gewicht von Poly(I:C)- oder Poly(A:U)-Molekülen, die zu einem gegebenen Volumen von Lösung zugegeben werden) oder einer lyophilisierten Zusammensetzung, um ein Gesamtvolumen der Zusammensetzung der Erfindung zu ergeben. Das bedeutet, dass jene Zusammensetzung in den vorigen Konzentrationen bereitgestellt wird, die bestimmt werden in Bezug auf das Gewicht von Poly(I:C) oder Poly(A:U), das in der Herstellung des Komplexes verwendet wird, pro Volumen der gesamten wässrigen Zusammensetzung, aber konzentriert sein kann wenn angebracht, insbesondere für langfristige Lagerung und/oder intratumorale Verabreichung. Insbesondere ist die BO-11X-Formulierung mit doppelsträngigen Poly(I:C)-Molekülen bei solch hohen Konzentrationen (d. h. die hergestellt aus Partikeln umfassend einen Komplex, der durch Komplexieren von mindestens 0,5 mg bis zu 0,7 mg, vorzugsweise 0,9 mg, bevorzugter 2,0 mg oder mehr Poly(I:C) mit linearem PEI pro ml der gesamten wässrigen Zusammensetzung gebildet wird) am geeignetsten zur Verabreichung und Verwendung als ein Medikament. Die intratumorale und peritumorale Injektion einer solchen Zusammensetzung (abhängig auch von der tatsächlichen Zugänglichkeit und/oder Größe der Tumormasse, wie durch den Arzt bestimmt) an einer oder mehr kleinen oder beschränkten Positionen, wo Tumore und Krebszellen vorliegen, kann einen stärkeren und/oder zeitigeren therapeutischen Effekt bewirken.
  • Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung zusätzlich eine Zusammensetzung wie hierin offenbart zur Verwendung in der Behandlung einer Zellwachstumsstörung, die durch abnormales Wachstum menschlicher oder tierischer Zellen gekennzeichnet ist. Eine solche Behandlung kann die kombinierte Verabreichung der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung mit einer anderen therapeutischen Behandlung beinhalten, wie einem anderen krebsspezifischen Medikament (das zum Beispiel ein Antikörper, der auf ein Krebsantigen abzielt, oder ein Krebsimpfstoff ist) oder einer Therapiestandard-Behandlung (wie Radio- oder Chemotherapie). Die kombinierte Verabreichung kann nicht nur einen additiven therapeutischen Effekt bewirken, sondern auch andere wertvollen Effekte wie Verringern der Dosierung des anderen Medikaments, die notwendig ist, einen ähnlichen therapeutischen Vorteil zu erzielen, Verringern von Nebenwirkungen oder Bewirken eines länger andauernden und/oder eines synergistischen Effekts auf Tumore und Krebszellen. Analog betrifft die vorliegende Erfindung deshalb auch die Verwendung der Zusammensetzung wie hierin offenbart zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Zellwachstumsstörung, die durch abnormales Wachstum menschlicher oder tierischer Zellen gekennzeichnet ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist abnormales Wachstum durch unkontrollierte Zellteilung und/oder -differenzierung gekennzeichnet.
  • In einer bevorzugteren Ausführungsform ist jene Zellwachstumsstörung Krebs oder eine gynäkologische Störung, die durch abnormales Wachstum von Zellen der weiblichen Säuger-Fortpflanzungsorgane gekennzeichnet ist. Der Krebs, auf den sich die vorliegende Erfindung bezieht, ist vorzugsweise eines oder mehr von Basalzellkarzinom; Gallentraktkrebs; Blasenkrebs; Knochenkrebs; Hirn- und Zentralnervensystemkrebs; Brustkrebs; Krebs des Bauchfells; Choriokarzinom; Bindegewebskrebs; Krebs des Verdauungstrakts (einschließlich Speiseröhren-, Magen-, Kolon-, Enddarm- oder Gastrointestinalkrebs); Augenkrebs; Krebs des Kopfes und des Halses; Glioblastom; Leberkarzinom; Hepatom; intraepithelialem Neoplasma; Nieren-, Nebennieren- oder Renalkrebs; Leukämie; Leberkrebs; Lungenkrebs (z. B. kleinzelliger Lungenkrebs, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Lungenadenokarzinom und Lungenplattenepithelkarzinom); Melanom; Myelom; Neuroblastom; Mundhöhlenkrebs (z. B. Lippen-, Kehlkopf-, Zungen-, Mund- oder Rachenkrebs); Bauchspeicheldrüsenkrebs; Prostatakrebs; Retinoblastom; Rhabdomyosarkom; Krebs der Atemwege; Speicheldrüsenkrebs; Hautkrebs; Plattenepithelkrebs; Hodenkrebs; Schilddrüsenkrebs; Gebärmutter-, Gebärmutterschleimhaut-, Gebärmutterhals-, Vulva-, Eierstock- oder anderem gynäkologischer Krebs; Krebs der Harnwege; Lymphom einschließlich B-Zell-Lymphom, Hodgkin- und Nicht-Hodgkin-Lymphom (NHL; einschließlich spezifischer Typen wie niederschwelligem/follikulärem, klein-lymphozytischem, mittelschwerem/follikulärem, mittelschwerem diffusem, schwerem immunoblastischem, schwerem lymphoblastischem, schwerem klein-nichtgespalten-zelligem, oder Bulky-Disease-NHL); Mantelzell- und AIDS-bedingtem Lymphom; chronischer lymphozytischer Leukämie; akuter lymphoblastischer Leukämie; Haarzellleukämie; chronischer myeloblastischer Leukämie; sowie anderen Karzinomen und Sarkomen; posttransplantativer Lymphoproliferationsstörung (PTLD), sowie abnormaler vaskulärer Proliferation assoziiert mit Phakomatosen oder Ödem (wie die mit Hirntumor assoziierten). Bevorzugter ist jener Krebs ausgewählt aus einem oder mehr von Blasenkrebs; Knochenkrebs; Hirn- und Zentralnervensystemkrebs; Brustkrebs; Krebs des Verdauungstrakts (einschließlich Speiseröhren-, Magen-, Kolon-, Enddarm- oder Gastrointestinalkrebs); Krebs des Kopfes und des Halses; Glioblastom; Leberkarzinom; Hepatom; Nieren-, Nebennieren- oder Renalkrebs; Leukämie; Leberkrebs; Lungenkrebs; Melanom; Myelom; Neuroblastom; Bauchspeicheldrüsenkrebs; Prostatakrebs; Krebs der Atemwege; Hautkrebs; Hodenkrebs; Schilddrüsenkrebs; Gebärmutter-, Gebärmutterschleimhaut-, Gebärmutterhals-, Vulva-, Eierstock- oder anderem gynäkologischer Krebs; Krebs der Harnwege; Lymphom oder Leukämie. Noch bevorzugter ist jener Krebs ausgewählt aus einem oder mehr von Karzinom, Gliom, Melanom oder Sarkom, noch bevorzugter Melanom, Prostatakrebs, Kolonkrebs, Brustkrebs oder Bauchspeicheldrüsenkrebs, oder alternativ Melanom oder Bauchspeicheldrüsenkrebs.
  • Die weiblichen Säuger-Fortpflanzungsorgane, auf die sich die vorliegende Erfindung bezieht, sind die weiblichen Säuger-Geschlechtsorgane, die sich zwischen und einschließlich der Scheide und dem Eileiter befinden. Jene Fortpflanzungsorgane der vorliegenden Erfindung sind die Gebärmutter, die Eileiter (einschließlich der uterotubalen Verbindung), Eierstöcke, Gebärmutterhals und Scheide, vorzugsweise die Gebärmutter, die Eileiter und der Gebärmutterhals, bevorzugter die Säuger-Gebärmutter. Daher ist die gynäkologische Störung der vorliegenden Erfindung eine Krankheit, die mindestens eine Zelle des weiblichen Säuger-Reproduktionstrakts betrifft, der sich zwischen der Scheide und den Eileitern befindet, vorzugsweise die Gebärmutter, die Eileiter und den Gebärmutterhals. In der vorliegenden Erfindung ist die gynäkologische Störung bevorzugter eine Krankheit, die mindestens eine Zelle in einem Gewebe der Säuger-Gebärmutter betrifft. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die gynäkologische Störung ausgewählt aus Endometriose und Leiomyom.
  • In der vorliegenden Erfindung ist das Säugetier vorzugsweise hominin, bovin, equin, canin, felin, ovin, porcin, camellin, caprin oder cervin. Weiter bevorzugt ist jenes Säugetier ein Mensch, Hund, Rind, Pferd oder Kamel, noch bevorzugter ein Mensch oder Hund, und am meisten bevorzugt ein Mensch.
  • Daher können die BO-11X-Formulierungen eine Kombination von Komponenten und anderen physikochemischen Merkmalen aufweisen, die Effekte von medizinischem Interesse (wie zur Behandlung von Krebsen wie Melanom oder Karzinomen) bereitstellen, und die vorzugsweise erhalten werden können durch Anwenden eines Prozesses, der mit regulatorischen und industriellen Erfordernissen kompatibel sind, wie jenen, die auf die Medikamentenherstellung anwendbar sind. Insbesondere werden BO-11X-Herstellungsstufen in strenger Übereinstimmung mit den Erfordernissen von Good Manufacturing Practices, die in Europa (spezifisch Anhang 13), USA, Japan und/oder anderen Ländern in Kraft sind, und/oder mit den Erfordernissen für die Genehmigung von Industrial Medicinal Product Dossier (IMPD) durchgeführt. BO-11X-Formulierungen sollten Tests auf Sterilität, Reinheit, Stabilität und Biosicherheit (Abwesenheit oder im Wesentlichen frei von Endotoxinen, Virus, Bakterien, Chemikalien, Metallen oder anderen Verunreinigungen, die mit der Verwendung in Menschen inkompatibel sind) bestehen. Zum Beispiel sollte der Endotoxinspiegel nicht mehr als 1,0 EU/mg oder 1 µg/ml betragen, unter Verwendung von offiziell zugelassenen Detektionskits.
  • Solche Komponenten und Merkmale, die BO-11X-Formulierungen weiter kennzeichnen (als hierin umfasste Zusammensetzung oder Partikel), können eines oder mehr der Folgenden sein:
    1. (i) Eine Zusammensetzung umfassend pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff und/oder Adjuvans, mit oder ohne jegliche weitere organische Verbindung (wie ein Lösungsmittel), anorganische Verbindung, Nukleinsäure, Aptamer, Peptid oder Protein von medizinischem Interesse, das von den Partikeln selbst umfasst ist (zum Beispiel, während ihrer Herstellung) oder später zur Zusammensetzung umfassend diese Partikel zugegeben wird;
    2. (ii) Partikel gebildet durch ein Polyalkylenimin (wie lineares PEI), insbesondere mit einem gewichtsgemittelten Molekulargewicht zwischen 17 und 23 kDa, bevorzugter zwischen 17,5 und 22,6 kDa;
    3. (iii) Eine Zusammensetzung umfassend Partikel, die durch Herstellen eines Komplexes unter Verwendung doppelsträngiger Polyribonukleotide bei einer Konzentration von mindestens 0,5 mg/ml des Gesamt- (d. h. End-) Volumens jener Zusammensetzung (zum Beispiel von 0,5 mg/ml bis zu 0,7 mg/ml, 0,9 mg/ml, 2 mg/ml oder mehr) gebildet werden;
    4. (iv) Partikel umfassend ein Polyalkylenimin und doppelsträngige Polyribonukleotide, die bei einem Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoff jenes Polyalkylenimins zur Anzahl von Molen von Phosphor jenes doppelsträngigen Polyribonukleotids (d. h. dem Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoff jenes Polyalkylenimins zur Anzahl von Molen von Phosphor jenes doppelsträngigen Polyribonukleotids, die bei der Bildung jener Partikel verwendet werden) gebildet werden, das gleich oder größer als 2,5, bevorzugter zwischen 2,5 und 5,5, noch bevorzugter zwischen 2,5 und 4,5, weiter bevorzugt zwischen 2,5 und 3,5 ist;
    5. (v) Partikel mit einer monomodalen Durchmesserverteilung mit einem Z-gemittelten Durchmesser, wie hierin definiert und gemäß ISO 22412 gemessen, vorzugsweise unter 200 nm, bevorzugter unter 150 nm, und noch bevorzugter in Bereichen umfasst zwischen 150 nm und 30 nm (wie zwischen 150 nm und 50 nm, zwischen 150 nm und 75 nm, zwischen 100 nm und 50 nm, zwischen 150 nm und 100 nm oder zwischen 60 nm und 130 nm);
    6. (vi) Partikel mit einer monomodalen Durchmesserverteilung, bestimmt aus der Durchmesserverteilung gemäß ISO 22412, die dargestellt wird durch D-Werte D50% (der maximale Partikeldurchmesser, unter den 50% der Probenintensität fällt, auch bekannt als der Median des Durchmessers) zwischen 75 und 150 nm und D90% (der maximale Partikeldurchmesser, unter den 90% der Probenintensität fällt) zwischen 140 und 250 nm;
    7. (vii) Mindestens 95% der Partikel haben einen Durchmesser von 600 nm, bevorzugt einen Durchmesser von 500 nm, bevorzugter einen Durchmesser von 400 nm, und noch bevorzugter einen Durchmesser von 300 nm. Noch bevorzugter haben mindestens 90% der Partikel eine monomodale Durchmesserverteilung unter 300 nm;
    8. (viii) Eine Zusammensetzung, die eine Osmolarität zwischen 200 und 600 mOsm/kg aufweist, bevorzugter eine wässrige Zusammensetzung umfassend 5% (Gewicht/Volumen) Glucose, die eine Osmolarität zwischen 200 und 400 mOsm/kg, bevorzugter zwischen 260 und 340 mOsm/kg aufweist;
    9. (ix) Eine Zusammensetzung, die einen pH zwischen 2,7 und 3,4 aufweist;
    10. (x) Eine wässrige Zusammensetzung umfassend 5% (Gewicht/Volumen) D-Glucose, die eine spezifische optische Drehung zwischen +1500 und +3750 Grad.ml.g-1.dm-1 bei einer Wellenlänge von 589 nm bei 20 °C bei einer Wellenlänge von 589 nm bei 20 °C in Wasser aufweist, verglichen mit Wasser; und/oder
    11. (xi) Eine Zusammensetzung, die ein Zeta-Potenzial gleich oder über 30 mV aufweist, wie 38 mV, vorzugsweise zwischen 35 und 50 mV, bevorzugter zwischen etwa 40 und 45 mV (z. B. 43 mV), wie hierin definiert und gemäß ISO 13099 gemessen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, insbesondere zur pharmazeutischen Verwendung, umfassend Partikel betreffen, wobei jene Partikel Komplexe doppelsträngiger Polyribonukleotide mit einem wasserlöslichen, polykationischen Homo- oder Hetero-Polymer umfassen, wobei jene Partikel durch eine monomodale Durchmesserverteilung gekennzeichnet sind, die dadurch definiert ist, dass sie einen Durchmesser von weniger oder gleich 600 nm, vorzugsweise weniger oder gleich 300 nm, und einen z-gemittelten Durchmesser von weniger oder gleich 200 nm, vorzugsweise weniger oder gleich 150 nm, hat.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die doppelsträngigen Polyribonukleotidmoleküle Poly(I:C)-Moleküle, die in den BO-11X-Formulierungen vorliegen, resultieren aus der Paarung von Polyinosinsäure- [Poly(l)-] Molekülen und einzelsträngigen Polycytidylsäure- [Poly(C)-] Molekülen, die selbst spezifische Bereiche von Prozentsätzen für Größen unter 0,4 Kb, zwischen 0,4 Kb und 0,85 Kb, zwischen 0,85 Kb und 5,0 Kb und über 5,0 Kb haben, wie in den Beispielen angegeben, die auch Mittel bereitstellt zur Erzeugung einer wässrigen Zusammensetzung von Poly(I:C)-Molekülen (die bereits einen Hilfsstoff wie Glucose oder Mannitol enthält oder nicht enthält) und geeignete Merkmale haben, um mit wässriger Lösung eines Polyalkylenimins (wie Polyethylenimin) zur Herstellung der BO-11X-Formulierungen gemischt zu werden. Die Poly(I:C)-haltige Formulierung, die sich aus der Mischung dieser zwei wässrigen Lösungen ergibt, wird dann als ein Chargenpräparat erhalten (vorzugsweise immer noch als eine wässrige Lösung oder in einer lyophilisierten Form) oder kann direkt in Aliquots vorbereitet werden, jedes enthalten in Röhrchen zur einmaligen Verwendung, Spritzen oder einem anderen geeigneten Behälter zur Lagerung, einmaligen Verwendung solcher Aliquots und/oder Lyophilisierung. BO-11X-Formulierungen (in einer flüssigen oder lyophilisierten Form) können bei Raumtemperatur oder einer Temperatur unter 0 °C oder unter -20 °C gelagert werden.
  • In einer solchen bevorzugten Ausführungsform können weitere Verbindungen (wie ein oder mehr Antikörper, Hormon, Peptid, Hilfsstoff, Träger, Inhibitor einer enzymatischen Aktivität, chemotherapeutisches Mittel, Antibiotikum, Stabilisierungsmittel, Markierungsmittel, organisches Lösungsmittel, Konservierungsstoffe, Träger oder anderes Medikament) entweder zu jeder der zwei wässrigen Lösungen vor ihrer Mischung (wenn die korrekte Bildung der Partikel oder jegliches andere der oben für BO-11X-Formulierungen aufgelisteten Merkmale nicht verändert wird), oder nachdem jene BO-11X-Formulierung durch Mischen der zwei wässrigen Lösungen (von doppelsträngigem Polyribonukleotid und Polyalkylenimin) hergestellt worden ist, zugegeben werden. Solche zusätzlichen Komponenten, die anschließend zur selben Zeit wie die BO-11X-Komponenten verabreicht werden, können einer Zusammensetzung Verbesserungen in der Bioverfügbarkeit, Wirksamkeit, pharmakokinetischen/pharmakodynamischen Profilen, Stabilität, Verstoffwechslung oder anderen Eigenschaft von pharmazeutischem Interesse verleihen, die nicht beobachtet werden, wenn jedes von anfänglicher BO-11X-Formulierung oder der zusätzlichen Komponente (eine andere Verbindung von pharmazeutischem Interesse, zum Beispiel) allein verabreicht wird, oder jedes von anfänglicher BO-11X-Formulierung oder der zusätzlichen Komponente getrennt verabreicht wird.
  • In einer weiteren bevorzugten Hauptausführungsform ist die BO-11X-Formulierung zur Verwendung als ein Medikament, wie etwa eine pharmazeutische Zusammensetzung, die formuliert (z. B. als eine injizierbare, wässrige Zusammensetzung, optional umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff und/oder Adjuvans) und verabreicht wird zur Zuführung eines doppelsträngigen Polyribonukleotids an ein Organ oder ein Gewebe in einem gesunden Zustand, das eine Krankheit in Beziehung mit einem exogenen pathogenen Agens (wie einem Bakterium oder einem Virus) aufweist, oder das eine Veränderung auf Grund einer Zellwachstumsstörung aufweist, die durch abnormales Wachstum menschlicher oder tierischer Zellen gekennzeichnet ist, zum Beispiel auf Grund von Krebs (das heißt unter Beteiligung von tumorigener Transformation, Metastasierung, toxischer Verbindung), oder einer gynäkologischen Störung, die durch abnormales Wachstum von Zellen der weiblichen Säuger-Fortpflanzungsorgane gekennzeichnet ist). Daher betrifft die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit umfassend Verabreichen der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an einen Menschen oder ein Tier. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Zellwachstumsstörung, die durch abnormales Wachstum menschlicher oder tierischer Zellen gekennzeichnet ist, wie hierin definiert, umfassend Verabreichen der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an einen Menschen oder ein Tier.
  • Vorzugsweise wird die BO-11X-Formulierung in Verfahren zum Induzieren (direkt oder indirekt) des Todes der Tumorzelle oder zum Unterdrücken des Wachstums der Tumorzelle bei der Behandlung, Verringerung, Verbesserung oder Verhinderung von Krebswachstum, Überleben, Metastasierung, Epithel-Mesenchym-Übergang, immunologischer Flucht oder Widerauftreten verwendet. Bevorzugter werden BO-11X-Formulierungen in Verfahren zur Behandlung von soliden Tumoren wie Karzinomen, Gliomen, Melanomen oder Sarkomen verwendet. Insbesondere wird die BO-11X-Formulierung entweder systemisch oder direkter in oder in der Nähe des Tumors, wie am Rand der Tumormasse, in den umgebenden Epithelzellen, Lymph- oder Blutgefäßen (z. B. durch intratumorale oder peritumorale Injektion), oder der abnormal wachsenden Zellen von weiblichen Säuger-Fortpflanzungsorganen verabreicht.
  • In einigen Ausführungsformen ist die BO-11X-Formulierung die gemäß den Herstellungsverfahren hergestellte und dann strukturell und funktionell definiert, wie in den Beispielen als BO-111- oder BO-112-Formulierungen beschrieben. Die BO-11X-Formulierung kann ferner die biologischen Aktivitäten aufweisen, die für BO-110 charakterisiert wurden, wie in WO2011003883 beschrieben, nämlich die Aktivierung einer Familienhelicase MDA-5 oder des Niveaus der NOXA-Expression, in Kombination mit der Induktion von Autophagie in Krebszellen oder in einer von Krebszellen abgeleiteten Zelllinie, vorzugsweise menschlichen Ursprungs, wenn auch in einem verbesserten Ausmaß. Beispiele für Zelllinien zur Validierung von BO-11X-Formulierungen sind humane SK-Mel-19-, SK-Mel-28-, SK-Mel-103- und SK-Mel-147-Zellen und die murinen B16-Zellen, wobei jene Melanomzelllinien eine erhöhte Expression von Molekülen wie Interferon Beta aufweisen, wenn sie einer BO-11X-Formulierung ausgesetzt werden. Zusätzlich weist die BO-11X-Formulierung keine Toxizität gegenüber normalen Zellen auf, die als Kontrollen verwendet werden, wie Melanozyten oder anderen Hautzellen, sowie Zellen des Immunsystems, die gewöhnlich Orte sekundärer Toxizität bei der Krebsbehandlung darstellen. Die BO-11X-Formulierung kann auch, nach Autophagie und Apoptose von Krebszellen (oder jeglichem anderen Effekt von therapeutischem Interesse, den diese Formulierung in solchen Zellen induzieren kann), die Freisetzung von Krebszellenantigenen induzieren, die als Induktoren einer tumorspezifischen immunologischen Antwort wirken können, insbesondere wenn BO-11X-Formulierung lokal an Krebszellen oder Tumore verabreicht wird (z. B. durch peritumorale oder intratumorale Injektion, Verabreichung von BO-11X am Rand der Tumormasse, in umgebenden Epithelzellen, Lymph- oder Blutgefäßen oder direkt in der Tumormasse), mit oder ohne gleichzeitige oder nachfolgende Verabreichung eines anderen Medikaments oder einer anderen Behandlung für dieselbe Indikation.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Prozess zur Herstellung einer Zusammensetzung, wie hierin offenbart, die Folgendes umfasst:
    1. (i) Herstellen einer wässrigen Lösung von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und einer wässrigen Lösung von mindestens einem Polyalkylenimin, oder einem Salz oder Solvat davon, wobei jegliche oder beide Lösungen optional weiter einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, organisches Lösungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans umfassen;
    2. (ii) getrenntes Filtrieren jeder Lösung durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von weniger als oder gleich 500 nm, um sterilisierte Lösungen zu bilden;
    3. (iii) Mischen der resultierenden sterilisierten Lösungen in einer Mischkammer, um eine wässrige Zusammensetzung zu bilden, durch Zugabe einer jener Lösungen zur anderen Lösung in jener Mischkammer, optional durch Injektion, mit einer Rate von mehr als oder gleich 1 ml/min, oder durch gleichzeitige Zugabe jeder jener Lösungen in jene Mischkammer, optional durch Injektion, mit einer Rate von mehr als oder gleich 1 ml/min; und optional
    4. (iv) Filtrieren der resultierenden wässrigen Zusammensetzung durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von weniger als oder gleich 600 nm, um ein Filtrat zu bilden, oder Zentrifugieren der resultierenden wässrigen Zusammensetzung bei mehr als oder gleich 22480 m/s2, um einen Überstand zu bilden; und/oder
    5. (v) Lyophilisieren der resultierenden wässrigen Zusammensetzung, des Filtrats oder des Überstands.
  • Daher kann in einer bevorzugten Ausführungsform die vorliegende Erfindung einen Prozess zur Herstellung der Zusammensetzung wie hierin offenbart betreffen, der Folgendes umfasst:
    1. (i) Herstellen einer wässrigen Lösung von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und einer wässrigen Lösung von mindestens einem Polyalkylenimin, oder einem Salz oder Solvat davon, wobei jegliche oder beide Lösungen optional weiter einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, organisches Lösungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans umfassen;
    2. (ii) getrenntes Filtrieren jeder Lösung durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von weniger als oder gleich 500 nm, um sterilisierte Lösungen zu bilden; und
    3. (iii) Mischen der resultierenden sterilisierten Lösungen in einer Mischkammer, um eine wässrige Zusammensetzung zu bilden, durch Zugabe einer jener Lösungen zur anderen Lösung in jener Mischkammer, optional durch Injektion, mit einer Rate von mehr als oder gleich 1 ml/min, oder durch gleichzeitige Zugabe jeder jener Lösungen in jene Mischkammer, optional durch Injektion, mit einer Rate von mehr als oder gleich 1 ml/min; und
    4. (iv) optional Lyophilisieren der resultierenden wässrigen Zusammensetzung.
  • Zusätzlich kann in einer anderen bevorzugten Ausführungsform die vorliegende Erfindung einen Prozess zur Herstellung der Zusammensetzung wie hierin offenbart betreffen, der Folgendes umfasst:
    1. (i) Herstellen einer wässrigen Lösung von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und einer wässrigen Lösung von mindestens einem Polyalkylenimin, oder einem Salz oder Solvat davon, wobei jegliche oder beide Lösungen optional weiter einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, organisches Lösungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans umfassen;
    2. (ii) getrenntes Filtrieren jeder Lösung durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von weniger als oder gleich 500 nm, um sterilisierte Lösungen zu bilden; und
    3. (iii) Mischen der resultierenden sterilisierten Lösungen in einer Mischkammer, um eine wässrige Zusammensetzung zu bilden, durch Zugabe einer jener Lösungen zur anderen Lösung in jener Mischkammer, optional durch Injektion, mit einer Rate von mehr als oder gleich 1 ml/min, oder durch gleichzeitige Zugabe jeder jener Lösungen in jene Mischkammer, optional durch Injektion, mit einer Rate von mehr als oder gleich 1 ml/min; und
    4. (iv) Filtrieren der resultierenden wässrigen Zusammensetzung durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von weniger als oder gleich 600 nm, um ein Filtrat zu bilden, oder Zentrifugieren der resultierenden wässrigen Zusammensetzung bei mehr als oder gleich 22480 m/s2, um einen Überstand zu bilden; und
    5. (v) optional Lyophilisieren der resultierenden Filtrats oder Überstands.
  • Bevorzugter umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung keinen letzten Schritt der Lyophilisierung. In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung sind das doppelsträngige Polyribonukleotid, das Polyalkylenimin und der pharmazeutisch annehmbare Träger, organische Lösungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans wie hierin offenbart. Das Sterilisieren jeder Lösung zur Bildung sterilisierter Lösungen erfolgt durch getrenntes Filtrieren der Lösungen durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von weniger als oder gleich 500 nm, vorzugsweise durch getrenntes Filtrieren jener Lösungen durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von weniger als oder gleich 300 nm, bevorzugter durch Filtrieren jener Lösungen durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von weniger als oder gleich 200 nm. Vorzugsweise erfolgt das Mischen der resultierenden Filtrate durch den großräumigen konvektiven Transport von Wirbeln und anschließend durch Beseitigung von Konzentrationsunterschieden durch reinen Diffusionstransport. Die Mischkammer kann jede Kammer oder jedes Gefäß sein, in dem das Mischen jener Lösungen beginnt, wie beispielsweise ein Kolben, Reaktor oder Mischer. Bevorzugter hat die Mischkammer ein festes Volumen zwischen 0,1 und 20 ml, weiterhin vorzugsweise zwischen 0,2 und 10 ml, viel bevorzugter zwischen 0,5 und 8 ml. Bevorzugter erfolgt das Mischen durch Zugabe, gegebenenfalls durch Injektion, mit einer Rate zwischen 1 ml/min und 2000 ml/min, noch bevorzugter zwischen 10 und 1000 ml/min, weiterhin vorzugsweise zwischen 20 und 500 ml/min. Optionale Filtration der resultierenden wässrigen Zusammensetzung, um ein Filtrat zu bilden oder zu sammeln, kann anschließend durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von weniger als oder gleich 600 nm, vorzugsweise nicht über dem Durchmesser von 500 nm, noch bevorzugter nicht über den Durchmesser von 400 nm, noch bevorzugter nicht über den Durchmesser von 300 nm durchgeführt werden. Alternativ kann optionales Zentrifugieren der resultierenden wässrigen Zusammensetzung, um einen Überstand zu bilden oder zu sammeln, anschließend bei mehr als 22480 m/s2 (5000 rpm auf einem Rotor mit einem Radius von 0,082 m), vorzugsweise bei mehr als 27202 m/s2 (5500 rpm auf einem Rotor mit einem Radius von 0,082 m), bevorzugter bei mehr als 32372 m/s2 (6000 rpm auf einem Rotor mit einem Radius von 0,082 m), noch bevorzugter 44062 m/s2 (7000 rpm auf einem Rotor mit einem Radius von 0,082 m) durchgeführt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist Schritt (iv) obligatorisch, wenn die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung nicht durch die Schritte (i) bis (iii) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erreicht wird, nämlich wenn die Zugabe mit einer solchen Rate durchgeführt wird, dass weniger als 95% der von jener wässrigen Zusammensetzung umfassten Partikel einen Durchmesser von weniger als oder gleich 600 nm haben; und/oder jene Partikel einen z-gemittelten Durchmesser von mehr als 200 nm haben, bevorzugter wenn jene Partikel keine monomodale Durchmesserverteilung haben. Dies kann der Fall sein, wenn die Zugabe mit einer Rate zwischen 1 ml/min und 20 ml/min durchgeführt wird, insbesondere in einer Reaktionskammer zwischen 0,5 und 20 ml. Schließlich kann die resultierende wässrige Zusammensetzung, das Filtrat oder der Überstand Lyophilisierung unterzogen werden, um die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung als einen teilchenförmigen Feststoff zu ergeben.
  • Daher umfasst in einer sehr besonders bevorzugten Ausführungsform des Prozesses der vorliegenden Erfindung jener Prozess:
    1. (i) Herstellen einer wässrigen Lösung von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und einer wässrigen Lösung von mindestens einem Polyalkylenimin, oder einem Salz oder Solvat davon, wobei jegliche oder beide Lösungen optional weiter einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, organisches Lösungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans umfassen;
    2. (ii) getrenntes Filtrieren jeder Lösung durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von weniger als oder gleich 200 nm, um sterilisierte Lösungen zu bilden;
    3. (iii) Mischen der resultierenden sterilisierten Lösungen in einer Mischkammer, um eine wässrige Zusammensetzung zu bilden, durch Zugabe einer jener Lösungen zur anderen Lösung in jener Mischkammer, optional durch Injektion, mit einer Rate zwischen 20 ml/min und 100 ml/min, oder durch gleichzeitige Zugabe jeder jener Lösungen in jene Mischkammer, optional durch Injektion, mit einer Rate zwischen 20 ml/min und 100 ml/min, wobei jene Mischkammer ein Volumen zwischen 0,2 und 10 ml hat;
    4. (iv) Filtrieren der resultierenden wässrigen Zusammensetzung durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von weniger als oder gleich 500 nm, um ein Filtrat zu bilden, oder Zentrifugieren der resultierenden wässrigen Zusammensetzung bei mehr als oder gleich 32372 m/s2 (6000 rpm auf einem Rotor mit einem Radius von 0,082 m), um einen Überstand zu bilden; und
    5. (v) optional Lyophilisieren des resultierenden Filtrats oder Überstands.
  • In einer anderen sogar noch mehr besonders bevorzugten Ausführungsform des Prozesses der vorliegenden Erfindung umfasst jener Prozess:
    • (i) Herstellen einer wässrigen Lösung von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und einer wässrigen Lösung von mindestens einem Polyalkylenimin, oder einem Salz oder Solvat davon, wobei jegliche oder beide Lösungen optional weiter einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, organisches Lösungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans umfassen;
    • (ii) getrenntes Filtrieren jeder Lösung durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von weniger als oder gleich 200 nm, um sterilisierte Lösungen zu bilden;
    • (iii) Mischen der resultierenden sterilisierten Lösungen in einer Mischkammer, um eine wässrige Zusammensetzung zu bilden, durch Zugabe einer jener Lösungen zur anderen Lösung in jener Mischkammer, optional durch Injektion, mit einer Rate zwischen 30 ml/min und 100 ml/min, oder durch gleichzeitige Zugabe jeder jener Lösungen in jene Mischkammer, optional durch Injektion, mit einer Rate zwischen 30 ml/min und 100 ml/min, wobei jene Mischkammer ein Volumen zwischen 0,5 und 8 ml hat; und
    • (vi) optional Lyophilisieren der resultierenden wässrigen Zusammensetzung.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die BO-11X-Formulierung gemäß einem Herstellungsprozess hergestellt, der das Mischen zweier wässriger Lösungen beinhaltet, einer ersten, die doppelsträngige Polyribonukleotide (oder ein Salz oder Solvat davon) umfasst, und einer zweiten, die Polyalkylenimin (oder ein Salz oder Solvat davon) umfasst, so dass die resultierenden Partikel die oben definierten Merkmale aufweisen, insbesondere in Bezug auf den Durchmesser und die monomodale Durchmesserverteilung sowie das Aussehen als eine im Wesentlichen klare kolloidale Lösung.
  • Wie mit weiteren Einzelheiten in den Beispielen beschrieben, können die BO-11X-Formulierungen durch Filtrieren und/oder Zentrifugieren einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend Partikel, die durch doppelsträngige Polyribonukleotide und ein wasserlösliches, polykationisches Homo- oder Hetero-Polymer gebildet werden, erhalten werden, wobei die BO-11X-Formulierungen im Großformat oder als wässrige Zusammensetzungen zur einmaligen Verwendung ohne sichtbare Aggregate erhalten werden. Solch ein Prozess zur Herstellung der Zusammensetzung umfasst:
    1. (i) Herstellen einer wässrigen Lösung von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und einer wässrigen Lösung von mindestens einem Polyalkylenimin, oder einem Salz oder Solvat davon, optional zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, organischen Lösungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans, das in einer der Lösungen vorliegt;
    2. (ii) Mischen jener Lösungen; und
    3. (iii) Filtrieren der resultierenden Mischung durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von weniger als oder gleich 600 nm, oder Zentrifugieren bei mehr als 2240 m/s2.
  • Dieser Prozess kann weiter an die tatsächlichen Komponenten der Zusammensetzung (doppelsträngige Polyribonukleotide, das Polyalkylenimin und optionale weitere Komponenten) sowie die gewünschten Verfahren von Verwendung, Lagerung, Transport, Verpackung und/oder Verabreichung der Zusammensetzung angepasst werden, insbesondere wenn die Zusammensetzung unmittelbar vor der Verwendung hergestellt oder, was für pharmazeutische Zusammensetzungen häufiger ist, zur langfristigen Lagerung und/oder in der Form mehrerer Behälter, jedes für eine einmalige Verwendung (z. B. in sterilen Röhrchen oder Spritzen), und umfassend Partikel mit der gleichmäßigsten Größe, Poly(I:C)-Gehalt, Stabilität, Löslichkeit und, letztlich, biologischen Effekten bei der Verabreichung, hergestellt werden muss.
  • In diesem Bereich können die obigen Misch- und Filtrierschritte (ii) und (iii) angepasst werden auf der Ordnungsebene von Filtrieren und/oder Mischen, Mischverfahren, der Mischgeschwindigkeit und/oder der Menge der Lösungen, die gemischt wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Prozess zur Herstellung von BO-11X-Formulierungen:
    1. (i) Herstellen einer wässrigen Lösung von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder einem Salz oder Solvat davon, und einer wässrigen Lösung von mindestens einem Polyalkylenimin, oder einem Salz oder Solvat davon, optional zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, organischen Lösungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans, das in einer der Lösungen vorliegt;
    2. (ii) Sterilisieren jeder Lösung, indem sie getrennt filtriert werden;
    3. (iii) Mischen jener Lösungen in dem Behälter zur Lagerung, Lyophilisierung und/oder Verwendung der Zusammensetzung durch Zugeben einer der Lösungen zuerst und dann Zugeben der anderen Lösung mit einer Injektionsgeschwindigkeit über 50 rpm bei einer Fließgeschwindigkeit zwischen 1 ml/min und 50 ml/min; und
    4. (iv) Versiegeln des Behälters.
  • Kombinationen
  • Eine Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann in Kombinationen umfassend andere Verbindungen oder Behandlungen verwendet werden, von denen bekannt ist, dass sie mit ihr kompatibel sind, wenn sie nicht einen additiven oder sogar synergistischen Effekt bereitstellen. Zum Beispiel können Poly(I:C)-Moleküle in Kombination mit verschiedenen Antikrebsmedikamenten, Antikörpern, Strahlentherapie oder Chemotherapie (Le U et al., 2008; Le U et al., 2009; Taura M et al., 2010; Matijević T et al., 201 1; Levitzki A, 2012; Yoshino H und Kashiwakura I, 2013; Hafner A et al., 2013) oder unterschiedlicher Länge von Poly(I:C)-Molekülen (Zhou Y et al., 2013) verwendet werden. Poly(I:C)-Moleküle wurden auch als Adjuvans oder synergistisch wirkendes Mittel verwendet, wenn sie mit anderen Mitteln kombiniert wurden, wie bei der Impfung mit Krebsantigenen oder Zelllysaten (Ammi R et al., 2015), Mitteln, die den PD-1/PD-L1-Signalweg blockieren (Nagato T und Celis E, 2014), anderen TLR-Agonisten wie TLR9-Agonist CpG ODN (Zhang Y et al., 2014), Dichloracetat (Ohashi T et al., 2013), IL27 (Chiba Y et al., 2013)), Kinase-Inhibitoren wie Sorafenib (Ho V et al., 2015), proapoptotischen Proteinen wie NS1 (Gupta S et al. 2016), Zoledronsäure (Chen L et al., 2013) oder All-trans-Retinsäure (Szabo A et al., 2012). Andere Verwendungen von BO-11X-Formulierungen können im Hinblick auf Aktivitäten von Poly(I:C)-Molekülen gegenüber spezifischen Zelltypen, die kürzlich zumindest unter Verwendung von Invitro-Assays gezeigt wurden, ersichtlich werden, wie auf Präadipozyten, Inhibieren von Differenzierung und Differenzierung in Adipozyten (Yu L et al., 2016), mesenchymale Stammzellen, Verstärken immunsuppressiver Effekte (Cho K. et al., 2016; Vega-Letter A et al., 2016) oder Aktivierung von NK-Zellen (Perrot I et al., 2010).
  • In einigen Aspekten betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine wirksame Menge einer BO-11X-Formulierung und eine wirksame Menge eines oder mehrerer immunmodulierender Mittel, insbesondere Mittel, die auf Immunkontrollpunktmoleküle abzielen (wie PD-1 , PD-L1, PD-L2, CTLA-4, CD134, CD134L, CD137, CD137L, CD80, CD86, B7-H3, B7-H4, B7RP1, LAG3, ICOS, TIM3, GAL9, CD28, AP2M1, SHP-2, PPP2R5A oder OX-40), diese Verbindungen werden üblicherweise als Kontrollpunkt-Inhibitoren (CPIs) bezeichnet.
  • Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die in Kombinationstherapien und -regimes nützlich sind, die die Verabreichung von BO-11X-Formulierungen und anderer therapeutischer Mittel oder Behandlungen (einschließlich Strahlentherapie, Chemotherapie, Kryotherapie, Tumorablation oder photodynamische Therapie) umfassen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Behandeln, Verbessern oder Verhindern von Krebswachstum, Metastasierung, Ulzeration, immunologischem Entweichen oder Wiederauftreten in einem Subjekt, umfassend das Verabreichen einer BO-11X-Formulierung und eines oder mehrerer Antikrebsmittel, vorzugsweise eines immunmodulierenden Mittels, wobei die Verabreichung gleichzeitig (als getrennte Formulierungen oder im Rahmen einer Koformulierung) oder sequenziell (in beliebiger Reihenfolge oder in aufeinanderfolgenden Verabreichungszyklen) erfolgt. In einigen Aspekten betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Krebs umfassend Verabreichen einer wirksamen Menge von Mittel der BO-11X-Formulierung und einer wirksamen Menge eines oder mehr immunmodulierender Mittel an ein Subjekt, das dessen bedarf, insbesondere wobei das Subjekt einer Krebstherapie mit einem oder mehreren immunmodulierenden Mitteln unterzogen wird.
  • In verschiedenen Ausführungsformen ist das immunmodulierende Mittel vorzugsweise ein Antikörper, umfassend einen monoklonalen Antikörper und andere Antikörperformate, oder jegliches andere pharmazeutisch verfügbare Mittel, das ein Zelloberflächenprotein bindet, das die Immunantwort kontrolliert, wodurch es als ein CPI wirkt. Dieser CPI kann PD-1 und PD-L1 oder PD-L2 und/oder die Bindung von PD-1 an PD-L1 oder PD-L2 blockieren, verringern und/oder hemmen. Alternativ kann dieses CPI blockieren, verringern und/oder inhibieren verringert und/oder inhibiert die Aktivität anderer Immunkontrollpunktmoleküle wie CTLA-4, AP2M1, CD80, CD86, SHP-2 und/oder PPP2R5A. Als eine weitere Alternative erhöht und/oder stimuliert das CPI CD137 (4-1BB) und/oder die Bindung von CD137 (4-1BB) an eines oder mehr von 4-1BB-Ligand und TRAF2.
  • In verschiedenen Ausführungsformen können die Verfahren umfassend Kombinationstherapien und -regimes zur Behandlung von Krebs, die die Verabreichung von BO-11X-Formulierungen umfassen, weiter in Bezug auf ein spezifisches Verabreichungsverfahren definiert werden, wobei die BO-11X-Formulierung auf einem anderen Weg verabreicht wird als der der anderen therapeutischen Verbindungen, wie etwa eines immunmodulierenden Mittels und vorzugsweise eines CPI. Dieses Verfahren kann das Verabreichen der BO-11X-Formulierung durch intratumorale oder peritumorale Injektion (innerhalb des Tumors, am Rand der Tumormasse, in den umgebenden Epithelzellen, Lymph- oder Blutgefäßen) oder andere Mittel umfassen, die das Verabreichen der BO-11X-Formulierung direkt innerhalb oder in der Nähe von Krebszellen oder einem Organ, das die Krebszellen umfasst, (und nicht indirekt, beispielsweise durch Blutstrom) und das systemische Verabreichen von CPI oder einem anderen immunstimulierenden Mittel) erlauben. Die BO-11X-Formulierung durch intratumorale oder peritumorale Injektion kann auf der Ebene der Haut, d. h. in die Haut (z. B. zur Behandlung von Melanom oder in Verbindung mit der Kombination mit einem Impfstoff), oder eines inneren Organs oder Gewebes, d. h. in jenes inneres Organ oder Gewebe (z. B. durch intrahepatische Injektion zur Behandlung von Leberkrebs oder intravesikuläre Verabreichung bei Blasenkrebs) durchgeführt werden. Eine solche lokale Verabreichung der BO-11X-Formulierung folgt vorzugsweise oder (vorzugsweise) wird gefolgt von der Verabreichung des immunstimulierenden Mittels.
  • Zusätzliche Effekte und Verwendungen
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Verwendungen und Verfahren bereit, die die Verabreichung einer BO-11X-Formulierung zur Verstärkung der Immunantwort gegen ein Pathogen oder unerwünschtes biologisches Agens und insbesondere zur Verstärkung einer antitumoralen Immunantwort bereit, wobei es potenziell selbst als ein immunmodulierendes Mittel wirkt. Ein solcher Effekt kann durch Messen der Tumor-bezogenen Immunantwort in die Tumorstelle und Tumormikroumgebung (oder in der Blutbahn, anderen biologischen Flüssigkeiten und Geweben) auf der Ebene relevanter Zelltypen oder -subpopulationen (z. B. dendritische Zellen, regulatorische T-Zellen, T-Zellen und/oder NK-Zellen) und/oder immunologischer Biomarker (z. B. Chemokine, Wachstumsfaktoren, Zytokine und ihre Rezeptoren) überwacht werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Auch bereitgestellt werden Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung von BO-111 oder BO-112 (und/oder anderer BO-11X-Formulierung) durch Mischen einer BO-11X-Formulierung und eines oder mehr pharmazeutisch annehmbaren Adjuvans, Verdünnungsmittels, Trägers oder Hilfsstoffs davon. Solche Komponenten können für die spezifische medizinische Indikation (z. B. ein fester Krebs oder ein hämatologischer Krebs) und/oder das Verabreichungsmittel z. B. durch Injektion (peritumorale, intratumorale, intrahepatische, intrapankreatische oder subkutane Injektion), durch Inhalation, oder oral, angepasst sein.
  • Auf BO-11X-Formulierungen basierte Kombinationsbehandlungen können dieselben oder andere Verabreichungswege für die BO-11X-Formulierung und die andere Verbindung beinhalten. Insbesondere kann die BO-11X-Formulierung, wie andere immunstimulatorische RNA-Mittel, durch intratumorale oder peritumorale Injektionen verabreicht werden, die das Immunsystem vor der systemischen Verabreichung eines therapeutischen Antikörpers aktivieren können, der als CPI, wie ein PD-1/PD-L1-Signalweg-Inhibitor, wirkt (Bald T et al., 2014), oder aktivierter T-Zellen (Amos SM et al., 2011). Alternativ die BO-11X-Formulierung zusammen mit anderen therapeutischen Verbindungen, die TLR-Agonisten oder - Liganden sind, wie CpG-Moleküle oder Resiquimod, zur Verstärkung der Effekte der Antikrebsimpfung (Sajadian A et al., 2014) oder dendritischen Zellen (Fujimura T et al., 2016).
  • Immunmodulierende Mittel
  • Die BO-11X-Formulierung kann mit einem oder mehr immunmodulierenden Mitteln kombiniert werden. In einigen Ausführungsformen ist das immunmodulierende Mittel ein kostimulierendes oder koinhibitorisches Molekül (z. B. von einer oder mehr Immunzellen, wie, ohne Beschränkung, T-Zellen und NK-Zellen). In einigen Ausführungsformen ist das immunmodulierende Mittel ein Mittel, das eine CD4- und/oder CD8-T-Zelle moduliert, zum Beispiel indem es als Agonist oder Antagonist in Bezug auf CD3, CD4, CD8, PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, CD137, CD96, CD73, CD90, CD47, CD69, CD26, TIM3 und LAG 3 wirkt. In anderen Ausführungsformen ist die Immunmodulation Mittel ist ein Mittel, das NK-Zellen moduliert, zum Beispiel indem es als Agonist oder Antagonist in Bezug auf CD3, NKp46, CD16, NKG2D, NKp44 und NKp30 wirkt. In anderen Ausführungsformen ist das immunmodulierende Mittel ein Mittel, das Tumorstroma- und Endothel-Biomarker moduliert, zum Beispiel indem es als Agonist oder Antagonist in Bezug auf CD45, PD-L1, PD-L2, PTEN und CD31 wirkt.
  • Das immunmodulierende Mittel wird als eine weitere Verbindung in Form einer chemischen organischen oder anorganischen Verbindung, einer Nukleinsäure, eines Aptamers, eines Peptids, eines Proteins und spezifischer eines Antikörpers, der das relevante Ziel in den biologischen Flüssigkeiten oder an der Zelloberfläche bindet, bereitgestellt. Der Antikörper kann polyklonal oder monoklonal sein; intakt oder verkürzt (z. B. F(ab')2, Fab, Fv); bispezifisch oder multispezifisch; xenogene, allogene, syngene oder modifizierte Formen davon (z. B. ein chimärer Antikörper oder ein humanisierter Antikörper). Wenn das immunmodulierende Mittel ein monoklonaler Antikörper ist, kann es ein von einem nicht-menschlichen Säugetier abgeleiteter monoklonaler Antikörper, ein rekombinanter chimärer monoklonaler Antikörper, ein rekombinanter humanisierter monoklonaler Antikörper oder ein humaner monoklonaler Antikörper sein.
  • Der Antikörper, der als immunmodulierendes Mittel wirkt, kann weiterhin die Strukturelemente umfassen, die normalerweise zur Ausübung der erforderlichen biologischen Aktivität erforderlich sind, wie vier Polypeptidketten, zwei schwere (H) Ketten und zwei leichte (L) Ketten, die durch Disulfidbrücken miteinander verbunden sind, die in der Lage sind, ein oder mehr Antigene zu binden (z. B. bispezifische oder multispezifische Antikörper) und eine Fc-Region eines Immunglobulins (z. B. IgA, IgG, IgE, IgD oder IgM) aufweisen, die mit Fc-Rezeptoren wechselwirken und eine Immunantwort aktivieren kann, die zu Depletion und/oder Zelltod von Immunzellen oder anderen Zellen führt. Jede schwere Kette besteht aus einer variablen Region der schweren Kette (VH) und einer konstanten Region der schweren Kette. Die konstante Region der schweren Kette besteht aus drei Domänen, CH1, CH2 und CH3. Jede leichte Kette besteht aus einer variablen Region der leichten Kette (VL) und einer konstanten Region der leichten Kette. Die konstante Region der leichten Kette besteht aus einer Domäne, CL. Die VH- und VL-Regionen können weiter in Hypervariabilitätsregionen unterteilt werden, als komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) bezeichnet, die von Regionen eingerahmt sind, die konservierter sind, als Framework-Regionen (FR) bezeichnet. Jede variable Region (VH oder VL) enthält 3 CDRs, die als CDR1, CDR2 und CDR3 bezeichnet werden. Jede variable Region enthält auch 4 Framework-Unterbereiche, die als FR1, FR2, FR3 und FR4 bezeichnet werden. Der Begriff Antikörper umfasst alle Typen von Antikörpern, einschließlich beispielsweise IgA, IgG, IgD, IgE und IgM und ihre jeweiligen Unterklassen (Isotypen), z. B. IgG-1, IgG-2, IgG-3 und IgG-4; IgA-1 und IgA-2. Ein Antikörper bezieht sich in einigen Ausführungsformen auch auf Antikörperfragmente und antigenbindende Fragmente.
  • Antikörper, die zur Durchführung der hierin beschriebenen Verfahren geeignet sind, können von verschiedenen Antikörperformaten sein, zum Beispiel monoklonal, polyklonal, bispezifisch, multispezifisch, und können humane, humanisierte oder chimäre Antikörper umfassen, einschließlich einzelkettiger Antikörper, Fab-Fragmente, F(ab')-Fragmente, von einer Fab-Expressionsbibliothek erzeugte Fragmente und/oder Bindungsfragmente von irgendeinem der obigen, sind aber nicht darauf beschränkt. Antikörper bezieht sich auch auf Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen, d. h. Moleküle, die mindestens zwei Antigene oder Zielbindungsstellen gegen mindestens zwei hierin beschriebene Ziele enthalten. Die hierin beschriebenen Immunglobulinmoleküle können von jedem Typ (z. B. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA und IgY), Klasse (z. B. IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 und IgA2), oder Unterklasse von Immunglobulinmolekül sein. Zusätzlich können Antikörper (z. B. mono-, bi- und/oder multispezifische), die zur Ausführung der hierin beschriebenen Erfindung geeignet sind, in jeglichem der alternativen Formate bereitgestellt werden, die in der Literatur offenbart sind, zum Beispiel Diabodies; Flexibodies; Kamelid-Antikörper, Immunobodies; Triomabs, Pepbodies, Vaccibodies, Minibodies, Fcabs, UniBodies oder DuoBodies (Storz U 2011).
  • PD-1 (auch bekannt als CD279 oder Programmierter-Zelltod-Protein 1) ist ein Mitglied der B7-Rezeptorfamilie. In einigen Ausführungsformen bezieht sich PD-1 auf die humane PD-1-Sequenz (siehe z. B. NCBI Referenzsequenz: NP_005009) und jegliche natürlich vorkommende allelische, Spleißvarianten und prozessierte Formen davon (Keir M et al., 2008; UniProt: Q15116). PD-1 bindet PD-L1 (auch bekannt als CD274 oder B7-H1) und PD-L2 (auch bekannt als CD273 oder B7-DC), die auch Mitglieder der B7-Familie sind. In einigen Ausführungsformen bezieht sich PD-L1 auf humanes PD-L1 (siehe z. B. GenBank: AF233516), bezieht sich PD-L2 auf humanes Pd-L2 (z. B. NCBI Referenzsequenz: NM_025239), zusammen mit jeglichen natürlich vorkommenden allelischen, Spleißvarianten und prozessierten Formen davon.
  • In verschiedenen Ausführungsformen zielt das immunmodulierende Mittel auf eines oder mehr von PD-1, PD-L1 und PD-L2. In verschiedenen Ausführungsformen ist das immunmodulierende Mittel PD-1-Inhibitor. In verschiedenen Ausführungsformen ist das immunmodulierende Mittel ein Antikörper, der für eines oder mehr von PD-1, PD-L1 und PD-L2 spezifisch ist. Zum Beispiel ist das immunmodulierende Mittel in einigen Ausführungsformen ein Antikörper wie zum Beispiel Nivolumab (ONO-4538/BMS-936558, MDX1106, OPDIVO), Pembrolizumab (KEYTRUDA), Pidilizumab (CT-011), MK-3475, BMS 936559, MPDL3280A.
  • In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit einem oder mehr von BMS-936559 und MEDI4736 zur Behandlung von beispielsweise fortgeschrittenen soliden Tumoren kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit einem oder mehr MPDL3280A (optional mit Vemurafenib) und MEDI4736 (optional mit einem oder mehr von Dabrafenib und Trametinib) zur Behandlung von Melanom kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit einem oder mehr MPDL3280A (optional mit Erlotinib) und MEDI4736 (optional mit Tremelimumab) zur Behandlung von NSCLC kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit MPDL3280A (optional mit einem oder mehr von Bevacizumab und Sunitinib) für die Behandlung von RCC kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit MPDL3280A zur Behandlung von soliden oder hämatologischen Malignitäten kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit einem oder mehr MPDL3280A (optional mit einem oder mehr von Bevacizumab, Chemotherapie und Cobimetinib); MEDI4736 (optional mit Tremelimumab) und MSB0010718C zur Behandlung von soliden Tumoren kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit AMP-224 zur Behandlung von fortgeschrittenem Krebs kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit Nivolumab (optional mit iliolumbalem (anti-KIR)) zur Behandlung von fortgeschrittenen soliden Tumoren kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit Nivolumab zur Behandlung von kastrationsresistentem Prostatakrebs, Melanom, NSCLC und RCC kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit Pembrolizumab zur Behandlung von Dickdarmkrebs kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit Pembrolizumab zur Behandlung von Magenkrebs, Kopf- und Halskrebs, TNBC und Urothelkrebs kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit Nivolumab (optional mit Ipilimumab) zur Behandlung von Magenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, kleinzelligem Lungenkrebs und TNBC kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit Nivolumab (optional mit Ipilimumab) zur Behandlung von Glioblastomen kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit Nivolumab zur Behandlung von hepatozellulärem Krebs kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit Pembrolizumab zur Behandlung von Hodgkin-Lymphom, Myelom, myelodysplastischem Syndrom und Non-Hodgkin-Lymphom kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit Pidilizumab zur Behandlung von malignen Gliomen kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit einem oder mehr von Nivolumab (optional mit einem oder mehr von Ipilimumab und mehreren Klasse-1-Peptiden und Montanid ISA 51 VG; und optional anschließend mit Ipilimumab) und Pembrolizumab für die Behandlung von Melanom kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit Pembrolizumab zur Behandlung von Melanom und NSCLC kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit einem oder mehr von Nivolumab (optional mit einem oder mehr von Gemcitabin/Cisplatin, Pemetrexed/Cisplatin, Carboplatin/Paclitaxel, Bevacizumab, Erlotinib und Ipilimumab) und Pembrolizumab zur Behandlung von NSCLC kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit Pidilizumab (optional mit Gemcitabin) zur Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit Pidilizumab (optional mit einem oder mehr von Sipuleucel-T und Cyclophosphamid) zur Behandlung von Prostatakrebs kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit einem oder mehr von Nivolumab (optional mit einem oder mehr von Sunitinib, Pazopanib und Ipilimumab), Pembrolizumab (optional mit Pazopanib) und Pidilizumab (optional mit dendritische-Zelle/RCC-Fusionzellimpfstoff zur Behandlung von RCC kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit einem oder mehr von Anti-LAG3 (BMS-986016, optional mit Nivolumab), Nivolumab (optional mit Interleukin-21) und AMP-554 zur Behandlung von soliden Tumoren kombiniert. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit Pembrolizumab zur Behandlung von soliden Tumoren kombiniert.
  • In verschiedenen Ausführungsformen zielt das immunmodulierende Mittel auf eines oder mehr von CD137 oder CD137L. In verschiedenen Ausführungsformen ist das immunmodulierende Mittel ein Antikörper, der für eines oder mehr von CD137 oder CD137L spezifisch ist. Zum Beispiel ist das immunmodulierende Mittel in einigen Ausführungsformen ein Antikörper, wie zum Beispiel, ohne Beschränkung, Urelumab (auch bekannt als BMS-663513 und anti-4-1BB-Antikörper). In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit Urelumab (optional mit einem oder mehr von Nivolumab, Lirilumab und Urelumab) zur Behandlung von soliden Tumoren und/oder B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphom und/oder Kopf- und Halskrebs und/oder multiplem Myelom kombiniert. In einigen Ausführungsformen ist das immunmodulierende Mittel ein Antikörper wie, ohne Beschränkung, Ilimumab (MDX-010, MDX-101, Yervoy, BMS) und/oder Tremelimumab (Pfizer). In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit Ipilimumab (optional mit Bavituximab) zur Behandlung von einem oder mehr von Melanom, Prostatakrebs und Lungenkrebs kombiniert.
  • In verschiedenen Ausführungsformen zielt das immunmodulierende Mittel auf CD20. In verschiedenen Ausführungsformen ist das immunmodulierende Mittel ein Antikörper spezifisch CD20. Zum Beispiel ist das immunmodulierende Mittel in einigen Ausführungsformen ein Antikörper wie, ohne Beschränkung Ofatumumab, Obinutuzumab (GAZYVA), AME-133v, Ocrelizumab, TRU-015 und Veltuzumab.
  • Validierung von BO-11X-Formulierungen
  • Die vorklinische Validierung der therapeutischen Wirksamkeit einer BO-11X-Formulierung (gemäß der vorliegenden Erfindung und wie in den Beispielen durch BO-111 und BO-112 veranschaulicht) kann in zellbasierten Tests und, am interessantesten, in Tiermodellen durchgeführt werden, bei denen verschiedene experimentelle Kriterien getestet und verglichen werden können, um die am besten geeigneten Bedingungen zur wirksamen Erzielung therapeutischer Wirkungen unter Verwendung der BO-11X-Formulierung allein oder in Kombination mit einem Kandidaten oder einem zugelassenen Krebsmedikament zu finden, Diese Kriterien umfassen die Dosierungen, den Verabreichungsweg, die Reihenfolge und/oder die Häufigkeit der Verabreichung einer der beiden Verbindungen im Rahmen der Feststellung, welche die besseren Bedingungen für die therapeutische Verwendung einer BO-11X-Formulierung sind (allein oder synergistisch mit einem Kandidaten oder zugelassenen AntiKrebsmedikament), in Bezug auf Wirksamkeit, Sicherheit und/oder klinische Verwendung.
  • Die Wirkungen unterschiedlicher Dosierung einer BO-11X-Formulierung, von Anzahl und/oder Stelle der Verabreichung (insbesondere durch Injektion an einer oder mehr Stellen), Verabreichungsweg, Häufigkeit und/oder Zeitpunkt für die Verabreichung können mit relevanten Endpunkten und physiologischen Parametern assoziiert sein, die in biologischen Proben gemessen werden, die von Zellen oder (vorzugsweise) Tieren erhalten werden, die den getesteten Verbindungen ausgesetzt sind, allein oder in Kombination mit anderen Medikamenten. Eine nicht einschränkende Liste solcher Parameter umfasst Regression der Tumorgröße, Blockierung des Tumorwachstums und/oder der Proliferation von Tumorzellen, Apoptose, reduzierte Tumorvaskularisierung oder -metastasierung, Überwindung von Resistenz gegen ein herkömmliches Antikrebsmedikament (oder ansonsten Verbessern der Reaktion auf ein solches Medikament in der behandelten Population), verringerte behandlungsbezogene unerwünschte Ereignisse auf normale Gewebe und Funktionen, Modulation der Immunantwort und/oder von Immunzellen mit spezifischen Aktivitäten und Merkmalen, Identifizierung von Biomarkern oder spezifischen Zellpopulationen in biologischen Materialien (z. B. in Krebszellpräparaten, Tumorbiopsien oder biologischen Flüssigkeiten), deren Zunahme (oder Abnahme) in der Literatur als mit der Antikrebswirkung im Allgemeinen und insbesondere mit dem Überleben von Tiermodellen und möglicherweise von Krebspatienten assoziiert bekannt ist. Wann immer möglich, werden solche Endpunkte zu Zwischen- und Endzeitpunkten nach der Verabreichung jeder Testverbindung oder einer Testkombination von Verbindungen bei einer gegebenen Dosis und/oder Behandlungsschema unter Verwendung eines spezifischen Verabreichungsweges und/oder pharmazeutischen Formulierungen gemessen.
  • Die therapeutische Anti-Krebs-Wirksamkeit einer BO-11X-Formulierung kann allein oder in Kombination mit herkömmlichen Standardbehandlungen (wie Strahlentherapie, Chemotherapie, Inhibitoren von zellulären Kinasen usw.) oder Behandlungen, die neue Mechanismen und/oder neue Kandidaten für Krebsmedikamente einbeziehen, getestet werden. In der Tat sind eine Kategorie neuer Antikrebsverbindungen, die in Kombination mit einer BO-11X-Formulierung getestet werden können, jene, die die Antitumor-Immunantworten innerhalb der Tumormikroumgebung verbessern, indem sie eine systemische Antitumorimmunität bereitstellen, die auf disseminierte Tumorzellen zielt eliminiert werden. Dieser Ansatz hat sich in Tiermodellen und Patienten bewährt und kann das Ergebnis konventioneller Therapien wie Strahlentherapie oder Chemotherapie verbessern (siehe z. B. Galluzzi L et al., 2014; Vacchelli E et al., 2013; Van der Jeught K et al., 2015).
  • Diese wachsende Bandbreite neuer Krebsmedikamente zielt auf die Mechanismen, mit denen Krebszellen der Immunerkennung und Zerstörung durch den menschlichen Körper entkommen. Krebsspezifische Immuntherapien können eine Reihe von Vorteilen im Vergleich zu anderen Krebstherapien bereitstellen (z. B. Tumorzellspezifität). In der Tat ermöglicht die Identifizierung einer Reihe von molekularen Zielen für Krebsimmuntherapien wesentliche Fortschritte bei der Definition der Mechanismen und Verbindungen, die die geeignete kostimulatorische (oder koinhibitorische) Wirkung auf Immunantworten gegen Tumore in Bezug auf ihre Plastizität, Heterogenität, Resistenz oder Mikroumgebung bereitstellen können.
  • Eine nicht beschränkende Liste von passiven oder aktiven Krebsimmuntherapien, die jeweils auf unterschiedliche molekulare Ziele und/oder Mechanismen zielen, umfasst auf Tumor zielende oder andere immunmodulatorische monoklonale Antikörper, onkolytische Viren, immunstimulierende Zytokine, adoptiven Zelltransfer und andere zellbasierte Therapien, DNA- oder Peptid-basierte Impfstoffe, Inhibitoren des immunsuppressiven Stoffwechsels oder Agonisten von Mustererkennungsrezeptoren. Unter diesen Mechanismen umfassen molekulare Ziele, gegen die Antikörper oder andere Verbindungen mit entweder agonistischer oder antagonistischer Aktivität (abhängig von ihrer Rolle in der Immunantwort oder dem Ausbruch von Krebs aus der Immunantwort) eine Reihe von Zellmembranproteinen wie PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, CD137, CD38, OX-40, CD26, TIM3 und LAG3, die Kontrollpunkte für die Tumorentwicklung sind und gegen die verschiedene agonistische oder antagonistische Antikörper kommerziell oder in wissenschaftlichen Hinterlegungen erhältlich sind zur Charakterisierung ihrer Spezifität und/oder dem Niveau der Antikrebswirkung gegen das humane Antigen oder (wenn es sich um Tiermodelle handelt) das entsprechende Nagetierantigen.
  • Trotz eindrucksvoller Patientenreaktionen auf Wirkstoffe, die auf diese kostimulatorischen oder koinhibitorischen Moleküle zielen (z. B. Therapien, die auf einem Anti-PD-1- oder Anti-PD-L1-Antikörper basieren), erreicht die klinische Reaktion auf Immunkontrollpunktinhibitoren die gewünschte therapeutische Wirkung bei zu vielen Krebspatienten immer noch unvollständig oder ineffizient. Eine BO-11X-Formulierung in einer geeigneten Kombination mit einer Verbindung, wie einem Anti-PD-1- oder Anti-CD137-Antikörper, kann die Verringerung von Tumorwachstum und -metastasierung verbessern (oder die Anzahl von Subjekten, die eine solche Reduktion aufweisen, erhöhen), verglichen mit der Wirkung der Verabreichung eines jener zwei Antikrebsmittel alleine, möglicherweise über die zu erwartenden additiven Wirkungen hinaus.
  • Die therapeutischen Wirkungen einer BO-11X-Formulierung können in einem der verschiedenen zellbasierten Modelle ausgewerter werden, die auf isolierter oder gemischter Zellkultur basieren, einschließlich primärer Krebszellen oder etablierter Krebszelllinien, vorzugsweise von einem menschlichen Ursprung. Beispiele für Krebszelllinien zur Validierung von BO-11X-Formulierungen können definiert werden nach Krebsarten wie Melanom (humane SK-Mel-19-, SK-Mel-103- und UACC62-Zellen; murine B16-Zellen), Karzinom (Maus-Hepa-1-6-Zellen; Ratten-FAO-Zellen), Brustkrebs (humane BT483-, HCC1143-, HCC1937-, MDA-MB-231-, MDA-MB-415-, MDA-MB-468- und BT549-Zellen), Pankreaskrebs (humane MiaPaCa2-, IMIM-PC2-, Panc1-, Panc0203-, Panc 3.27- oder BxPc3-Zellen), oder andere relevante Zelllinien, die über ATCC, andere offizielle oder akademische Hinterlegungsstellen oder kommerzielle Anbieter erhältlich sind. Die Antikrebswirkungen von BO-11X-Formulierungen können ausgewertet werden auf der Ebene der Zeit, Häufigkeit und/oder Dosis, die erforderlich ist, um eine Proliferationsblockade, den Tod, die Expression von Biomarkern und/oder die Freisetzung von Signalmolekülen (wie Chemokinen oder Interferon Beta) zu erhalten, die einen möglicherweise relevanten Effekt der BO-11X-Formulierung anzeigen, der unter physiologischeren Bedingungen bestätigt werden muss.
  • Dann können die Wirkungen einer BO-11X-Formulierung in Tumor-Tiermodellen ausgewertet werden, in denen die Antitumorantwort auf Grund der Verabreichung einer beispielhaften Formulierung wie BO-112 in verschiedenen Protokollen sowohl für die Monotherapie als auch für die Kombinationsbehandlung (z. B. zusammen mit einem CPI wie einem Anti-PD-1-Antikörper) über einen kürzeren oder längeren Zeitraum nach der Verabreichung bewertet wird. Die Studie kann verfolgt werden durch Verabreichen von BO-112 und/oder Anti-PD-1-Antikörper in Tieren zu einem gegebenen Zeitpunkt der Tumorentwicklung auf Grund der Proliferation injizierter Zellen, d. h. nach einer bestimmten Anzahl von Tagen nach der Injektion von Krebszellen oder (vorzugsweise) die die gewünschte Tumorgröße aufweisen (z. B. eine durchschnittliche Größe von 80-100 mm3), oder sogar nach ihrem Verschwinden (zur Bewertung jeglichen Effekts jedes Arzneimittels oder jeder Arzneimittelkombination auf Tumorrückfall). Die Studie würde auch Kontrollverbindungen umfassen, die entweder Negativ- (z. B. Vehikel alleine) oder Positivkontrollen, wie chemotherapeutische oder andere Antikrebsmittel, die in der Literatur als Standard für Medikamentenwirksamkeit für einen spezifischen Tumor und/oder in einem gegebenen Tiermodell angegeben sind, sind. Diese Aktivitäten der Validierung in Tiermodellen und Tierzellen können auch zur Entwicklung der BO-11X-formulierung für veterinärmedizinische Zwecke führen.
  • Das Tiermodell ist typischerweise ein Mausmodell, bei dem der Krebs entweder auf die Übertragung und die Einpflanzung von menschlichen Krebszellen (die von einer immortalisierten Zelllinie oder einer von einem Patienten erhaltenen Krebsbiopsie stammen) oder der Induktion (oder Übertragung) von Maus-Tumorzellen in den Tieren beruht. Zellen können aus verschiedenen Arten von Tumoren (z. B. Lungenkarzinom, Melanom, Lymphom) stammen und können subkutan in die Flanke der Mäuse injiziert werden, um den Nachweis des Tumors und die Analyse seiner Größe und/oder Zusammensetzung während der Studie zu vereinfachen. Die Mäuse werden dann behandelt, indem sie in Gruppen randomisiert werden, die jeweils eine Größe aufweisen, die eine statistische Analyse der Ergebnisse erlaubt (z. B. 3, 5, 10, 12, 15, 20 oder mehr Tiere für jede Kontroll- oder Behandlungsgruppe).
  • Eigenschaften, die eine BO-11X-Formulierung wie BO-112 und ein Kontrollpunktinhibitor wie ein Anti-PD-1-Antikörper in Krebstiermodellen verbessern können (insbesondere wenn sie in Bezug auf Menge, Reihenfolge oder andere Verabreichungskriterien geeignet kombiniert werden), können das Überleben von Tieren nach der Behandlung und/oder das Verschwinden des Tumors, verringerten Tumorrückfall, begrenzte oder verzögerte Toxizität und/oder Resistenzwirkungen und Reaktion auf erneute Exposition der Tumorimpfung nach Beendigung der Behandlung mit BO-112 und/oder Anti-PD-1-Antikörper umfassen.
  • Die beispielhafte BO-11X-Formulierung, die oben strukturell und funktionell als BO-112 identifiziert wird, und Anti-PD-1-Antikörper können an verschiedenen Stellen in Bezug auf Tumorzellen verabreicht werden und/oder in unterschiedlicher Menge verabreicht werden (allein oder in Kombination in Einzel- oder Mehrfachdosen). Typischerweise werden BO-112 und der für Maus-PD-1 spezifische monoklonale Antikörper (z. B. Klon RMP1-14 von BioLegend oder ähnliche, von anderen Anbietern erhältliche) subkutan, intravesikular, intraperitoneal, peritumoral oder intratumoral injiziert (abhängig vom Modell und molekularen und pathologischen Merkmalen des Tumors), bei einer Konzentration, die in Bezug auf das Tiergewicht bestimmt wird (z. B. zwischen 0,01 und 2,5 mg/kg), Konzentration im injizierten Volumen (z. B. zwischen 0,01 und 0,5 ml und/oder Gehalt in jeder Dosis (z. B. zwischen 0,01 und 250 µg pro Dosis). Insbesondere kann die Dosis-Antwort von BO-112 in verschiedenen Konzentrationen, kombiniert mit einer festen Anti-PD-1-Antikörperdosis (oder umgekehrt), die Bestimmung jeglichen vorteilhaften Effekts ermöglichen, der Folge der signifikanten Reduktion der Menge an jeder Verbindung ist, die auf Grund der Kombination mit der anderen Verbindung verabreicht wird (z. B. unbeeinflusste oder sogar verbesserte Wirksamkeit und/oder Sicherheitsprofil; abskopale Effekte bei Tumoren, die sich an verschiedenen, unbehandelten Standorten befinden).
  • BO-112 kann in einem oder mehr Zyklen (z. B. 2, 3, 4 oder mehr) injiziert werden, die durch eine gegebene Anzahl von Tagen getrennt sind (1, 2, 3, 5, 7 oder mehr). Alternativ kann, wenn BO-112 zusammen mit dem Anti-PD1-Antikörper verabreicht wird, BO-112 unmittelbar vor (oder nach) dem Antikörper (oder in einer einzigen injizierbaren Zubereitung) erneut in einem oder mehr Zyklen injiziert werden (die durch eine gegebene Anzahl von Tagen getrennt sind. Alternativ können die beiden Mittel in jeder aufeinanderfolgenden Reihenfolge formuliert oder verabreicht werden, aber getrennt durch einen variablen Zeitraum (z. B. 1 Stunde, 3 Stunden, 6 Stunden, 12 Stunden, 18 Stunden, 24 Stunden, 36 Stunden, 2 Tage oder mehr). Insbesondere wenn BO-112 nach Anti-PD-1-Antikörper verabreicht wird, kann dessen spätere Verabreichung (allein oder weiter in Kombination mit dem Anti-PD-1-Antikörper) eine Antitumor-Rescue-Wirkung bei Tieren bewirken, bei denen Anti-PD-1-Antikörper gegen Tumorzellen unwirksam war, wobei jeglicher spezifischer Tumorresistenz- oder Fluchtmechanismus überwunden wird. Am Ende der Behandlung können alle überlebenden Tiere für 1, 2, 3 oder mehr aufeinanderfolgende Wochen unbehandelt gelassen werden, um zu überwachen, ob und wie Tumorzellen wieder auftauchen, mit oder ohne erneute Exposition aller Tiere, die eine vollständige Rückbildung des Tumors hatten, mit einer weiteren subkutanen Injektion von Krebszellen.
  • Die Wirkungen von BO-112, alleine oder in Kombination mit dem oben aufgeführten Anti-PD1-Antikörper, können als Zwischenergebnisse, die während der Studie ohne die Tiere zu opfern berichtet werden, beurteilt werden (z. B. durch Messen der Tumorgröße, des Prozentsatzes noch lebender Mäuse, des Körpergewichts oder von Verhaltenskriterien), oder nach dem Töten des Tieres (oder in bereits toten Mäusen) zur Bestimmung molekularer Merkmale von Tumor- und/oder normalen Zellen (einschließlich Gesamtanzahl und/oder spezifische Subpopulationen von NK-Zellen, tumorinfiltrierten Lymphozyten, Splenozyten, Einbau von radiomarkierten Vorläufern und andere Zellen, die an der lokalen oder systemischen Immunantwort gegen Tumore beteiligt sein können, wie Myeloid-abgeleitete Suppressorzellen (MDSCs), regulatorische T-Zellen (Tregs); und tumorassoziierte Neutrophile (TANs), M2-Makrophagen und tumorassoziierte Makrophagen (TAMs). Parallel kann das Vorhandensein/Fehlen relevanter Biomarker durch PCR-Amplifikation relevanter RNAs oder auf Proteinebene auf der Oberfläche von Zellen innerhalb von Geweben oder im Blut zirkulierend bestimmt werden, wie Zytokine oder Chemokine, unter Verwendung von immunologischen Standardtests und Kits.
  • Diese globale Phänotypanalyse kann unter Verwendung von Zellen, die aus Tumoren, Blut, Milz, Lymphknoten oder anderen relevanten Geweben und Stellen isoliert wurden, durchgeführt werden, um jede statistisch und/oder therapeutisch relevante Veränderung in der Anzahl von Zellen nachzuweisen, die Zelloberflächenmarker exprimieren, die durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden und in der Literatur beschrieben sind, wie CD3, CD4, CD25, FoxP3, CD8, PD-1, PD-L1, PD-L2, PTEN, CTLA-4, CD137, CD96, CD73, CD90, CD47, CD69, CD26, TIM3, LAG3, Gr1, CD11b, Ly6C, Ly6G, NKp46, CD16, NKG2D, NKp44, NKp30, CD45 und CD31. Solche Zellen können auch auf der Ebene der Tumorantigenspezifischen Immunantwort, der Expression von relevanten Transkriptionsfaktoren, Zytokinen oder Chemokinen (z. B. IFN-gamma, IFN-beta, TNFalpha, HIF1a, HIF2a, p53) oder unter Verwendung anderer zellbasierter Tests ausgewertet werden.
  • Darüber hinaus kann die makroskopische Untersuchung von Organen und Haut und mikroskopische, pathologische Analyse in entweder immundefizienten vollständig immunkompetenten Tiermodellen weiter einen Hinweis auf die Wirksamkeit der Studienverbindungen (allein oder in der Kombination) oder ihrer Toxizität, wie Organentzündung und Nekropsie, liefern. Die quantitativen Daten, die in ähnlichen Studien erzeugt werden, können unter Verwendung der geeigneten statistischen Tests mit und ohne Korrekturen für mehrere Tests unter den verschiedenen experimentellen Gruppen verglichen werden, um zu bestimmen, welche therapeutischen (insbesondere Antitumor-) Wirkungen durch die Verabreichung einer BO-11X-Formulierung, allein oder in Kombination mit einem anderen Antikrebsmittel, bereitgestellt werden.
  • Behandlungsverfahren und Patientenauswahl
  • In einigen Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Behandeln, Reduzieren, Verbessern oder Verhindern von Krebswachstum, Überleben, Metastasierung, Epithel-Mesenchym-Übergang, immunologischem Entweichen oder Wiederauftreten, umfassend Verabreichen durch Verabreichung einer BO-11X-Formulierung und eines oder mehr immunmodulierender Mittel. Der Krebs kann eine onkologische Krankheit sein. Der Krebs kann ein ruhender Tumor sein, der aus der Metastasierung eines Krebses resultieren kann. Der ruhende Tumor kann auch bei der chirurgischen Entfernung eines Tumors übrig gelassen worden sein. Das Krebswiederauftreten kann beispielsweise Tumorwachstum, eine Lungenmetastase oder eine Lebermetastase sein.
  • In verschiedenen Ausführungsformen ist der Krebs einer oder mehr von Basalzellkarzinom, Gallentraktkrebs; Blasenkrebs; Knochenkrebs; Gehirn- Zentralnervensystemkrebs; Brustkrebs; Krebs des Bauchfells; Choriokarzinom; Bindegewebskrebs; Krebs des Verdauungstrakts (einschließlich Speiseröhren-, Magen-, Kolon-, Enddarm- oder Gastrointestinalkrebs); Augenkrebs; Krebs des Kopfes und des Halses; Glioblastom; Leberkarzinom; Hepatom; intraepithelialem Neoplasma; Nieren-, Nebennieren- oder Renalkrebs; Leukämie; Leberkrebs; Lungenkrebs (z. B. kleinzelliger Lungenkrebs, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Lungenadenokarzinom und Lungenplattenepithelkarzinom); Melanom; Myelom; Neuroblastom; Mundhöhlenkrebs (z. B. Lippen-, Kehlkopf-, Zungen-, Mund- oder Rachenkrebs); Bauchspeicheldrüsenkrebs; Prostatakrebs; Retinoblastom; Rhabdomyosarkom; Krebs der Atemwege; Speicheldrüsenkrebs; Hautkrebs; Plattenepithelkrebs; Hodenkrebs; Schilddrüsenkrebs; Gebärmutter-, Gebärmutterschleimhaut-, Gebärmutterhals-, Vulva-, Eierstock- oder anderem gynäkologischer Krebs; Krebs der Harnwege; Lymphom einschließlich B-Zell-Lymphom, Hodgkin- und Nicht-Hodgkin-Lymphom (NHL; einschließlich spezifischer Typen wie niederschwelligem/follikulärem, klein-lymphozytischem, mittelschwerem/follikulärem, mittelschwerem diffusem, schwerem immunoblastischem, schwerem lymphoblastischem, schwerem klein-nichtgespalten-zelligem, oder Bulky-Disease-NHL); Mantelzell- und AIDS-bedingtem Lymphom; chronischer lymphozytischer Leukämie; akuter lymphoblastischer Leukämie; Haarzellleukämie; chronischer myeloblastischer Leukämie; sowie anderen Karzinomen und Sarkomen; posttransplantativer Lymphoproliferationsstörung (PTLD), sowie abnormaler vaskulärer Proliferation assoziiert mit Phakomatosen oder Ödem (wie die mit Hirntumor assoziierten).
  • In verschiedenen Ausführungsformen ist der Krebs ein Gallentraktkrebs. In einigen Ausführungsformen ist der Gallengangskrebs ausgewählt aus Bauchspeicheldrüsenkrebs, Gallenblasenkrebs, Gallengangkrebs und Krebs der Vater'schen Ampulle. In verschiedenen Ausführungsformen ist der Krebs Leberkrebs. In verschiedenen Ausführungsformen ist der Krebs Kolonkrebs. In einigen Ausführungsformen ist der Gallentraktkrebs ein Cholangiokarzinom und/oder ein Adenokarzinom.
  • In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung und/oder das immunmodulierende Mittel zur Behandlung von Krebserkrankungen verschiedener Stadien (z. B. Stadium I oder II oder III oder IV) verwendet. Als nicht einschränkendes Beispiel sind, unter Verwendung der gesamten Stadiengruppierung, die Stadium-I-Krebse an einem Körperteil lokalisiert; Stadium-II-Krebse lokal fortgeschritten, ebenso wie Stadium-III-Krebse. Ob ein Krebs als Stadium II oder Stadium III bezeichnet wird, hängt von der spezifischen Krebsart ab. In einem nicht einschränkenden Beispiel, Morbus Hodgkin, bezeichnet Stadium II befallene Lymphknoten nur auf einer Seite des Zwerchfells, wohingegen Stadium III betroffene Lymphknoten oberhalb und unterhalb des Zwerchfells bezeichnet. Die spezifischen Kriterien für die Stadien II und III unterscheiden sich daher je nach Diagnose. Stadium-IV-Krebse haben oft metastasiert oder sich auf andere Organe oder den ganzen Körper ausgebreitet.
  • In einigen Ausführungsformen verringert die BO-11X-Formulierung (und/oder das immunmodulierende Mittel) Nebenwirkungen der Therapien, die ein Patient erfahren kann. Zum Beispiel kann die Kombinationstherapie einer BO-11X-Formulierung und eines oder mehr immunmodulierender Mittel eine niedrigere Dosis der BO-11X-Formulierung und/oder eines oder mehr immunmodulierender Mittel (z. B. verglichen mit Monotherapie) ermöglichen und dadurch das therapeutische Fenster beider Mittel erhöhen. In einigen Ausführungsformen mildert die verringerte Dosis eine oder mehr Nebenwirkungen ohne (oder minimalen) Verlust der Wirksamkeit. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung und/oder das immunmodulierende Mittel verwendet, um ein Subjekt zu behandeln, das einen behandlungsrefraktären Krebs aufweist. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung verwendet, um ein Subjekt zu behandeln, das gegenüber einem oder mehr immunmodulierenden Mitteln, insbesondere jenem, das tatsächlich mit der BO-11X-Formulierung kombiniert wird, refraktär ist.
  • Zum Beispiel ist das Subjekt in einigen Ausführungsformen gegenüber einem PD-1- und/oder PD-L1- und/oder PD-L2-Mittel refraktär, einschließlich zum Beispiel Nivolumab- (ONO-4538/BMS-936558, MDX1106, OPDIVO), Pembrolizumab- (KEYTRUDA), Pidilizumab- (CT-011), MK-3475-, BMS-936559-, Ibrutinib- und/oder MPDL3280A-refraktäre Patienten. Zum Beispiel ist das Subjekt in einigen Ausführungsformen gegenüber einem Anti-CTLA-4-Mittel refraktär, z. B. Ipilimumab- (Yervoy) refraktäre Patienten (z. B. Melanompatienten). In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt gegenüber einer BO-11X-Formulierung refraktär. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in verschiedenen Ausführungsformen Verfahren zur Krebsbehandlung bereit, die Patienten retten, die auf verschiedene Therapien nicht ansprechen, einschließlich Monotherapie mit einer BO-11X-Formulierung oder einem oder mehr immunmodulierenden Mittel.
  • In verschiedenen Ausführungsformen werden die Begriffe „Patient“ und „Subjekt“ austauschbar verwendet. In einigen Ausführungsformen ist das Subjekt und/oder Tier ein Säugetier, z. B. ein Mensch, eine Maus, eine Ratte, ein Meerschweinchen, ein Hund, eine Katze, ein Pferd, ein Rind, ein Schwein, ein Kaninchen, ein Schaf oder ein nicht-menschlicher Primat, wie ein Affe (z. B. Pavian) oder Schimpanse.
  • In verschiedenen Ausführungsformen sind Verfahren der Erfindung nützlich bei der Behandlung eines menschlichen Subjekts. In einigen Ausführungsformen ist der Mensch ein pädiatrischer Mensch. In anderen Ausführungsformen ist der Mensch ein erwachsener Mensch. In anderen Ausführungsformen ist der Mensch ein geriatrischer Mensch. In anderen Ausführungsformen kann der Mensch als ein Patient oder ein Subjekt bezeichnet werden. In einigen Ausführungsformen ist der Mensch weiblich. In einigen Ausführungsformen ist der Mensch männlich.
  • Behandlungsregime und Kombinationstherapien
  • In einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung spezifische Krebsbehandlungsregime mit BO-11X-Formulierungen und immunmodulierenden Mitteln (und optional einem oder mehr zusätzlichen therapeutischen Mitteln) bereit. Zum Beispiel wird in einigen Ausführungsformen die BO-11X-Formulierung, z. B. BO-111 oder BO-112, einem Patienten zuerst verabreicht, um die Tumorvaskularisierung zu normalisieren, optional durch Reduzieren oder Abtragen von Hypoxie. Eine solche erste Verabreichung der BO-11X-Formulierung, z. B. BO-111 oder BO-112, können T-Lymphozyten (z. B. CD4 + und CD8 + T-Zellen) und/oder NK-Zellen Tumor stimulieren und/oder erhöhen und/oder die Rekrutierung von immunsuppressiver Zellen (z. B. myeloid-abgeleiteter Suppressorzellen (MDSCs), regulatorischer T-Zellen (Tregs), tumorassoziierter Neutrophile (TANs), M2-Makrophagen und tumorassoziierter Makrophagen (TAMs)) zu dem Tumor hemmen und/oder verringern. In einigen Ausführungsformen können die vorliegenden Therapien das Verhältnis von M1- zu M2-Makrophagen an der Tumorstelle verändern, um M1-Makrophagen zu bevorzugen. Bemerkenswerterweise, anders als beispielsweise anti-angiogene Moleküle, induzieren die BO-11X-Formulierungen in einigen Ausführungsformen eine lang anhaltende (d. h. Mehr als vorübergehende) vaskuläre Normalisierung. Zum Beispiel kann vaskuläre Normalisierung durch die BO-11X-Formulierung länger als 1 oder 2 oder 3 oder 4 oder 5 oder 6 oder 7 oder 14 Tage oder 21 Tage andauern. Dementsprechend ermöglicht diese lang anhaltende vaskuläre Normalisierung durch die BO-11X-Formulierung in einigen Ausführungsformen eine nachhaltige permissive Tumor-Mikroumgebung, die eher auf ein oder mehr immunmodulierende Mittel anspricht. Das heißt, in einigen Ausführungsformen potenziert die BO-11X-Formulierung die Therapie mit immunmodulierendem Wirkstoff.
  • Alternativ wird die BO-11X-Formulierung, z.B. BO-111 oder BO-112, einem Patienten nach Behandlung mit einem oder mehr immunmodulierenden Mitteln verabreicht. Zum Beispiel zielt das immunmodulatorische Mittel in einigen Ausführungsformen auf ein oder mehr koinhibitorische Moleküle und verringert oder eliminiert Immunsuppression. In diesem günstigen Kontext, d. h. nach Entfernung der Suppression, wird die BO-11X-Formulierung, z.B. BO-111 oder BO-112 verabreicht, um das Immunsystem zu stimulieren. Oder das immunmodulatorische Mittel zielt zuerst auf ein oder mehr kostimulatorische Moleküle und die BO-11X-Formulierung, z. B. BO-111 oder BO-112, wird verabreicht, um diesen Effekt zu unterstützen, beispielsweise synergistisch.
  • Ferner kann, wie hierin beschrieben, die BO-11X-Formulierung und/oder das immunmodulierende Mittel mit einem zusätzlichen therapeutischen Mittel kombiniert werden, beispielsweise im Kontext der gemeinsamen Verabreichung, eines Behandlungsregimes oder einer Koformulierung.
  • In einigen Ausführungsformen kann die BO-11X-Formulierung und/oder das immunmodulierende Mittel, optional mit einem zusätzlichen therapeutischen Mittel, sequenziell verabreicht werden. Der Ausdruck „sequenziell“, wie hierin verwendet, bedeutet, dass das zusätzliche therapeutische Mittel und die BO-11X-Formulierung und/oder das immunmodulierende Mittel mit einem Zeitabstand von mehr als etwa 60 Minuten verabreicht werden. Zum Beispiel kann die Zeit zwischen der sequenziellen Verabreichung des zusätzlichen therapeutischen Mittels und der BO-11X-Formulierung und/oder des immunmodulierenden Mittels mehr als etwa 60 Minuten, mehr als etwa 2 Stunden, mehr als etwa 5 Stunden, mehr als etwa 10 Stunden, mehr als etwa 1 Tag, mehr als etwa 2 Tage, mehr als etwa 3 Tage oder mehr als etwa 1 Woche auseinanderliegen. Die optimalen Verabreichungszeiten können von den Stoffwechselgeschwindigkeiten, der Ausscheidung und/oder der pharmakodynamischen Aktivität des zusätzlichen therapeutischen Mittels und der verabreichten BO-11X-Formulierung und/oder des immunmodulierenden Mittels abhängen. Entweder das zusätzliche therapeutische Mittel oder die vorliegenden Mittel können zuerst verabreicht werden.
  • In einigen Ausführungsformen kann die BO-11X-Formulierung und/oder das immunmodulierende Mittel, optional mit einem zusätzlichen therapeutischen Mittel, gleichzeitig verabreicht werden. Der Ausdruck „gleichzeitig“, wie hierin verwendet, bedeutet, dass das zusätzliche therapeutische Mittel und die BO-11X-Formulierung und/oder das immunmodulierende Mittel mit einem Zeitabstand von nicht mehr als etwa 60 Minuten verabreicht werden, wie nicht mehr als etwa 30 Minuten, nicht mehr als etwa 20 Minuten, nicht mehr als etwa 10 Minuten, nicht mehr als etwa 5 Minuten oder nicht mehr als etwa 1 Minute. Die Verabreichung des zusätzlichen therapeutischen Mittels und der BO-11X-Formulierung und/oder des immunmodulierenden Mittels kann durch gleichzeitige Verabreichung einer einzelnen Formulierung (z. B. einer Formulierung, die das zusätzliche therapeutische Mittel und die BO-11X-Formulierung und/oder das immunmodulierende Mittel enthält) oder von getrennten Formulierungen (z. B. eine erste Formulierung, die das zusätzliche therapeutische Mittel enthält, und eine zweite Formulierung, die die BO-11X-Formulierung und/oder das immunmodulierende Mittel enthält), erfolgen.
  • Gemeinsame Verabreichung erfordert auch nicht, dass die zusätzlichen therapeutischen Mittel dem Subjekt auf dem gleichen Verabreichungsweg verabreicht werden. Vielmehr kann jedes therapeutische Mittel auf jeglichem geeigneten Weg verabreicht werden, zum Beispiel parenteral oder nicht-parenteral.
  • Solch eine Kombination kann zu Synergismus und/oder additiven und/oder potenten Wirkungen bei einer niedrigeren Dosis der BO-11X-Formulierung und/oder des immunmodulierenden Mittels führen. Zum Beispiel kann, wenn die BO-11X-Formulierung mit einem oder mehr immunmodulierenden Mitteln kombiniert wird, die wirksame Menge der BO-11X-Formulierung niedriger sein als sie bei einer Monotherapie wäre. In einigen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit einem immunmodulierenden Mittel kombiniert und die wirksame Menge der BO-11X-Formulierung ist eine subtherapeutische Dosis, beispielsweise kann, wenn das immunmodulierende Mittel mit einer BO-11X-Formulierung kombiniert wird, die wirksame Menge des immunmodulierenden Mittels kann niedriger sein als sie bei einer Monotherapie wäre. In einigen Ausführungsformen wird das immunmodulierende Mittel mit einer BO-11X-Formulierung kombiniert und die wirksame Menge des immunmodulierenden Mittels ist eine subtherapeutische Dosis. In verschiedenen Ausführungsformen wird das immunmodulierende Mittel mit einer BO-11X-Formulierung und einem zusätzlichen therapeutischen Mittel kombiniert und die wirksame Menge des zusätzlichen therapeutischen Mittels ist eine subtherapeutische Dosis. Der Ausdruck „subtherapeutische Dosis oder Menge“ bedeutet, dass eine Dosis oder Menge einer pharmakologisch aktiven Substanz unterhalb der Dosis oder Menge dieser Substanz liegt, die als einzige Substanz verabreicht wird, um eine therapeutische Wirkung zu erzielen. Die subtherapeutische Dosis solch einer Substanz kann in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Subjekt und Krankheitszustand, dem Gewicht und Alter des Subjekts, der Schwere des Krankheitszustands, der Art der Verabreichung und dergleichen variieren, was leicht durch einen Fachmann bestimmt werden kann. In einer Ausführungsform beträgt die subtherapeutische Dosis oder Menge des Chemotherapeutikums weniger als 90% der zugelassenen vollen Dosis des Chemotherapeutikums, wie sie in der von der U.S. Food & Drug Administration genehmigten Etiketteninformation für das Chemotherapeutikum angegeben ist. In anderen Ausführungsformen beträgt die subtherapeutische Dosis oder Menge des Chemotherapeutikums weniger als 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% oder sogar 10% der zugelassenen vollen Dosis, wie von 20% bis 90%, 30% bis 80%, 40% bis 70% oder ein anderer Bereich innerhalb der hierin angegebenen Werte.
  • In einigen Ausführungsformen ist die wirksame Menge des immunmodulierenden Mittels geringer als eine wirksame Menge, die bei der Monotherapie für denselben Krebs und/oder einer Kombinationstherapie mit einem Mittel neben einer BO-11X-Formulierung für denselben Krebs verwendet wird. In einigen Ausführungsformen ist die wirksame Menge der BO-11X-Formulierung geringer als eine wirksame Menge, die bei der Monotherapie für denselben Krebs oder klinischen Zustand und/oder einer Kombinationstherapie mit einem Mittel (wie einem immunmodulierenden Mittel) für den gleichen Krebs oder klinischen Zustand verwendet wird.
  • In verschiedenen Ausführungsformen wird die BO-11X-Formulierung mit einem oder mehr immunmodulierenden Mitteln (z. B. 1 oder 2 oder 3 oder 4 oder 5 immunmodulierenden Mitteln) und optional einem oder mehr zusätzlichen therapeutischen Mitteln (z. B. 1 oder 2 oder 3 oder 4 oder 5 zusätzlichen therapeutischen Mitteln) kombiniert. Solche Kombinationen können zu Synergismus und/oder additiven und/oder potenten Wirkungen bei einer niedrigeren Dosis der BO-11X-Formulierung und/oder des immunmodulierenden Mittels und/oder des einen oder der mehr zusätzlichen therapeutischen Mittels führen. Die gemeinsame Verabreichung kann gleichzeitig oder sequenziell erfolgen. Ferner können die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die BO-11X-Formulierung und/oder das immunmodulierende Mittel enthalten, das zusätzliche therapeutische Mittel umfassen (z. B. über Koformulierung). Das heißt, in einigen Ausführungsformen können zwei oder mehr jeglicher der hierin offenbarten Mittel koformuliert werden. Ferner kann in einigen Ausführungsformen die BO-11X-Formulierung und/oder das immunmodulierende Mittel einem Patienten verabreicht werden, der einer Behandlung mit einem oder mehr zusätzlichen therapeutischen Mitteln unterzogen wird. Ferner kann in einigen Ausführungsformen die BO-11X-Formulierung und/oder das immunmodulierende Mittel die derzeitige Behandlung eines Patienten durch ein oder mehr zusätzliche therapeutische Mittel ersetzen.
  • Adjuvante Therapie, auch adjuvante Versorgung genannt, ist eine Behandlung, die zusätzlich zur Primär-, Haupt- oder Erstbehandlung verabreicht wird. Als nicht einschränkendes Beispiel kann adjuvante Therapie eine zusätzliche Behandlung sein, die üblicherweise nach einer Operation verabreicht wird, bei der alle nachweisbare Krankheit entfernt wurde, bei der jedoch ein statistisches Risiko eines Rückfalls auf Grund einer versteckten Erkrankung verbleibt. In einigen Ausführungsformen werden die hierin beschriebenen Mittel als eine adjuvante Therapie bei der Behandlung von Krebs verwendet. In einigen Ausführungsformen werden die hierin beschriebenen therapeutischen Mittel als neoadjuvante Therapie vor der Resektion verabreicht. In bestimmten Ausführungsformen bezieht sich neoadjuvante Therapie auf Therapie zum Schrumpfen und/oder Herunterstufen des Tumors vor jeglicher Operation. In einigen Ausführungsformen bedeutet neoadjuvante Therapie, dass ein hierin beschriebenes therapeutisches Mittel Krebspatienten vor einer Operation oder einer anderen Technik, die eine Tumorablation erlaubt, verabreicht wird.
  • In einigen Ausführungsformen sind die hier beschriebenen therapeutischen Mittel als eine Erhaltungstherapie nach einer anfänglichen Behandlung mit einer First-Line-Therapie nützlich, einschließlich, ohne Einschränkung, eines der zusätzlichen therapeutischen Mittel der vorliegenden Offenbarung.
  • In verschiedenen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung ein Behandlungsregime oder ein Verfahren zur Behandlung von Krebs oder Tumoren in einem Patienten bereit, das das gleichzeitige oder sequenzielle Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer BO-11X-Formulierung und/oder eines immunmodulierenden Mittels und eines oder mehr der hierin beschriebenen zusätzlichen therapeutischen Mittel umfasst. In verschiedenen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung ein Behandlungsregime oder ein Verfahren zur Behandlung von Krebs oder Tumoren in einem Patienten bereit, das die gleichzeitige oder sequenzielle Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer BO-11X-Formulierung und/oder eines immunmodulierenden Mittels und eines oder mehr der hierin beschriebenen Antikrebsmittel umfasst, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, chemotherapeutische Mittel. Geeignete, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung zu verwendende chemotherapeutische Mittel können die hierin beschriebenen umfassen. In bestimmten Ausführungsformen ist das chemotherapeutische Mittel eines oder mehr von 5-Fluoruracil (5-FU), Doxorubicin, Gemcitabin, Paclitaxel und Cisplatin. Als Beispiel stellt die vorliegende Erfindung in einigen Ausführungsformen das Kombinieren einer BO-11X-Formulierung und/oder eines immunmodulierenden Mittels mit einem oder mehr üblichen Krebsbehandlungsregimen bereit (als nicht einschränkende Darstellung FOLFOX, FOLFIRI, IFL, FL (Mayo), QUASAR, Machover-Plan, CAF, CMF, ECF und FEC).
  • In verschiedenen Ausführungsformen ist das zusätzliche therapeutische Mittel ein antihyperproliferatives Mittel. Antihyperproliferative Mittel umfassen Doxorubicin, Daunorubicin, Mitomycin, Actinomycin D, Bleomycin, Cisplatin, VP16, Enytin, Taxol, Vincristin, Vinblastin, Carmustin, Melphalan, Cyclophosophamid, Chlorambucil, Busulfan, Lomustin, 5-Fluoruracil, Gemcitabin, BCNU oder Camptothecin, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Zusätzlich kann das zusätzliche therapeutische Mittel die Verwendung von Strahlung umfassen. Zusätzlich können die Behandlungsverfahren die Verwendung von photodynamischer Therapie umfassen.
  • Salze, pharmazeutische Zusammensetzungen und Dosen
  • In einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung die hierin beschriebenen Mittel und pharmazeutisch verträgliche Ester, Prodrugs, Salze, Solvate, Enantiomere, Stereoisomere, aktive Metabolite, Kokristalle und andere physiologisch funktionelle Derivate davon bereit.
  • In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung hierin beschriebene Mittel und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Hilfsstoff bereit. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in jeder geeigneten Form vorliegen, die für die gewünschte Verwendung und den Verabreichungsweg geeignet ist. Pharmazeutische Hilfsstoffe können Flüssigkeiten sein, wie Wasser und Öle, einschließlich solcher von Erdöl, tierischem, pflanzlichem oder synthetischem Ursprung, wie Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und dergleichen. Die pharmazeutischen Hilfsstoffe können beispielsweise Kochsalzlösung, Akaziengummi, Gelatine, Stärkepaste, Talk, Keratin, kolloidales Siliciumdioxid, Harnstoff und dergleichen sein. In einer Ausführungsform sind die pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffe steril, wenn sie einem Subjekt verabreicht werden. Wasser ist ein nützlicher Hilfsstoff, wenn jegliches hierin beschriebene Mittel intravenös verabreicht wird. Salzlösungen und wässrige Dextrose- und Glycerinlösungen können auch als flüssige Hilfsstoffe, insbesondere für injizierbare Lösungen, verwendet werden. Geeignete pharmazeutische Hilfsstoffe umfassen auch Stärke, Glucose, Lactose, Saccharose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kreide, Silicagel, Natriumstearat, Glycerinmonostearat, Talk, Natriumchlorid, getrocknete Magermilch, Glycerin, Propylen, Glycol, Wasser, Ethanol und dergleichen. Andere Beispiele geeigneter pharmazeutischer Hilfsstoffe sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (herausgegeben von Allen, Loyd V., Jr; 22. Ausg., 2012) beschrieben.
  • Zusätzlich können die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung Hilfsstoffe wie Konservierungsmittel, Benetzungsmittel, Emulgatoren, pH-Puffer und Dispergiermittel enthalten. Ferner können Hilfs-, Stabilisierungs-, Verdickungs-, Schmier- und Färbemittel enthalten sein. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch die Zugabe verschiedener antibakterieller und antimykotischer Mittel sichergestellt werden, beispielsweise Paraben, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure und dergleichen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch isotonische Mittel wie Zucker, Natriumchlorid und dergleichen umfassen.
  • Wo erforderlich, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen auch ein Solubilisierungsmittel enthalten. Die Mittel können auch mit einem geeigneten Vehikel oder einer geeigneten Verabreichungsvorrichtung geliefert werden, wie sie in der Technik bekannt sind. Zusammensetzungen zur Verabreichung können optional ein lokales Anästhetikum umfassen, wie beispielsweise Lidocain, um Schmerz an der Injektionsstelle zu verringern.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können die Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen, Tabletten, Pillen, Pellets, Kapseln, Kapseln umfassend Flüssigkeiten, Pulver, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung, Suppositorien, Emulsionen, Aerosolen, Sprays, Suspensionen oder jegliche andere Form, die für den Gebrauch geeignet ist, annehmen. Somit kann die hierin beschriebene Zusammensetzung in einer Kapsel, Tablette, Pille, Caplet, Flasche, Ampulle, Beutel, Spritze, Patrone, Vernebler oder anderen Behälter enthalten sein. In einer Ausführungsform liegt die pharmazeutische Zusammensetzung in Form einer Kapsel vor. In einer anderen Ausführungsform liegt die pharmazeutische Zusammensetzung in Form einer Tablette vor.
  • In einigen Ausführungsformen ist die Verabreichung jegliches der beschriebenen Mittel und Zusammensetzungen eines von oral, intravenös und parenteral. In verschiedenen Ausführungsformen umfassen die Verabreichungswege beispielsweise: oral, intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, subkutan, intranasal, epidural, sublingual, intranasal, intrazerebral, intrahepatisch, intrapankreatisch, intravesikular, intravaginal, transdermal, rektal, durch Inhalation, oder topisch, zum Beispiel an den Ohren, der Nase, den Augen oder der Haut. In einigen Ausführungsformen wird die Verabreichung oral oder durch parenterale Injektion bewirkt. Die Art der Verabreichung kann dem Ermessen des Anwenders überlassen werden und hängt teilweise von der Stelle des medizinischen Zustands und/oder den gleichzeitigen Behandlungen ab (beispielsweise Chemotherapie, Strahlentherapie, oder in Kombination mit Antikörpern, Impfstoffen und anderen Krebs-gerichteten Medikamenten). In verschiedenen Ausführungsformen führt die Verabreichung zur Freisetzung jegliches beliebigen hier beschriebenen Mittels in den Blutkreislauf.
  • Jegliches hierin beschriebene Mittel und/oder pharmazeutische Zusammensetzung kann oral verabreicht werden. Solche Mittel und/oder pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch auf jedem anderen geeigneten Weg verabreicht werden, zum Beispiel durch intravenöse Infusion oder Bolusinjektion, durch Absorption durch epitheliale oder mukokutane Auskleidungen (z. B. Mundschleimhaut, rektale und intestinale Schleimhaut, usw.), und kann zusammen mit einem zusätzlichen therapeutischen Mittel verabreicht werden. Die Verabreichung kann systemisch oder lokal erfolgen. Verschiedene Abgabesysteme sind bekannt, z. B. Verkapselung in Liposomen, Mikropartikeln, Mikrokapseln, Kapseln usw. und können verwendet werden. In spezifischen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, lokal im Bereich, der einer Behandlung bedarf, zu verabreichen.
  • In einer Ausführungsform wird ein hierin beschriebenes Mittel und/oder eine hierin beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Routineverfahren als eine Zusammensetzung formuliert, die an die orale Verabreichung an Menschen angepasst ist. Feste Dosierungsformen für die orale Verabreichung umfassen beispielsweise Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granulate. In solchen Dosierungsformen wird der Wirkstoff gemischt mit mindestens einem inerten, pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff oder Träger, wie Natriumcitrat, Dicalciumphosphat usw., und/oder a) Füllstoffen oder Streckmitteln wie Stärken, Lactose, Saccharose, Glucose, Mannitol, Kieselsäure, mikrokristalline Zellulose und Bakers Spezialzucker usw., b) Bindemitteln, wie beispielsweise Carboxymethylzellulose, Alginaten, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon usw., c) Feuchthaltemitteln, wie Glycerin usw., d) Sprengmitteln wie Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, bestimmten Silikaten, Natriumcarbonat, vernetzten Polymeren wie Crospovidon (vernetztem Polyvinylpyrrolidon), Croscarmellose-Natrium (vernetzter Natriumcarboxymethylzellulose), Natriumstärkeglycolat usw., e) Lösungsverzögerern wie Paraffin usw., f) Absorptionsbeschleunigern wie quartären Ammoniumverbindungen usw., g) Benetzungsmitteln wie beispielsweise Cetylalkohol und Glycerinmonostearat, usw., h) Absorptionsmitteln wie Kaolin und Bentonitton, und i) Gleitmitteln wie Talk, Calciumstearat, Magnesiumstearat, festen Polyethylenglykolen, Natriumlaurylsulfat, Glycerylbehenat usw. und Mischungen solcher Hilfsstoffe. Ein Fachmann wird erkennen, dass bestimmte Hilfsstoffe zwei oder mehr Funktionen in der oralen Dosierungsform haben können. Im Falle einer oralen Dosierungsform, beispielsweise einer Kapsel oder einer Tablette, kann die Dosierungsform auch Puffermittel umfassen.
  • Flüssige Dosierungsformen für die orale Verabreichung umfassen pharmazeutisch annehmbare Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Elixiere. Zusätzlich zu den Wirkstoffen können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünnungsmittel enthalten, die üblicherweise in der Technik verwendet werden, wie beispielsweise Wasser oder andere Lösungsmittel, Lösungsvermittler und Emulgatoren, wie Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol, Dimethylformamid, Öle (insbesondere Baumwollsamen-, Erdnuss-, Mais-, Keim-, Oliven-, Rizinus- und Sesamöl), Glycerin, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglykole und Fettsäureester von Sorbitan und Mischungen davon. Dosierungsformen, die für die parenterale Verabreichung (z. B. intravenöse, intramuskuläre, intrahepatische, intrapankreatische, intraperitoneale, subkutane und intraartikuläre Injektion und Infusion) geeignet sind, umfassen zum Beispiel Lösungen, Suspensionen, Dispersionen, Emulsionen und dergleichen. Sie können auch in Form von sterilen festen Zusammensetzungen (z. B. lyophilisierten Zusammensetzungen) hergestellt werden, die unmittelbar vor der Verwendung in sterilem injizierbarem Medium gelöst oder suspendiert werden können. Sie können zum Beispiel in der Technik bekannte Suspendier- oder Dispergiermittel umfassen. Pharmazeutische Zusammensetzungen dieser Erfindung zur parenteralen Injektion umfassen pharmazeutisch annehmbare sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen sowie sterile Pulver zur Rekonstitution zu sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen unmittelbar vor der Verwendung. Beispiele für geeignete wässrige und nicht-wässrige Träger, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel oder Vehikel umfassen Wasser, Ethanol, Polyole (wie Glycerin, Propylenglykol, Polyethylenglykol und dergleichen) und geeignete Mischungen davon, Pflanzenöle (wie Olivenöl) und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Die richtige Fließfähigkeit kann beispielsweise durch die Verwendung von Beschichtungsmaterialien wie Lecithin, durch Beibehaltung der erforderlichen Teilchengröße im Fall von Dispersionen und durch die Verwendung von Tensiden aufrechterhalten werden.
  • Jegliches hierin beschriebene Mittel und/oder hierin beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung kann durch Mittel zur kontrollierten Freisetzung oder verzögerten Freisetzung oder durch Abgabevorrichtungen verabreicht werden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Solche Dosierungsformen können nützlich sein, um eine kontrollierte oder verzögerte Freisetzung von einem oder mehr aktiven Bestandteilen bereitzustellen, unter Verwendung von beispielsweise Hydropropylzellulose, Hydropropylmethylzellulose, Polyvinylpyrrolidon, Eudragit, anderen Polymermatrices, Gelen, permeablen Membranen, osmotischen Systemen, mehrschichtigen Beschichtungen, Mikropartikeln, Liposomen, Mikrokügelchen oder einer Kombination davon, um das gewünschte Freisetzungsprofil bereitzustellen, in variierenden Anteilen. Geeignete Formulierungen mit kontrollierter oder verzögerter Freisetzung können leicht zur Verwendung mit den Wirkstoffen der hierin beschriebenen Mittel ausgewählt werden. Die Erfindung stellt somit einzelne Einheitsdosierungsformen bereit, die für die orale Verabreichung geeignet sind, wie, ohne Beschränkung, Tabletten, Kapseln, Gelkapseln und Caplets, die zur kontrollierten oder verzögerten Freisetzung angepasst sind.
  • Formulierungen, die die hierin beschriebenen Mittel und/oder pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen, können zweckmäßigerweise in Einheitsdosierungsformen dargereicht werden und können nach irgendeinem der auf dem Gebiet der Pharmazie bekannten Verfahren hergestellt werden. Solche Verfahren umfassen im Allgemeinen den Schritt des Inkontaktbringens der therapeutischen Mittel mit einem Träger, der einen oder mehr zusätzliche Bestandteile darstellt. Typischerweise werden die Formulierungen hergestellt, indem das therapeutische Mittel gleichmäßig und innig mit einem flüssigen Träger, einem feinverteilten festen Träger oder beiden in Kontakt gebracht wird und dann, falls erforderlich, das Produkt zu Dosierungsformen der gewünschten Formulierung geformt wird (z. B. nasse oder trockene Granulate, Pulvermischungen usw., gefolgt von Tablettieren unter Verwendung herkömmlicher auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren).
  • Es versteht sich, dass die tatsächliche Dosis der hierin beschriebenen Mittel und/oder erfindungsgemäß zu verabreichenden pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß dem jeweiligen Mittel, der jeweiligen Dosierungsform und der Art der Verabreichung variieren kann. Viele Faktoren, die die Wirkung der BO-11X-Formulierungen modifizieren können (z. B. Körpergewicht, Geschlecht, Ernährung, Zeitpunkt der Verabreichung, Verabreichungsweg, Ausscheidungsrate, Zustand des Subjekts, Arzneimittelkombinationen, genetische Veranlagung und Reaktionsempfindlichkeiten) können von Fachleuten in Betracht gezogen werden. Verabreichung kann kontinuierlich oder in einer oder mehr diskreten Dosen innerhalb der maximal tolerierten Dosis durchgeführt werden. Optimale Verabreichungsraten für einen gegebenen Satz von Bedingungen können von Fachleuten auf dem Gebiet unter Verwendung herkömmlicher Dosierungsverabreichungstests bestimmt werden.
  • Individuelle Dosen der hierin beschriebenen Mittel und/oder pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in Einheitsdosierungsformen (z. B. Tabletten oder Kapseln) verabreicht werden, die beispielsweise etwa 0,01 mg bis etwa 1000 mg Poly(I:C)-Moleküle innerhalb der BO-11X-Formulierung enthalten [z. B. wobei die individuelle BO-11X-Formulierung gebildet wird durch Herstellen eines Komplexes von etwa 0,01 mg bis etwa 1000 mg Poly(I:C)], einschließlich aller Werte und Bereiche dazwischen. In einigen Ausführungsformen werden die hierin beschriebenen Mittel und/oder pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in einer Menge von etwa 0,01 mg bis etwa 1000 mg Poly(I:C)-Moleküle innerhalb der BO-11X-Formulierung täglich, oder von etwa 0,1 mg bis etwa 10 mg täglich verabreicht [z. B. wobei die individuelle tägliche BO-11X-Formulierung gebildet wird durch Herstellen eines Komplexes von etwa 0,01 mg bis etwa 1000 mg, vorzugsweise etwa 0,01 mg bis 10 mg Poly(I:C)], einschließlich aller Werte und Bereiche dazwischen.
  • In einigen Ausführungsformen liegt eine geeignete Dosierung der Mittel und/oder pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in einem Bereich von etwa 0,001 bis etwa 10 mg Poly(I:C)-Moleküle innerhalb der BO-11X-Formulierung/kg Körpergewicht des Subjekts, vorzugsweise 0,003 bis etwa 10 mg Poly(I:C)-Moleküle innerhalb der BO-11X-Formulierung/kg Körpergewicht des Subjekts, bevorzugter 0,005 bis etwa 10 mg Poly(I:C)-Moleküle innerhalb der BO-11X-Formulierung/kg Körpergewicht des Subjekts und noch bevorzugter 0,01 bis etwa 10 mg Poly(I:C)-Moleküle innerhalb der BO-11X-Formulierung pro kg Körpergewicht des Subjekts [z. B. wobei die einzelne verabreichte BO-11X-Formulierung gebildet wird durch Herstellen eines Komplexes von etwa 0,005 mg bis etwa 10 mg Poly(I:C)] pro kg Körpergewicht des Subjekts, vorzugsweise etwa 0,003 mg bis etwa 10 mg Poly(I:C)] pro kg Körpergewicht des Subjekts, bevorzugter etwa 0,001 mg bis etwa 10 mg Poly(I:C)] pro kg Körpergewicht des Subjekts, einschließlich aller Werte und Bereiche dazwischen. In anderen Ausführungsformen liegt eine geeignete Dosierung der BO-11X-Formulierung und/oder des immunmodulierenden Mittels und/oder des zusätzlichen therapeutischen Mittels in einem Bereich von etwa 0,01 mg/kg bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht, oder in einem Bereich von etwa 0,05 mg/kg bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht.
  • In Übereinstimmung mit bestimmten Ausführungsformen der Erfindung können die hierin beschriebenen Mittel und/oder pharmazeutischen Zusammensetzungen zum Beispiel mehr als einmal täglich, etwa einmal pro Tag, etwa jeden zweiten Tag, etwa jeden dritten Tag, etwa einmal pro Woche, etwa einmal alle zwei Wochen, etwa einmal im Monat, etwa einmal alle zwei Monate, etwa einmal alle drei Monate, etwa einmal alle sechs Monate oder etwa einmal im Jahr verabreicht werden.
  • Kits
  • Die Erfindung stellt auch Kits bereit, die die Verabreichung der hierin beschriebenen Mittel und/oder pharmazeutischen Zusammensetzungen vereinfachen können. Das Kit ist eine Zusammenstellung von Materialien oder Komponenten, einschließlich mindestens eines der hierin beschriebenen Mittel. Die genaue Art der im Kit konfigurierten Komponenten hängt vom Verwendungszweck ab. In einer Ausführungsform ist das Kit für den Zweck der Behandlung von menschlichen Subjekten konfiguriert.
  • Eine Gebrauchsanweisung kann in dem Kit enthalten sein. Gebrauchsanweisungen enthalten typischerweise einen greifbaren Ausdruck, der die Technik beschreibt, die bei der Verwendung der Komponenten des Kits verwendet werden soll, um ein gewünschtes Ergebnis zu beeinflussen, wie zum Beispiel Krebs, Diabetes oder Fettleibigkeit zu behandeln. Optional enthält das Kit auch andere nützliche Komponenten wie Verdünnungsmittel, Puffer, pharmazeutisch annehmbare Träger, Spritzen, Katheter, Applikatoren, Filter, (Mikro-)Nadeln, Pipettier- oder Messwerkzeuge, Verbandmaterialien oder andere nützliche Utensilien, wie von Fachleuten auf dem Gebiet leicht zu erkennen ist.
  • Die Materialien und Komponenten, die in dem Kit zusammengestellt sind, können dem Fachgeschäft in jeder Zweckmäßigkeit und auf geeignete Weisen zur Verfügung gestellt werden, die ihre Funktionsfähigkeit und Anwendbarkeit bewahrt. Zum Beispiel können die Komponenten bei Raum-, Kühl- oder Tiefkühltemperaturen bereitgestellt werden. Die Komponenten sind typischerweise in geeigneten Verpackungsmaterialien enthalten. In verschiedenen Ausführungsformen wird das Verpackungsmaterial durch wohlbekannte Verfahren hergestellt, vorzugsweise um eine sterile, kontaminationsfreie Umgebung bereitzustellen. Das Verpackungsmaterial kann ein externes Etikett aufweisen, das den Inhalt und/oder den Zweck des Kits und/oder seine Komponenten angibt.
  • Während die Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen beschrieben worden ist, versteht es sich, dass sie weiter modifiziert werden kann, und diese Anmeldung soll jegliche Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung abdecken, die im Allgemeinen den Prinzipien der Erfindung folgen, und einschließlich solcher Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung, wie sie innerhalb der bekannten oder üblichen Praxis innerhalb des Stands der Technik, auf den sich die Erfindung bezieht, fallen, und die auf die wesentlichen Merkmale anwendbar sind, die hierin oben dargelegt wurden und im Umfang der beigefügten Ansprüche folgen.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Effekte der Komplexgröße auf Antikrebseffekte verschiedener jetPEI-basierter Poly(I:C)-Präparate (BO-111-Formulierungen)
  • Materialien und Methoden
  • BO-111-Formulierungen (2-Gefäß-Prozess)
  • Die einzelsträngigen Polyinosinsäure- [Poly(l)-] und Polycytidylsäure- [Poly(C)-] Moleküle, die zur Erzeugung doppelsträngiger Polyinosin-Polycytidylsäure- [Poly(I:C)-] Moleküle verwendet wurden, wurden von kommerziellen Anbietern wie Tide Group, Carbogen oder Invivogen bezogen. Je nach Anbieter und Charge wird die Größenverteilung für Poly(C)-Moleküle wie folgt definiert: <400 Basen, 20-82% (wobei weitere Tests unter Verwendung von Präparaten durchgeführt wurden, die beispielsweise 33%, 43% oder 50% aufweisen); 400-850 Basen, 15-40% (wobei weitere Tests unter Verwendung von Präparaten durchgeführt wurden, die beispielsweise 27%, 30% oder 37% aufweisen); 850-5000 Basen, 3-50% (wobei weitere Tests unter Verwendung von Präparaten durchgeführt wurden, die beispielsweise 13%, 30% oder 34% aufweisen); >5000 Basen, 1% oder weniger (im Allgemeinen nicht vorhanden). Abhängig vom Anbieter und der Charge ist die Größenverteilung für Poly(I)-Moleküle definiert als: <400 Basen, 80-95% (wobei weitere Tests unter Verwendung von Präparaten durchgeführt wurden, die beispielsweise 86% und 91% aufweisen); 400-850 Basen, 5-20% (wobei weitere Tests unter Verwendung von Präparaten durchgeführt wurden, die beispielsweise 8% oder 12% aufweisen); 850-5000 Basen, 0-5% (wobei weitere Tests unter Verwendung von Präparaten durchgeführt wurden, die beispielsweise 1% oder weniger aufweisen); >5000 Basen, 1% oder weniger (im Allgemeinen nicht vorhanden). Akzeptanzkriterien für die Herstellung von BO-111-Formulierungen, die für Poly(I)- und Poly(C)-Pulver oder -Lösungen gelten, umfassen auch maximale Absorption (bei einer Wellenlänge von 248 ± 1 nm und von 268 ± 1 nm für Poly(I) und Poly(C),) Endotoxingehalt (≤ 10 EU/≤mg), pH (6,0 - 8,0) und Sedimentationskoeffizient (≥ 4S).
  • Poly(I)-Präparatchargen wurden erhalten durch Auflösen von pulverförmigem Poly(I) (1,0 Äq., 23,99 g) bei 50 °C in PBS 1 × (2,4 I) unter kontinuierlichem Rühren in einem 6-Liter-Kolben. Die Poly(C)-Präparatchargen wurden getrennt unter Verwendung von pulverförmigem Poly(C) in der gleichen Weise und mit der gleichen Konzentration erhalten. Zusätzliche Filtrationsschritte könnten implementiert werden, um die Qualität der Ausgangslösungen unter Verwendung von Membranen mit einem Ausschluss von 300 kDa oder einem Ausschluss von 500 kDa (Pellicon 2-Kassette, Millipore) weiter zu verbessern. Die Permeate dieser Filtrationsschritte werden konzentriert und von Verunreinigungen kleiner Größe, wie Monomeren, über einer 30 kDa Membran (Pellicon 2-Kassette, Millipore) befreit. Das resultierende Retentat für jede Lösung wird mit einer konzentrierten Pufferlösung (wie PBS 10X) gemischt. Für beide Lösungen wurde die optische Dichte bestimmt, um die Konzentration als eine Basis für eine 1:1 Stöchiometrie für den folgenden Paarungsschritt zu berechnen, wobei folglich das Gesamtvolumen vor dem Paarungsschritt eingestellt wurde. Poly(I)-Lösung wird mit Poly(C)-Lösungsmolekülen 30 Minuten bei 55 bis 62 °C gemischt und gerührt. Die resultierende Lösung wird langsam bei Raumtemperatur ungefähr 10 Minuten abgekühlt. 3 Stunden, um einzelsträngige Moleküle zu paaren und Poly(I:C)-Moleküle zu erzeugen, und schließlich filtriert über einen G3-Glasporenfilter (Porengröße von ca. 15 - 40 µm).
  • Dieser Paarungsprozess erzeugt eine Lösung, die einen Pool verschiedener doppelsträngiger Poly(I:C)-Moleküle enthält, die dann auf eine chromatographische GPC-Säule aufgetragen wird. Die Chromatographie wird mit einer Omnifit-Glassäule von 5 cm Durchmesser durchgeführt, die mit einer Aufschlämmung von 700 ml Toyopearl HW-65F in 40 mM Natriumphosphatpuffer gefüllt war. Die Aufschlämmung wurde langsam absetzen gelassen, gefolgt von Waschen mit 40 mM Natriumphosphatpuffer (pH = 6,9) bei zunehmender Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min bis 60 ml/min. Die Säule wurde in eine präparative HPLC-Vorrichtung eingebaut, die aus zwei Zufuhrpumpen, einem UV-Detektor, Probenventilen und einem Computer bestand. Die Reaktionsmischung aus der Paarung wurde auf die Säule geladen und mit 40 mM Natriumphosphatpuffer (Fluss = 50 ml/min, pH = 6,9) eluiert. Zielfraktionen wurden entnommen, wenn das UV-Signal zwischen 100 mV und 1250 mV lag, und zur weiteren Aufarbeitung unter Verwendung von vier Entsalzungszyklen von Verdünnung und Konzentration unter Verwendung einer Tangentialströmungsvorrichtung (TFF, Millipore Pellicon 2, regenerierte Zellulose, ausgestattet mit drei Membrankassetten von je 0,1 m2, 300 kDa Ausschluss) vereinigt. Einlass und Auslass wurden mit der ersten Glasflasche mit den vereinigten Chromatographiefraktionen verbunden. Endgültiges Retentat und Waschlösung wurden über eine Membran filtriert, um eine klare, farblose Lösung zu ergeben, die unter Verwendung von Isopropanol entsalzt, gefriergetrocknet und bei Raumtemperatur (bei 1 mbar über ca. 5 Tage) lyophilisiert wurde.
  • Verschiedene kommerzielle In-vivo-JetPEI [mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht zwischen 8,3 und 22,5 kDa und einem Polydispersitätsindex <1,5, bestimmt aus dem von PEOX (Polyethylenoxid, Vorläufer zu PEI) durch Gelpermeationschromatographie (GPC: SOP GPC-0044) und durch einen 0,2 µm Filter sterilfiltriert] wurde von PolyPlus (Katalog Nr. 201-50G) erhalten. Der 2-Gefäß-Prozess umfasst das Mischen des Inhalts eines Gefäßes 1, das Poly(I:C)-Moleküle enthält (Volumen von 1,0 ml oder weniger beim schnellen Pipettieren der Lösungen, oder bis zu 5,5 ml bei Verwendung einer Spritze) mit einem Gefäß 2, das PEI-Lösung enthält (Volumen von 1,0 oder weniger ml beim schnellen Pipettieren der Lösungen, oder bis zu 5,5 ml bei Verwendung einer Spritze). Alternativ wird der Inhalt von Gefäß 1 mit einer Spritze (10 ml) und einer Nadel (G20-0,9 µm) abgesaugt und schnell über die Oberfläche der Flüssigkeit in Gefäß 2 geschossen. Das resultierende BO-111-Präparat wird dann durch eine Membran mit einer Porengröße im Bereich von 1-5 µm filtriert, was die Eliminierung größerer sichtbarer Partikel sicherstellt. Glucose (oder Mannitol) war als Hilfsstoff in Fläschchen 1 enthalten, um eine Konzentration von 5% (Gew./Vol.) im endgültigen BO-111-Präparat zu erreichen [d.h. jene Zusammensetzung wird gebildet durch zusätzliches Hinzufügen von Glucose (oder Mannitol) in einer Konzentration von 5% (Gewicht/Gesamtvolumen jener Zusammensetzung)]. Glucose wurde ausgiebig als ein Hilfsstoff verwendet, der eine annehmbare Osmolalität von BO-111 (302 mOsm/kg) fördert, ohne funktionelle oder physikalisch-chemische Merkmale zu beeinträchtigen und mögliche unerwünschte Nebenwirkungen auf Grund der Verabreichung von Mannitol in hohen Konzentrationen zu vermeiden.
  • Verschiedene BO-111 -Präparate wurden hergestellt, indem die anfängliche BO-111-Lösung nach den Angaben des Herstellers ein- oder zweimal durch Zelluloseacetatmembranen unterschiedlicher Porengröße (Minisart® NML-Spritzenfilter; Sartorius) filtriert wurde. Alternativ wurde das anfängliche BO-111-Präparat 15 Minuten bei der angegebenen Geschwindigkeit unter Verwendung eines Festwinkelrotors FA-45-24-1 1 für Zentrifugen 5415 D/5415 R (Eppendorf) zentrifugiert. Der Durchfluss der Membranfiltration bzw. der Zentrifugationsüberstand wurde bis zur Verwendung bei 4 °C bei einer Poly(I:C)-Konzentration von 0,5 bis 0,8 mg/ml, bestimmt durch UV, aufbewahrt. Die Poly(I:C)-Konzentration wird dann vor jedem Experiment neu berechnet, wobei für jede Bedingung eine Probe mit der gleichen Dosis erzeugt wird.
  • Die Größe von Poly(I:C)-Molekülen in BO-111-Präparaten wurde unter Verwendung von Agarosegelen und unmarkierten oder [32P]-markierten Poly(I)- und Poly(I:C)-Präparaten bestimmt. Kurz gesagt werden 1 µg Poly(I) und Poly(I:C) (PBS) auf das Agarosegel geladen und die Elektrophorese wurde 1 Stunde bei 80 Volt in TBE-Puffer durchgeführt. Abhängig von der Größenverteilung der anfänglichen Poly(C)- und Poly(I)-Moleküle wurde die Größenverteilung von Poly(I:C)-Molekülen, die in BO-111-Präparaten vorliegen, bestimmt als: <400 Basen, 7- 57% (wobei weitere Tests unter Verwendung von Präparaten durchgeführt wurden, die beispielsweise 15% oder 21% aufwiesen); 400-850 Basen, 20-45% (wobei weitere Tests unter Verwendung von Präparaten durchgeführt wurden, die beispielsweise 25% oder 27% aufwiesen); 850-5000 Basen, 20-70% (wobei weitere Tests unter Verwendung von Präparaten durchgeführt wurden, die beispielsweise 52% oder 53% aufwiesen); >5000 Basen, 0-9% (mit weiteren Tests, die unter Verwendung von Präparaten durchgeführt wurden, die beispielsweise 1% oder 0% aufwiesen).
  • Analysetechniken
  • Der Wert für den Zeta-gemittelten Durchschnitt (z-Durchschnitt) und den Polydispersitätsindex von JetPEI/Poly(I:C)-Partikeln in verschiedenen BO-111-Präparaten (zwischen 0,5-0,8 mg/ml, für zellbasierte und andere Tests bei einer Poly(I:C)-Konzentration von 1,0 µg/ml zu verdünnen) wurden unter Verwendung von Zetasizer Nano ZS gemäß den Anweisungen des Herstellers und in Übereinstimmung mit ISO 22412 bestimmt, unter der Annahme, dass die Partikel kugelförmig sind. Im Allgemeinen wird die dynamische Lichtstreuung (Nanosizer-Technologie) unter Verwendung der Software v7.11 angewendet.
  • Funktionelle Charakterisierung von BO-111-Präparaten
  • Die verschiedenen BO-111-Präparate wurden unter Verwendung humaner Melanomzellen, humaner Pankreaszellen oder humaner Melanozyten gemäß der die Eigenschaften von BO-110-Komplexen beschreibenden Literatur getestet (Pozuelo-Rubio M et al., 2014; Tormo D et al., 2009; WO2011003883 ). Kurz gesagt wurden Zelllebensfähigkeitstests an adhärenten Zellen mindestens 12 Stunden vor der Behandlung durchgeführt. Der Prozentsatz von Zelltod zu den angegebenen Zeiten und Behandlungskonzentrationen wurde durch Standard-Trypanblau-Ausschlusstests an schwimmenden und adhärenten Zellen abgeschätzt, die vereinigt, mit einer 0,4% Trypanblau-Lösung (Gibco Laboratories, Grand Island, NY, USA) gefärbt und unter einem Lichtmikroskop bewertet wurden (ein Minimum von 100-500 Zellen pro Behandlung wurde gezählt). Jedes Präparat wurde über einen Zeitraum zwischen 12 Stunden und 48 Stunden und bei Konzentrationen von Poly(I:C)-Molekülen in den verschiedenen Präparaten, die zwischen 0,1 und 2,5 µg/ml umfassten, getestet.
  • Ergebnisse
  • Vorhandene Verfahren zur Herstellung von BO-110-Komplexen, wie sie in der Literatur beschrieben sind (Pozuelo-Rubio Met al., 2014; Tormo D et al., 2009; WO2011003883 ), wurden im Labormaßstab etabliert und weisen einige wichtige Einschränkungen hinsichtlich der Erfordernisse für die Herstellung von Materialien auf, die in einem größeren präklinischen Maßstab getestet werden können, und dann für die klinische Bewertung: begrenzte Konzentration (nicht über 0,05 mg/ml) und begrenzte Möglichkeit zur Vergrößerung und gleichzeitiger Herstellung von GMP-Konformität des Herstellungsprozesses. Insbesondere sollte der Herstellungsprozess die Herstellung von Formulierungschargen ermöglichen, die Poly(I:C)-haltige Partikel mit physikalisch-chemischen Eigenschaften (wie Sterilität, Partikelgrößenverteilung, Stabilität, Fehlen sichtbarer und sub-sichtbarer Partikel und Konzentration von mindestens 0,5 mg/ml) umfassen, die so einheitlich wie möglich zwischen verschiedenen Präparaten sind, zur korrekten Bewertung ihrer biologischen Wirkungen und medizinischen Verwendung in relevanten präklinischen Modellen und pharmakologisch-toxikologischen Tests.
  • Ein erster Schritt zum Erreichen dieser Ziele war das Ersetzen des Schritts der tropfenweisen Zugabe von Poly(I:C)-Lösung zu JetPEI-Lösung (oder anders herum, wie in anfänglichen BO-110 -Präparaten; WO2011003883 ) und Inkubation der Mischung bei Raumtemperatur. Die Mischgeschwindigkeit wurde als ein potentiell wichtiger, jedoch nicht bewerteter Faktor zur Lösung des Herstellungsproblems identifiziert. In diesem Rahmen wurde eine neue Art von Poly(I:C)-PEI-Formulierung, die als BO-111 bezeichnet wird, durch Ersetzen des Ansatzes des Massenmischens von zu lyophilisierenden und in Gefäßen zu verpackenden Lösungen mit dem Ansatz des Herstellens zweier Gefäße, die jeweils die gewünschte Menge an JetPEI- und Poly(I:C)-Molekülen enthalten. Der Inhalt der zwei Gefäße wird schnell durch Injizieren (oder durch andere Mittel zum schnellen Mischen von Flüssigkeiten, wie schnelles Pipettieren) gemischt, wobei die zwei Lösungen ein ähnliches Volumen haben. Die resultierende Lösung hat ein Volumen, das mit späteren Tests und Verwendungen kompatibel ist (z. B. ein 1,2 ml BO-111-Präparat bei 0,5 mg/ml, resultierend aus dem Mischen von 2 Lösungen mit jeweils einem Volumen von 0,6 ml).
  • Die für die Mischung verwendete Spritze und Nadel erzeugen genügend Turbulenz, um eine schnelle Mischung und schnelle Bildung von Partikeln in BO-111-Präparaten mit begrenzten (oder fehlenden) sichtbaren Partikeln zu fördern. Spezifische technische Details des BO-111-Herstellungsprozesses können angepasst werden, um ein weiter erhöhtes Niveau von Aktivität, Reproduzierbarkeit, Stabilität und/oder Homogenität von BO-111-Präparaten bereitzustellen, zum Beispiel durch Extrahieren von Salzen, Eliminieren von Produktionsrückständen, Filtrieren der Lösungen mit Filtern mit großen Porengrößen (z. B. im Bereich zwischen 1 und 5 µm), schnelles Pipettieren oder Verwirbeln der beiden Lösungen, Auswahl von Spritzengröße/-durchmesser, schnelle Zugabe von Poly(I:C)-Lösung zu JetPEI-Lösung und nicht das Gegenteil, oder Lyophilisieren von Präparaten unter Verwendung von Verbindungen wie Glucose oder Mannitol als Hilfsstoff.
  • Jedoch können solche Details kaum von kleinen Volumina zur einmaligen oder sofortigen Verwendung auf Präparate von GMP-konformen pharmazeutischen Formulierungen höherer Größenordnung übertragen werden, die auf JetPEI als Träger basieren und Poly(I:C)-Moleküle in der ausreichend hohen Konzentration (mindestens 0,5 mg/ml) und einheitlichen Konzentrationen enthalten, die für das Testen hoher Dosen während einer pharmako-toxikologischen oder anderen vorklinischen Untersuchung erforderlich sind. Darüber hinaus überlässt der Schritt des Mischens der Komponenten von BO-111 direkt vor der Verabreichung die gute Qualität des Endmaterials dem Techniker, insbesondere in Bezug auf die Bildung von klaren, nicht trüben Lösungen, die BO-111-Partikel mit größerem und nicht vollständig kontrolliertem Durchmesser- (Größen-) Bereich enthalten.
  • In diesem Zusammenhang bestand das Ziel im nächsten Schritt darin, verschiedene Mittel und Effekte der Standardisierung des Durchmessers der BO-111 -Partikelmischung auszuwerten. Das anfängliche BO-111-Präparat, das durch das schnelle 2-Gefäß-Pipettierverfahren erhalten wurde, wurde zum Erzeugen und Vergleichen von alternativen Präparaten verwendet, in denen Konzentration und/oder Größe des Soluts, wie BO-111-Komplexe, innerhalb der Lösung unter Verwendung üblicher Techniken wie Zentrifugieren bei hoher Geschwindigkeit (z. B. über 5000 U/min) und Filtration (z. B. mit einer Porengröße im Bereich von 1 bis 5 µm oder im submikromolaren Bereich) verändert werden.
  • Diese erste Analyse zeigt, dass durch die Anwendung jeder der beiden Techniken die resultierenden BO-111-Präparate nicht nur eine Verringerung des mittleren BO-111-Partiketdurchmessers zeigen, sondern auch eine überraschende Erhöhung der Zytotoxizität solcher Präparate gegen Krebszellen, die proportional ist zu dem verringerten mittleren Durchmesser von BO-111-Komplexen (1A). Solch eine verstärkte Antikrebswirkung wurde auch in einer Dosis-Wirkungs-Studie bestätigt, die zeigt, dass die Durchfluss-BO-111-Lösung, die durch Filtrieren der anfänglichen BO-111-Lösung mit der größeren submikromolaren Porengröße erhalten wurde, einen bereits wichtigen Anstieg der Antikrebswirkung von BO-111-Komplexen darstellt, insbesondere bei niedrigeren BO-111-Konzentrationen (1B). Ein ähnlicher Anstieg der Zytotoxizität wird auch durch Verwendung von BO-110-Präparaten bestätigt, die durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,8 µm filtriert werden.
  • Weitere Kriterien, die ausgewertet werden können, sind solche, die sich auf die JetPEI-Merkmale und das Verhältnis in Bezug auf Poly(I:C)-Moleküle beziehen. Auf struktureller Ebene wurden JetPEI-Präparate, die lineares PEI in einem Bereich des mittleren Molekulargewichts enthielten, unter Verwendung des 2-Gefäß-Verfahrens getestet. Der Vergleich der Zytotoxizität solcher BO-111-Präparate (2A) zeigte, dass lineares PEI mit höherem Molekulargewicht (z. B. zwischen 17 und 23 kDa) Antikrebs-BO-111-Zubereitungen bereitstellt, die wirksamer sind als solche, die lineares PEI mit niedrigerem Molekulargewicht (z. B. 8,3 kDa) umfassen.
  • Zusätzlich zur Definition eines Bereichs linearer PEI-Größen, die zur Herstellung von BO-111 mit den gewünschten Antikrebseigenschaften geeignet sind, wurde die Wirkung eines unterschiedlichen Konzentrationsverhältnisses zwischen Aminen von PEI und anionischem Phosphat von Poly(I:C)-Molekülen im Kontext der BO-111 Herstellung getestet. Das Ionenbalance zwischen JetPEI- und Poly(I:C)-Molekülen kann Komplexe bereitstellen, die ein unterschiedliches Niveau an Wechselwirkungen mit zellulären Komponenten aufweisen (z. B. für einen effektiven Zelleintritt). Diese Balance wird als das N/P-Verhältnis berechnet, das die Anzahl der Stickstoffreste von JetPEI pro Polyribonukleotidphosphat definiert, ein Wert, der für In-vivo-Polyribonukleotid-Freisetzungsexperimente als zwischen 6 und 8 empfohlen wird (wobei die Toxizitätsprobleme über 8 hinaus vermieden werden, das heißt 0,16 µl JetPEI pro µg doppelsträngige Poly(I:C)-Moleküle). Verschiedene BO-111-Präparate zeigten eine dosisabhängige zytotoxische Wirkung sowohl auf Melanomzellen als auch auf normale Melanozyten, wenn ein solches Verhältnis N/P von 1,8 auf 5,2 erhöht wurde. Tatsächlich ist die Zytotoxizität gegen Melanomzellen nur in einem mittleren Bereich (um das Verhältnis N/P von 3 herum) dem gegenüber normalen Melanozyten deutlich überlegen, wobei die Lebensfähigkeit letzterer Zellen durch dieses spezifische BO-111-Präparat nur geringfügig beeinflusst wird, verglichen mit unbehandelten Zellen (2B).
  • Die BO-111-Präparate wurden auch unter Verwendung von markierten oder unmarkierten Poly(I:C)-Chargen auf den Gehalt an Poly(I:C)-Molekülen analysiert. Die anfängliche Poly(I:C)-Präparatcharge umfasst doppelsträngige Poly(I:C)-Moleküle, die auf Grund ihrer Herstellung und ihrer Paarung eine Größenverteilung von bis zu 5 Kilobasen Länge (oder mehr) aufweisen mit mindestens 40% oder 50% solcher Doppelstränge mit einer Größe von mehr als 0,85 Kb und mindestens 70% solcher doppelsträngigen Polyribonukleotide mit einer Größe zwischen 0,4 und 5 Kb (in einem repräsentativen Präparat <400 Basenpaare (bp): 21%, 400-850 bp: 27%, 850-5000 bp 52%). Wenn Poly(I:C)-Moleküle in Komplexen in BO-111-Präparaten unter Verwendung des 2-Gefäß-Verfahrens mit JetPEI assoziiert werden, wird die Gesamtheit der Poly(I:C)-Moleküle mit JetPEI assoziiert, wie durch Agarosegelanalyse mit unmarkierten oder markierten Poly(I:C)-Präparaten gezeigt wurde (3A und 3B). Durch Elektrophorese wurde auch festgestellt, dass in BO-111-Präparaten bei einem N/P-Verhältnis unter 3 Poly(I:C)-Moleküle nicht vollständig mit JetPEI assoziiert sind, wie es bei einem höheren N/P-Verhältnis beobachtet werden kann (3 oder darüber; 3C). Somit ermöglicht ein geeigneter Herstellungsprozess das effiziente Einbringen von Poly(I:C)-Molekülen mit einer breiten Größenverteilung in biologisch funktionelle BO-111 -Präparate, ohne ein spezielles Verfahren zum Entfernen von nicht komplexierten Poly(I:C)-Molekülen oder JetPEI hinzuzufügen.
  • Strukturelle BO-111-Merkmale wurden auch unter Verwendung von Techniken zum Bestimmen der Größenverteilung von Partikeln im Submikrometerbereich ausgewertet, wenn der Herstellungsprozess wiederholt oder modifiziert wird oder wenn BO-111-Zubereitungen auf ihre Stabilität getestet werden. Die Reproduzierbarkeit dieses Herstellungsprozesses ist gezeigt, da verschiedene BO-111-Präparate immer eine monomodale Verteilung der Partikelgröße aufweisen, mit Durchmessern, die meistens um 100 nm konzentriert sind, am häufigsten zwischen 50 und 90 nm (mittlerer Durchmesser (d.nm) von 85-90 nm), wobei eine große Mehrzahl von Partikeln eine Größe unter 100 nm oder 200 nm, aber nicht über 400 nm, aber üblicherweise sogar nicht über 300 nm (4A) aufweisen. Wenn diese BO-111-Referenzpräparat Variationen der Temperatur oder der Inkubationszeit ausgesetzt ist, kann sich die Durchmesserverteilung ändern, aber sie ist immer noch monomodal, mit Spitzenwerten zwischen 100 und 150 nm (mittlerer Durchmesser (d.nm) von 105-110 nm), wobei die große Mehrheit der Partikel immer noch einen Durchmesser unter 300 nm und nicht über 600 nm aufweist (4B und 4C). Die entsprechenden BO-111-Präparate zeigen immer noch ein ähnliches Zytotoxizitätsniveau, wenn sie wie für 1 und 2 beschrieben getestet werden, was zeigt, dass dieses Mischverfahren Formulierungen bereitstellen kann, die mit den Erfordernissen für die pharmazeutische Entwicklung übereinstimmen. Jedoch können Modifikationen des Verfahrens, wie die Verringerung der Mischgeschwindigkeit oder das Nichteinführen von Filterprozeduren, die Größenverteilung von BO-111-Komplexen verändern, die bimodal wird, mit einem schlecht kontrollierten Verhalten und höherer durchschnittlichen Größe (d.nm) und einer großen Mehrheit von Partikeln, die 500 nm überschreiten (4D).
  • Diese Experimente zeigen, dass der Herstellungs- und Formulierungsprozess des Komplexes namens BO-110 verbessert werden kann durch Anwenden einer schnellen und kontrollierten Mischung von Komponenten in kleinem Maßstab vor ihrer Verwendung, was zu einem gleichförmigeren, konzentrierteren und wirksameren Poly(I: C)-basierten Präparat mit der Bezeichnung BO-111 führt. Es sind jedoch weitere Verbesserungen erforderlich, um Präparate zu erzeugen, die vollständig GMPkonforme Präparate für die höchsten Stabilitäts- und Wirksamkeitsmerkmale aufweisen, unabhängig von einem Verfahren, das der medizinischen Verwendung zu etablieren ist. Insbesondere können das „Schnellpipettier-“ Verfahren oder andere Variationen des 2-Gefäß-Verfahrens immer noch eine beträchtliche Menge an Partikeln mit einem Durchmesser über 200 nm (bis zu 1 µm oder mehreren Mikrometern) bereitstellen. Der zusätzliche (und möglicherweise nur teilweise wirksame) Filtrationsschritt, der erforderlich wäre, um die gewünschten sterilen und konzentrierten BO-111-Präparate bereitzustellen (die funktionelle Komplexe mit kleinerem, enger verteiltem, gleichförmigem Durchmesser um 100 nm aufweisen), kann als Folge den Verlust einer großen Menge an Material haben, das in dem Membranfilter zurückgehalten wird. Obwohl es der anfängliche Ansatz daher ermöglicht hat, BO-111-Präparate in kleinem Maßstab mit einer umgekehrten Beziehung zwischen dem Komplexdurchmesser von BO-111 und seiner therapeutischen Aktivität zu etablieren, sind weitere technische Verbesserungen erforderlich, um Poly(I:C)-Moleküle und JetPEI-Lösungen in einer Weise herzustellen und zu mischen, die für die Massenherstellung GMP-konformer, stabiler pharmazeutischer Formulierungen geeignet ist, die Poly(I:C)-basierte Komplexe mit einer engen und kontrollierten Größenverteilung umfassen und die dann zur Herstellung mehrerer Ampullen mit jeweils kontrollierten und vergleichbaren Eigenschaften [wie Poly(I:C)-Gehalt, Komplexstabilität und biologische Aktivitäten der Formulierungen] verwendet werden können.
  • Beispiel 2: 1-Gefäß-Prozess zur Herstellung von BO-11X-Präparaten unter GMP-Bedingungen (BO-112-Formulierung)
  • Materialien & Methoden
  • Herstellung von BO-112-Präporaten (1-Gefäß-Prozess)
  • Poly(I:C)-Präparate werden als Lösungen mit Konzentration, Molekülgrößenverteilung und gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll hergestellt. In einer Charge wurde jedoch Poly(I:C) selbst durch den folgenden beispielhaften Prozess erhalten: Poly(C)-Lösung wurde 1,5 h auf 61 bis 66 °C erhitzt, bevor dies mit der Poly(I)-Lösung gemischt und 70 Minuten bei 55 bis 58 ° C gerührt wurde, wonach die Mischung abgekühlt und über eine 0,2 µm Membran filtriert wurde. Einige Bedingungen, die auf den Chromatographie- und/oder Filtrationsschritt, die Abwesenheit oder Anwesenheit eines Gefrierschrittes, zusammen mit dem Puffer und der Paarungszeit, anwendbar waren, wurden angepasst, um die Lösungsviskosität oder die Ausfällung von Komplexen weiter zu verringern. In der Endformulierung wird entweder Mannitol oder Glucose als Hilfsstoff verwendet. Lösung 1, die JetPEI enthält, wird entweder erhalten durch Verwendung von JetPEI in einem konzentrierten flüssigen Präparat oder Solubilisieren fester Massenpräparate von JetPEI (mit einem Molekulargewicht zwischen 17 und 23 kDa) in einer Menge von sterilem Wasser zur Injektion, um 150 mM zu erreichen, und Mischen, um eine homogene zu Lösung erhalten. Ein weiterer Verdünnungsschritt wird durchgeführt, um eine Konzentration von 11,25 mM zu erreichen, vor der Endverdünnung auf 5,62 mM in dem endgültigen Gefäß. Lösung 2 enthält Poly(I:C)-Moleküle und Glucosemonohydrat in einer Menge, die nach dem Mischen mit JetPEI eine Lösung ergibt, die durch Zugabe von 5% Glucose (Gewicht/Gesamtvolumen jener Zusammensetzung) und Poly(I:C) bei 0,5-0,7 mg/ml des Gesamtvolumens der Zusammensetzung gebildet wird, wodurch jenes Poly(I:C) mit dem JetPEI komplexiert, was zu einer BO-112-Zusammensetzung mit 108 bis 1010 Partikeln in pro Gefäß in Lösung führt.
  • Lösungen 1 und 2 werden unabhängig voneinander sterilisiert unter Verwendung einer Doppelfiltration durch 0,2 µm Filter (Sartopore® 2 150 0,2 µm, vollständig validiert als Sterilisierungsgradilter (gemäß den Richtlinien ASTM F-838-05) unter Verwendung einer Pumpe Watson Marlon (Geschwindigkeit 30 rpm). Das automatisierte Mischen der zwei Lösungen wird in jedem Gefäß unter Verwendung eines sequentiellen Verfahrens durchgeführt: (i) Lösung 1 wird zu dem Gefäß zugegeben, unter Verwendung einer Watson-Marlow-Pumpe, um 5,95-6,05 g (6 ml; Dichte: 1 g (ml) zu dosieren, (ii) Lösung 2 wird über Lösung 1 zugegeben, unter Verwendung eines Rohrs mit einem Innendurchmesser von 1,8 mm, das mit einer G20-0,9 µm Nadel verbunden ist, unter Verwendung einer Flexicon-Pumpe bei 550 U/min, um 6,08-6,40 g (6 ml) zu dosieren. Die Ergebnisse können verbessert werden durch Verwendung eines T-Stück-Mischers. Im Falle von Aggregaten von Partikeln (z. B. mit einer Größe in dem Bereich von 1-100 µm oder größer), die noch durch visuelle Inspektion am Ende des Herstellungsprozesses (oder während seiner Lagerung) auf Grund elektrostatischer Wechselwirkungen vorhanden sein können, kann das Produkt vor Verwendung durch einen 0,8 µm Filter filtriert werden (beispielsweise vor seiner Injektion), wodurch weder die biologischen Eigenschaften noch die monomodale Durchmesserverteilung der Partikel in der Zusammensetzung verändert werden. Zum Beispiel kann die BO-112-Formulierung durch einen Minisart-Spritzenfilter (Sartorious) mit einer Ausschlussgröße von 0,8 µm filtriert werden. Die Gefäße werden mit sterilen pyrogenfreien Gummistopfen verschlossen und mit Aluminiumkapseln geheftet und einzeln etikettiert.
  • Kommerziell erhältliche Poly(I:CJ-haltige Formulierungen
  • Poly-ICLC ist ein Poly(I:C)-Präparat, das mit Polylysin und Carboxymethylzellulose stabilisiert ist (Ewel C et al., 1992; WO2005102278 ). LyoVec-HMW (Kat. Nr. tlrl-piclv) und LyoVec-LMW (Kat. Nr. tlrl-picwlv) und entsprechende Poly(I:C)-Präparate mit hohem Molekulargewicht (HMW; Kat.-Name tlrl-pic) und niedrigem Molekulargewicht (LMW; Kat.-Name tlrl-picw) sind von Invivogen erhältlich.
  • Analytische Tests
  • Die Durchmesser- und Verteilungsanalyse von BO-112 wurde gemäß Beispiel 1 unter Verwendung von standardmäßiger dynamischer Lichtstreuungsausrüstung durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • Die Definition des BO-11X-Präparats gilt für die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die durch geeignetes Mischen einer Lösung, die ein Polymer wie PEI enthält, mit einer Lösung, die Poly(I:C)-Moleküle enthält, erhalten werden, um Komplexe mit einem kleinen, eng verteilten Partikeldurchmesserbereich zu erzeugen (wie durch den z-gemittelten Durchmesser mit einem Gipfel zwischen 50 und 100 nm und nicht über 300 nm oder sogar 200 nm definiert, wie in Beispiel 1 gezeigt).
  • Wenn BO-111-Zubereitungen aus einem Mischschritt resultieren, der kurz vor der weiteren Verwendung manuell durchgeführt wird (d. h. der „2-Gefäß-Prozess“), wurden GMP-bezogene und andere industrielle Anforderungen (z. B. zur Automatisierung des Prozesses) berücksichtigt um, einen „1-Gefäß-Prozess“ zu etablieren, der eine BO-11X-Formulierung bereitstellt, die den erforderlichen pharmazeutischen Spezifikationen entspricht und bereit ist, injiziert zu werden. In diesem Umfang werden die zwei Lösungen getrennt hergestellt (und, im Fall von Poly(I:C) -Lösung, einschließlich auch eines oder mehr Hilfsstoffe) und durch Filtration sterilisiert, bevor sie in einem automatisierten System gemischt werden, wobei Geschwindigkeit und Zeit des Mischens gesteuert und für jedes Gefäß beibehalten werden.
  • 5A liefert einen Überblick über ein solches Verfahren zum Erzeugen eines ersten Typs von BO-11X-Präparaten, das als BO-112 -Formulierungen bezeichnet wird, wobei die Medikamentensubstanz (d. h. doppelsträngige Poly(I:C)-Moleküle, die durch Paaren von einzelsträngigen Poly(I) und Poly-(C)-Molekülen erzeugt werden) zuerst mit einem Hilfsstoff wie Glucose in einer Lösung gemischt wird, die durch Filtration sterilisiert wird, getrennt von der Lösung, die ein Polymer mit der Funktion eines Trägers (d. h. JetPEI) enthält. Dann werden diese beiden Massenpräparate in geeigneter Weise in jedes Gefäß gemischt, um eine große Anzahl von strukturell und funktionell vergleichbaren pharmazeutischen Formulierungen zu erzeugen, die für pharmakotoxikologische Studien und klinische Anwendungen benötigt werden.
  • Dieser Ansatz nutzt die in Beispiel 1 beschriebenen Ergebnisse und er kann automatisiert werden, um BO-112-Präparate mit noch einheitlicheren Merkmalen bereitzustellen. Dieses Mischverfahren ermöglicht nicht nur, die gesamten verfügbaren Glucose-, JetPEI- und Poly(I:C)-Moleküle in Komplexe in BO-112-Präparaten einzubinden (5B), sondern auch, den mittleren Durchmesser und die monomodale Durchmesserverteilung der Komplexe in BO-112-Präparaten zu modulieren, so dass der Z-Mittelwert zwischen 30 und 150 nm moduliert werden kann (5C). Die resultierenden BO-112-Präparate weisen BO-112-Komplexe mit einer monomodalen Durchmesserverteilung ohne sichtbare Partikel auf, selbst wenn die Endlösung nach Mischen der Massenlösungen 1 und 2 nicht durch 5 µm filtriert wird. Die Mischbedingungen können angepasst werden, insbesondere durch Modifizieren der Mischgeschwindigkeit zwischen 50 U/min und 600 U/min und/oder der Fließgeschwindigkeit für entweder Poly(I:C)- oder JetPEI-Lösung zwischen 1 ml/min und 50 ml/min.
  • Im Allgemeinen weisen BO-11X-Präparate (insbesondere BO-112-Präparate) die folgenden Hauptmerkmale auf: farblos, keine sichtbaren Partikel eine Osmolarität zwischen 260 und 340mOsm/kg, ein pH zwischen 2,7 und 3,4, eine optische Drehung zwischen +1500 und +3750, ein Zeta-Potenzial gleich oder höher als 30 mV, eine monomodale Partikeldurchmesserverteilung mit Z-gemitteltem Durchmesser (nm) zwischen 30 und 150 nm, aber vorzugsweise zwischen 60 nm und 130 nm, und umfassend Poly(I:C)-Moleküle, wobei mindestens 40% oder 50% solcher doppelsträngiger Polyribonukleotide mit einer Größe von mehr als 0,85 Kb und mindestens 70% solcher doppelsträngiger Polyribonukleotide eine Größe zwischen 0,4 und 5 Kb haben. Merkmale wie Durchmesserverteilung der Partikel können durch Verwendung von T-Stück-Mischer in Kombination mit unterschiedlicher Fließgeschwindigkeit sowohl für Lösung 1 als auch Lösung 2 modifiziert werden. Liegt diese Geschwindigkeit über 20 ml/min (z. B. 30 ml/min), so wird die Trübung des resultierenden BO-112-Präparats parallel zur Verringerung des Z-gemittelten Partikeldurchmessers und der Durchmesserverteilung um diesen Wert verringert, während die Monomodalität beibehalten wird, möglicherweise auf Grund der Änderung des Strömungsregimes.
  • Das beispielhafte BO-112-Präparat zeigt eine Zusammensetzung ähnlich zu BO-111 (gebildet mit 6,924 mg Poly(I:C), 5,625 mM JetPEI, 5% Glucose), aber jedes Gefäß umfasst Partikel mit einem Z-gemittelten Durchmesser zwischen 45 +/- 5 nm und 81 +/- 5 nm (z. B. 73 +/- 5 nm), mit mindestens 50% der Partikel kleiner als 85 +/- 20 nm, dem Zeta-Potenzial von 38 mV und pH 3,1. Diese strukturellen Eigenschaften, die nach dem Gefrier-/Auftau-Zyklus bei -20 ° C oder extensiver Exposition bei Raumtemperatur erhalten bleiben, können in verschiedenen Chargen modifiziert werden, wobei die Akzeptanzkriterien innerhalb spezifischer Wertebereiche gehalten werden (zum Beispiel können BO-112-Formulierungen einen Z-gemittelten Durchmesser von 100 +/- 50 nm (z. B. 89 nm) mit einem Potential z zwischen etwa 40 und 45 mV (z. B. 43 mV) aufweisen. Diese Werte können nach Kryokonservierung modifiziert werden, aber sie können immer noch in diesen Bereichen verbleiben.
  • Zumindest einige solcher Reproduzierbarkeits- und Akzeptanzkriterien können mit denen anderer Poly(I:C)-haltiger Formulierungen verglichen werden, für die eine Antikrebsaktivität bekannt ist. Auf der Ebene der Poly(I:C)-Molekülgröße decken die Poly(I:C)-Moleküle, die in dem kommerziellen Lyovec-HMW und Lyovec-LMW enthalten sind, Größenbereiche ab, die sich deutlich von denen unterscheiden, die der BO-11X Herstellungsprozess tatsächlich nutzt (mit HMW fast vollständig über 0,85 kb und LMW fast vollständig unter 0,85 kb; 6A). Dieser Größenunterschied in Poly(I:C)-Molekülen kann von dem unterschiedlichen Herstellungsprozess und/oder Träger abhängen, der in den Komplexen mit Poly(I:C)-Molekülen assoziiert ist. Die Z-gemittelten Werte von Komplexen in Poly(I:C)-basierten Komplexen in Poly-ICLC (umfassend Polylysin und Carboxymethylzellulose) und LyoVec-HMW/LyoVec-LMW (nach dem Herstellers umfassend aus kationische lipidbasierte Transfektionsreagenzien Di-tetradecylphosphoryl-N,N,N-trimethylmethanaminiumchlorid oder DTCPTA und das neutrale Lipid 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin oder DiPPE) wurden mit dem von BO-112-Formulierungen verglichen und gezeigt, dass diese kommerziellen Formulierungen Komplexe enthalten, die viel größer sind (in der großen Mehrheit größer als 200 nm) und, zumindest für Lyovec-LMW, mit einer bimodalen Verteilung (6B).
  • Wenn diese Analyse nach einem Gefrier-/Auftau-Zyklus durchgeführt wird, erscheinen diese kommerziellen Präparate auch als weniger stabil, mit einer für BO-112 nicht beobachteten Variabilität (7A-D). In der Tat, wenn BO-112-Formulierung einen Z-gemittelten Durchmesser (d. nm) von 100 +/-50 nm (z. B. 82,5 nm), und ohne 400 nm zu überschreiten, wie in BO-111-Formulierungen (siehe 4 und 6B), LyoVec-basierte und Poly-ICLC-Formulierungen mit einem Z-gemittelten Wert deutlich über 300 nm, was bestätigt, dass kommerziell erhältliche Poly(I:C) als Präparate bereitgestellt werden, die entweder heterogen in der Zusammensetzung sind oder große Partikel umfassen, die funktionell schlecht charakterisiert sind und deren Größe während eines Gefrier-/Auftau-Zyklus verändert wird.
  • Hyperchromizität kann auch verwendet werden, um die BO-112-Formulierung auszuwerten, und insbesondere die Stabilität doppelsträngiger Poly(I:C)-Moleküle in Partikeln als Folge von Änderungen der Temperatur (oder anderer Bedingungen), die die Trennung zwischen Poly(I)-Strängen und Poly(C)-Strängen bestimmen. BO-112 Formulierung zeigt eine sehr geringen hyperchromatischen Effekt mit Unterschieden in der Durchlässigkeit bei 260 nm unter 0,2 oder 0,1. Die Stabilität gefrorener BO-11X-Gefäße bei -20 °C für unterschiedliche Zeit wurde ebenfalls bewertet und bestätigt.
  • Filtration, Lyophilisierung und Einfrieren von BO-112-Formulierung vor der Verabreichung fördert keine wesentlichen Modifikationen der zytotoxischen Eigenschaften, der Stabilität oder der strukturellen Merkmale auf den Partikeln in der Zusammensetzung verglichen mit der ursprünglichen BO-112-Formulierung. Zum Beispiel erhalten die Zusammensetzungen D90% unter 250 nm, Zeta-Potenzial zwischen 40 mV und 50 mV, hydrodynamischen Durchmesser mit einem Z-Durchschnitt zwischen 30 und 150 nm, Kompatibilität mit der Verwendung von Glucose als Hilfsstoff, Polydispersitätswerte zwischen 0,1 und 0,6, und andere anwendbare Kriterien aus der European Pharmacopoeia).
  • Somit sind BO-11X-Präparate, wie BO-112-Präparate, Formulierungen, die das hohe Maß an Stabilität und Reproduzierbarkeit für Partikel aufweisen, die durch Poly(I:C)-JetPEI-Komplexe mit einem Z-gemittelten Durchmesser (d.nm) unter 200 nm (wenn nicht unter 100 nm) gebildet werden, die bei kommerziellen Poly(I:C)-Formulierungen, die auf anderen Trägern und Herstellungsverfahren basieren, nicht beobachtet werden.
  • Beispiel 3: Funktionelle Charakterisierung von BO-11X-Präparaten in zellbasierten Modellen Materialien & Methoden
  • Poly(I:C)-Formulierungen
  • Die Poly(I:C)-Präparate wurden wie in Beispiel 2 beschrieben erhalten.
  • Analyse der Zelllebensfähigkeit
  • Die humane Melanomzelllinie SK-MEL-103 und die humane Bauchspeicheldrüsenkrebszelllinie PANC 02.03 wurden wie in Beispiel 1 und der hier zitierten Literatur beschrieben verwendet, wobei die Poly(I:C)-Formulierungen in Konzentrationen verwendet wurden, die Poly(I:C)-Moleküle in einem Bereich zwischen 0,3 und 2,5 µg/ml enthalten (wobei 0,85 µg/ml der relevanteste Referenzwert ist), und Zellen über einen Zeitraum zwischen 12 und 48 Stunden exponiert wurden.
  • Die Tod-induzierende Aktivität von BO-112 wurde in normalen Melanozyten und Zelllinien aus Melanom und Glioblastom getestet und mit isolierten Komponenten verglichen, d. h. Poly(I:C)-Molekülen und linearem PEI (Jet PEI; Polyplus). Normale Melanozyten wurden aus Vorhäuten von asymptomatischen Spendern isoliert. Melanomzellen SK-Mel-28, SK-Mel-103 und UACC62 (mit Mutationen in p53, NRAS bzw. BRAF) wurden aus etablierten Sammlungen am ATCC oder Memorial Sloan Kettering Cancer Center (USA) erhalten und waren einem Short-Tandem-Repeat- (STR-) Profiling zur Zelllinien-Authentifizierung unterzogen (System GenePrint® 10). Die Zellen wurden auf 96-Gefäß-Platten (6000 Zellen/Gefäß) ausplattiert. In Triplikat pro Experiment, mit. Poly(I:C) allein, BO-110- oder BO-112-Formulierungen bei 0,5 oder 1 µg/ml für eine Behandlung von 24 Stunden oder 40 Stunden.
  • Ergebnisse
  • Beispiele 1 und 2 zeigen experimentelle Daten über die anfängliche Entwicklung und Charakterisierung von BO-11X-Formulierungen, die zu einer erhöhten Zytotoxizität von BO-11X-Formulierungen gegen Krebszellen im Vergleich zu BO-110 führten. Diese Daten können weiter integriert werden durch Vergleichen des BO-11X-Herstellungsprozesses und resultierender Poly(I:C)-haltiger Zubereitungen mit den in der Literatur beschriebenen Prozessen und Präparaten.
  • Beispiel 2 hat gezeigt, dass kommerzielles Lyovec-HMW und Lyovec-LMW eine wesentlich unterschiedliche Verteilung aufweisen. Es kann jedoch bewertet werden, in welchem Ausmaß die unterschiedliche Größe von Poly(I:C)-Molekülen in den entsprechenden Poly(I:C)-HMW- und -LMW-Präparaten auch die Aktivität von Komplexen beeinflussen kann, die unter Verwendung des BO-11X-Herstellungsprozesses und Poly(I:C) HMW und LMW erzeugt werden. Wenn die zytotoxische Aktivität der BO-112 -Formulierung mit kommerziellen Formulierungen verglichen wird, erscheinen die letzteren viel weniger wirksam beim Abtöten von Krebszellen in mindestens zwei in-vitro-Modellen (8A und B). Die zytotoxische Aktivität von BO-11X kann in verschiedenen Typen von Krebszelllinien gemessen werden, die für verschiedene klinische Krebsindikationen repräsentativ sind, um zu bewerten, welche Krebsindikationen durch BO-11X wirksamer behandelt werden. Diese Effekte können auch untersucht werden durch Messen der Expression und/oder Sekretion von Proteinen, von denen bekannt ist, dass sie die zelluläre Antwort gegen Krebszellen modifizieren und möglicherweise verbessern. Zum Beispiel induziert eine BO-112-Formulierung, viel wirksamer als Poly-ICLC, Interferon-beta-Expression in einer Melanomzelllinie über einen Zeitraum von mindestens 24 Stunden (8C). Dieser in-vitro-Nachweis kann nicht nur verwendet werden, um auszuwerten, welche Krebstypen durch Verabreichung einer BO-11X-Formulierung wirksamer behandelt werden können, sondern auch, um auszuwerten, welche anderen Krebsbehandlungen (wie Impfstoffe, Adjuvantien, Antikörper, Chemotherapeutika, Strahlentherapie, Immuntherapie oder Inhibitoren enzymatischer Aktivitäten wie Kinasen) auf eine wirksamere Weise wirken, wenn sie in Kombination mit einer BO-11X-Formulierung verabreicht werden (z. B. durch Verringern der Dosierung, der Häufigkeit und/oder der Dauer der Behandlung mit diesem anderen Ansatz).
  • Tatsächlich wurde die Spezifität solcher zytotoxischen Wirkungen gegen Krebszelllinien, und nicht gegen normale primäre Zellen, durch BO-11X-Formulierungen (wie zuvor für BO-110-Formulierungen im LaborMaßstab beschrieben; Tormo D et al., 2009) in vitro bestätigt durch Vergleich der Aktivitäten mit geeigneten Verbindungen und Zellkontrollen (9). Weder lineare PEIL- noch Poly(I:C)-Moleküle allein beeinflussen die Lebensfähigkeit von Tumorzellen (Melanom oder Gliom) in signifikanter Weise. Nur wenn lineare PEI- und Poly(I:C)-Moleküle komplexiert werden, wird eine signifikante Abtötung von Tumorzellen beobachtet, ohne die Lebensfähigkeit normaler Melanozyten zu beeinträchtigen. Ähnliche zellbasierte Ansätze wurden zur Validierung der BO-11X, und insbesondere BO-112-Formulierung, verwendet, die Filtration, Lyophilisierung und/oder Gefrieren unterzogen wurden, was bestätigt, dass die zytotoxischen Wirkungen in BO-112-Präparaten nach solchen Prozessen qualitativ und quantitativ erhalten werden. Tiefergehende Analyse dieser in-vitro-Daten zur Lenkung der klinischen Entwicklung kann unter Verwendung verschiedener präklinischer Modelle durchgeführt werden, die die Herstellung und den Vergleich verschiedener BO-11X Formulierungen, verschiedene Verabreichungsregime und/oder Zustände umfassen, die mit einer Krankheit wie Krebs assoziiert sind.
  • Beispiel 4: Funktionelle Charakterisierung von BO-11X-Präparaten in Tiermodellen Materialien & Methoden
  • BO-11X-Formulierungen und andere Verbindungen
  • BO-112-Formulierungen wurden erhalten wie in Beispiel 2 beschrieben, und mit einer 5% Glucose-PBS-Lösung (Vehikel; Ref: BE14-516F, Lonza, Frankreich) zu drei verschiedenen Konzentrationen verdünnt, gemäß einer Dosierungsmenge pro Kilo Körpergewicht des Tieres von 0,05 mg/Kg, 0,5 mg/Kg bzw. 2,5 mg/Kg.
  • Muriner Anti-PD-L1-Antikörper (InVivoPlus, Klon 10F.9G2) wurde als Kombinationsimmuntherapie-Verbindung gewählt. An jedem Injektionstag in Mäuse wurde Anti-PD-1-Antikörper mit Vehikel zu Endkonzentrationen von 1,5 mg/mL verdünnt.
  • Ergebnisse
  • Die Antikrebs-, in-vivo-Wirksamkeit von BO-112-Formulierung wurde in vivo in einem immunkompetenten Mausstamm untersucht, in den Maus-Melanomzellen implantiert wurden. Die Mäuse wurden entweder mit einer PBS-Lösung oder einer BO-112-Formulierung in drei verschiedenen Konzentrationen (0,05, 0,5 oder 2,5 mg/kg, vorzugsweise intratumoral verabreicht) in Kombination mit einem murinen Anti-PD-L1-Antikörper (vorzugsweise intravenös verabreicht) behandelt und mit dem Vehikel allein über 3 Wochen verglichen (10A). Der Anti-PD-Ll-Antikörper in Kombination mit dem Vehikel erhöhte das Überleben im Vergleich zum Vehikel alleine nicht signifikant. Alle drei mit Anti-PD-L1 getesteten Kombinationen von BO-112-Formulierungen (und möglicherweise unabhängig von solchem Antikörper), erhöhten signifikant das Überleben der Mäuse im Vergleich zu Vehikel oder Anti-PD-L1 allein. Des Weiteren stieg das Überleben in der Kombination von 2,5 mg/kg BO-112-Formulierung + Anti-PD-Ll verglichen mit den niedrigeren Dosen der BO-112-Formulierung signifikant. Diese Ergebnisse korrelierten mit gemessenen Tumorgrößen in diesen Gruppen.
  • Anti-PD-L1-Antikörper ist ein wichtiges und validiertes Antikrebsmedikament und Mediator einer wirksamen Immunantwort gegen die Krebszellen. Unser Experiment zeigt, dass BO-11X-Komplexe in Kombination mit anderen Antikrebsmitteln verwendet werden können, und dass die Kombination von BO-11X-Verbindungen mit anderen Antikrebsmitteln wie Anti-PD1 eine überlegene Wirksamkeit gegenüber dem Antikrebsmittel allein aufweist und zu signifikanten Anstiegen des Überlebens und der Antitumorwirksamkeit führt. Des Weiteren korreliert die Verbesserung des Überlebens mit einer Zunahme der Dosis der BO-11X-Formulierung gegenüber der Kombination, was unterstützt, dass der zusätzliche Nutzen im Überleben durch die BO-11X-Formulierung vermittelt wird.
  • Somit können BO-11X-Formulierungen (allein oder in Kombination mit anderen Antikrebsmitteln, wie Antikörpern, Immuntherapie oder Chemotherapie, die unter Verwendung des gleichen oder eines anderen Wegs verabreicht werden können) bei der Behandlung von Melanom und anderen Krebsindikationen verwendet werden, insbesondere solchen, die eine peritumorale oder intratumorale Injektion erlauben, wie bei Bauchspeicheldrüsen-, Gebärmutterschleimhaut-, Eierstock- oder Kolorektalkrebs. In diesem Rahmen kann die Identifizierung spezifischer biologischer Signalwege und Wirkmechanismen die am besten geeigneten Dosierungen, Regime, Kombinationen mit anderen Medikamenten oder Therapien und Indikationen für BO-11X-Formulierungen leiten, wie gezeigt für kombinierte Wirkungen von immunmodulatorischen monoklonalen Antikörpern gegen PD-1 oder CD137 und Poly(I:C), die die Aktivität dendritischer Zellen verstärken (Sanchez-Paulete AR et al., 2015). Zu diesem Zweck offenbaren Duewell P et al., 2015, ein alternatives Tiermodell der Krankheit, das zum Testen der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
  • Die therapeutische Wirkung von BO-11X auf Tumorwachstum (lokal und/oder an distalen Orten) und die Antitumor-Immunantwort kann gemessen werden durch Durchführung von In-vivo-Studien über intratumorale (i.t.) Verabreichung über einen Konzentrationsbereich für Poly(I:C)-Moleküle (wie 0,5, 1, 2, 2,5 oder 5 mg/kg), um zu bewerten, wie eine solche Behandlung das Überleben von Mäusen in einem relevanten Modell, wie einem Maus-Melanommodell, verbessert, mit oder ohne gemeinsame Verabreichung eines weiteren Medikaments oder Impfstoffs. Gleichzeitig können Dosis-Wirkungs-Studien über spezifische biologische Aktivitäten, die durch BO-11X-Behandlung induziert werden, parallel ex vivo ausgewertet werden, unter Verwendung menschlicher oder tierischer Proben auf der Ebene von Apoptoseinduktion (durch Caspase-verwandtes Glow), Chemokin-/Zytokinsekretion in biologischer Flüssigkeit (z. B. Sekretion von IL-6 und IP-10), zelluläre Aktivierung und/oder Proliferation in vitro (z. B. assoziiert mit CD40-, CD86-, CD69-Hochregulation auf relevanten Zelltypen). Diese Studien können unter Verwendung von Zellen durchgeführt werden, die direkt an Krankheiten beteiligt sind (z. B. Tumorzellen, Epithelzellen, Endothel- oder Epithelzellen) oder indirekt beteiligt sind, da sie einige immunologische oder immunregulatorische Aktivitäten ausüben (z. B. humane mononukleäre Zellen des peripheren Bluts, NK-Zellen, B-Zellen, CD4+ / CD8+ T-Zellen, dendritische Zellen). Diese Studien können ferner mit der Identifizierung von Molekülen assoziiert sein, die als Biomarker verwendet werden können, um eine Reaktion auf BO-11X (oder dessen Fehlen) vorherzusagen, um Krankheitsstadien und/oder Patientenpopulationen für BO-11X-Behandlung zu stratifizieren.
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Claims (14)

  1. Eine wässrige Zusammensetzung umfassend ein oder mehr Partikel, wobei (a) jedes Partikel einen Komplex von mindestens einem doppelsträngigen Polyribonukleotid, oder ein Salz oder Solvat davon, und mindestens ein Polyalkylenimin, oder ein Salz und/oder Solvat davon, umfasst, wobei (i) das doppelsträngige Polyribonukleotid eine Polyinosin-Polycytidylsäure [Poly(I:C)] ist, wobei mindestens 60% des doppelsträngigen Polyribonukleotids mindestens 850 Basenpaare haben, mindestens 70% des doppelsträngigen Polyribonukleotids zwischen 400 und 5000 Basenpaare haben, und zwischen 20% und 40% des doppelsträngigen Polyribonukleotids zwischen 400 und 850 Basenpaare haben; und (ii) das Polyalkylenimin mindestens 95% lineare Polyethylenimine umfasst, wobei das durchschnittliche Molekulargewicht des linearen Polyalkylenimins zwischen 17 und 23 kDa ist und der Polydispersitätsindex < 1,5 ist, und wobei das Verhältnis der Anzahl von Molen von Stickstoff des Polyalkylenimins zu der Anzahl von Molen von Phosphor des doppelsträngigen Polyribonukleotids in der Zusammensetzung zwischen 2,5 und 5,5 ist; und (b) die Partikel einen z-gemittelten Durchmesser, gemessen nach ISO 22412, von zwischen 30 nm und 150 nm haben.
  2. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei mindestens 99% der Partikel eine monomodale Durchmesserverteilung unter 600 nm haben.
  3. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung ein Zeta-Potenzial von zwischen 35 und 50 mV hat.
  4. Die Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das lineare Polyalkylenimin ein wasserlösliches Homo-Polyalkylenimm oder ein Hetero-Polyalkylenimm ist.
  5. Die Zusammensetzung gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei die Polyribonukleotidzusammensetzung Polyinosin-Polycytidylsäure [Poly(I:C)] bei einer Konzentration von mindestens 0,5 mg/ml enthält.
  6. Die Zusammensetzung gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei die Zusammensetzung weiter (a) mindestens einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, organisches Lösungsmittel, Hilfsstoff und/oder Adjuvans; und/oder (b) mindestens eine Verbindung ausgewählt aus einer organischen Verbindung, einer anorganischen Verbindung, einer Nukleinsäure, einem Aptamer, einem Peptid und einem Protein umfasst.
  7. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung weiter Glucose oder Mannitol bei einer Konzentration von zwischen 1 und 10% Gewicht/Volumen der Zusammensetzung umfasst.
  8. Die Zusammensetzung gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei die Zusammensetzung weiter: (a) einen pH zwischen 2 und 4; und/oder (b) eine Osmolarität zwischen 200 und 600 mOsm/kg umfasst.
  9. Die Zusammensetzung gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei die Zusammensetzung gebildet wird durch Herstellen des Komplexes aus mindestens 0,5 mg Polyinosin-Polycytidylsäure [Poly(I:C)] pro ml des Gesamtvolumens der Zusammensetzung.
  10. Die Zusammensetzung gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei die Zusammensetzung gebildet wird durch zusätzliches Zugeben von Glucose oder Mannitol in einer Konzentration zwischen 1 und 10% Gewicht/Volumen der Zusammensetzung.
  11. Eine Zusammensetzung, erhalten durch Lyophilisierung der wässrigen Zusammensetzung gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch.
  12. Eine Zusammensetzung gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch zur Verwendung als ein Medikament, optional wobei das Medikament eine injizierbare, wässrige Zusammensetzung ist, optional weiter umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff und/oder Adjuvans.
  13. Die Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 zur Verwendung in der Behandlung einer Zellwachstumsstörung, die durch abnormales Wachstum menschlicher oder tierischer Zellen gekennzeichnet ist, wobei die Zellwachstumsstörung Krebs oder eine gynäkologische Störung, gekennzeichnet durch ein abnormales Wachstum von Zellen der weiblichen Säuger-Fortpflanzungsorgane, ist.
  14. Die Zusammensetzung zur Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei die Zusammensetzung durch intratumorale oder peritumorale Injektion oder durch Injektion in Haut oder ein inneres Organ oder Gewebe verabreicht wird.
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