JP2022507840A - ナノプレックス化ポリ（ｉ：ｃ）製剤及びその使用 - Google Patents

ナノプレックス化ポリ（ｉ：ｃ）製剤及びその使用 Download PDF

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Abstract

ナノプレックス化ポリ（Ｉ：Ｃ）製剤をより効率的に内在化することができ、したがって、かかる製剤によってより効果的に修飾される免疫細胞及び癌細胞を今回、新規の標識ナノプレックス化ポリ（Ｉ：Ｃ）製剤を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で特性評価する。細胞による開示の製剤の内在化は、特に癌を呈する被験体において、単独での又は他の薬物と組み合わせたナノプレックス化ポリ（Ｉ：Ｃ）製剤を有益に投与し、かかる患者に所望の治療結果を達成するのに好ましい経路及びレジメンの特定に加えて、特定の医学的適応症及び／又は被験体患者集団の規定を可能にする。【選択図】図１

Description

本発明は、ポリリボヌクレオチドとポリマーとの組合せによって形成される粒子を含む医薬製剤の検出、評価及び臨床使用の改善に関する。
ウイルスｄｓＲＮＡを模倣することが可能な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の合成類似体の使用、特に癌細胞成長を阻害し、癌細胞アポトーシスを誘導する目的で腫瘍に対する免疫系を特異的に活性化するそれらの役割が近年調査されている。特に、二本鎖ポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ）又はｐＩＣとして知られる）は、数種類の癌及びそれらの転移に対する様々な治療効果、免疫系活性化に依存して又はそれとは独立して達成される効果、ナチュラルキラー細胞及び／又は樹状細胞により媒介される活性、及び／又は腫瘍遺伝子発現及び細胞微小環境の変化をもたらすｄｓＲＮＡの一種として特徴付けられている。
ここ数年で、免疫調節特性及び／又は治療特性を有するポリ（Ｉ：Ｃ）分子の製剤化における著しい進展が報告されている。標的部分、担体ポリマー及び化学リンカーを含む又は含まないポリマーベースの微粒子中でポリ（Ｉ：Ｃ）分子を調製及び製剤化する方法が、様々な投与量、投与計画及び医学的適応症について開示されている。
薬物としてのポリ（Ｉ：Ｃ）分子の臨床開発は不利点を伴い、その厳しい規制要件への準拠は、キトサン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又はポリ－Ｌ－リジン等のカチオン性ポリマーをベースとすることが多い、癌療法のための薬物送達系と共にポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含む複雑な構造の抗癌複合体を作製することによって克服され得る。これらのポリマー系は、ポリプレックス系、又はより具体的にはナノプレックス系としても知られ、後者は薬物ナノ粒子と逆帯電した高分子電解質とによって形成される複合体に相当する（非特許文献１）。
ポリリボイノシン酸：ポリリボシチジル酸をベースとした生成物について記載されるポリプレックスの選択肢（非特許文献２）の中でも、ＰＥＩは、様々なレベルで修飾及び適合させることができるカチオン性ポリマーである、特に興味深いポリアルキレンイミンである。ＰＥＩと会合し、ＴＬＲ３、ＲＩＧ－Ｉ及び／又はＭＤＡ５アゴニストとして作用するポリ（Ｉ：Ｃ）分子の調製及び投与を伴う、このアプローチは、ＢＯ－１１０として知られる作用物質によって文献中に例示されている（非特許文献３、特許文献１）。ＢＯ－１１０生成物を製造する最初のアプローチは、高度に制御された均一なサイズ、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の高い濃度、及び強い腫瘍標的治療効果等の有益な生物活性を特徴とするナノプレックス粒子を提供するプロセスによって改善されている。この製造プロセス及び得られる医薬組成物（一般にＢＯ－１１Ｘと称され、ＢＯ－１１２として知られる一製剤によって例示される）は、特許文献２及び特許文献３に記載されており、ＢＯ－１１２の生物学的活性及び治療活性が様々な細胞ベースの系、動物モデル及び臨床研究において、特に腫瘍内注射によって試験されている。第一相研究では、ＢＯ－１１２は、固形腫瘍を呈する患者において単剤療法として、又は抗ＰＤ１遮断との併用療法として安全であることが見出された（非特許文献４）。
国際公開第２０１１／００３８８３号 国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７８０７８号 国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７９６８８号
Kadam, RN et al., 2015 Patel MC et al., 2014 Tormo D et al., 2009 Marquez Rodas I et al., 2018
しかしながら、これまで、ＢＯ－１１Ｘ製剤の前臨床及び臨床特性評価には、特定の条件、現在適用されている治療プロトコル及び／又は投与レジメンだけでなく、患者の特定の亜集団にも潜在的に治療上有用な薬物、例えば癌治療剤としてのＢＯ－１１Ｘの有効な医学的使用を確立する、根底にある作用機構、投与後の細胞局在化及び生体内分布、並びにヒト身体内の細胞との相互作用（主に細胞内在化による）の更なる特性評価が依然として必要とされている。実際、患者コンプライアンスと併せたＢＯ－１１Ｘの一般的臨床評価及び使用の改善に加えて、同等の臨床状態を有するが、癌治療、特に標準治療プロトコル（放射線療法等）、癌抗原を標的とする抗体、又は癌免疫療法への応答が異なる癌患者間で明確に規定された安全性の限界及び治療効果を有するＢＯ－１１Ｘ製剤の使用について、候補患者の分子プロファイル及び生物学的プロファイルと並行して、細胞型特異的なＢＯ－１１Ｘ相互作用、腫瘍及び他の組織の内部又は周辺での局在化、並びに任意の他の生理的効果を特性評価することが重要である。
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方、特に臨床状況での細胞特異的ＢＯ－１１Ｘ相互作用及び対応する治療効果の特性評価に関する。一実施の形態では、本開示は、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）及び／又は細胞質二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）センサー（ＲＩＧ－Ｉ又はＭＤＡ５等）のアゴニストとして作用することに加え、ＰＥＩ及び／又はポリ（Ｉ：Ｃ）分子内が、好ましくは蛍光色素で標識された（ＢＯ－１１ＸＬ製剤と称される）、治療用組成物として作用するＰＥＩ及びポリ（Ｉ：Ｃ）分子から形成される１つ以上の粒子の新規のナノプレックス化製剤に関する。
本発明は、好ましくは製剤を、特に腫瘍内に又は他のタイプの注射によって投与した後にＢＯ－１１Ｘ製剤を特徴付ける同様のタイプの複合体と相互作用する、組織又は器官（リンパ節、皮膚、又は肝臓若しくは肺のような内臓器官等）内の細胞の特定を可能にする、効率的に標識されたナノプレックス粒子を含むＢＯ－１１Ｘ製剤の使用を伴う。開示のＢＯ－１１ＸＬ製剤は、開示のナノ粒子と選択的に相互作用する免疫細胞及び癌細胞の局在化及び／又は数及び生物学的特徴の変化の特定及び追跡を可能にする。ＢＯ－１１ＸＬ及びＢＯ－１１Ｘ製剤は、特に腫瘍又はリンパ節内で、好ましくは細胞がヒト被験体を含む哺乳動物被験体に由来する場合に、かかる細胞に対して治療的に興味深い異なる生物学的効果（細胞マーカー、遺伝子発現又は生存性の変更等）を発揮し、及び／又は代替的な生物学的機構によりヒト身体内でのかかる細胞の活性を変更する。
これらの知見は、分析し、ＢＯ－１１Ｘ製剤により治療され、したがってナノプレックス化製剤と相互作用する細胞を呈する癌患者（又は治療の候補である癌患者）において観察された臨床読み出し情報又は治療効果と比較した場合に、癌抗原又は免疫チェックポイントに対する抗体等の薬物のより適切な投与量、投与レジメン又は投与方法によって特に利益を得る可能性があるものを含む、特定のタイプの癌又は癌を患う患者の集団を対象とする治療の間又はその前に、単独での又は第１の治療用組成物と従来の癌治療（標準治療及び／又は癌免疫療法等）を含む第２の治療剤との組合せでのＢＯ－１１Ｘ製剤の新規の臨床使用を有利に規定することができる。癌の治療のための投薬レジメンを決定する、かかる方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで生体サンプルにおけるナノプレックス粒子を含む製剤の効果を検出することを含む（癌患者から得られた細胞株、腫瘍生検標本又は血液サンプルを使用する）。
後者の場合は、ＢＯ－１１Ｘ治療（一次又は二次以降の治療として）の候補として特定される被験体が、特定のパラメーター（例えばバイオマーカー）を示し、及び／又は従来の標準治療の癌療法又は特定の癌抗原、免疫チェックポイント、細胞若しくは生物学的経路を標的とする癌療法に応答せず、小分子、ペプチド、抗体、細胞ベースの生成物、又は核酸等の異なる化学的性質の癌療法を要することから、かかる治療について選択されるか、又はＢＯ－１１Ｘ製剤で治療されるのが好ましいと特定され得る。
実際、ＢＯ－１１Ｘ製剤の上記の検証プロセスは、付加的にＢＯ－１１Ｘ製剤の特性評価をもたらすことができ、粒子、ＰＥＩ分子及び／又はポリ（Ｉ：Ｃ）分子の代替的なサイズ範囲を種々のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｅｘ ｖｉｖｏモデルを用いて試験し、癌細胞及び／又は免疫細胞に対して最も治療的及び／又は薬学的に適切な効果を与えるものを特定することで、ＢＯ－１１２製剤に加えて有用なＢＯ－１１Ｘ製剤が提供される。
本発明は、ＢＯ－１１Ｘ製剤の最適化された医学的使用、例えば特定のプロトコル及び／又は組合せに関して改善された癌治療の方法及びレジメン、特に癌抗原（ＣＤ２０又はＨｅｒ２等）及び／又は免疫チェックポイント（ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１等）に対する第２の治療剤としての抗体の投与を含む方法及びレジメン、ＢＯ－１１Ｘ治療に対する臨床応答をモニタリングし、かかる治療を適合させる方法、ＢＯ－１１Ｘ治療前に癌患者の潜在的臨床応答を評価する方法、又は癌を治療するか、若しくは特定の適応症における及び／又は特定の癌患者についてのＢＯ－１１Ｘ製剤を含む医薬組成物を改善する方法に更に関する。これらの方法は、上記患者から得られた適切な生体サンプル（好ましくは生検標本又は血液サンプル）及び一般に用いられる分析技術（フローサイトメトリー、ｉｎ ｖｉｖｏイメージング又はＥＬＩＳＡ等）を用いることによる最適化された投薬レジメンの決定を可能にする、ＲＥＣＩＳＴ、ｉｒＲＣ及び／又はＰＥＲＣＩＳＴ標準化基準の下で規定されるもの等の、かかる患者について決定される臨床応答の標準化評価基準との比較も含み得る。
本発明による新規の改善されたＢＯ－１１Ｘ製剤、使用及び方法に関する更なる実施形態を本明細書で以下の詳細な説明及び下記実施例において開示する。
標準ＢＯ－１１２（ＢＯ－１１２）又は蛍光標識されたＢＯ－１１Ｘ製剤（ＢＯ－１１ＸＬ）の生物物理学的特徴、細胞取込み及び効果の比較を示す図である。３つのＢＯ－１１Ｘ製剤である、非標識ＢＯ－１１２、ローダミンで標識されたポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含むＢＯ－１１ＸＬ（ＢＯ－１１ＸＬ ｐＩＣ：Ｒｈｏ）及びＣｙ５で標識されたＰＥＩ分子を含むＢＯ－１１ＸＬ（ＢＯ－１１ＸＬ ＰＥＩ：Ｃｙ５）を、極めて類似しているように見えるサイズ分布を含む一連の特徴について動的光散乱（ＤＬＳ）によって比較した（Ａ）。ＢＯ－１１ＸＬ（ｐＩＣ：Ｒｈｏ）製剤を、２つのマウス細胞株である、ＯＶＡトランスフェクトＢ１６由来黒色腫細胞株（Ｂ１６－ＯＶＡ；Ｂ）又はＤＣ２．４樹状細胞株（ＤＣ２．４；Ｃ）を用いて更に試験し、ＢＯ－１１ＸＬ（１μｇ／ｍＬ）の取込みを、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）及び陽性細胞のパーセンテージを経時的に追跡することによる生細胞に対するフローサイトメトリーによって評価した（ｔ＝５分、１０分、３０分及び６０分）。非処理細胞を閾値として使用し、各時点での陽性細胞のパーセンテージを算出した。細胞生存性に対する効果を、細胞培養培地中で１μｇ／ｍＬ ＢＯ－１１２との４８時間のインキュベーション後に、陰性対照として非処理細胞を使用してＭＴＳアッセイによって測定した（パネルＢ及びＣの右のグラフを参照されたい）。この細胞生存性分析が７２時間まで続行される場合、ＢＯ－１１２処理により細胞増殖がもたらされ、樹状細胞活性化が示唆される（Ｄ）。データを平均±ＳＤとして示す（ｎ＝３）。 種々の細胞培養モデルにおけるＢＯ－１１ＸＬ製剤の取込みの評価を示す図である。指定の細胞株の細胞培養物を、ＢＯ－１１ＸＬ（ｐＩＣ：Ｒｈｏ）を添加した培地中でインキュベートする。細胞のサンプルを７２時間にわたって種々の時点で単離し、標識された粒子の取込みによる蛍光強度中央値（ＭＦＩ）及び各サンプル中の標識された陽性細胞のパーセンテージを算出するフローサイトメトリーによって分析する（Ｂ）。フローサイトメトリーデータを、ＤＮＡ特異的蛍光プローブであるＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）により細胞核を青色に対比染色した後に細胞質中の典型的な赤色のローダミン蛍光シグナルを特定する、固定したＭＣ３８（大腸癌）及びＤＣ２．４（樹状細胞株）の共焦点顕微鏡法における免疫蛍光によって確認した。 動物モデルにおける腫瘍内注射後のｅｘ ｖｉｖｏでのＢＯ－１１ＸＬのリンパ取込みの検出を示す図である。モデルは、ＭＣ３８（大腸癌細胞）を各マウスの右脇腹の腋窩リンパ節の近くに注射することによって確立する（Ａ；マウス身体内での位置及び関連リンパ節の名称を示す）。ＭＣ３８に起因する腫瘍に注射したＢＯ－１１ＸＬ（ｐＩＣ：Ｒｈｏ）のｉｎ ｖｉｖｏ蛍光を、腫瘍自体（参照シグナルとして使用される）及び指定のリンパ節において２４時間～４８時間後に検出する（Ｂ）。並行して、ＣＤ４５＋細胞等の特定の免疫細胞（Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＣＤ４陽性細胞及びＣＤ８陽性細胞を含む）を各リンパ節から単離し、指定の時点で屠殺した動物における標識された細胞の数（左パネル）及び蛍光強度（右パネル）をフローサイトメトリーによってｅｘ ｖｉｖｏで評価することができる（Ｃ、近位リンパ節のみの詳細を含む）。 動物モデルにおける腫瘍内注射後のｉｎ ｖｉｖｏでのＢＯ－１１ＸＬのリンパ取込みの検出を示す図である。先の図面に記載される同じマウスモデルを用いて、蛍光をＢＯ－１１ＸＬ（ｐＩＣ：Ｒｈｏ）の腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射の１時間後、６時間後、２４時間後及び４８時間後にマウスにおいて側臥位（Ａ）又は外科手術後の開腹（open）仰臥位（Ｂ）のいずれかで検出する。後者の場合、腫瘍及び同側リンパ節において検出されるシグナルと、対側リンパ節でも検出される、より低いが依然として測定可能なシグナルとが比較される。各時点で測定されたシグナルを、いずれかの体位の注射マウスの代表的な画像と共にグラフに示す。 抗ＰＤ１（例えばペムブロリズマブ）又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の静脈内注射（抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１；０．１ｍｇ／回～１．０ｍｇ／回、例えば２００ｍｇ／回）等の癌免疫療法と組み合わせたＢＯ－１１Ｘ投与の代替的な方法及び投薬レジメンを示す図である。腫瘍内注射によるＢＯ－１１２製剤等のＢＯ－１１Ｘ製剤の投与（ＢＯ－１１２ ＩＴ；０．４ｍｇ／回～２．４ｍｇ／回）は、標準抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１プロトコルの開始前（Ａ及びＢ）又は標準抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１プロトコルと同時（Ｃ及びＤ）のいずれかのスケジュールで開始することができる。標準抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１プロトコルは、抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１を３週間に１回（ｑ３ｗ；パネルＡ及びＣ）又は２週間に１回（ｑ２ｗ；パネルＢ及びＤ）投与することによって行うことができる。腫瘍内注射によるＢＯ－１１２製剤の投与は、抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１も組合せで投与される毎週（又は毎日）行ってもよく、又は注射を特定の週に行わなくてもよい（例えば、パネルＢに示される例示的な投薬レジメンの１０週目、１８週目及び２２週目、又はパネルＤに示される例示的な投薬レジメンの７週目、１１週目、１９週目及び２３週目）。そうでなければ、腫瘍内注射によるＢＯ－１１２製剤の投与は、抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１を投与しない週に行ってもよい（例えば、パネルＣ及びＤに示される例示的な投薬レジメンの２週目）。各パネルのボックスに特定される具体的な投薬レジメンは、患者の臨床状態及び応答に応じて複数サイクル行うことができる維持投薬レジメンを表す（例えば、２回、３回又は４回繰り返される１２週間のサイクル；パネルＡ及びＢの１２週目～２３週目、パネルＣ及びＤの１３週目～２４週目を参照されたい）。図５に例示される投薬レジメンは、同じ病巣（依然として存在する場合）への注射、又は原病巣がもはや存在しない場合に（例えば全身性免疫活性化による）、若しくはバイオマーカー、癌抗原、免疫細胞の分析、又は臨床基準（例えば腫瘍負荷、腫瘍の病期、転移の量及び／又は腫瘍再発）によって規定される臨床応答等の他の臨床パラメーターを考慮して臨床医により評価されるように別の病巣への注射を含み得る。 腎細胞癌を患う被験体におけるＢＯ－１１２製剤の腫瘍内注射の効果を示す図である。注射腫瘍病巣及び非注射腫瘍病巣のサイズの減少（Ａ）は、免疫細胞集団の組み合わせ変動と関連付けられる（Ｂ）。注射（又は非注射）腫瘍病巣のサイズ等の臨床的に関連する効果と免疫細胞又は癌細胞の量、分布又はマーカーの変化等の生物学的特徴との比較により、有効性及び実際の治療の間又はその前にＢＯ－１１Ｘベースの癌治療に適用可能な代替投薬レジメンを規定することが可能となり得る。 Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇを用いて、ＢＯ－１１２及び抗ＰＤ－１抗体による治療後に最良効果（best response）としてＰＲ（部分奏効（Partial Response））又はＳＤ（病勢安定（stable disease））を有していた患者に由来する腫瘍サンプルと、最良効果が病勢進行（効果なし）であった患者に由来するサンプルとを比較した場合の遺伝子発現の変化を表すボルケーノプロットである。３回のＢＯ－１１２治療後に採取した腫瘍サンプルにおける遺伝子発現を、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ技術を用いて評価した。遺伝子発現についてのＢＯ－１１２腫瘍内注射の評価は、インターフェロンγ又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）媒介性細胞傷害に関連するもの等の様々な治療的に適切なシグナル伝達経路又は免疫応答と関連することが知られる遺伝子のカテゴリーに焦点を合わせたものであった。ボルケーノプロット中に示される遺伝子に加えて、統計的に有意な（Ｐ＜０．００５）発現の上方調節が特定された他のヒト遺伝子としては、遺伝子Ｓ１００Ａ８（Ｓ１００－Ａ８、カルグラニュリン－Ａ）、ＲＲＡＤ（ＧＴＰ結合タンパク質ＲＡＤ）、ＣＸＣＬ１３（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１３）、ＳＰＩＮＫ５（セリンプロテアーゼ阻害剤Ｋａｚａｌ型５）、ＣＣＬ２１（Ｃ－Ｃモチーフケモカイン２１）、ＧＮＬＹ（グラニュライシン）、ＣＸＣＬ９（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン９）、ＳＬＡＭＦ１（シグナル伝達リンパ球活性化分子）、ＴＮＦＲＳＦ１７（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７、ＣＤ２６９）及びＣＣＬ１９（Ｃ－Ｃモチーフケモカイン１９）が挙げられる。同様に、統計的に有意な（Ｐ＜０．００５）発現の下方調節が特定された他のヒト遺伝子としては、ＣＤ３６（血小板糖タンパク質４）及びＡｐｏＥ（アポリポタンパク質Ｅ）が挙げられる。 癌患者においてＢＯ－１１２製剤等のＢＯ－１１Ｘ製剤を評価及び使用する代替的なアプローチを示す図である。（Ａ）一次又はそれ以降の治療としての単剤療法でのＢＯ－１１２等のＢＯ－１１Ｘ製剤の効果的な投与に適格な癌患者を評価するための医学関連の読取りをまとめたフローチャート。ＢＯ－１１Ｘ投与の前に、癌細胞若しくは免疫細胞の特定の（亜）集団の存在若しくは非存在、並びに突然変異、下方調節、又は抗原提示に関与する遺伝子及び経路（Ｂ２Ｍ又はＮＬＲＣ５等）の発現及び／又は活性レベルの他の変化、又は交差提示樹状細胞（ＣＤ１４１陽性ＤＣ等）の存在及び／又は活性を測定することによって候補癌患者の適格性を決定することができる（右上のボックスを参照されたい）。これらの特徴は、これらの候補患者における他の代替的な自然免疫アゴニスト（ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ６アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト又はＳＴＩＮＧアゴニスト等）の代わりのＢＯ－１１Ｘ製剤の好ましい使用の予測に適している場合もある。医学的状態のフォローアップは例えば、標準化評価基準（ＷＨＯ基準、ＲＥＣＩＳＴ、ｉｒＲＣ又はＰＥＲＣＩＳＴとして規定されるもの等）を用いて癌治療における免疫関連応答基準である腫瘍負荷を特定及び測定する、及び／又は治療に対する応答又は再発を評価するための血液中の癌特異的バイオマーカーをモニタリングする理学的検査及びイメージング手法を用いて行うことができる。一連の下位基準を、サイトカイン（個別の又は特定の組合せのインターフェロン又はインターロイキン等）の発現及び／又はそれに対する応答の変更、又はマーカーの組合せによって規定される循環／浸潤免疫細胞を含む、生検により得られた腫瘍組織における及び／又は血液サンプルにおける特定のパラメーター又はバイオマーカーの評価を伴う３つの主要評価基準（すなわちフローチャートの下部のボックス）の各々と関連付けることができる。（Ｂ）別の抗癌剤（特にチェックポイント阻害剤、すなわちＣＰＩ）と組み合わせたＢＯ－１１２製剤の腫瘍内注射等のＢＯ－１１Ｘ製剤の投与後に（場合によっては、その前又はそれと同時に開始される）利用可能な治療機会をまとめたフローチャート。これらのアプローチ（右上のボックスを参照されたい）により、先のフローチャートで規定される読取り（ＢＯ－１１２投与の前及びその後に特定の細胞又は組織における遺伝子発現、タンパク質発現、突然変異負荷状態又はＴ細胞クローン性の分析から得られる読取り等）に加えて、ＢＯ－１１Ｘ製剤と組み合わせて投与される薬物の治療効果に適切な薬理学的又は生物学的特徴（腫瘍生検標本における関連細胞表面受容体の陽性率、例えばＰＤ－Ｌ１を発現する細胞のパーセンテージ及び／又は細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現レベルの変化のスコアリング等）を比較することができる。この複合分析は、併用治療レジメンへの癌患者の適格性を決定し、併用治療の有効性を予測し、及び／又はかかる他の制癌剤と組み合わせたＢＯ－１１Ｘ製剤の投与前に患者の腫瘍が殆ど反応しない、耐性を示す又は非感受性であることが特定された他の付加的な治療又は介入（例えば放射線療法、化学療法、抗ＰＤ－１又は別の免疫賦活療法、癌ワクチン接種、養子細胞移入等）を使用する可能性を含む、同じ若しくは異なるＢＯ－１１Ｘの投薬レジメン及び／又は併用制癌剤治療、又は異なるタイプの医学的フォローアップの継続を示し得る（フローチャートの下部のボックスを参照されたい）、併用治療に関連する分子シグネチャーを特定する手段をもたらす。
本発明は、単剤療法としてのＢＯ－１１Ｘ製剤の効果の検出及び臨床使用を改善する手段を評価するために、又は臨床状況において、特に癌治療若しくはワクチン接種用途に有用な併用投薬レジメン及び／又は他の治療製剤の一部として治療的に利用することができる、新規のＢＯ－１１Ｘ製剤によってもたらされるｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞特異的相互作用及び効果に関する。本明細書で提供される、これらの改善は、ＢＯ－１１２製剤等のＢＯ－１１Ｘ製剤で治療された患者から得られた生体サンプルの分析後に、またＢＯ－１１Ｘナノプレックス粒子が効率的に標識されたＢＯ－１１Ｘ製剤（本明細書でＢＯ－１１ＸＬ製剤と規定される）の調製によって観察された。ＢＯ－１１Ｘ製剤の治療的に適切な特性を、ポリ（Ｉ：Ｃ）及び／又はＰＥＩの特徴を変更することによって適切に評価するか、又は必要に応じて予測することができ、より望ましい癌特異的及び／又は免疫特異的効果を、種々のＢＯ－１１Ｘ製剤を用いて得ることができるように、ＢＯ－１１ＸＬ製剤を細胞ベースのモデル又は動物モデルで、特に細胞生存性及び／又は細胞型分布に関して試験することができる。ＢＯ－１１Ｘ製剤のかかる生物学的効果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで種々の起源の細胞株のパネルにおいて（これにより細胞型特異的効果を決定することができる）又はｉｎ ｖｉｖｏ／ｅｘ ｖｉｖｏで動物モデルにおいてＢＯ－１１ＸＬ製剤の投与後に（生物学的応答のパターンを規定する）、検出及び比較することができる。
本明細書に記載されるＢＯ－１１ＸＬ製剤は、ＢＯ－１１２製剤等の以前のＢＯ－１１Ｘ製剤の特徴と同等の生物学的及び生物物理学的特徴を呈し、ＢＯ－１１ＸＬ製剤中に存在するナノプレックス粒子と選択的に相互作用する細胞、特に免疫細胞及び癌細胞の定性的及び定量的の両方の評価を可能にする。細胞調製物、組織、器官、動物、オルガノイド、ヒト若しくは臨床サンプル（生検標本、血液又は血漿調製物等）、又は病変（癌又はウイルス感染等）を示す他の生体サンプル若しくは抽出物をＢＯ－１１ＸＬ製剤に曝露することで得られるデータの分析により、開示のＢＯ－１１Ｘ製剤がかかる細胞に対して発揮する活性（例えばアポトーシス、自食作用、活性化、増殖等）又はかかる細胞が後にヒト身体内（腫瘍内、リンパ節内、血液中等）で発揮する活性の直接的な結果であるか、又はそれと関連する明らかな生物学的標的及び効果を規定することが可能になる。ＢＯ－１１ＸＬ製剤の生物学的効果は、様々な生理学的基準（例えばケモカイン、サイトカイン、インターフェロン等の分泌の組合せ、又は特定の細胞表面受容体若しくは転写因子の発現の変化）を用いて検出及び規定することができる。かかる知見により、並行して又は同等の状況においてＢＯ－１１Ｘ製剤で治療された（又は治療の潜在的候補である）癌モデル又は患者における臨床効果又は治療効果と比較した場合に、有利には、治療の過程で又は治療前に、単独での又は抗癌剤（標準治療、癌抗原に対する抗体、又は癌免疫療法等）若しくは抗原（ヒト又は非ヒト抗原、例えばワクチン接種における抗原）を含む他の薬物と組み合わせたＢＯ－１１Ｘ製剤による治療から利益を得る可能性がある新規の臨床使用、治療方法及び投薬レジメンの特定が可能となる。
特に、本発明は、所与の病変（すなわち、その病態生理、転移特性、位置、病期等による特定のタイプの癌、又は特定のワクチン接種アプローチ）、候補患者の集団（すなわち過去の治療、現在行われている標準治療又は他の治療、免疫プロファイル、コピー数の変化、感染のタイプ、関連遺伝子の遺伝子突然変異又は活性化によって規定される）、及び／又は他の薬物（チェックポイント阻害剤、癌抗原を標的とする抗体、癌ワクチン、非ヒト抗原又は養子細胞療法等）との組合せに適切なＢＯ－１１２製剤等のＢＯ－１１Ｘ製剤の投与から利益を得る可能性がある治療方法及び医学的レジメンの規定を可能にする。加えて、本発明は、特定のタイプの治療用化合物により治療された（又は治療の候補である）患者が、かかる治療用化合物が治療的に活性となる機構が非効果的であるか又はそうでなければ非効率的であるために、好ましくはＢＯ－１１Ｘ製剤で治療され得るかを規定する手段も提供する。臨床的に関連するモデルにおけるＢＯ－１１ＸＬ製剤が発揮する効果及び／又はかかる他の治療用化合物を用いた場合のＢＯ－１１Ｘ製剤の効果の比較により、有利には、現在の細胞、腫瘍、及び／又は患者の全体的な病理学的又は免疫学的状態の特定が可能となり、かかる患者がＢＯ－１１Ｘベースの治療に選択的かつ肯定的に反応することが示される。かかる比較は、所与の患者又は患者の亜集団、及び／又は疾患の病期若しくはタイプ（概して癌又は感染において規定されるもの）により更に適合し得る投薬レジメン（複数の場合もある）（すなわち単剤療法又は薬物の併用）の決定にも有益であり得る。
これらの代替的な新規の治療投薬レジメンは、血流への（それにより種々の組織が製剤に曝露され得る）又は特定の生理学的位置での、例えば器官、皮膚、及び／又は癌病巣等の変化した病理学的組織への直接的な注射によるＢＯ－１１Ｘ製剤の投与を含み得る。この後者の場合、ＢＯ－１１Ｘ製剤の投与は、同じ病巣（依然として存在する場合）、又は原病巣がもはや存在しない場合に（全身性免疫活性化又は他の機構による）、若しくはバイオマーカー、遺伝子発現シグネチャー、癌抗原、免疫細胞の分析、若しくは臨床基準（例えば腫瘍負荷、腫瘍の病期、転移の量及び／又は腫瘍再発）によって規定される適切な臨床応答等の他の臨床パラメーターを考慮して臨床医により評価されるように別の病巣で行うことができる。投薬レジメン及び治療過程をどのようにＢＯ－１１Ｘ製剤を要する単剤療法又は薬物併用治療のいずれかに適合させ得るかについての更なる詳細を図８に示す。さらに、臨床治療法の評価及び／又は管理を担う関連の機関（ＦＤＡ、ＥＭＡ、ＷＨＯ及びＩＣＬＩＯ等）は、近年概説されるように（Rossi S et al., 2017、Subbiah V et al., 2017、Eleneen Y and Colen RR, 2017）、全般的な又は特定の薬物（例えば免疫療法）、特定の技術（例えばＰＥＴ及びイメージング）及び／又は特定のタイプの癌（例えば固形癌）についての癌患者における薬物治療に対する応答を評価する一連の基準を提供している。
効果的な治療薬の組合せの最初の例は、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（ＴＬＲアゴニスト）、及び臨床開発中であるが、その活性がＢＯ－１１２製剤等のＢＯ１１Ｘ製剤の治療活性に無関係なインターフェロンベースの機構に依存する他のＴＬＲリガンドの投与を含み得る。かかる作用物質のいずれかに耐性を示す又は非感受性の患者は、好ましくは、単独での又は別の薬物（例えばチェックポイント阻害剤）と組み合わせたＢＯ－１１Ｘ製剤によって治療され得る。かかるＴＬＲリガンド又はアゴニストの例としては、小分子、抗体、又はＴＬＲ９アゴニストである核酸ベースの化合物（ＣｐＧベースの核酸等）、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ６アゴニスト、及び／又はＴＬＲ８アゴニストが挙げられる（Smith S. et al. 2018に公表された癌免疫療法について臨床開発中のＴＬＲアゴニストの概説を参照されたい）。
治療的組合せの別の例は、癌免疫療法薬としての有効性が、かかる薬物の既存のレジメン（抗体の定期的な静脈注射を伴う）をＢＯ－１１２製剤等のＢＯ－１１Ｘ製剤（好ましくは１つ以上の腫瘍病巣に、１回又は複数回腫瘍内注射される）の投与を含めることで変更することによって改善することができる（又は単に可能となる）抗ＰＤ－１及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体（抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１）の投与を含み得る。図５にも示されるように、開示のＢＯ－１１２製剤は、標準抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１臨床プロトコルの開始前又は抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１プロトコルと同時に（すなわち、抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１を３週間に１回又は２週間に１回投与することによる）開始することができる。特に腫瘍内注射によるＢＯ－１１２製剤の投与は、抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１抗体も投与する場合に毎週（又は毎日）行うことができる。代替的には、投薬レジメンは、１回の治療（ＢＯ－１１Ｘ腫瘍内注射又は抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１静脈注射のいずれか）しか行わない特定の週を含んでいてもよい。投薬レジメンは、２つの薬物を数週間（例えば８週間、１０週間、１２週間又はそれ以上）にわたって代替的に又は同時に投与する維持サイクルを含んでいてもよく、かかるサイクルは２回、３回、４回又はそれ以上繰り返される。
ＢＯ－１１Ｘ治療（一次又は二次以降の治療として）に適切な候補と特定される癌患者は、臨床パラメーター及び／又はバイオマーカーの適切な組合せを呈し、及び／又は標準治療の癌療法（放射線療法又は化学療法等）又は特定の癌抗原、免疫チェックポイント、細胞若しくは生物学的経路を標的とする薬物に応答しないことから、かかる治療に選択される（又は除外される）か、又はＢＯ－１１Ｘ製剤による治療が好ましいと特定され得る。これらの薬物は、小分子（例えばキナーゼ又は他の酵素の阻害剤）、ペプチド（癌ワクチン等）、抗体（例えばＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４又はＣＤ２０に対する）、細胞ベースの生成物（例えば養子細胞移入）、又は核酸（例えばＴＬＲ９又は他の受容体を標的とする、ＤＮＡベクター）等、化学的性質が異なり得る。癌抗原に対する抗体に関して、例示的な抗原は、特に固形腫瘍の治療のための標的化細胞表面タンパク質に加えて、ＥＭＡ（欧州）又はＦＤＡ（米国）を含む規制当局によって認可され（又は検証及び再検討中の）、ＢＯ－１１Ｘ製剤を含むアジュバント様活性及び免疫刺激活性を有する医薬組成物との併用投与によって改善され得る治療活性及び／又は臨床使用を特徴とする抗原である。かかる抗原の例は、ＰＤＧＦＲα、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＡ、ＣＥＡ、ＣＤ４０及びＣＤ２５である（Corraliza-Gorjon I et al., 2017）。
本発明は、組成物の成分、組成物の製造、組成物の生物物理学的特徴及び生物活性、並びに他の基準に関して特許文献２及び特許文献３に開示されている、ナノプレックス粒子を含む医薬組成物に適用可能な使用及び方法に更に関する。特に、本発明に従って使用されるＢＯ－１１Ｘ製剤は、粒子を含む組成物であって、（ｉ）各粒子が少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくは溶媒和物と、少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩及び／又は溶媒和物との複合体を含み、（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９５％又は少なくとも９０％が６００ｎｍ以下、好ましくは３００ｎｍ以下（例えば１４０ｎｍ～２５０ｎｍ）の直径を有し、かつ（ｉｉｉ）上記粒子が、特にＩＳＯ ２２４１２：２０１７に準拠して（又はこのＩＳＯ標準のその後の改訂を用いて）測定され、２００ｎｍ以下、好ましくは１５０ｎｍ以下のｚ－平均直径を有する、組成物に関する。
好ましい実施形態では、本発明に従って使用されるＢＯ－１１Ｘ製剤は、粒子を含む水性組成物であって、（ｉ）上記粒子の各々が少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくは溶媒和物と、少なくとも１つの線状ポリアルキレンイミン又はその塩及び／又は溶媒和物との複合体を含み、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドがポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））であり、線状ポリアルキレンイミンの平均分子量が１７ｋＤａ～２３ｋＤａであり、（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９０％が３００ｎｍ未満の単峰性直径分布を有し、（ｉｉｉ）上記粒子が、ＩＳＯ ２２４１２：２０１７に準拠して測定される、２００ｎｍ以下のｚ－平均直径を有し、かつ（ｉｖ）上記組成物が、ＩＳＯ １３０９９－２：２０１２に準拠した、３０ｍＶ以上、好ましくは３５ｍＶ～５０ｍＶのゼータ電位を有する、水性組成物に関する。
更に好ましい実施形態では、本発明に従って使用されるＢＯ－１１Ｘ製剤は、粒子を含む水性組成物であって、（ａ）各粒子が、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくは溶媒和物と、少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩及び／又は溶媒和物との複合体を含み、該二本鎖ポリリボヌクレオチドがポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））であり、該二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも６０％が少なくとも８５０個の塩基対を有し、該二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも７０％が４００個～５０００個の塩基対を有し、該二本鎖ポリリボヌクレオチドの２０％～４５％が４００個～８５０個の塩基対を有し、上記ポリアルキレンイミン少なくとも９５％のポリエチレンイミンを含み、該ポリアルキレンイミンの平均分子量が１７ｋＤａ～２３ｋＤａであり、多分散指数が１．５以下であり、上記組成物中の上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率が２．５～５．５であり、かつ（ｂ）上記粒子が、ＩＳＯ ２２４１２：２００８に準拠して測定される、３０ｎｍ～１５０ｎｍのｚ－平均直径を有し、かつ（ｃ）上記粒子の少なくとも９９％が６００ｎｍ未満の直径分布を有する、水性組成物に関する。
後者のＢＯ－１１Ｘ製剤の実施形態の組成物では、含有する粒子の少なくとも９５％が４００ｎｍ以下の直径を有する。さらに、この組成物は、ＩＳＯ １３０９９－２：２０１２に準拠して（又はこのＩＳＯ標準のその後の改訂によって）測定される、３５ｍＶ～４５ｍＶのゼータ電位を有する。この組成物中のナノプレックス粒子は、好ましくは水溶性の線状ポリアルキレンイミンであるポリエチレンイミンを含有し、組成物中のポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））のリンのモル数に対する線状ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率は、２．５～３．５である。
本発明はまた、粒子を含むＢＯ－１１Ｘ製剤に適用可能な使用及び方法であって、（ｉ）上記粒子の各々が、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくは溶媒和物と、少なくとも１つの線状ポリアルキレンイミン又はその塩及び／又は溶媒和物との複合体を作製することによって形成され、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドがポリ（Ｉ：Ｃ）分子であり、上記線状ポリアルキレンイミンの平均分子量が１７ｋＤａ～２３ｋＤａであり、（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９０％が３００ｎｍ未満の単峰性直径を有し、上記粒子が、ＩＳＯ ２２４１２：２０１７に準拠して測定される、２００ｎｍ以下のｚ－平均直径を有し、かつ（ｉｉｉ）上記組成物が、ＩＳＯ １３０９９－２：２０１２に準拠した、３０ｍＶ以上、好ましくは３５ｍＶ～４５ｍＶのゼータ電位を有し、上記粒子が、上記組成物中の上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率が２．５以上で形成される、使用及び方法にも関する。
本発明は、２～４のｐＨ、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ～６００ｍＯｓｍ／ｋｇの重量モル浸透圧濃度、３５ｍＶ～４０ｍＶ又は４０ｍＶ～４５ｍＶのゼータ電位（ＩＳＯ １３０９９－２：２０１２に準拠する）、及び組成物の総体積に対して０．５ｍｇ／ｍＬ以上の１つの二本鎖ポリリボヌクレオチドの濃度等の水性組成物において測定される特徴に基づいて更に規定され得るＢＯ－１１Ｘ製剤の使用にも関する。これらのＢＯ－１１Ｘ製剤は、上で規定した基準及び特徴に従う水性組成物の凍結乾燥及び再構成後に使用することができる。
本発明の方法及びレジメンにおいて使用される、提供されるＢＯ－１１Ｘ製剤の更に好ましい組成物は、本明細書に開示されるナノプレックス粒子に適用可能なサイズ範囲に関して、特許文献２及び特許文献３に記載されている。これらの組成物は、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の量及びサイズに基づいて更に規定することができ、特に、（ｉ）上記粒子に含まれる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも４０％が少なくとも８５０個の塩基対を有し、上記粒子に含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）分子の少なくとも５０％が４００個～５０００個の塩基対を有し、及び／又は（ｉｉ）ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の５％～６０％が４００個未満の塩基対を有し、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の１５％～３０％が４００個～８５０個の塩基を有し、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の１０％～７０％が８５０個～５０００個の塩基対を有し、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の０％～１０％が５０００個超の塩基対を有する。
特許文献２及び特許文献３に記載されているように、これらの組成物は、特に所望の使用及び方法に最適かつより再現可能な成分の組合せ、物理的及び／又は化学的基準、及び関連の数値範囲（粒子又は組成物のいずれかに適用可能）を特定することによって、医薬品製造及び臨床使用について首尾よく最適化されており、例えば（ａ）上記粒子が７５ｎｍ～１５０ｎｍの中位径（Ｄ５０％）を有し（好ましくは少なくとも８５±２０ｎｍの中位径を有する）、（ｂ）上記粒径の多分散指数が０．２～０．３に含まれ、かつ（ｃ）組成物が３．０±０．２のｐＨ及び３００ｍＯｓｍ／ｋｇ～３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量モル浸透圧濃度を有する。
加えて、本発明は、ポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））及び／又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が蛍光標識されたナノプレックス粒子を含有する組成物、例えば本明細書に開示されるＢＯ－１１Ｘ製剤又は組成物に更に関する。蛍光標識（又は蛍光色素）は、かかる粒子成分の修飾に使用される任意の市販の標識であってもよく、両方の粒子成分が標識される場合、蛍光標識は、ポリ（Ｉ：Ｃ）とＰＥＩ分子とで励起波長及び／又は発光波長に関して異なっていてもよい。標識剤として使用することができる蛍光基の例は、関連の技術情報及びかかる標識調製物を生成するためのキットと共に、様々な商業供給業者（例えばMirus Bio LLC、Chroma、IDT、LumiProbe又はSigma）から入手可能である。ナノプレックス粒子のポリエチレンイミン成分の標識に有用な好ましい蛍光色素は、Ｃｙ５である。ナノプレックス粒子に含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）分子の標識に有用な好ましい蛍光色素は、ローダミンである。
今回開示する実施例は、特許文献２及び特許文献３に開示されているプロトコル及び方法に従って別個に調製された後、標識ＢＯ－１１Ｘ製剤（ＢＯ－１１ＸＬ）の調製に使用され、それに記載されるＢＯ－１１Ｘ製剤と同等の生物物理学的及び生物学的特徴を有する蛍光標識成分及び非標識成分の適切な組合せについての更なる詳細を示す。ＢＯ－１１ＸＬ製剤は、様々なパーセンテージの標識ナノプレックス粒子（例えば、製剤と共に少なくとも１％、５％、１０％、２０％、５０％、７０％、９０％又はそれ以上のナノプレックス粒子）を含み得る。ＢＯ－１１Ｘ及びＢＯ－１１ＸＬ製剤は、別個に作製し、任意の適切なモデルを用いて比較するか、又は適用可能な場合、実際にモデルで使用する前に様々な比率の組合せで混合することができる（例えば、１：１又はいずれかの製剤がより多量に存在する）。例えば、ＢＯ－１１ＸＬ製剤は、使用前に僅かなパーセンテージ（２０％、１０％、５％、１％又はそれ以下）をＢＯ－１１Ｘ製剤に添加することでＢＯ－１１Ｘ製剤中のトレーサーとして使用することができる。
ＢＯ－１１Ｘ製剤と同様、ＢＯ－１１ＸＬ製剤は、粒子自体に含まれるか、又は水性組成物に添加される、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバント、例えば１％～１０％（重量／体積）の濃度で添加されるグルコースを更に含み得る。他のタイプのＢＯ－１１Ｘ製剤が特許文献２及び特許文献３に記載されている。本組成物は、粒子（ＢＯ－１１ＸＬｍ製剤を形成する）中に含まれ得る少なくとも１つの化合物、特に治療用化合物、例えば有機化合物、無機化合物、核酸（例えば、ノンコーディングＲＮＡ又はタンパク質をコードするＲＮＡ）、アプタマー、ペプチド又はタンパク質を更に含み得る。
今回開示される実施例では、特許文献２及び特許文献３に記載される医薬組成物に含まれるもののようなナノプレックス粒子を内在化することが可能な癌細胞、免疫細胞又は他の細胞を規定するために、ＢＯ－１１ＸＬ製剤を細胞ベースのモデル（細胞株、初代細胞調製物又は共培養系、例えばオルガノイドを用いる）、動物モデル（例えば悪性腫瘍病理学及び癌治療の関連研究）、及び／又はｅｘ ｖｉｖｏモデル（腫瘍生検標本、ＰＢＭＣ又は血漿サンプルを含む）に使用することができる方法が実証され、ＢＯ－１１Ｘ製剤の治療的使用に適切な生物学的特徴が示される。これらのモデルにおいてＢＯ－１１Ｘ及び／又はＢＯ－１１ＸＬ製剤を用いて決定され得る例示的な生物学的特徴としては、細胞傷害、壊死、分化、アポトーシス、自食作用、（不）活性化、特定の組織若しくは器官の外側若しくは内側への移動、増殖、又はかかる細胞が後にヒト身体内（腫瘍内、リンパ節内、血液中等）で、若しくは代替的な機構（例えばケモカイン、サイトカイン、インターフェロン等の分泌の組合せ、又はエピジェネティクス若しくはＤＮＡ修復に関与する特定の細胞表面受容体、転写因子若しくは酵素の発現の変化）によって発揮する他の特徴が挙げられる。細胞ベースのモデル又は動物モデルにおいてかかる機構を検証する例示的なモデルが特許文献２、特許文献３、及び本明細書の実施例に記載されている。特に、ＢＯ－１１ＸＬ製剤は、ＢＯ－１１Ｘ製剤が、例えば細胞型の特性に独自の方法で影響を及ぼすことで種々の細胞型（癌細胞及び免疫／間質細胞等）によって内在化し得ることの実証を可能にするだけでなく、ＢＯ－１１ＸＬ製剤は、組成物を投与した位置とは異なる特定の位置、例えばリンパ節内で生物学的効果を発揮することが特定され、見出され得る。これらの観察結果は、単剤療法としての、又はリンパ節におけるＢＯ－１１Ｘ製剤の効果が臨床状況で有用であり得る併用療法でのＢＯ－１１Ｘ製剤の治療的使用を検証するのに有用である。
本発明は、ＢＯ－１１Ｘ製剤の投与（例えば、１週間以上にわたる１回以上の腫瘍内注射に続く１回以上の皮下、静脈内、節内（intra-nodal）又は筋肉内注射）及び／又は開示の組成物へのヒト細胞のｅｘ ｖｉｖｏ曝露の後の患者への細胞の再投与の種々の経路を組み合わせることができる医学的方法及び使用を更に提供する。加えて、ＢＯ－１１Ｘ及び／又はＢＯ－１１ＸＬ製剤に対する免疫応答を調査するように設計されたｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｅｘ ｖｉｖｏ研究から、直接的な（注射腫瘍内）又は遠位の腫瘍での腫瘍細胞死、局所及び／又は全身性Ｔ細胞免疫応答の増強等の治療的に適切な事象、及び再発性の、他の療法に応答しない又は難治性の癌の治療に有用であり得る他の機構を促進するために有益に利用することができる、代替的な生物学的機構（例えばインターフェロン非依存性及び／又は標的免疫細胞）を誘発し得る、ＢＯ－１１Ｘ（又はＢＯ－１１Ｘｍ）製剤の投与を含む投薬レジメン及び治療方法を示すことができる。特に二本鎖ポリリボヌクレオチドの含有量に対する組成物の用量は、各々の投与タイプ、投薬レジメン（例えば腫瘍内又は肝臓内注射で最も高く、皮下、節内又は筋肉内注射でより低く、ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞の治療で更に低い）、及び／又は他の薬物（別の薬物との併用療法又はワクチン接種治療レジメンにおける場合）に適合させることができる。
本発明の他の目的は、有効性、最適な投薬レジメン、別の抗癌剤又は標準治療プロトコルとの最適な治療的組合せ、及び／又はＢＯ－１１Ｘ若しくはＢＯ－１１Ｘｍによる治療に対して強い応答を示す被験体を評価する方法に関する。これらの方法は、ＢＯ－１１Ｘ組成物への曝露後の選択された細胞型（免疫細胞及び癌細胞等）の遺伝子パネルの発現における上方及び下方調節を測定することと、その結果として治療効果を改善する適切な手段を適用すること（例えば、更なる治療について患者を層別化又は選択する、特定の生物学的標的を標的とする薬物を投与する又は投与しない、及び／又はＢＯ－１１Ｘ及び／又は他の治療用組成物の投与量を減少又は増加させるため）とを含む。
ＢＯ－１１Ｘ製剤と１つ以上の薬学的に許容可能なそのアジュバント、希釈剤、担体又は賦形剤とを混合することを含む、ＢＯ－１１２（及び／又はＢＯ－１１Ｘｍ製剤、ＢＯ－１１ＸＬ製剤、ＢＯ－１１ＸＬ製剤又はＢＯ－１１２ｍ製剤等の他のＢＯ－１１Ｘ製剤）の医薬組成物を作製する方法も本明細書で提供される。かかる成分は、特定の医学的適応症（例えば固形癌又は血液癌）、及び／又は例えば注射（腫瘍周囲、腫瘍内、眼内、節内、肝臓内、膵臓内、筋肉内又は皮下注射）による、吸入による、局所的な又は経口での投与手段に適合させることができる。本発明に従って使用することができるＢＯ－１１Ｘ製剤の塩、医薬組成物及び用量に関する付加的な実施形態は、特許文献２、特許文献３、及びRemington's Pharmaceutical Sciences (edited by Allen, Loyd V., Jr; 22nd edition, 2012)等の参照文献に記載されている。ＢＯ－１１Ｘ製剤は、単位剤形で簡便に与えることができ、調剤学の技術分野で既知の方法のいずれかによって調製することができる。かかる方法は概して、治療剤と１つ以上の副成分を構成する担体とを会合させることを含み、特定の治療方法、特定の剤形及び投与方法に応じて変更することができる。ＢＯ－１１Ｘ及びＢＯ－１１Ｘｍ製剤の生理的作用を変更する可能性がある多数の因子（例えば体重、性別、食生活、投与時期、投与経路、排出率、被験体の状態、薬物の併用、遺伝的素因及び反応感度）を、当業者は考慮することができる。製剤の投与は、必要に応じて任意の他の薬物又は標準治療に適合して、連続的に又は最大耐量内の１回以上の個別投与で行うことができる。
当業者は、所与の条件に最適な投与速度を、従来の投与量投与試験を用いて確認することができる。本明細書に記載される作用物質及び／又は本発明の医薬組成物の個々の用量は、例えばＢＯ－１１Ｘ製剤又はＢＯ－１１Ｘｍ製剤中に約０．０１ｍｇ～約１０００ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含有する単位剤形（例えば、錠剤又はカプセル）で投与することができ、例えば上記の個々のＢＯ－１１Ｘ製剤は、約０．０１ｍｇ～約１０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）、好ましくは約０．５ｍｇ～約２．５ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）、より好ましくは約１ｍｇ～約２ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）（それらの間の全ての値及び範囲を含む）から複合体を作製することによって形成される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される作用物質及び／又は本発明の医薬組成物は、１日当たりＢＯ－１１Ｘ製剤中約０．０１ｍｇ～約１０００ｍｇ、又は１日当たり約０．１ｍｇ～約１０ｍｇ（それらの間の全ての値及び範囲を含む）のポリ（Ｉ：Ｃ）分子の量で投与される。本発明の或る特定の実施形態に従うと、本明細書に記載される作用物質及び／又は医薬組成物は、例えば１日２回以上、ほぼ１日１回、ほぼ２日に１回、ほぼ３日に１回、ほぼ週１回、ほぼ２週間に１回又はほぼ３週間に１回投与することができる。本発明の作用物質及び／又は医薬組成物の適切な投与量は、治療サイクルにわたって被験体（患者）１人当たりＢＯ－１１Ｘ製剤中０．１ｍｇ～１０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）分子、好ましくは被験体１人当たりＢＯ－１１Ｘ製剤中０．５ｍｇ～２ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）分子、より好ましくは被験体１人当たり０．６ｍｇ～１ｍｇの範囲である。ＢＯ－１１Ｘ製剤を節内、静脈内、肝臓内、皮内又は腫瘍内注射によって投与する場合、組成物の総量を結果として適合させることができる。
本発明によるＢＯ－１１Ｘ製剤の治療方法及び使用は、ヒト又は動物細胞の異常成長を特徴とする細胞増殖障害、好ましくは癌、最も好ましくは固形癌又はリンパ腫の治療又は予防に関する。更なる好ましい実施形態では、製剤化され（例えば、任意に薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又はアジュバントを含む注射用水性組成物）、外因性病原因子（細菌、ウイルス及び感染全般等）に関連した疾患を呈するか、又はヒト若しくは動物細胞の異常成長を特徴とする細胞増殖障害、例えば癌（すなわち腫瘍化、転移、毒性化合物を伴う）若しくは雌性哺乳動物の生殖器の細胞の異常成長を特徴とする婦人科障害に起因する変化を呈する、健常状態の器官又は組織への二本鎖ポリリボヌクレオチドの送達のために投与される医薬組成物としてのＢＯ－１１Ｘ製剤の治療方法及び使用が提供される。本発明の治療方法及び使用を評価するための例示的なモデルは、特許文献２、特許文献３及び下記の実施例に記載されている。
好ましくは、ＢＯ－１１Ｘ又はＢＯ－１１Ｘｍ製剤の治療方法及び使用は、１つ以上の腫瘍細胞の死滅の誘導（直接的又は間接的）又は１つ以上の腫瘍細胞の成長の抑制を対象とし、癌増殖、生存、転移、上皮間葉移行、免疫回避又は再発の治療、軽減、改善又は予防を更に含む。幾つかの実施形態では、ＢＯ－１１Ｘ製剤（又はＢＯ－１１Ｘｍ製剤）及び／又は免疫調節剤は、様々な病期（例えばステージＩ又はステージＩＩ又はステージＩＩＩ又はステージＩＶ）の癌の治療に使用される。非限定的な例としては、総合病期分類を用いると、ステージＩの癌は身体の一部分に局在化し、ステージＩＩの癌は、ステージＩＩＩの癌と同様、局所的に進行している。癌がステージＩＩ又はステージＩＩＩのいずれに指定されるかは、通常は癌の特定のタイプによる。非限定的な一例であるホジキン病では、ステージＩＩは横隔膜の片側のみのリンパ節が罹患していることを示し、ステージＩＩＩは横隔膜の上下のリンパ節が罹患していることを示す。したがって、ステージＩＩ及びＩＩＩの具体的な基準は、診断によって異なる。ステージＩＶの癌は多くの場合、転移しているか、又は他の器官若しくは全身に広がっている。代替的には、本発明による治療方法及び投薬レジメンは、アジュバント療法、すなわち一次、主要又は初期治療に加えて行われる治療に用いられる。非限定的な例としては、アジュバント療法は通常、全ての検出可能な疾患が取り除かれるが、潜在性疾患に起因する統計上の再発リスクが残る外科手術後に行われる付加的な治療であり得る。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される作用物質は、癌の治療にアジュバント療法として使用される。
本発明において、開示の組成物、組合せ、投薬レジメン及び関連の投与方法によって治療される癌は、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳及び中枢神経系の癌；乳癌；腹膜の癌；絨毛癌；結合組織癌；消化器系癌（食道、胃、結腸、直腸、又は他の消化器の癌を含む）；眼癌；頭頸部癌；膠芽腫；肝癌；肝細胞腫；上皮内腫瘍；腎臓癌、副腎癌又は腎癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮癌）；黒色腫；腎細胞癌；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（唇、喉頭、舌、口及び咽頭）；膵癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；呼吸器系の癌；唾液腺癌；皮膚癌；扁平上皮癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮、子宮内膜、子宮頸部、外陰部、卵巣、又は他の婦人科の癌；尿路系の癌；Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ；低悪性度／濾胞状、小リンパ球性、中悪性度／濾胞状、中悪性度びまん性、高悪性度免疫芽球性、高悪性度リンパ芽球性、高悪性度小型非切れ込み核細胞性、又は巨大腫瘤病変ＮＨＬ等の特定の種類を含む）を含むリンパ腫、マントル細胞リンパ腫及びエイズ関連リンパ腫；慢性リンパ球性白血病；急性リンパ芽球性白血病；毛様細胞性白血病；慢性の骨髄芽球白血病；同様に他の癌腫及び肉腫；移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、また同様に、母斑症又は浮腫と関連する（脳腫瘍と関連するもの等）血管増殖異常の１以上である。幾つかの実施形態では、癌は胆道癌である。幾つかの実施形態では、胆道癌は、膵癌、胆嚢癌、胆管癌及びファーター乳頭部の癌から選択される。幾つかの実施形態では、癌は肝臓癌である。幾つかの実施形態では、癌は結腸癌である。幾つかの実施形態では、胆道癌は胆管細胞癌及び／又は腺癌である。代替的には、癌は、欧州又は米国において規定される発生及び／又は罹患率の基準に従って規定され、International Rare Cancers Initiative（http://www.irci.info）又はRareCare（http://www.rarecare.eu）等の組織のウェブサイトで利用可能な定期的に更新される一覧に示される希少疾患の一覧に挙げられるものであり得る。
より好ましくは、本発明によるＢＯ－１１Ｘ製剤は、癌腫、神経膠腫、黒色腫又は肉腫等の固形腫瘍を治療する治療方法に使用される。特に、ＢＯ－１１Ｘ製剤は全身的に、又は腫瘍内若しくは腫瘍近くの位置でより直接的に、例えば腫瘍塊の境界で、周囲の上皮細胞、リンパ管又は血管で（例えば腫瘍内又は腫瘍周囲注射による）、又は雌性哺乳動物の生殖器の異常増殖細胞に投与される。癌は、癌の転移に起因する可能性がある休眠腫瘍であり得る。休眠腫瘍は、腫瘍の外科的切除の後に残る場合もある。癌の再発は例えば、本発明の治療方法及び使用が、治療された癌（例えばＢＯ－１１２製剤の腫瘍内注射による）がそうでなければ引き起こした可能性がある遠隔部位への転移の低減又は遮断をもたらす腫瘍再増殖、肺転移又は肝転移であり得る。
付加的に、器官及び皮膚の肉眼検査、並びに免疫不全の又は完全に免疫適格な動物モデルにおける顕微病理分析により、本発明による方法及び使用の有効性を更に示すことができる。同様の研究において生成する定量的データを、単独での又は別の薬物と組み合わせたＢＯ－１１Ｘ製剤の投与によってもたらされる治療（特に抗腫瘍）効果を評価する目的で、多重検定の補正を伴う及び伴わない適切な統計的検定を用いて異なる実験群間で比較することができる。さらに、本発明による治療方法及び投薬レジメンは、免疫細胞記憶を促進することによって局所又は全身性免疫を誘導するＢＯ－１１Ｘ製剤の効果を改善し、単一の治療剤、又は免疫調節化合物、腫瘍標的剤、腫瘍溶解性ウイルス、養子細胞移入及び他の細胞ベースの療法、ＤＮＡ若しくはペプチドベースのワクチン、又は免疫抑制代謝若しくは他の癌関連代謝経路の阻害剤と組み合わせたＢＯ－１１Ｘ製剤の使用を可能にし得る。
さらに、開示の組成物は、例えばアジュバントとして、癌（固形又は非固形）若しくは感染を治療若しくは予防するワクチン、サイトカイン、抗原、抗体、化学化合物、及び免疫調節活性を有する他の化合物を補助するために、及び／又は癌免疫療法のための作用物質を含む薬物に殆ど反応しない若しくは抵抗性を示す患者を救うために、細胞代謝及び／又は機能（好ましくは免疫細胞及び／又は癌細胞における）を変化させるために、ＤＮＡ発現、複製及び／又は修復を調節するために（後成的機構を標的とする薬物を含む）、又は標準治療の療法（化学療法若しくは放射線療法、又は癌抗原若しくはウイルス抗原を用いるワクチンベースの療法等）のために投与することができる。ＢＯ－１１Ｘ（又はＢＯ－１１Ｘｍ）製剤と同時投与される（その後に、任意の順序で）、かかる付加的な作用物質は、治療方法をバイオアベイラビリティ、有効性、薬物動態／薬力学的プロファイル、安定性、代謝、又は初期ＢＯ－１１Ｘ製剤若しくは薬学的に興味深い別の化合物の各々での治療を単独で行った場合に観察されない薬学的に興味深い他の特性に関して改善することができる。
本発明の治療方法及びレジメンは、免疫応答を制御して、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２及び／又はＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２との結合を遮断、低減及び／又は阻害することができるチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）として作用する、好ましくはモノクローナル抗体及び他の抗体フォーマットを含む抗体、又は細胞表面タンパク質に結合する任意の他の薬学的に利用可能な作用物質である免疫調節剤の投与も含み得る。
代替的には、ＣＰＩは、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ－４、ＡＰ２Ｍ１、ＬＡＧ３、ＯＸ－４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＳＨＰ－２及び／又はＰＰＰ２Ｒ５Ａ等の他の免疫チェックポイント分子の活性を遮断、低減及び／又は阻害することができる。更なる選択肢としては、ＣＰＩは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）及び／又はＣＤ１３７（４－１ＢＢ）と１つ以上の４－１ＢＢリガンド及びＴＲＡＦ２との結合を増大及び／又は刺激する。免疫調節特性を有する第２の治療剤の他の例としては、放射線療法、化学療法ＣＡＲ－Ｔ細胞、癌抗原ワクチン、又は制御性Ｔ細胞、代謝酵素、ＤＮＡ修復及び／又は複製を標的とする作用物質が挙げられる。本発明は、ＢＯ－１１Ｘ製剤と免疫調節剤及び／又は１つ以上の一般的な癌治療レジメン（例えばＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＩＲＩ、放射線、光線力学的療法、又はドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、シスプラチン、ＶＰ１６、エンジイン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、カルムスチン等の抗増殖剤）との組合せも提供する。
標準治療（例えば、アジュバントとしての放射線療法）を用いて又は用いずに、ＰＤ－１を阻害する作用物質（抗ＰＤ－１抗体等）及びＢＯ－１１Ｘ製剤の投与を適切に組み合わせることによって本発明による治療方法及び投薬レジメンを実行することができる例示的な癌適応症としては、黒色腫、トリプルネガティブ乳癌、肉腫、頭頸部癌、大腸癌、膀胱癌、腎細胞癌、肝転移、胃癌、前立腺癌及び肝細胞癌が挙げられるが、これらに限定されない。かかる適応症は、最適化された投薬レジメン設計を用いてＢＯ－１１Ｘ製剤を抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ４又は抗ＯＸ－４０抗体と共に投与することによっても治療することができる。
幾つかの実施形態では、免疫調節剤はＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の１つ以上を標的とする。免疫調節剤は、ＰＤ－１阻害剤であるのが好ましい。幾つかの実施形態では、免疫調節剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の１つ以上に特異的な抗体である。かかる免疫調節剤は、ニボルマブ（ＯＮＯ－４５３８／ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ）、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１）、ＭＫ－３４７５、ＢＭＳ ９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８ＯＡの非限定的な例を含む抗体である。例えば、ＢＯ－１１Ｘ製剤を黒色腫の治療のためにＭＰＤＬ３２８０Ａ（任意にベムラフェニブを伴う）及びＭＥＤＩ４７３６（任意にダブラフェニブ及びトラメチニブの１つ以上を伴う）の１つ以上と組み合わせる。
より具体的には、本明細書に開示されるＢＯ－１１Ｘ（又はＢＯ－１１Ｘｍ）製剤は、第２の治療剤の投与の定期的投与量及び／又は頻度の低減（これにより付加的な医学的介入の必要性、薬物に対する望ましくない耐性、及び／又は患者の全身的な不快感が潜在的に低減する）を含む、第２の治療剤と共に投与した場合の相乗的な治療効果を得るために使用することができる。さらに、本発明によるＢＯ－１１Ｘ（又はＢＯ－１１Ｘｍ）製剤は、第２の治療剤と共に投与した場合に、任意の特定の腫瘍耐性又は回避機構（特定の遺伝子、経路、及び／又は薬物若しくはサイトカイン等の内因性化合物に対する応答を変化させる突然変異を含む）を克服することによって、第２の治療剤に対して耐性を示す、非感受性の又は不良な臨床応答を示す患者の治療を可能にし得る。このため、今回開示されるＢＯ－１１Ｘ（又はＢＯ－１１Ｘｍ）製剤は、好ましくは癌を治療するための薬物救済又は薬物感作併用治療の形態で使用することができる。かかる治療方法は、開示のＢＯ－１１Ｘ製剤を腫瘍内若しくは腫瘍周囲注射（腫瘍内での、腫瘍塊の境界での、周囲の上皮細胞、リンパ管又は血管での）、又は癌細胞若しくは癌細胞を含む器官において直接の又はその付近でのＢＯ－１１Ｘ（又はＢＯ－１１Ｘｍ）製剤の投与及び免疫刺激薬の全身投与を可能にする他の手段によって投与することを含み得る。
本発明によるＢＯ－１１Ｘ製剤（又はＢＯ－１１Ｘｍ製剤）は、細胞ベースの療法との組合せを含む治療方法及び投薬レジメンでも投与することができ、この場合、ＢＯ－１１Ｘ組成物は、細胞ベースの療法と共に患者に直接同時投与されるか、又はＢＯ－１１Ｘ組成物は、患者から（血液から、又は腫瘍塊内の、腫瘍塊の境界の、周囲の上皮細胞、リンパ管又は血管内の細胞を含む生検標本から）得られた細胞の治療に使用される。これらの細胞は、特定の細胞型の正又は負の選択を用いて又は用いずに、この治療後に更なる癌治療（例えば癌ワクチン）に有用なマーカーを提示し、タンパク質を分泌し、及び／又は抗原を露出する細胞を生成するのに適切な実験室環境でＢＯ－１１Ｘ製剤に曝露され得る。かかる自己細胞は、この場合も更なる負又は正の選択を用いて又は用いずに、患者に投与することができる。後の治療段階で、開示のＢＯ－１１Ｘ製剤を、任意の適切な手段によって（例えば腫瘍内注射、又は好ましくは筋肉内若しくは皮下注射によって）患者に更に投与することができる。患者に由来する細胞（例えば樹状細胞）のｅｘ ｖｉｖｏ治療は、１時間超、好ましくは３時間超、より好ましくは８時間超、更により好ましくは２４時間超、又はそれ以上の期間にわたって、筋肉内又は皮下注射に必要とされるよりも低い（好ましくは、かかる用量の５０％、より好ましくは２５％、更により好ましくは１０％、又はより一層好ましくは１％の）濃度で行うことができる。
本発明は、病原体又は他の望ましくない生物学的作用物質に対する免疫応答を増大し、特に抗腫瘍免疫応答を増強し、潜在的にそれ自体が免疫調節剤として作用するＢＯ－１１Ｘ製剤（又はＢＯ－１１Ｘｍ製剤）の投与を含む治療方法及び投薬レジメンも提供する。かかる効果は、腫瘍部位及び腫瘍微小環境での（又は血流、他の体液及び組織中での）腫瘍関連免疫応答を、関連の細胞型又は亜集団（例えば樹状細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞）及び／又は免疫学的バイオマーカー（例えばケモカイン、成長因子、サイトカイン及びそれらの受容体）のレベルで測定することによってモニタリングすることができる。特に、ＢＯ－１１Ｘ製剤（又はＢＯ－１１Ｘｍ製剤）を腫瘍内注射によって臨床的に投与する場合、アポトーシス及び／又は壊死が腫瘍内で観察され、それにより潜在的に常在樹状細胞への腫瘍抗原の提示が促進される。シグナル伝達カスケードが腫瘍塊への免疫細胞、特にＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の動員をもたらし、腫瘍に対する免疫効果を促進し、ＢＯ－１１Ｘの細胞傷害効果に寄与する可能性もある。そうでなければ、本明細書の実施例に記載され、示されるように、開示のＢＯ－１１Ｘ製剤の投与は、腫瘍、リンパ節又はそれらの両方での特定の免疫細胞集団の絶対値及び／又は比率の変化を誘導し得る。
実施例１：蛍光標識されたＢＯ－１１Ｘ製剤の調製、生物物理学的特性評価及びｉｎ ｖｉｔｒｏ機能的検証
材料及び方法
主な試薬、細胞株及びキット
ＢＯ－１１２（ＧＭＰグレード）を特許文献２に記載のように作製した。本明細書のＢＯ－１１ＸＬ製剤の調製に使用したＰＥＩ及びポリ（Ｉ：Ｃ）調製物は、それぞれPolyplus-Transfection（商標） SA（France）及びCARBOGEN AMCIS（Switzerland）から購入した。スルホ－Ｃｙ５ ＮＨＳエステルは、LumiProbe（Germany）から入手した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｒｅｄ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎキットは、Thermo Fisherから購入した。Ｌａｂｅｌ ＩＴ（商標） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ、ＴＭ－ローダミンは、Mirus Bio LLC（USA）から入手した。ATCC又はCentra de Investigacion Medica Aplicada（Navarra，Spain）から入手可能な以下の細胞株を使用した：ＰＡＮＣ０２．０３（膵癌）、Ｂ１６－ＯＶＡ（マウス黒色腫）及びＭＣ３８（マウス結腸癌）、ＮＳ４７（マウス線維芽細胞）、ＲＡＷ２６４．７（マウスマクロファージ）及びＤＣ２．４（マウス樹状細胞）。細胞培養培地及び関連材料は、Gibco又はSigma-Aldrichから購入した。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、Capricorn Scientific（Germany）から購入した。８ウェル及び１５ウェルμ－Ｓｌｉｄｅは、iBidi（Germany）から入手した。検定用試薬（assay）は、Promegaから購入した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｃｏｕｎｔ Ｂｅａｄｓ及びＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（商標） Ｍｏｕｓｅキット（ＴＮＦ－α、ＩＦＮγ）は、BioLegend（USA）から購入した。Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｂｅａｄｓは、Beckman Coulterから購入した。
ＰＥＩ標識
ＰＥＩを任意の更なる取扱いの前に室温に平衡化した。典型的な標識実験では、ＰＥＩの希釈標準溶液を、２５ｍｇのポリマー（１．１６×１０－４ｍｍｏｌ／ｍＬ第二級アミン、すなわち反復モノマー単位に存在する量）を５ｍＬの１００ｍＭ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝９．０、適切な容量のＮａＯＨ（水溶液）を添加することによって調整した）に室温で静かに溶解することによって調製した。並行して、４．５ｍｇのスルホ－Ｃｙ５ ＮＨＳエステルを０．４５ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。完全な可溶化後に、０．４ｍＬの色素溶液（５倍過剰モルを含有する、０．２ｍｏｌ％第二級アミンを標的とする）をＰＥＩ溶液に添加し、混合物を室温で一晩、遮光して撹拌した（３００ｒｐｍ）。標識されたＰＥＩ生成物を、廃水の蛍光（プレートリーダーによって測定される）及び導電率（導電率プローブに接続したｐＨメーターによって測定される）の値がＭｉｌｌｉ－Ｑ水の値に達するまで、Ａｍｉｃｏｎフィルターを用いた遠心限外濾過（１回の洗浄当たり４５００ｇで４５分）及びＭｉｌｌｉ－Ｑ水（アミンのプロトン化、ひいてはポリマーの可溶化及び回収を確実にするために弱酸性）に対する洗浄によって精製した。精製した標識ＰＥＩ生成物を最後に急速凍結し、フリーズドライした（水の完全な除去を確実にするために少なくとも２日間）。ポリマー質量回収率を初期質量に対する回収されたポリマーの量として算出し、パーセンテージとして表した。防湿のために、フリーズドライしたポリマーを使用するまで密封したバイアルに－２０℃で保管した。官能基化度は、既知濃度の蛍光標識されたＰＥＩ生成物の蛍光強度を測定することによって（Ｅｘ：５４０／２５、Ｅｍ：６２０／４０ｎｍ；Ｇｅｎ５ソフトウェアを備えるＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸ Ｂｉｏｔｅｋプレートリーダー）、発光を蛍光色素のモル濃度と関連付けるためにスルホ－Ｃｙ５ ＮＨＳエステル色素の検量線を用いて算出した。典型的な質量回収率値＝７０％。典型的な誘導体化度＝０．１ｍｏｌ％～０．１５ｍｏｌ％。
ポリ（Ｉ：Ｃ）標識
Ｌａｂｅｌ ＩＴ（商標）キットを初めに室温に温め、「Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ」を短時間遠心分離して凍結乾燥ペレットを採取した。ペレットを１００μＬの「Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」で再構成し、懸濁するまで十分に混合した。典型的な標識実験では、以下のキット試薬：７００μＬのＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ水、１００μＬの「１０Ｘ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ａ」、５ｍｇ／ｍＬポリ（Ｉ：Ｃ）を含有する１００μＬのＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ水、及び１００μＬの「Ｌａｂｅｌ ＩＴ（商標） Ｒｅａｇｅｎｔ」を指定の順序でポリ（Ｉ：Ｃ）（ｐＩＣ）と混合し、３７℃で１．５時間、遮光してインキュベートした。蒸発の影響を最小限に抑え、反応成分の正確な濃度を維持するために、バイアルを途中で、すなわち４５分間のインキュベーション後に遠心分離した。標識されたポリ（Ｉ：Ｃ）（ｐＩＣ：Ｒｈｏ）を、Ａｍｉｃｏｎフィルター３を用いた遠心限外濾過（１回の洗浄当たり５０００ｇで４０分、Ｔ＝４℃）によって精製した。濃縮されたｐＩＣ：Ｒｈｏを、廃水の蛍光（プレートリーダーによって測定される）及び導電率（導電率プローブに接続したｐＨメーターによって測定される）の値がＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ水の値に達するまでヌクレアーゼフリー水で更に洗浄した。次いで、ｐＩＣ：Ｒｈｏ溶液を、バイアルを液体窒素に浸すことで急速凍結し、フリーズドライした（水の完全な除去を確実にするために少なくとも１日～２日間）。回収されたｐＩＣ：Ｒｈｏの質量を、高精度天秤を用いて乾燥固体を秤量することによって記録し、質量回収率を、初期ｐＩＣ質量に対する回収されたｐＩＣ：Ｒｈｏの量（ポリマー質量への色素の寄与は無視する）として算出し、パーセンテージとして表した。防湿のために、フリーズドライしたポリマーを使用するまで密封したバイアルに－２０℃で保管した。
ＢＯ－１１ＸＬナノプレックスの調製
ポリマーを任意の調製操作の前に室温に平衡化し、特許文献２に記載されるプロトコルを用い、必要に応じてｐＨを調整し、ＢＯ－１１２製剤の調製に用いたプロトコルと同様に遠心限外濾過して塩を除去して、ｐＩＣ：Ｒｈｏ標識製剤又はＰＥＩ－Ｃｙ５標識製剤のいずれかの調製に使用した。全てのＢＯ－１１ＸＬ製剤を使用するまで４℃で滅菌状態に維持した。
動的光散乱（ＤＬＳ）を用いたナノプレックスの特性評価
ＢＯ－１１２及びＢＯ－１１Ｘナノプレックスの流体力学直径（Ｚ－平均サイズ）、表面電荷（ζ電位）及び多分散指数（ＰＤＩ）をＤＬＳによって決定した。簡潔に述べると、非標識及び標識ナノプレックスを、固体ＨｅＮｅレーザー（λ＝６３３ｎｍ）を備えるＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍｏｄｅｌ ＺＥＮ３６００、Malvern Instruments Ltd.，UK）を１７３°の散乱角で用いて２５℃で分析した（予備平衡化時間＝２分；ｐＩＣ含量に対するナノプレックス濃度＝０．６ｍｇ／ｍＬ；溶媒＝グルコース５％（ｗ／ｖ）（水溶液））。サイズ及び多分散性データを、汎用アルゴリズムを用いて算出した。サンプルの電気泳動移動度を、スモルコフスキー方程式を用いてζ電位に変換した。
一般細胞培養プロトコル
Ｂ１６－ＯＶＡ、ＤＣ２．４及びＮＳ４７細胞株は、ＲＰＭＩ １６４０中で成長させ、ＭＣ３８及びＲＡＷ２６４．７細胞株は、ＤＭＥＭ中で成長させた。培地に１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２ｍＭ Ｇｌｕ、１％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム及び１％（ｖ／ｖ）Ｐ－Ｓを添加した。ＮＳ４７及びＢ１６－ＯＶＡの場合、培地に０．２５μｇ／ｍｌアムホテリシンＢを添加した。付加的に、ＮＳ４７及びＤＣ２．４細胞株については、培地に１％（ｖ／ｖ）ＮＥＡＡ、０．１％（ｖ／ｖ）２－メルカプトエタノール及び１％（ｖ／ｖ）ＨＥＰＥＳを添加した。培養培地への添加前にＦＢＳ溶液を標準手順に従って実験室内で加熱不活性化した。全ての細胞を標準条件下、すなわち５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２及び３７℃で培養し、マイコプラズマについて定期的に試験し、少ない継代数で使用した。
取込み研究：フローサイトメトリー
細胞を６ウェルプレート（Corning）に播種し、一晩付着及び成長させて、最後に１μｇ／ｍＬ ＢＯ－１１ＸＬ（ｐＩＣ：Ｒｈｏ）と共に３７℃でインキュベートした。指定のインキュベーション時間後に、細胞を予め温めたＰＢＳで洗浄し、予め温めたトリプシン－ＥＤＴＡとの室温で５分～１０分間のインキュベーションによって分離させた。取込みを、少なくとも５０００個の個々の生細胞について、ＣｙｔＥｘｐｅｒｔソフトウェア（ｖ２．０、Beckman Coulter, Inc.）を備えるＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓ（Beckman Coulter, Inc.）で決定した。生及び単一事象を、それぞれＦＳＣ－Ａ／ＦＳＣ－Ｈ（シングレット）及びＦＳＣ／ＳＳＣ（生）ウィンドウでゲーティングした後にデータをＫａｌｕｚａソフトウェア（ｖ２．１、Beckman Coulter, Inc.）で分析した。非処理細胞を、各時点のＭＦＩ ｎ倍及び陽性事象のパーセンテージを算出するために自己蛍光対照として使用した（レーザー：５６１ｎｍ、蛍光チャネル：５８５／４２ ＢＰ）。ＤＡＰＩを用いて死細胞を除外した（レーザー：４０５ｎｍ、蛍光チャネル：４５０／４５ ＢＰ）。
取込み研究：共焦点顕微鏡法
細胞を１５ウェルμ－Ｓｌｉｄｅに低密度で播種し、一晩付着及び成長させ、最後に１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ ＢＯ－１１ＸＬ（ｐＩＣ：Ｒｈｏ）の処理により３７℃でインキュベートした。５％（ｗ／Ｖ）グルコース又は培地中での指定のインキュベーション時間後に、細胞をＰＢＳで十分に洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液を用いて室温で１５分間固定し、再びＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ中の０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ－１００溶液で透過処理した（室温で１０分間のインキュベーション）。細胞核を１μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩにより室温で１０分間対比染色した後、ＰＢＳで洗浄し、１ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸／ＰＢＳ溶液中、４℃の暗所で保管した。
ＭＴＳアッセイ
２００μＬの成長培地中の５×１０３細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、一晩付着及び成長させた。細胞生存性を完全培地中での１μｇ／ｍＬ ＢＯ－１１２又はＢＯ－１１ＸＬ調製物との２４時間、４８時間及び７２時間のインキュベーション後にＭＴＳアッセイによって測定した。非処理細胞を陰性対照として使用した。各時点で２０μＬのＭＴＳ溶液を各ウェルに添加し（製造業者の使用説明書に従う）、４９０ｎｍでの吸光度を３７℃で１時間～４時間のインキュベーション後に記録した（Ｇｅｎ５ソフトウェアを備えるＳｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸ Ｂｉｏｔｅｋプレートリーダー）。
結果
本発明は、２つの光安定性かつｐＨ非感受性の蛍光色素（細胞実験に一般に用いられる典型的なｐＨ値にわたる）、すなわちＴＭ－ローダミン及びＣｙ５（各々が異なる蛍光色素励起及び発光波長を有し、生体内分布及び生物学的相互作用を評価する共局在化多重蛍光研究に利用することができる）を用いた、ＢＯ－１１２／ＢＯ－１１Ｘ製剤の２つの成分、すなわちＰＥＩ及びポリ（Ｉ：Ｃ）の標識化のための新たに設計された戦略を提供する。
Ｃｙ５標識ＰＥＩポリマーを調製する基本手順は、スルホ－Ｃｙ５ ＮＨＳエステルとＰＥＩのアミン基との反応、すなわち、例えばスルホ－シアニン５（Ｃｙ５）ＮＨＳエステルを用いたＮＨＳエステル反応化学に基づく。ＮＨＳエステルは、弱アルカリ性条件（７．２～９．０のｐＨ範囲）においてアミン基と反応し（反応性は、第一級＞第二級＞第三級アミンの順に増大する）、アミド結合の形成により安定なコンジュゲートをもたらす化学基である。ＮＨＳエステルは、ｐＨに依存して加水分解し（ｐＨが高いほど加水分解が速くなる）、より低効率の反応及びより低いコンジュゲーション収率に不利に寄与する（加水分解生成物とアミン反応との競合による）。ＮＨＳエステル反応は一般に、緩衝液（例えばリン酸塩又は炭酸塩ベース、ＨＥＰＥＳ等）中にて室温又は４℃で行われる。これらの手順には、低分子量（ＭＷ範囲１７ｋＤａ～２３ｋＤａ；平均ＭＷ＝２０．５ｋＤａ）の線状ＰＥＩポリマーが使用される。ＮＨＳ蛍光色素のコンジュゲーションについては、反応収率は、標識ポリマーの発光を蛍光色素のモル濃度と関連付けるためにスルホ－Ｃｙ５ ＮＨＳエステルの検量線を用いる蛍光測定法により、既知濃度のＰＥＩサンプルを用いて決定される。このコンジュゲーション手順は、他の市販の蛍光のＮＨＳエステル蛍光色素に容易に適用することができる。
本発明によるＴＭ－ローダミン（Ｒｈｏ）を用いたポリ（Ｉ：Ｃ）分子（ＢＯ－１１２製剤の調製に使用されるポリ（Ｉ：Ｃ）分子等）の化学的（すなわち非酵素的）官能基化に関する方法は、Mirus Bio LLCによって市販される、強い核酸結合能（静電相互作用によって促進される）を特徴とする反応性アルキル化剤に基づく。アルキル化反応は、出発核酸を劇的に変化させるか又は下流のハイブリダイゼーション性能を妨げることなく、ＤＮＡ又はＲＮＡサンプルの任意のヌクレオチド上の反応性ヘテロ原子で起こり得る。これらの反応は、核酸出発物質に対して非破壊的であり、製造業者によって推奨されるよりも低い官能基化度を標的とするように設計されている。
得られる標識ポリマー溶液を、廃水の蛍光及び導電率の値が純水の値に達するまで、ＰＥＩ又はポリ（Ｉ：Ｃ）分子の場合に、それぞれＭｉｌｌｉ－Ｑ又はＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ水に対する遠心限外濾過によって精製した。両方のポリマー生成物を精製し、初期質量の大部分が回収された（ＰＥＩ：Ｃｙ５及びポリ（Ｉ：Ｃ）：Ｒｈｏの質量回収率は、それぞれ７０％及び９０％～１００％であった）。ＰＥＩ：Ｃｙ５の場合、算出された誘導体化度は、０．１ｍｏｌ％のＮＨ単位であった。ポリ（Ｉ：Ｃ）分子については、製造業者のキット説明書に従うと、予想される誘導体化度は、４塩基～１２塩基毎に１つのローダミン標識であった。
非標識ＢＯ－１１Ｘ及びＢＯ－１１２製剤は、特許文献２及び特許文献３に記載のように調製した。標識ＢＯ－１１Ｘナノプレックスは、同じ手順に従うが、回収された蛍光標識ポリマーを用いて調製した。全てのＢＯ－１１Ｘ製剤を使用するまで４℃で滅菌状態に維持した。
次いで、ＢＯ－１１ＸＬ製剤中の得られるナノプレックス粒子の生理化学的特徴を、動的光散乱（ＤＬＳ）及び原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を用いてＢＯ－１１２製剤の生理化学的特徴と比較し、ＢＯ－１１ＸＬ及びＢＯ－１１２製剤の両方について極めて類似した形態学的及び生物物理学的特徴が確認された（図１Ａを参照されたい）。例えば、ＡＦＭ分析により、ＢＯ－１１２製剤とＢＯ－１１ＸＬ製剤とで同様の球状の形態が明らかとなり、ＤＬＳにより同等の粒径、多分散指数（約０．３）及びゼータ電位（約４０ｍｖ）が明らかとなった。
ＢＯ－１１ＸＬ製剤の生物学的特性をＢＯ－１１２製剤に対して比較するために、初めにヒト膵臓細胞株であるＰａｎｃ０２．０３をベースとした単純なｉｎ ｖｉｔｒｏ癌細胞モデルを検証した。次いで、非標識及び標識ＢＯ－１１２／ＢＯ－１１Ｘナノプレックスの抗腫瘍効果を、ＭＴＳアッセイを用いて評価した。ＭＴＳの結果から、２４時間、４８時間及び７２時間で全製剤について同一の抗腫瘍効果が明らかとなった。
次いで、このような検証された標識ＢＯ－１１ＸＬ製剤の細胞相互作用を、Ｐａｎｃ０２．０３細胞を用いて評価した。初めに、フローサイトメトリー（生細胞に対する）を用いて担体（すなわちＰＥＩ）又はカーゴ（すなわちポリ（Ｉ：Ｃ））に対応するシグナルを追うことによって細胞取込みを追跡した。結果は、いずれかの成分をモニタリングすることで同様に急速な取込み動態となった。また、ＢＯ－１１ＸＬ製剤の侵入機構を、初めに特定の取込み経路を薬剤で遮断し、次いで１０分間の曝露後にＢＯ－１１ＬＸ／ＰＥＩ：Ｃｙ５シグナルを追うことで調査した。ＢＯ－１１Ｘは、エンドソーム成熟（バフィロマイシン処理で８０％の低減）及びマクロピノサイトーシス（ＥＩＰＡ処理で３０％の低減）の阻害の影響を受けるプロセスにおいてクラスリン依存性エンドサイトーシス（ノコダゾール処理で６０％の低減）によって取り込まれるようである。このアプローチは、単独で又は他の治療剤と組み合わせて投与した場合のＢＯ－１１Ｘ製剤の相互作用、共局在化及び／又は作用機構を特定するように更に発展させることができる。
ＢＯ－１１ＸＬ製剤の特性評価は、標準条件で培養し、少ない継代数で試験される、それぞれ黒色腫、樹状細胞及びマクロファージのマウスモデルとして使用されるＢ１６－ＯＶＡ（マウス黒色腫細胞株）、ＤＣ２．４（マウス樹状細胞株）及びＲＡＷ２６４．７（マウスマクロファージ細胞株）等の幾つかの参照マウス細胞株において追求されている。図１（Ｂ～Ｄ）に示されるように、ＢＯ－１１ＸＬ製剤の取込み動態は急速であり、３つのマウス細胞モデルで同等であったが、Ｂ１６－ＯＶＡ細胞のみがＢＯ－１１Ｘ製剤によって顕著に死滅し、ＤＣ２．４細胞は死滅しなかった（ＲＡＷ２６４．７は同様の特性を有する）。実際に、樹状細胞によるＢＯ－１１Ｘの取込みは増殖活性を増大させ、本発明によるＢＯ－１１Ｘ製剤が腫瘍塊内、リンパ節内及び／又は血流中の樹状細胞の亜集団等の特定の免疫細胞を標的とすることで特定の治療効果をもたらし得ることが示唆される。これらの知見を、免疫細胞又は癌細胞のいずれかに由来するヒト又はマウス細胞株において（最終的には共培養系において）更に調査し、かかる細胞株を本明細書に記載されるＢＯ－１１２及び／又はＢＯ－１１ＸＬ製剤でスクリーニングし、どの細胞型が、どの機構を用いて、かかる製剤内のナノプレックス粒子を内在化するかを更に規定することができる。付加的に、細胞生存性、増殖、分化又は活性化等の生物学的パラメーターを決定することもできる。確証的知見が癌細胞及び免疫／間質細胞のパネルを用いて得られ（図２）、代謝活性（処理の７２時間後に比色ＭＴＳアッセイによって測定される細胞生存性及び増殖に比例する）に対するＢＯ－１１Ｘ製剤の特定の効果は更に示されず、癌細胞に対するＢＯ－１１Ｘ製剤の細胞傷害効果、又は線維芽細胞及びマクロファージに対する毒性の欠如、又は樹状細胞に対する増殖効果が、ＥＬＩＳＡによって測定されるＴＮＦα及びＩＦＮγ等のサイトカインの産生に対するＢＯ－１１Ｘの効果の増大と同時に見られた。
実施例２：蛍光標識されたＢＯ－１１Ｘ製剤のｉｎ ｖｉｖｏ機能的検証
材料及び方法
ＭＣ３８ベースの癌モデル
ＭＣ３８結腸癌細胞を、０日目に８週齢～１０週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６匹～１１匹のマウス／群）の右上脇腹に皮下注射した（５×１０５個）。ノギスを用いて腫瘍を週２回測定し、腫瘍体積を算出した（長さ×幅２／２）。腫瘍が８０ｍｍ３～１００ｍｍ３の体積に達した時点で（０日目）、マウスを実験プロトコルに従って種々の処理群に無作為化した。標識ＢＯ－１１ＸＬ（ｐＩＣ：Ｒｈｏ）製剤（２．５ｍｇ／ｋｇ、１００μｌ）を腫瘍内注射によって投与した。対照群には、５％（ｖ／ｖ）グルコース（ＢＯ－１１Ｘビヒクル、同一の容量）又は非標識ＢＯ－１１２（同一の投与当たりの量）の腫瘍内注射を行った。腫瘍内注射後の種々の時点でマウスをＣＯ２窒息によって安楽死させた。
ｉｎ ｖｉｖｏ分析
ＢＯ－１１ＸＬ（ｐＩＣ：Ｒｈｏ）の生体内分布を、ＩＶＩＳ ＳｐｅｃｔｒｕｍＣＴ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（PerkinElmer）を用いて同一の機器設定（フィルター：５３５／５８０ｎｍ）で決定した。動物の全体像を取得した後（横臥位及び仰臥位（開腹））、腫瘍及びリンパ節を摘出し、それらの蛍光を記録した。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（ｖ４．２）を定量分析に使用した。いずれの場合にも蛍光バックグラウンド除去を行った。２回の独立実験を行った。
ｉｎ ｖｉｔｒｏリンパ節細胞分析
単一細胞懸濁液を、シリンジプランジャー及びセルストレーナーを用いたリンパ節の機械的解離によって得た。フローサイトメトリー前に、採取した細胞を初めに予熱した赤血球溶解バッファー（ＮＨ４Ｃｌ）によって３７℃で２分間処理し、次いで抗体カクテル（ＣＤ４５：ＡＰＣ、ＣＤ１９：ＦＩＴＣ、ＣＤ３：ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＣＤ４：ＢＶ５１０、ＣＤ８：ＰＥＣｙ７、ＮＫ１．１：ＰＥＣｙ５、製造業者の使用説明書の通りに希釈した）によって４℃で３０分間、暗条件で染色した。次いで、細胞をＰＢＳで十分に洗浄し、ＣｙｔＥｘｐｅｒｔソフトウェア（ｖ２．０、Beckman Coulter, Inc.）を備えるＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓ（Beckman Coulter, Inc.）を用いて分析した。データを、Ｋａｌｕｚａソフトウェア（ｖ２．１、Beckman Coulter, Inc.）を用いて分析した。Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｂｅａｄｓ及びＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｃｏｕｎｔ Ｂｅａｄｓを補償に、また絶対細胞数を得るためにそれぞれ使用した。
結果
記載の細胞ベースのモデルにおいて本発明によるＢＯ－１１ＸＬ製剤を用いて生成したデータを利用して動物モデルを確立することができ、特定の細胞型（特に免疫細胞及び癌細胞）に対する生物学的効果及びＢＯ－１１Ｘ製剤の解剖学的分布の両方を特に腫瘍内注射による投与後に特性評価することができる。例えば、ＢＯ－１１ＸＬ製剤の成分を、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子がどのように腫瘍塊内の特定の細胞に会合し（例えば細胞内在化による）、及び／又はポリ（Ｉ：Ｃ）分子がどのように近位若しくは遠位リンパ管ネットワーク、又は免疫応答の組織化に関連する他の代替的な位置に拡散するかを決定するために調査することができる。特に、蛍光標識されたポリ（Ｉ：Ｃ）分子は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植したマウス結腸腺癌ＭＣ３８細胞をベースとした同種マウス癌モデル、又は別の関連癌マウスモデルにおいて、臨床活動に用いられるものと同等の品質を有する抗ＰＤ－１抗体等の他の薬物と一緒の又はそれとは別々のＢＯ－１１ＸＬ製剤の腫瘍内注射後に検出することができる。
これらの誘導された腫瘍病巣における本発明によるＢＯ－１１ＸＬ製剤の腫瘍内注射は、マウス組織における蛍光強度のｅｘ ｖｉｖｏ検出を用い、処理後４８時間まで時間に依存して追跡することができる。異なる時点で屠殺したマウスの群において腫瘍塊及びリンパ節を摘出し、別個に走査する。前者のタイプのサンプルは凍結し、薄片にすることができ、免疫蛍光を用いて腫瘍塊内の不均一な細胞集団間の標識ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の細胞局在化を決定する。後者のサンプルタイプは、分離して単一細胞懸濁液を作ることができ、これを、関連対照（例えばビヒクルのみ、ＰＥＩなし若しくは標識ポリ（Ｉ：Ｃ）分子なしで注射した、又は全く注射しなかった腫瘍）と比較したＢＯ－１１ＸＬ処理の結果として規定され得る細胞型の様々な生物学的特徴及び／又は細胞亜集団間の変動を特定するためにフローサイトメトリー分析に供することができる。この分析は、蛍光標識されたポリ（Ｉ：Ｃ）分子の局在化、遺伝子発現データ（特に特定の発現プロファイル、及び癌細胞又は病原体を標的とする免疫応答等の治療的に適切な応答と関連する任意の「シグネチャー」に分析の焦点を合わせることによる）、及び任意の他の関連の生物学的読取りにおける任意の正（又は逆）相関を決定するために、腫瘍及びリンパ節から抽出されたＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質にも拡張することができる。
付加的な確証的データを、ＢＯ－１１１ＸＬ（ｐＩＣ：Ｒｈｏ）をＭＣ３８誘導性腫瘍に注射した後、注射腫瘍及び主要なリンパ節における標識されたポリ（Ｉ：Ｃ）分子（依然としてＰＥＩとの複合体に含まれるか又はＰＥＩから分離している）の分布を、関連組織を摘出し、細胞を単離し、蛍光標識された細胞又はリンパ節に存在する免疫細胞の増加を特定するためのフローサイトメトリー分析を行うことによってｅｘ ｖｉｖｏで（図３）、又は代替的には、特定の位置での蛍光のｉｎ ｖｉｖｏ分析及び位置決めを行うことによって（図４）、分析することで生成した。
加えて、腫瘍内注射に使用される腫瘍病巣（複数の場合もある）の部位（複数の場合もある）を比較して、注射腫瘍病巣（皮膚病巣、皮下結節、リンパ節等）及び任意の遠位の非注射病巣（例えば肝臓又は肺等の内臓器官）を減少させることで特定の利益をもたらす、開示のＢＯ－１１Ｘ及びＢＯ－１１ＸＬ製剤を内在化する（又はそうでなければｉｎ ｖｉｖｏでのかかる製剤への曝露に対して感受性がある）細胞を特定することもできる。この潜在的に差次的な効果は、関連組織の分析だけでなく、血液サンプル中の循環細胞（特に樹状細胞、マクロファージ、及び免疫応答に関与する他の細胞）及びタンパク質（概してケモカイン、インターフェロン及びサイトカイン）の分析による更なる評価を必要とする場合がある。
実施例３：臨床研究、特に併用薬物治療におけるＢＯ－１１Ｘ製剤の投与を伴う治療のレジメン及び方法の特性評価
材料及び方法
Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ（商標）分析
特定の遺伝子シグネチャーの発現の分析を、臨床研究「浸潤性固形腫瘍を有する成人患者におけるＢＯ－１１２の予備的研究（Exploratory Study of BO-112 in Adult Patients With Aggressive Solid Tumors）」（ＮＣＴ０２８２８０９８）において遺伝子検査に必要とされる追加のインフォームドコンセント用紙に登録患者が署名した後に行った。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ技術を、ヒトの固形及び液性癌型において適応免疫及び自然免疫の両方を測定するように設計された７７０－ｐｌｅｘ遺伝子発現パネルであるｎＣｏｕｎｔｅｒ ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｐａｎｅｌによる発現評価に用いた（Cesano J, 2015）。腫瘍生検標本の全ＲＮＡを開示のＢＯ－１１２製剤の注射の前及びその後に同じ患者から単離した。腫瘍生検標本を、核酸の完全性を維持するために、それらの回収の直後にＲＮＡｌａｔｅｒ（Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）ですすいだ。全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA USA）により、製造業者の使用説明書に従って単離し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ技術（Agilent，Santa Clara，USA）によって完全性／品質を評価した。試験は、Laboratory of Translational Oncology（Hospital General Universitario Gregorio Maranon，Madrid，Spain）で行われ、生物情報分析は、Dreamgenics（Oviedo，Spain）で製造業者の使用説明書（Nanostring，Seattle，USA）に従って行われた。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇカウントを、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒソフトウェアを用いて抽出した。カウントの正規化を、潜在バッチ効果等の望ましくない実験変動を検出し、ハウスキーピング遺伝子に基づく正規化を適用するＲＵＶＳｅｑ Ｒパッケージを用いて行った（Risso D et al., 2014）。ｎＣｏｕｎｔｅｒ ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｐａｎｅｌに含まれる遺伝子の差次的発現分析は、ＤＥＳｅｑ２アルゴリズムを用いて行った（Love M et al., 2014）。差次的発現分析による条件間のｐ値（－ｌｏｇ１０）及び倍率変化（ｌｏｇ２）を、ボルケーノプロットを用いて表した。
結果
特許文献２及び特許文献３はそれぞれ、特にＢＯ－１１２製剤の腫瘍内投与後に臨床研究において観察することができるＢＯ－１１２生物学的活性及び治療活性等のＢＯ－１１Ｘ製剤の臨床的有用性を決定する多数のアプローチを記載している。ＢＯ－１１Ｘ製剤と抗ＰＤ／ＰＤ－Ｌ１療法との組合せを種々の投薬レジメンに適合させ（図５にまとめる）、臨床プロトコルを行う前、その間及びその後に測定される生物学的特徴の分析と関連付けることができる。かかる基準は、全般的に又は他の治療を参照して、処理腫瘍病巣及び非処理腫瘍病巣のサイズ、他の位置への転移等の臨床パラメーター、並びにＲＥＣＩＳＴ又はｉｒＲＣを含む標準化システム下で規定される他の臨床基準の評価と並行して、異なる時点で血流、生検標本、及び患者から得られる他の生体サンプルにおいて測定することができる。
特に、ＢＯ－１１２は、主に抗ＰＤ－１（ニボルマブ又はペムブロリズマブ）に抵抗性を示す固形腫瘍を有する患者において抗ＰＤ－１と組み合わせて投与されている。腫瘍内注射に適した１ｃｍを超える病巣は、進行、限界毒性又は１年の時点まで先の抗ＰＤ－１とＢＯ－１１２との併用を継続する前にＢＯ－１１２（１ｍｇ）×２回又は３回（ｑｗ）の注射が必要であった。注射病巣からのＢＯ－１１２前及びＢＯ－１１２後の生検標本を壊死、アポトーシス及び免疫浸潤について分析した。治療した患者のうち、黒色腫及び腎癌を患う特定の患者において部分奏効（ＰＲ）が観察され、他の患者は病勢安定（ＳＤ）を示した。この臨床研究では、抗ＰＤ－１と組み合わせた開示のＢＯ－１１２は、対処可能な安全性プロファイル、直接的な抗腫瘍効果、並びに自然及び適応免疫系活性化を示し、放射線療法による同時治療を用いて又は用いずに抗ＰＤ１治療に対する耐性を逆転させる大きな可能性が示唆された。
ＢＯ－１１２治療の例示的な分析を、腎細胞癌を患う患者において行った（図６）。患者を初めにスニチニブ、カボザンチニブ、エベロリムスで治療し、次いでニボルマブで治療し、続いてＢＯ－１１２製剤で治療した（鎖骨上リンパ節への注射による投与）。この治療レジメンは、注射病巣における顕著な壊死効果（ＣＤ８陽性細胞及び特定のマクロファージ亜集団の存在が増加した）及び同様に左右の非注射傍大動脈リンパ節のサイズの減少をもたらした。この治療パラダイムは、免疫組織化学を用いて腫瘍生検標本において、またフローサイトメトリーを用いて循環細胞においても研究されており、特定の免疫細胞集団の大きな変化の検出を可能にしている。このアプローチは、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１薬物の併用のための（又はＢＯ－１１Ｘ製剤と別の免疫調節薬との組合せでの）図５に示される投薬レジメンの１つを適用することによって患者を治療する臨床研究に拡張して、より規則的に負又は正の影響を受ける臨床パラメーター、並びに特に癌細胞に対する直接的な効果及び腫瘍に対する間接的な免疫効果を薬物組成物、投薬レジメン及び薬物の併用を選択することで特定し、場合によっては改善することができる方法に関して、同様に結果として投薬レジメンの影響を受ける潜在的生物学的特徴を決定することができる。
この臨床集団における更なる分析は、特に免疫応答に関して特定の細胞の活性化を示唆すると特徴付けられている遺伝子のパネルについて細胞サンプル中に見られるｍＲＮＡの迅速な並行検出及び定量化を可能にし、患者からの臨床サンプルの多重遺伝子発現分析を可能にする高感度の技術であるＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ技術を用いて実行することができる（Veldman-Jones M et al., 2015）。患者のコホートからの腫瘍生検標本をＢＯ－１１２の腫瘍内注射による治療後に分析し、最良効果としてＰＤに対してＰＲ＋ＳＤを示した患者を比較する場合、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析をボルケーノプロットとして示すことができ、より高い統計的有意性でＢＯ－１１２によって特異的に上方調節又は下方調節される遺伝子が、グラフの右上及び左上の領域で他の遺伝子と区別される（図７）。このアプローチを用いることで、ＮＣＡＭ１（神経細胞接着分子１）、ＧＺＭＢ（グランザイムＢ）及びＳ１００Ａ７（タンパク質Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ７）等のヒト遺伝子の発現が、ＢＯ－１１２投与後に最良効果としてＰＲ及びＳＤを有する患者に由来する臨床サンプルにおいて特異的かつ顕著に上方調節される。並行して、ＩＬ１３ＲＡ（ＩＬ－１３受容体サブユニットα－１２、又はＣＤ２１３ａ２）、ＣＴＣＦＬ（癌／精巣抗原２７、ＣＴ２７）、ＳｅｒｐｉｎＢ２（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２、ＰＡＩ－２）及びＭＡＧＥＣ２（黒色腫関連抗原Ｃ２、癌／精巣抗原１０、ＣＴ１０）等の遺伝子について逆の効果が検出された。このようにして、遺伝子のサブセットを、ＢＯ－１１２投与の効果及び腫瘍、リンパ節又は他の位置における臨床効果との比較のための生物学的読取りを規定する指針として使用することができる。
より一般には、図８に例示されるように、本発明によるＢＯ－１１Ｘ製剤の投与を含む治療レジメンは、特定の癌又は患者の集団において観察される応答に適合させることができる。さらに、治療効果と正に相関するようである開示の組成物での実際の治療の前に測定される生物学的特質は、この場合、患者の集団を階層化し、単独での又は別の薬物（例えば抗ＰＤ－１抗体）と組み合わせたＢＯ－１１Ｘ投与により最も治療的な効果を受ける集団を決定するアッセイ及びプロトコルを確立するために使用することができる。開示のＢＯ－１１ＸＬ製剤はまた、このように患者に由来する細胞をｅｘ ｖｉｖｏで試験し、これらの製剤の並行効果を決定することで使用することができる。
参照文献
Cesano J, J Immunother Cancer. 2015; 3: 42.
Corraliza-Gorjon I et al.,. Front Immunol. 2017;8:1804.
Eleneen Y and Colen RR, Adv Exp Med Biol. 2017; 995:141-153.
Kadam, RN et al., Braz. J. Pharm. Sci. 2015; 51: 255-263.
Love M et al., Genome Biol. 2014; 15: 550.
Marquez Rodas I et al., Annals of Oncology 2018; 29 (suppl_8), mdy424.049,
Patel MC et al., Future Virol. 2014; 9:811-829.
Risso D et al., Nat Biotechnol. 2014; 32: 896-902.
Rossi S et al., Eur J Nucl Med Mol Imaging 2017; 44: 2310-2325.
Smith S. et al., OncoImmunol. 2018; 7: e1526250.
Subbiah V et al., Diagnostics 2017; 7: E10.
Tormo D et al., Cancer Cell. 2009; 16: 103-14.
Veldman-Jones M et al., Cancer Res. 2015; 75: 2587-93.

Claims (31)

  1. 癌の治療のための１つ以上の投薬レジメンを決定する方法であって、
    （ａ）生体サンプルを得ることと、
    （ｂ）前記生体サンプルにおける薬物効果を、単独での又は第２の治療剤と組み合わせた被験体への第１の治療用組成物の投与後の臨床応答に基づいて検出することと、
    前記第１の治療用組成物は、ＰＥＩ及びポリ（Ｉ：Ｃ）分子から形成される１つ以上のナノプレックス化粒子の製剤を含み、任意に蛍光色素標識を含む；
    （ｃ）前記薬物効果に基づいて、前記サンプルにおける癌の治療のための１つ以上の投薬レジメンを決定することと、
    を含む、方法。
  2. 前記生体サンプルが被験体、好ましくはヒト被験体に由来する血液サンプル又は腫瘍生検標本である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記生体サンプルが細胞株である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記第１の治療用組成物がＢＯ－１１Ｘ製剤である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ＢＯ－１１Ｘ製剤が粒子を含む水性組成物であり、（ａ）各粒子が、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくは溶媒和物と、少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩及び／又は溶媒和物との複合体を含み、該二本鎖ポリリボヌクレオチドがポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））であり、該二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも６０％が少なくとも８５０個の塩基対を有し、該二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも７０％が４００個～５０００個の塩基対を有し、該二本鎖ポリリボヌクレオチドの２０％～４５％が４００個～８５０個の塩基対を有し、前記ポリアルキレンイミンが少なくとも９５％のポリエチレンイミンを含み、該ポリアルキレンイミンの平均分子量が１７ｋＤａ～２３ｋＤａであり、多分散指数が１．５以下であり、前記組成物中の前記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する前記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率が２．５～５．５であり、かつ（ｂ）前記粒子が、ＩＳＯ ２２４１２：２００８に準拠して測定される、３０ｎｍ～１５０ｎｍのｚ－平均直径を有し、かつ（ｃ）前記粒子の少なくとも９９％が６００ｎｍ未満の直径分布を有する、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ＢＯ－１１Ｘ製剤が粒子を含む水性組成物であり、（ｉ）前記粒子の各々が、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくは溶媒和物と、少なくとも１つの線状ポリアルキレンイミン又はその塩及び／又は溶媒和物との複合体を作製することによって形成され、前記二本鎖ポリリボヌクレオチドがポリ（Ｉ：Ｃ）分子であり、前記線状ポリアルキレンイミンの平均分子量が１７ｋＤａ～２３ｋＤａであり、（ｉｉ）前記粒子の少なくとも９０％が３００ｎｍ未満の単峰性直径を有し、前記粒子が、ＩＳＯ ２２４１２：２０１７に準拠して測定される、２００ｎｍ以下のｚ－平均直径を有し、かつ（ｉｉｉ）前記組成物が、ＩＳＯ １３０９９－２：２０１２に準拠した、３０ｍＶ以上、好ましくは３５ｍＶ～４５ｍＶのゼータ電位を有し、前記粒子が、前記組成物中の前記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する前記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率が２．５以上で形成される、請求項４に記載の方法。
  7. 前記第２の治療剤が抗ＰＤ－１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記１つ以上のナノプレックス化粒子が蛍光色素で標識される（ＢＯ－１１ＸＬ）、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記臨床応答がバイオマーカー、癌抗原、免疫細胞の分析、又は腫瘍負荷、腫瘍の病期、転移の量及び／又は腫瘍再発を含む臨床基準に従って規定される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 工程（ｂ）において検出される前記薬物効果が前記被験体についての臨床応答の対応する標準化評価基準に基づいて決定される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記標準化評価基準がＲＥＣＩＳＴ、ｉｒＲＣ及び／又はＰＥＲＣＩＳＴ標準化基準に準拠して規定される、請求項１０に記載の方法。
  12. 工程（ｂ）において検出される前記薬物効果が注射腫瘍病巣及び非注射腫瘍病巣のサイズの減少に相当する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記生体サンプルを免疫細胞及び／又は癌細胞の存在について分析する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 工程（ｂ）において検出される前記薬物効果が、癌細胞又は免疫細胞の特定の（亜）集団の存在若しくは非存在、及び／又は抗原提示に関与する遺伝子及び経路の発現及び／又は活性レベルの変化、及び／又は交差提示樹状細胞の存在及び／又は活性に相当する、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記投薬レジメンが、
    単独での前記第１の治療用組成物の投与、及び／又は、
    毎日又は毎週行われる、前記第２の治療剤と組み合わせた前記第１の治療用組成物の投与、及び／又は、
    前記第２の治療剤を用いない週に行われる前記第１の治療用組成物の投与及びその逆、及び／又は、
    維持サイクルとしての毎週の代替的又は同時の前記第１の治療用組成物の投与、
    を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の投薬レジメンを行うことを含む、癌を治療する方法。
  17. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の投薬レジメンに従い、単独での又は第２の治療剤と組み合わせた第１の治療用組成物で治療される被験体を特定する方法。
  18. 前記第１の治療用組成物を、単独で又は前記第２の治療剤と組み合わせて被験体に投与する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. ＰＥＩ及びポリ（Ｉ：Ｃ）分子から形成される１つ以上のナノプレックス化粒子の製剤を含み、任意に蛍光色素標識を含む組成物。
  20. 薬剤として使用される、ＰＥＩ及びポリ（Ｉ：Ｃ）分子から形成される１つ以上のナノプレックス化粒子の製剤を含み、任意に蛍光色素標識を含む組成物。
  21. 被験体への投与後にナノプレックス化粒子組成物と相互作用する組織又は器官の１つ以上の細胞を特定するための請求項２１に記載のナノプレックス化粒子組成物の使用。
  22. 前記特定が、
    前記ナノプレックス化粒子組成物を１つ以上の細胞に投与することと、
    前記１つ以上の細胞への前記ナノプレックス化粒子組成物の取込みを評価し、及び／又は前記ナノプレックス化粒子組成物の取込み後の前記１つ以上の細胞の生存性を評価することと、
    を更に含む、請求項２１に記載の使用。
  23. 前記細胞への投与がｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏである、請求項２１又は２２に記載の使用。
  24. 前記１つ以上の細胞がリンパ節、皮膚又は内臓器官に由来する、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の使用。
  25. 前記１つ以上の細胞が哺乳動物被験体に由来し、好ましくは該被験体がヒト被験体である、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の使用。
  26. 前記１つ以上の細胞に投与される第１の治療用組成物を用いた治療レジメンを特定することを更に含み、該第１の治療用組成物が好ましくはＰＥＩ及びポリ（Ｉ：Ｃ）分子から形成される１つ以上のナノプレックス化粒子の製剤である、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の使用。
  27. 第２の治療剤を投与することを更に含む、請求項２６に記載の使用。
  28. 前記第２の治療剤が従来の癌治療であり、該従来の癌治療が好ましくは小分子、ペプチド、細胞ベースの生成物又は核酸である、請求項２７に記載の使用。
  29. 前記第２の治療剤が癌抗原に対する抗体又は免疫チェックポイントに対する抗体である、請求項２７又は２８に記載の使用。
  30. 前記癌抗原がＣＤ２０、Ｈｅｒ３又はＨｅｒ２から選択され、前記免疫チェックポイントがＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１から選択される、請求項２９に記載の使用。
  31. 前記第２の治療剤が前記第１の治療用組成物の投与の前、その間又はその後に投与される、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の使用。
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