CN114788864A - Ldlr在肿瘤免疫治疗、增强免疫细胞免疫效应中的应用 - Google Patents

Ldlr在肿瘤免疫治疗、增强免疫细胞免疫效应中的应用 Download PDF

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Abstract

一种LDLR在肿瘤免疫治疗、增强免疫细胞免疫效应中的应用。揭示了胆固醇代谢相关基因、蛋白对免疫细胞免疫效应、抗肿瘤活性的调控作用，且该调控过程不完全依赖于胆固醇的摄取，从而为了促进肿瘤免疫治疗或增强免疫细胞免疫效应提供新的策略和靶点，克服了现有技术的技术偏见。LDLR基因或其蛋白能作为靶点被调节以改善相应CTL的杀伤效果，应用于肿瘤免疫治疗中，以显著提高CTL细胞抗肿瘤活性，提高肿瘤免疫治疗效果。除了直接作用LDLR外，也能通过抑制肿瘤和/或免疫细胞中LDLR调控相关基因、蛋白，如PCSK9，而提高CTL的抗肿瘤作用。在此基础上，还能联合免疫检查点阻断剂PD‑1抗体进一步提高免疫治疗的效果。

Description

LDLR在肿瘤免疫治疗、增强免疫细胞免疫效应中的应用
技术领域
本发明涉及免疫治疗领域，更具体地，涉及一种LDLR在肿瘤免疫治疗、增强免疫细胞免疫效应中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是一种严重危害人类生命、健康的重大疾病，目前，恶性肿瘤的治疗手段主要包括手术治疗、放疗、化疗和免疫治疗。其中，肿瘤免疫治疗旨在通过调动机体的免疫系统，提供抗肿瘤效力，从而抑制和杀伤肿瘤细胞，是当前肿瘤治疗的一种重要手段。尤其是以T细胞为核心的免疫疗法，在多种类型肿瘤中均取得了一定的疗效。
T细胞是获得性免疫系统中的重要组成成分，它可以识别特定抗原并介导细胞免疫反应，在抵抗外来病原体感染、肿瘤免疫和自身免疫性疾病中发挥着重要作用。以T细胞为核心的免疫疗法，如靶向PD-1和CTLA-4的免疫检测点阻断治疗和嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗都已在肿瘤治疗中取得了很好的效果，并已经被批准应用于临床治疗。其能通过增强患者自身免疫系统功能以治疗肿瘤，具有反应快、副作用小、疗效持久等特点。
但是，该类疗法也存在一定的缺陷，如，受肿瘤微环境等因素影响而不能充分的发挥抗肿瘤作用，且抗肿瘤效应容易受到肿瘤微环境的调控而被抑制，在部分肿瘤中响应率低，对于部分病人而言疗效甚微。因此探究肿瘤免疫治疗的调控机制，进一步开发新的靶点和治疗策略以提高免疫细胞免疫效应，尤其是T细胞抗肿瘤活性，仍是目前基础研究和临床研究的焦点。
在肿瘤发生、进展的过程中，表现较为明显的特征之一就是肿瘤微环境的构成，具体的，肿瘤中的免疫抑制性基质细胞、髓系细胞、淋巴系细胞以及肿瘤细胞自身，共同构成免疫抑制性的肿瘤微环境。该类肿瘤微环境会抑制如CD8+T细胞免疫细胞的抗肿瘤活性，且除了如营养物质葡萄糖等匮乏、低氧状态等肿瘤微环境特性而引起免疫细胞效应功能的抑制外，部分研究也发现肿瘤微环境可以通过代谢调控而影响免疫细胞抗肿瘤效应。其中就有研究指出，胆固醇代谢重编程可能影响CD8+T细胞的活化，在肿瘤免疫治疗中调控CD8+T细胞抗肿瘤活性。在此基础上，现有技术展开有就胆固醇相关调控基因，如PSCK9等，在肿瘤免疫治疗中的作用的研究，旨在从代谢层面研究提高免疫治疗的策略。但是，近来也有研究表明，PCSK9缺陷导致的肿瘤生长衰减不受宿主LDLR状态或胆固醇水平影响。所以，肿瘤组织是否通过影响免疫细胞胆固醇代谢而抑制相应的抗肿瘤效应，且是否有其他机制影响胆固醇代谢相关基因、蛋白而抑制免疫细胞抗肿瘤活性均不可得知。而本申请则意在研究免疫细胞胆固醇代谢相关基因、蛋白与肿瘤微环境、免疫效应受抑制等表现的相关性，探索能解决现有技术中免疫治疗受抑制等问题的治疗策略以及相应的靶点，以获得新的治疗靶点、策略而提高免疫细胞尤其是T细胞的抗肿瘤活性，弥补现有技术免疫治疗所存在的空缺。
发明内容
本发明旨在针对上述现有技术的至少一种不足，提供LDLR在肿瘤免疫治疗、增强免疫细胞免疫效应中的应用，通过减小LDLR表达受到的抑制或促进LDLR表达、过表达LDLR，能够促进TCR信号转导，提高免疫细胞的抗肿瘤活性，增强包括CD8+T细胞的免疫细胞的免疫效应，以提高肿瘤免疫治疗效果；提供新的免疫治疗靶点和策略，弥补现有技术免疫治疗所存在的空缺。
本发明的一个目的在于提供LDLR基因、其蛋白或其蛋白中间体作为免疫细胞上靶点在制备肿瘤免疫治疗和/或增强免疫细胞免疫效应的药物中的用途。在本发明的一个实施例中，发现肿瘤浸润CD8+T细胞胆固醇转运受体低密度脂蛋白受体(Low DensityLipoprotein Receptor，LDLR)呈现表达下调的状态，且在进一步研究中，发现LDLR敲除后，CD8+T细胞增殖、细胞因子IFNγ和TNFα产生、颗粒酶B(GzmB)释放下调，同时，细胞毒性T(CTL)细胞免疫突触形成、肿瘤杀伤活性显著下调。而在LDLR过表达的免疫细胞中，其免疫细胞抗肿瘤效应得到增强。且LDLR调控CTL细胞因子的产生以及CTL的杀伤活性并不完全依赖于LDL摄取。一方面表明了LDLR通过除胆固醇摄取外的其他机制影响免疫细胞的抗肿瘤活性，另一方面由实施例结果也表明，肿瘤浸润CD8+T细胞中LDLR下调是引起免疫细胞免疫效应受抑制的原因之一，且LDLR的过表达能促进包括CD8+T细胞的免疫细胞的免疫效应。所以，LDLR能够作为一个靶点存在，以实现在肿瘤免疫治疗或增强包括CTL细胞的免疫细胞的免疫效应上的应用。同时，LDLR基因表达或已形成蛋白后的过程都会受到调节而影响到免疫细胞的免疫效应，即LDLR基因、LDLR蛋白、LDLR蛋白中间体也应被保护，作为靶点应用于肿瘤免疫治疗或增强免疫细胞免疫效应的过程中。
本发明的另一目的在于提供LDLR基因表达或LDLR蛋白的调节剂在制备肿瘤免疫治疗和/或增强免疫细胞免疫效应的药物中的应用。进一步地，通过调节LDLR基因表达或LDLR蛋白能够直接影响免疫细胞的LDLR含量，从而调节相应的活性、免疫效应。进一步地，所述LDLR基因表达或LDLR蛋白的调节剂包括促进LDLR基因表达、避免LDLR蛋白减少的正向调节剂。有助于促进LDLR参与TCR信号转导，增强免疫细胞免疫效应，尤其是提高活化的CTL的抗肿瘤活性，促进对肿瘤的免疫杀伤作用。
进一步地，上述的肿瘤包括实体瘤、血液瘤。
进一步地，上述的肿瘤包括结直肠癌、肺癌和乳腺癌。
进一步地，LDLR基因表达或LDLR蛋白的调节剂包括PCSK9抑制剂。PCSK9是LDLR的一种调控蛋白，其介导LDLR的内吞和降解，本发明的一个以上实施例中表明，肿瘤组织PCSK9的表达参与调控CD8+T细胞的LDLR表达，且敲低/敲除PCSK9后能促进免疫细胞免疫效应、抗肿瘤效果。进一步地，PCSK9抑制剂包括PCSK9抗体、CRISPR/Cas9制剂、PCSK9 shRNA和/或PF-06446846。
进一步地，肿瘤免疫治疗和/或增强免疫细胞免疫效应的药物包括调节免疫细胞上LDLR含量、调节免疫细胞细胞膜CD3含量、调节免疫细胞上LDLR与TCR/CD3复合体相互作用、调节TCR信号转导、调节免疫突触形成和/或调节CD3转运至细胞膜的药物。
在本发明的一个实施例中，发现敲低LDLR后，免疫细胞的免疫突触形成也受到抑制，所以，LDLR调节剂还能应用于调节免疫突触形成的药物中。而且，本发明的一个以上实施例还表明，LDLR能够与TCR/CD3相互作用，调控TCR循环利用及信号转导通路，包括参与TCR复合体配体CD3转运的调控，从而直接影响免疫细胞的免疫效应、抗肿瘤活性。其调节蛋白PCSK9也是通过抑制LDLR-TCR信号通路而抑制CD8+T细胞抗肿瘤活性，相应的，PCSK9抑制剂也是通过减少PCSK9对LDLR-TCR信号通路的抑制而提高CD8+T细胞抗肿瘤活性，所以包括PCSK9抑制剂的LDLR调节剂也能应用于制备括调节TCR信号转导和/或调节CD3转运至细胞膜的药物中。在本发明的一个实施例中发现，PCSK9能调节免疫细胞膜上LDLR含量、CD3表达，所以包括PCSK9抑制剂的LDLR调节剂也能应用于制备调节免疫细胞上LDLR含量、调节免疫细胞细胞膜CD3含量的药物中。
进一步地，增强免疫细胞免疫效应包括促进T细胞的增殖和/或包括IFNγ、TNFα的细胞因子及颗粒酶B的产生和释放，免疫细胞包括CD8+T细胞。
本发明的再一目的在于提供促进LDLR与TCR/CD3复合体相互作用的药剂在制备肿瘤免疫治疗和/或增强免疫细胞免疫效应的药物中的应用。本发明的实施例表明，LDLR与TCR/CD3复合体相互作用会直接影响到TCR的信号转导通路，而影响免疫细胞的抗肿瘤活性、免疫效应因子的产生和释放。
进一步地，促进LDLR与TCR/CD3复合体相互作用的药剂包括促进免疫细胞LDLR表达的药剂和/或解除免疫细胞LDLR表达受抑制状态的药剂。除了促进LDLR表达而促进LDLR与TCR/CD3复合体相互作用外，在肿瘤微环境下，LDLR表达往往是受抑制状态，而此时通过调节引起抑制情形的上游调节基因的表达，如抑制PCSK9，以解除LDLR表达受抑制的状态，也能促进LDLR与TCR/CD3复合体的相互作用，从而促进包括CTL的免疫细胞的增殖或分泌免疫效应因子，免疫效应因子包括具有杀伤作用的细胞因子、颗粒酶B等，以提高肿瘤微环境中免疫细胞活性，尤其是抗肿瘤活性。
本发明的再一目的在于提供一种试剂盒，包括促进免疫细胞LDLR表达的药剂、解除LDLR表达受抑制状态的药剂、促进LDLR与TCR/CD3复合体相互作用的药剂和/或免疫检查点阻断剂。进一步地，所述免疫检查点阻断剂为PD-1抗体。
本发明的再一目的在于提供LDLR作为免疫细胞内药物促进靶点在制备肿瘤过继性细胞免疫治疗药物中的应用。
本发明的再一目的在于提供一种用于过继性细胞免疫治疗的T淋巴细胞，其特征在于，LDLR基因过表达。
在本发明的一个实施例中，过表达LDLR的CD8+T细胞效应功能得到增强，细胞因子TNFα产生及颗粒酶B(GzmB)释放得到显著增加，杀伤活性也得以增加。且通过过继转输过表达LDLR的CTL进行肿瘤治疗时，发现转输LDLR过表达CTL后，肿瘤生长明显受到抑制，表明LDLR能够作为免疫细胞内药物促进靶点应用于制备肿瘤过继性免疫治疗药物中，且相应形成的T细胞，同样能用于过继性细胞免疫治疗。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：揭示了胆固醇代谢相关基因、蛋白对免疫细胞免疫效应、抗肿瘤活性的调控作用，且实际上该调控过程不完全依赖于胆固醇的摄取，从而为了肿瘤免疫治疗或增强免疫细胞免疫效应提供新的策略和靶点，克服了现有技术存在的技术偏见。具体的，发现LDLR能够直接影响免疫细胞的TCR循环利用和信号转导通路，从而使得相应的CTL具有不同的效应功能表现。肿瘤浸润T细胞中，其LDLR表达下调，相应的效应功能、抗肿瘤活性下降，而过表达LDLR则能促进CTL的抗肿瘤活性。所以，LDLR基因或蛋白能作为靶点被调节以改善相应CTL的杀伤效果，从而促进抗肿瘤作用。应用于肿瘤免疫治疗中，有助于显著提高CD8+T细胞抗肿瘤活性，提高肿瘤免疫治疗效果，延长病人生存期。且LDLR的调节能通过对其调节基因进行调节而实现，包括对PCSK9表达的调节，能够通过抑制肿瘤和/或免疫细胞中PCSK9而至少促进LDLR-TCR通路，从而提高CTL的抗肿瘤作用。在此基础上，还能联合免疫检查点阻断剂PD-1抗体进一步提高免疫治疗的效果。即本发明能为肿瘤治疗，尤其是免疫治疗提供新的治疗方案、靶点，有望应用于临床中以提高肿瘤治疗效果、患者生存率。而揭示的PCSK9、LDLR、TCR关系也能为进一步提高肿瘤免疫治疗效果提供研究基础，促进肿瘤治疗领域的发展。
附图说明
图1显示肿瘤微环境富含胆固醇，但肿瘤浸润CD8+T细胞胆固醇含量降低。
图2显示肿瘤浸润CD8+T细胞中LDLR表达下调。
图3显示LDLR敲除会抑制CD8+T细胞效应功能。
图4显示LDLR过表达会增强CD8+T细胞效应功能。
图5显示LDLR调控CD8+T细胞功能并不完全依赖于LDL/胆固醇摄取。
图6显示LDLR可以与TCR结合，调控CD8+T细胞TCR信号通路。
图7显示肿瘤组织高表达LDLR调控蛋白PCSK9。
图8显示敲除肿瘤细胞PCSK9表达能提高肿瘤浸润CD8+T细胞抗肿瘤活性。
图9显示敲低肿瘤细胞PCSK9表达能提高肿瘤浸润CD8+T细胞抗肿瘤活性。
图10显示敲除CD8+T细胞PCSK9表达能增强CD8+T细胞抗肿瘤活性。
图11显示PCSK9调控CD8+T细胞抗肿瘤活性依赖于CD8+T细胞LDLR表达。
图12显示PCSK9通过抑制LDLR-TCR信号通路调控CD8+T细胞抗肿瘤活性。
图13显示PCSK9抑制剂PF-06446846提高肿瘤免疫治疗效果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。
1、病人和临床样本
石蜡包埋结直肠癌组织样本、临近非肿瘤区域以及肺癌和乳腺癌组织样本来自南方医科大学南方医院病理科组织库。所使用结直肠癌、肺癌和乳腺癌样本已经临床诊断为肿瘤组织。所有涉及病人样本的实验符合赫尔辛基宣言原则且获得南方医科大学医学伦理委员会批准。
2、实验动物
C57BL/6小鼠、Rag2–/–小鼠、Ldlr–/–小鼠、Pcsk9–/–小鼠和OT-I TCR转基因小鼠购自Jackson实验室。Ldlr–/–小鼠、Pcsk9–/–小鼠分别与OT-I小鼠交配并利用PCR方法鉴定小鼠基因型。实验中使用的所有动物都饲养在SPF屏障系统中，所有动物实验都使用年龄和性别匹配的小鼠并进行随机分组。本研究所有动物实验都经过南方医科大学实验动物福利与伦理委员会批准。
3、试剂和抗体
流式细胞术使用抗体anti-CD3ε(145-2C11),anti-CD8(53-6.7),anti-CD44(IM7),anti-CD45(30-F11),anti-IFNγ(XMG1.2),anti-granzyme B(NGZB),anti-TNF-α(MP6-XT22),anti-p-ZAP70/Syk(Tyr319,Tyr352)(n3kobu5),anti-p-BTK/ITK(Tyr551,Tyr511)(M4G3LN),anti-p-Akt(Ser473)(SDRNR)和anti-p-Erk(Thr202,Tyr204)(MILAN8R)均购自Thermofisher。Anti-mouse LDLR(101)购自Sino Biological Inc.
Western blot相关抗体anti-β-actin,anti-GAPDH,anti-CD3ε,anti-CD3γ,anti-CD3ζ购自Santa Cruz Biotechnology。Anti-p-CD3ζ(Tyr142)购自Abcam。Anti-HA购自Sigma。免疫组织化学相关抗体anti-Apolipoprotein B购自Abcam，anti-PCSK9购自SinoBiological，anti-CD3(SP7)购自Abcam。
免疫荧光和PLA相关抗体anti-LDLR购自Lifespan，anti-CD3购自Genetex，anti-CD3ε购自Bio X Cell。Filipin III购自Cayman。PF-06446846购自MedChemExpress。分离组织浸润T细胞相关试剂Type IV Collagenase购自Gibco，DNase I购自Applichem，Hyaluronidase购自Sigma，Percoll购自GE。T细胞激活相关抗体anti-CD3ε(145-2C11)、anti-mouse CD28(37.51,Bio X Cell)购自Bio X Cell。OVA257-264多肽(SIINFEKL)购自上海强耀生物科技有限公司。PCSK9蛋白购自ACROBiosystems。Celltrace CFSE,CelltrackerDeep Red和Cell proliferation Dye eFluor 450购自Invitrogen。Methyl-beta-cyclodextrin(MβCD)和MβCD-coated cholesterol购自Sigma。
4、细胞系
MC38细胞购自广州吉妮欧生物科技有限公司，B16F10和EL4细胞购自ATCC，所有细胞都未有支原体污染。MC38、B16F10和293T细胞在DMEM培养基中培养，EL4细胞在RPMI-1640培养基培养，培养时都添加10％FBS和1％penicillin-streptomycin。通过慢病毒感染MC38细胞或B16F10细胞并通过流式细胞分选构建MC38-OVA或B16F10-OVA细胞。
5、构建PCSK9敲除及敲低细胞系
pLKO.1-shRNA-GFP、psPAX2和VSV-G转染293T细胞包装慢病毒，取含有病毒的培养基上清感染MC38细胞，流式分选GFP+细胞。利用QPCR方法检测敲低效率。
shRNA Sequence(5’-3’)
shPcsk9#1 GCTGATCCACTTCTCTACC
shPcsk9#2 CAGAGGCTACAGATTGAAC
利用Lenti-CRISPR-V2、psPAX2和VSV-G转染293T细胞包装慢病毒，取含有病毒的培养基上清感染MC38或B16F10细胞，流式分选GFP+细胞。分选后的MC38细胞通过有限稀释方法分选单克隆细胞并利用Sanger测序鉴定单克隆细胞基因型。
sgRNA Sequence(5’-3’)
sgPcsk9#1 GCTGATGAGGCCGCACATG
sgPcsk9#2 CTACTGTGCCCCACCGGCGC
sgPcsk9#3 ACTTCAACAGCGTGCCGG
sgLacZ GCGAATACGCCCACGCGAT
6、流式细胞术分析
取处理好的细胞用PBS洗一遍，并利用anti-mouse CD16/32封闭细胞表面Fc受体，随后与相应抗体在4度孵育30分钟进行细胞表面染色。进行细胞因子染色时，使用5μg/mlBrefeldin A处理细胞4小时，收集细胞先进行表面染色，随后利用4％多聚甲醛固定细胞和0.1％Triton X-100通透细胞膜，细胞与相应抗体在4度孵育60分钟进行细胞因子染色。所有实验均使用索尼SA3800流式细胞仪检测，并利用FlowJo软件(Treestar)进行数据分析。
7、免疫组织化学
石蜡包埋病人或小鼠肿瘤组织并切片为5μm厚度，经过脱蜡、复水、抗原修复、封闭内源性过氧化酶活性后，切片用羊血清封闭抗原并分别用抗PCSK9、APOB或CD3抗体4度孵育过夜，随后用抗IgG-HRP孵育并使用3-amino-9-ethylcarbazole(AEC)显色，最后使用苏木精染细胞核。使用蔡司显微镜拍照。
8、实时定量PCR
利用TRIzol抽提RNA，随后利用Hiscript III RT Supermix(诺唯赞)反转录为cDNA，使用QuantStudio实时定量PCR仪器(Thermo Fisher)检测基因表达，以18S为内参。
实时定量PCR所用引物如下表：
Figure BDA0002905492550000081
Figure BDA0002905492550000091
9、分离及激活CD8+T细胞
使用EasySep Mouse
Figure BDA0002905492550000092
CD8+T cell Isolation Kit(Stem Cell)分离纯化
Figure BDA0002905492550000093
CD8+T细胞，利用相应浓度anti-CD3和anti-CD28抗体包被的板子刺激细胞。
10、OVA抗原激活OT-I CD8+T细胞
取OT-I小鼠脾脏磨碎，并使用红细胞裂解液去除红细胞，随后使用10nM OVA257-264多肽和10ng/ml人源重组IL-2(Peprotech)刺激3天，随后将细胞在含有10ng/ml IL-2的培养基中培养进行后续实验。
11、利用CFSE检测CD8+T细胞增殖
利用0.4μM CFSE染料标记分离纯化的
Figure BDA0002905492550000101
CD8+T细胞后，PBS洗3遍去除残存CFSE染料，随后利用anti-CD3和anti-CD28抗体(1μg/ml)刺激48小时或72小时，随后利用流式细胞术检测CD8+T细胞CFSE荧光强度。
12、检测细胞毒性T(CTL)细胞杀伤活性
从OT-I小鼠中分离脾脏细胞，加入OVA257-264和IL-2培养3天，将细胞分化为细胞毒性T细胞。将靶细胞EL4细胞与OVA257-264抗原37度孵育30分钟，并用1μM CellTracker DeepRed(CTDR)标记，而未结合抗原的EL4细胞用0.5μM CFSE染料标记，将两种EL4细胞等比例混合，以不同比例将CTL细胞和EL4细胞共培养4小时，利用流式细胞术检测EL4细胞比例以评估CTL细胞杀伤活性。
13、检测CTL细胞免疫突触形成
将靶细胞EL4细胞与OVA257-264抗原37度孵育30分钟，并用1μM CellTracker DeepRed(CTDR)标记，将CTL细胞用0.5μM CFSE染料标记，将标记好的CTL细胞和EL4细胞等比例混合，培养30分钟后加入等体积4％多聚甲醛室温固定5分钟，利用流式细胞术检测CTDR+CFSE+细胞比例。
14、CTL细胞过表达LDLR
将LDLR编码序列克隆到pMxs-mTFP1质粒中，转染platE细胞包装逆转录病毒，利用含病毒的培养基上清感染OT-I CTL细胞，加入10ng/ml IL-2和10μg/ml polybrene，在离心机中2000rpm 2小时，第二天进行二次感染，随后利用流式细胞分选技术分选mTFP1+的细胞，加入10ng/ml IL-2进行培养。
15、小鼠皮下结直肠癌和黑色素瘤模型
我们利用MC38或MC38-OVA细胞构建小鼠皮下结直肠癌模型，利用B16F10细胞构建小鼠皮下黑色素瘤模型。消化MC38、MC38-OVA细胞或B16F10细胞后用40μm滤器过滤细胞。随后将1×106MC38、MC38-OVA或4×105B16F10细胞接种到小鼠背部皮下。接种6-10天后，每2天测量肿瘤大小，每天记录小鼠存活情况。肿瘤大小＝肿瘤长度×肿瘤宽度。出于伦理考虑，肿瘤大小超过225mm2(15mm×15mm)后小鼠将被处死。
16、T细胞过继转输
将1×106MC38-OVA细胞皮下接种到Rag2敲除小鼠背部，12-14天后将荷瘤小鼠随机分组，分别通过尾静脉注射PBS、1×106WT CTL细胞、LDLR敲除CTL细胞或PCSK9敲除CTL细胞；在LDLR过表达实验中，分别通过尾静脉注射PBS、5×105WT CTL细胞、LDLR敲除CTL细胞、LDLR过表达CTL细胞。每2天测量肿瘤大小，每天记录小鼠存活情况。肿瘤大小＝肿瘤长度×肿瘤宽度。出于伦理考虑，肿瘤大小超过225mm2(15mm×15mm)后小鼠将被处死。
17、CD8抗体清除CD8+T细胞
将6-8周C57BL/6小鼠分组，腹腔注射200μg/mlα-CD8清除抗体(2.43,Bio X Cell)或大鼠IgG抗体(2A3,Bio X Cell)，2天后将1×106MC38细胞接种到小鼠背部皮下，分别在接种肿瘤细胞后第4、8、12、16天注射α-CD8清除抗体或大鼠IgG抗体。
18、PF-06446846和anti-PD-1治疗小鼠结直肠癌和黑色素瘤
将肿瘤大小相似的MC38荷瘤小鼠随机分组，每两天腹腔注射PBS、anti-PD-1抗体(RMP1-14,Bio X Cell,200μg)、PF-06446846(5mg/kg)或者anti-PD-1和PF-06446846联合治疗。从接种肿瘤第8天后注射PF-06446846，共计7次；从接种肿瘤9天后注射anti-PD-1抗体，共计6次。按照之前方法记录肿瘤大小和小鼠存活状况。
19、分离肿瘤浸润淋巴细胞
小鼠在接种肿瘤14-18后将肿瘤取出，剪碎后用胶原酶(210U/ml)、DNA酶(100U/ml)和透明质酸酶(0.5mg/ml)37度消化30分钟，用70μm滤器过滤去除未消化组织，50g离心1分钟后取上清，1000g离心10分钟，弃上清后将细胞进行40％-70％Percoll密度梯度离心，取中间层细胞1000g离心5分钟，得到肿瘤浸润淋巴细胞。为检测细胞因子表达，将肿瘤浸润淋巴细胞用50ng/ml PMA、1μM ionomycin和5μg/ml BFA 37度刺激4小时，随后用流式细胞术检测细胞因子产生。为进一步得到肿瘤浸润CD8+T细胞，利用CD8细胞阳选试剂盒(Stemcell)进行分离纯化。
20、Filipin III染色
将细胞用PBS洗3次，4％多聚甲醛固定，PBS洗3次后用50μg/ml Filipin III染料室温避光染色2小时，用PBS洗8遍去除残余染料，利用蔡司激光共聚焦显微镜(LSM880,AxioObserver)成像并用Image J软件分析数据。
21、使用MβCD和MβCD包被的胆固醇改变细胞膜上胆固醇含量
为了去除细胞膜上胆固醇含量，将CD8+T细胞用PBS洗2次，用1mM MβCD 37度孵育细胞15分钟，PBS洗3次，进行后续实验。
为了增加细胞膜上胆固醇含量，将CD8+T细胞用PBS洗2次，用10μg/ml MβCD包被的胆固醇37度孵育细胞15分钟，用PBS洗3次，进行后续实验。
22、PCSK9或PF-06446846刺激细胞
从小鼠脾脏中分选
Figure BDA0002905492550000121
CD8+T细胞，利用2μg/ml anti-CD3和anti-CD28抗体和5μg/ml PCSK9蛋白刺激CD8+T细胞，检测细胞因子产生。而对于CTL细胞，利用5μg/ml或10μg/ml PCSK9蛋白刺激CTL细胞6小时，进行后续实验。
用5μM或10μM PF-06446846刺激EL4细胞和EL4-OVA细胞24小时，再在PF-06446846刺激下与CTL细胞共培养12小时，进行后续杀伤活性检测实验。
23、免疫荧光实验检测CD3和LDLR共定位
收集CTL细胞并用4％多聚甲醛固定细胞，使用羊血清室温封闭30分钟后，用anti-LDLR(Lifespan)和anti-CD3(Genetex)抗体4度孵育过夜，随后使用Alexa 488-conjugatedgoat anti-rabbit IgG和Alexa Fluor Plus 555-conjugated donkey anti-mouse IgG抗体4度孵育2小时，最后用In Situ Mounting Medium with DAPI(Sigma)封片，使用蔡司激光共聚焦显微镜(LSM880,AxioObserver)采集照片。
24、临近连接技术检测LDLR和CD3相互作用
我们利用Duolink PLA技术(Sigma)检测LDLR和CD3相互作用。首先将细胞用4％多聚甲醛固定，用Duolink Blocking Solution 37度孵育60分钟以封闭非特异性信号，随后使用anti-LDLR和anti-CD3抗体4度孵育12小时，在样品中加入2种PLA探针37度孵育60分钟。经过连接和扩增反应后使用In Situ Mounting Medium with DAPI封片。使用OlympusFV1000或蔡司LSM880激光共聚焦显微镜采集图片并用Image J软件分析。使用Nikon N-SIM+N-STORM显微镜进行TIRF成像。
25、免疫共沉淀
收集EL4细胞和CTL细胞并用NP-40裂解液(50mM Tris-HCl,pH 7.4,155mM NaCl,5mM EDTA,2mM Na3VO4,20mM NaF,complete protease inhibitor cocktail和phosphataseinhibitor cocktail)裂解，使用PierceTMCo-Immunoprecipitation Kit进行免疫共沉淀实验。
26、统计分析
本文所有数据统计都是用GraphPad Prism软件进行分析，统计方法使用t检验或two-way ANOVA，小鼠生存曲线使用Log-rank(Mantel-Cox)方法统计分析；本文所有数据误差线代表标准差；ns,no significance；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001.
试验1
肿瘤微环境富含胆固醇，但肿瘤浸润CD8+T细胞胆固醇含量降低
在被抗原刺激后，CD8+T细胞胆固醇代谢发生重编程，以确保能获得足够的胆固醇进行细胞扩增以及发挥效应功能。部分研究表明，肿瘤微环境内营养和氧气匮乏，为了探究肿瘤微环境中是否存在足量胆固醇以维持CD8+T细胞抗肿瘤活性，本发明人利用免疫组织化学染色方法在病人结直肠癌(图1.a、b)、肺癌(图1.c)和乳腺癌(图1.d)样本中检测了载脂蛋白B(APOB)含量。APOB含量反应了低密度脂蛋白(LDL)/胆固醇含量，染色结果表明，相对于癌旁正常组织，肿瘤组织中含有更多的LDL/胆固醇。同时本发明人建立了MC38细胞盲肠种植小鼠模型(图1.e)和B16F10黑色素瘤肺转移小鼠模型(图1.f)，利用免疫组化方法检测APOB水平，发现在小鼠肿瘤组织中LDL/胆固醇含量也比正常组织中高。即结果表明肿瘤微环境实际上是富含胆固醇的。
为了探究肿瘤浸润CD8+T细胞胆固醇含量，本发明人建立了MC38细胞皮下瘤模型，随后利用Filipin III标记小鼠脾脏CD8+T细胞和肿瘤浸润CD8+T细胞游离胆固醇，通过激光共聚焦成像检测细胞胆固醇含量，发现肿瘤浸润CD8+T细胞胆固醇含量显著下降(图1.g、h)。
以上结果表明，在病人结直肠癌、肺癌、乳腺癌组织样本以及小鼠MC38肿瘤和B16F10肺转移癌样本中LDL/胆固醇含量相对于正常组织增加，但是肿瘤浸润CD8+T细胞的胆固醇含量反而相对于脾脏细胞显著下降。
具体的，图1肿瘤微环境富含胆固醇但肿瘤浸润CD8+T细胞胆固醇含量降低；(a-b)利用免疫组织化学方法检测病人正常结直肠组织和肿瘤组织中APOB水平；(c)利用免疫组织化学方法检测病人正常肺组织和肺癌组织中APOB水平；(d)利用免疫组织化学方法检测病人正常乳腺组织和乳腺癌组织中APOB水平；(e)建立小鼠盲肠种植MC38细胞模型，并利用免疫组织化学方法检测小鼠正常肠组织和肿瘤组织中APOB水平；(f)通过尾静脉注射B16F10细胞建立小鼠黑色素瘤肺转移模型，并利用免疫组织化学方法检测小鼠正常肺组织和肺癌组织中APOB水平；(g-h)通过皮下种植建立小鼠MC38皮下瘤模型，分别分离小鼠脾脏和肿瘤浸润CD8+T细胞，利用Filipin III标记细胞游离胆固醇，进行激光共聚焦成像，分析细胞胆固醇含量；利用t检验方法统计分析；****,P<0.0001。
试验2
肿瘤浸润CD8+T细胞中LDLR表达下调
试验1结果表明，肿瘤浸润CD8+T细胞胆固醇含量下降，为了探究其机制，本发明人建立了MC38细胞皮下接种Rag2敲除小鼠模型，并取OT-I转基因小鼠脾脏细胞培养分化为成熟的杀伤性CD8+T细胞(CTL)，利用尾静脉注射将CTL细胞过继转输到荷瘤小鼠中，分别在3天和7天后分离纯化肿瘤浸润CD8+T细胞(CD8+TILs)。同时，从OT-I转基因小鼠脾脏中分离纯化
Figure BDA0002905492550000141
CD8+T细胞，并利用荧光定量PCR方法分别检测
Figure BDA0002905492550000142
CD8+T细胞、CTL细胞和CD8+TILs中胆固醇代谢通路相关基因的转录水平。
结果表明，相对于过继转输前的CTL细胞，肿瘤浸润CD8+T细胞中胆固醇合成通路相关基因如Srebp1,Srebp2,Hmgcs1,Hmgcr,Sqle,Acaca和Fasn的mRNA水平显著降低(图2.a)，而胆固醇外排相关基因Abca1的mRNA水平显著上升(图2.b)，胆固醇酯酰化修饰相关基因Acat1，Acat2，Nceh的mRNA水平显著下调(图2.c)。同时肿瘤浸润CD8+T细胞中Ifng的mRNA水平也显著下调(图2.d)，该结果也与部分现有研究相一致。随后本发明人检测了胆固醇转运相关基因表达，发现肿瘤浸润CD8+T细胞中胆固醇转运主要受体Ldlr(LDLreceptor)的mRNA水平显著降低，而Ldlr的负调控因子Idol在浸润肿瘤3天的CD8+T细胞中略有下调，而在浸润7天的CD8+T细胞表达上升(图2.e)。紧接着，利用流式细胞术分析检测肿瘤浸润CD8+T细胞中LDLR细胞表面水平，发现相对于CTL细胞，肿瘤浸润CD8+T细胞表面LDLR水平显著下调(图2.f)。
上述结果表明，肿瘤浸润CD8+T细胞中胆固醇转运受体LDLR的mRNA水平及蛋白水平显著下调，这提示着即使肿瘤微环境中存在充足的胆固醇，肿瘤浸润的CD8+T细胞也不能进行有效地摄取。
具体的，图2肿瘤浸润CD8+T细胞LDLR表达下调；(a-d)利用荧光定量PCR方法检测胆固醇合成相关基因(a)、外排相关基因(b)、酯酰化修饰相关基因(c)和Ifng(d)转录水平；(e)利用荧光定量PCR方法检测胆固醇转运相关基因Ldlr和Idol转录水平；(f)利用流式细胞术检测细胞表面LDLR表达水平；利用t检验方法分析转录水平差异；图中，*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001。
试验3
LDLR敲除抑制CD8+T细胞效应功能
为了验证LDLR在CD8+T细胞中的功能，本发明人通过LDLR全身性敲除小鼠(简称Ldlr-/-)继续展开研究。首先，先鉴定了LDLR敲除是否影响T细胞发育。通过分析野生型小鼠(WT)和Ldlr-/-小鼠胸腺(图3.a)和脾脏(图3.b)中CD4细胞和CD8细胞比例，发现LDLR敲除不影响小鼠T细胞发育。随后为验证LDLR对CD8+T细胞效应功能的调控作用，分别从野生型小鼠和Ldlr-/-小鼠脾脏中分离
Figure BDA0002905492550000151
CD8+T细胞，利用anti-CD3和anti-CD28抗体交联激活CD8+T细胞，利用流式细胞术检测其细胞因子产生，发现LDLR敲除后CD8+T细胞活化水平明显下调，且细胞因子IFNγ和TNFα产生及颗粒酶B(GzmB)释放显著下调(图3.c)。
为了探究LDLR是否调控CD8+T细胞增殖速率，利用CFSE染料标记CD8+T细胞，细胞每分裂一代胞内CFSE含量下降一半，因此可以根据CFSE荧光强度分析细胞增殖速率。从结果发现LDLR敲除后CD8+T细胞增殖速率显著下降(图3.d)。
随后，将Ldlr-/-小鼠与OT-I转基因小鼠进行交配，获得了OT-I背景的OT-I Ldlr-/-小鼠。OT-I转基因小鼠的T细胞绝大多数为CD8+T细胞，其TCR可以特异性识别Ovabumin蛋白的257-264肽段(SIINFEKL)。分别培养OT-I小鼠和OT-I Ldlr-/-小鼠的脾脏细胞，将其分化为成熟的杀伤性CD8+T细胞(CTL)。
在CD8+T细胞被抗原激活时，T细胞可以与靶细胞在细胞接触面形成免疫突触(Immunological Synapse)结构，免疫突触的形成有利于CD8+T细胞信号体的稳定，并且CD8+T细胞可以通过免疫突触释放颗粒酶等细胞毒性颗粒，有效地进行靶细胞杀伤。为了探究LDLR对CD8+T细胞免疫突触形成的影响，本发明人用一种悬浮细胞系——EL4细胞孵育OVA257-264肽段，使其可以递呈OVA抗原，随后与CTL细胞共培养，检测免疫突触形成比例。结果发现LDLR敲除后CFSE+CTDR+细胞比例明显下调(图3.e)，说明LDLR敲除抑制CD8+T细胞免疫突触形成。
随后为探究LDLR敲除对CD8+T细胞抗肿瘤活性的调控作用，将CTL细胞与EL4细胞共培养，发现LDLR敲除后CD8+T细胞杀伤活性显著下降(图3.f)。为了进一步确定体内LDLR对CD8+T细胞肿瘤杀伤活性的影响，建立了MC38-OVA细胞皮下种植Rag2敲除小鼠模型，分别将PBS、WT OT-I CTL细胞和Ldlr-/-OT-I CTL细胞通过尾静脉过继转输到荷瘤小鼠中，发现过继转输Ldlr-/-OT-I CTL细胞后肿瘤生长速度比转输WT OT-I CTL细胞更快，小鼠存活时间缩短(图3.g,h)。以上结果表明LDLR敲除可以抑制CD8+T细胞抗肿瘤活性。
具体的，图3LDLR敲除抑制CD8+T细胞效应功能；(a，b)利用流式细胞术检测野生型(WT)小鼠和LDLR敲除(Ldlr-/-)小鼠胸腺(a)和脾脏(b)中CD4细胞和CD8细胞比例；(c)从WT小鼠和Ldlr-/-小鼠脾脏中分离CD8+T细胞，利用anti-CD3和anti-CD28抗体(0，1，2，5μg/ml)交联激活T细胞24小时，检测CD8+T细胞活化(CD44)、细胞因子IFNγ、TNFα产生及颗粒酶B(GzmB)释放；利用two-way ANOVA方法分析统计数据。(d)从WT小鼠和Ldlr-/-小鼠脾脏中分离CD8+T细胞，利用CFSE染料标记细胞，利用anti-CD3和anti-CD28抗体(1μg/ml)激活T细胞72小时，利用流式细胞术检测CFSE荧光强度；利用t检验方法进行统计分析；(e)将EL4细胞与OVA孵育并用CellTracker Deep Red(CTDR)染料标记，并将CTL细胞用CFSE染料标记，将等量CTL细胞与EL4细胞共培养4小时；利用t检验方法进行统计分析；(f)用CTDR染料标记与OVA孵育过的EL4细胞，用CFSE染料标记未孵育OVA的EL4细胞，两种细胞等比例混合后与CTL细胞按照图示细胞数比例共培养4小时，利用流式细胞术检测CTL细胞杀伤能力；利用t检验方法进行统计分析；(g,h)将MC38-OVA细胞通过皮下接种到Rag2敲除小鼠中，利用尾静脉注射将PBS、WT OT-I CTL细胞和Ldlr-/-OT-I CTL细胞过继转输到荷瘤小鼠中，每两天测量记录肿瘤大小(g)，每天记录小鼠生存状况(h)；利用two-way ANOVA方法分析统计数据；图中，***,P<0.001；****,P<0.0001。
试验4
LDLR过表达增强CD8+T细胞效应功能
上述结果表明LDLR敲除抑制CD8+T细胞效应功能，本发明人随后进行了LDLR过表达实验鉴定其对CD8+T细胞功能的调控作用。将LDLR CDS序列克隆到一个表达TFP荧光蛋白的逆转录病毒质粒中，利用platE细胞包装病毒并感染CTL细胞，利用流式分选方法将TFP+细胞分选出来，检测CD8+T细胞效应功能。发现过表达LDLR后CTL细胞细胞因子TNFα产生及颗粒酶B(GzmB)释放显著增加(图4a,b)。随后通过体外细胞杀伤实验，发现LDLR过表达可以增强CTL细胞杀伤活性(图4c)。本发明人进一步建立了MC38-OVA皮下瘤模型，通过过继转输CTL细胞进行肿瘤治疗，发现相对于过继转输WT CTL细胞，转输LDLR过表达的CTL细胞后肿瘤生长速率显著降低，肿瘤生长被明显抑制，同时小鼠生存率明显上升(图4d,e)。以上结果表明LDLR过表达可以增强CD8+T细胞效应功能。
具体的，图4LDLR过表达增强CD8+T细胞效应功能；(a，b)培养WT OT-I小鼠脾脏细胞，将其分化为成熟的CTL细胞，并分别利用对照(Vector)和LDLR过表达(Ldlr OE)逆转录病毒感染CTL细胞，流式分选方法分选出成功感染的细胞后，利用anti-CD3和anti-CD28抗体(1μg/ml)及BFA(5μg/ml)交联激活CTL细胞4小时，检测细胞因子及颗粒酶B表达；利用t检验方法进行统计分析；(c)用CTDR染料标记与OVA孵育过的EL4细胞，用CFSE染料标记未孵育OVA的EL4细胞，两种细胞等比例混合后与CTL细胞按照1:5比例共培养4小时，利用流式细胞术检测CTL细胞杀伤能力；利用t检验方法进行统计分析；(d,e)将MC38-OVA细胞通过皮下接种到Rag2敲除小鼠中，利用尾静脉注射将PBS、WT OT-I CTL细胞、Ldlr-/-OT-I CTL细胞和Ldlr OE OT-I CTL细胞过继转输到荷瘤小鼠中，每两天测量记录肿瘤大小(d),每天记录小鼠生存状况(e)；利用two-way ANOVA方法分析统计数据；图中，ns,no significance；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001。
试验5
LDLR调控CD8+T细胞功能并不完全依赖于LDL/胆固醇摄取
LDLR最基本的功能是介导LDL/胆固醇的转运，而LDL/胆固醇是细胞内胆固醇的重要来源之一，在CD8+T细胞增殖和效应功能中发挥重要调控功能。为了探究LDLR调控CD8+T细胞效应功能的机制，本发明人首先检测了LDLR敲除CD8+T细胞LDL摄取能力，发现当LDLR敲除后，CD8+T细胞基本无法摄取LDL(图5a)，说明CD8+T细胞的LDL摄取完全依赖于LDLR。随后为了探究LDL对CD8+T细胞增殖的影响，用不含脂蛋白的培养基(Lipoprotein deficientserum)培养CTL细胞，发现培养基去除LDL后CD8+T细胞增殖被明显抑制(图5b)，说明LDL的摄取对CD8+T细胞增殖是必需的。
在TCR识别抗原后，CD8+T细胞的胆固醇代谢会发生重编程，以满足细胞活化和增殖过程中胆固醇的供给。通过检测活化CTL细胞的LDLR表达，发现相对于
Figure BDA0002905492550000171
CD8+T细胞，活化的CTL细胞中LDLR表达急剧增加(图5c)。为了探究LDL对CTL细胞效应功能的影响，利用anti-CD3和anti-CD28抗体重刺激WT CTL细胞和Ldlr-/-CTL细胞，发现Ldlr-/-CTL细胞的细胞因子IFNγ、TNFα产生以及颗粒酶B(GzmB)释放下调，在不含LDL的培养基中这种差异并没有改变(图5d,e)，说明LDLR调控CTL细胞的细胞因子产生并不依赖于LDL的摄取。
随后为了进一步探究LDL对CTL细胞杀伤活性的影响，用不含LDL的培养基预处理WT CTL细胞和Ldlr-/-CTL细胞，再将CTL细胞与EL4细胞共培养，发现不含LDL时，Ldlr-/-CTL细胞的杀伤活性仍显著降低(图5.f)。
LDLR敲除后CD8+T细胞的LDL摄取几乎被完全抑制(图5.a)，通过Filipin III染色发现Ldlr-/-CTL细胞的细胞膜胆固醇含量明显降低(图5.g)。有报道发现细胞膜上胆固醇参与T细胞活化，为了探究LDLR是否通过调控细胞膜上胆固醇含量调控CD8+T细胞效应功能，本发明人用MβCD包被的胆固醇处理CTL细胞，人为增加Ldlr-/-CTL细胞的细胞膜胆固醇含量(图5.g)。随后用anti-CD3和anti-CD28抗体重刺激CTL细胞，发现增加胆固醇含量后Ldlr-/-CTL细胞的IFNγ产生仍然显著下调(图5.h)。
以上结果表明，除了LDL/胆固醇的摄取外，LDLR还可以通过其他机制调控CD8+T细胞效应功能。
具体的，图5LDLR调控CD8+T细胞功能并不完全依赖于LDL/胆固醇摄取；(a)在培养基中加入不同浓度的LDL和LDL-Dil，利用流式细胞术检测WT CD8+T细胞和Ldlr-/-CD8+T细胞LDL-Dil摄取；(b)利用CFSE染料标记CD8+T细胞，分别在含有或不含有LDL的培养基中培养CD8+T细胞，利用流式细胞术检测细胞增殖速率；(c)利用流式细胞术检测从脾脏中分选的
Figure BDA0002905492550000181
CD8+T细胞和分化成熟的CTL细胞中LDLR表达。利用t检验方法进行统计分析；(d,e)培养WT OT-I小鼠和Ldlr-/-OT-I小鼠脾脏细胞，将其分化为成熟的CTL细胞，分别用含有LDL或不含LDL的培养基预处理后，利用anti-CD3和anti-CD28抗体(0,0.5,1,2μg/ml)及BFA(5μg/ml)重刺激CTL细胞4小时，检测细胞因子及颗粒酶B表达。利用two-way ANOVA方法进行统计分析；(f)用CTDR染料标记与OVA孵育过的EL4细胞，用CFSE染料标记未孵育OVA的EL4细胞，两种细胞等比例混合后与CTL细胞按照图示比例共培养4小时，利用流式细胞术检测CTL细胞杀伤能力。利用t检验方法进行统计分析；(g)用10μg/ml MβCD包被的胆固醇在37℃处理WT CTL细胞和Ldlr-/-CTL细胞15min后，利用Filipin III染色及激光共聚焦成像检测CTL细胞的胆固醇含量；标尺：10μm；(h)按照(g)方法用MβCD包被的胆固醇处理CTL细胞后，利用anti-CD3和anti-CD28抗体(1μg/ml)及BFA(5μg/ml)重刺激CTL细胞4小时，检测细胞因子IFNγ产生；利用t检验方法进行统计分析；图中，ns,no significance；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001。
试验6
LDLR可以与TCR结合，调控CD8+T细胞TCR信号通路
上述结果表明除LDL/胆固醇的摄取之外，LDLR还可以通过其他机制调控CD8+T细胞效应功能，随后本发明人进一步探究了LDLR调控CD8+T细胞效应功能的分子机制。从前期结果发现，在没有anti-CD3和anti-CD28抗体刺激情况下，LDLR敲除不影响CD8+T细胞的细胞因子产生以及颗粒酶B释放(图3.c)。anti-CD3和anti-CD28抗体刺激可以分别模拟TCR抗原识别和CD80/CD86-CD28结合的共刺激信号，很多研究发现TCR的抗原识别即TCR信号通路受多种因素调控，如激酶、磷酸酶、细胞质膜的脂质和蛋白组成等。为了探究LDLR对TCR信号通路的调控作用，利用anti-CD3和anti-CD28抗体刺激WT CTL细胞和Ldlr-/-CTL细胞，发现Ldlr-/-CTL细胞的CD3ζ(TCR复合体的组分之一)的磷酸化水平明显下降(图6.a)，同时下游信号分子ZAP70、BTK/ITK、ERK1/2和Akt的磷酸化水平也显著下降(图6.b)，说明LDLR敲除可以抑制CTL细胞TCR信号通路。随后发现当用MβCD处理CTL细胞去除细胞胆固醇后，LDLR敲除CTL细胞的CD3ζ磷酸化水平仍显著下降(图6.c)，提示着LDLR可能直接调控TCR信号。
随后我们利用免疫荧光染色探究CD3和LDLR在CTL细胞内的定位，通过激光共聚焦成像结果发现LDLR和CD3共定位在细胞膜上(图6.d)。为了更精确探究LDLR与TCR的相互作用，利用邻位连接技术(Proximal Ligation Assay，PLA)，分别利用识别CD3和LDLR的特异性抗体以及对应的探针，当两种探针距离小于40nm时，连接反应才会发生，最终呈现荧光信号，表明这两种蛋白空间位置非常接近。本发明人在WT CTL细胞中进行PLA实验以及激光共聚焦(Laser scanning confocal microscopy，LSCM)成像时，发现在CTL细胞中有清晰荧光信号点，而在LDLR敲除CTL细胞中荧光信号完全消失(图6.e)，说明在CTL细胞中LDLR可以与CD3相互作用。随后利用全内反射荧光显微镜(total internal reflection fluorescentmicroscope，TIRFM)成像发现LDLR和CD3的相互作用位于CTL细胞质膜或靠近质膜区域(图6.e)。进一步，利用免疫共沉淀(co-IP)方法检测了LDLR和CD3的相互作用情况，发现当在CTL细胞中使用CD3ε抗体进行IP时，LDLR蛋白可以在IP样品中检测出来(图6.f)，而在LDLR-HA过表达的EL4细胞中用HA抗体进行IP时，CD3γ和CD3ε亚基可以在IP样品中检测出来，同时当用MβCD去除细胞质膜胆固醇后CD3γ和CD3ε亚基仍然可以被IP下来(图6.g)，进一步证明LDLR可以与CD3相互作用，且其相互作用不受细胞质膜胆固醇含量影响。
另外，本发明人还发现Ldlr-/-CD8+T细胞表面CD3表达下降(图6.h，i)，为了进一步探究其机制，利用一种蛋白转运抑制剂Brefeldin A(BFA)抑制质膜蛋白循环转运，发现BFA处理后WT CTL细胞膜上CD3表达显著下降，而WT CTL细胞和Ldlr-/-CTL细胞膜上CD3表达差异明显缩小，而阻断蛋白合成(Cycloheximide，CHX)或蛋白酶体抑制剂MG132则没有此现象(图6.j)，提示着LDLR可能参与到细胞质膜TCR的循环转运过程中，因此调控TCR信号通路。随后本发明人检测了阻断蛋白转运后CTL细胞的效应功能，发现阻断后WT CTL细胞和Ldlr-/-CTL细胞的TNFα产生和颗粒酶B(GzmB)释放差异显著缩小(图6.k)。
以上结果表明在CD8+T细胞中LDLR可以与TCR复合体中的CD3蛋白相互作用，作为免疫调控膜蛋白调控TCR信号通路，而不仅仅是LDL转运受体。
具体的，图6LDLR与TCR结合，调控CD8+T细胞TCR信号通路；(a)WT和Ldlr-/-CTL细胞分别用1μg/ml anti-CD3、anti-CD28、anti-Armenian hamster IgG和anti-Syrianhamster IgG抗体刺激0、5、10、15和30分钟，利用免疫印迹方法检测CTL细胞磷酸化CD3ζ、总CD3ζ和β-actin表达；(b)WT和Ldlr-/-CTL细胞按照(a)方法利用抗体刺激10分钟，利用流式细胞术检测ZAP70、BTK/ITK、ERK1/2和Akt磷酸化水平；利用t检验方法进行统计分析；(c)利用1mM MβCD在37℃处理WT和Ldlr-/-CTL细胞15分钟，随后按照(a)方法刺激CTL细胞，通过免疫印迹方法检测CD3ζ磷酸化水平；(d)利用免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜(laserconfocal scanning microscopy，LCSM)检测CTL细胞中CD3和LDLR的细胞定位；标尺：10μm；(e)利用邻位连接技术及激光共聚焦显微镜检测WT和Ldlr-/-CTL细胞中CD3和LDLR相互作用(标尺：20μm)，并用全内反射荧光显微镜(total internal reflection fluorescentmicroscope，TIRFM)成像检测(标尺：10μm)；(f)利用anti-CD3ε抗体在CTL细胞中进行免疫共沉淀实验，通过免疫印迹实验检测IP样品中LDLR水平；(g)利用病毒感染在EL4细胞中过表达带HA标签的LDLR蛋白，随后利用MβCD处理EL4细胞(Ctrl：未用MβCD处理)，并用anti-HA抗体进行免疫共沉淀实验，通过免疫印迹实验检测IP样品中CD3γ和CD3ε水平；(h，i)BFA(5μg/ml)刺激WT和Ldlr-/-CTL细胞2小时，利用流式细胞术检测细胞表面CD3表达；利用t检验方法进行统计分析；(j)分别用CHX(50μg/ml)、MG132(15μM)和BFA(5μg/ml)刺激WT和Ldlr-/-CTL细胞2小时，通过流式细胞术分别检测细胞表面和胞内CD3表达；利用t检验方法进行统计分析；(k)BFA(5μg/ml)预处理WT和Ldlr-/-CTL细胞2小时，随后利用anti-CD3、anti-CD28(0，0.5，1μg/ml)和5μg/ml BFA刺激CTL细胞4小时，通过流式细胞术检测细胞因子产生和颗粒酶B释放；利用t检验方法进行统计分析；图中，ns,no significance；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001。
试验7
肿瘤组织高表达LDLR调控蛋白——PCSK9
本发明人前期利用小鼠过继转输模型发现转输CD8+T细胞72小时后肿瘤微环境中CD8+T细胞LDLR的转录水平和蛋白水平都显著被抑制(图2.e，f)。为了更深入探究肿瘤微环境调控肿瘤浸润CD8+T细胞LDLR表达的机制，建立了MC38-OVA皮下种植Rag2敲除小鼠模型，通过尾静脉注射方式将WT OT-I CTL细胞过继转输到荷瘤小鼠中，随后在转输24小时和48小时后，分离纯化了肿瘤浸润CD8+T细胞，利用QPCR检测LDLR转录水平以及利用流式细胞术检测LDLR表面表达。发现在转输24小时后肿瘤浸润CD8+T细胞表面LDLR蛋白表达已经急剧下降，而LDLR mRNA水平在转输24小时后无显著变化，48小时后才被抑制(图7.a，b)，结果表明除转录水平调控外肿瘤微环境还通过其他途径调控CD8+T细胞表面LDLR蛋白水平。
部分现有研究发现前蛋白转化酶蛋白酶/kexin9型(proprotein convertasesubtilisin/kexin type 9,PCSK9)可以与LDLR结合，介导LDLR的内吞和降解，进而调控LDLR蛋白水平，且PCSK9已被用作治疗高胆固醇血症的靶点。为探究肿瘤免疫过程中PCSK9是否参与调控CD8+T细胞LDLR表达，本发明人首先收集了结直肠癌病人的肿瘤样本并利用免疫组化方法检测了PCSK9水平，发现相对于正常组织，肿瘤组织中PCSK9表达显著升高(图7c-f)。随后检测了结直肠癌样本中CD3+细胞的浸润，通过分析发现肿瘤中PCSK9的表达与CD3+细胞的浸润呈现负相关(图7g，h)。为了进一步验证PCSK9功能，我们在B16F10细胞中敲除PCSK9表达，检测发现PCSK9对肿瘤细胞MHC-I和PD-L1表达无影响(图7i，j)。
具体的，图7肿瘤组织高表达LDLR调控蛋白——PCSK9；(a，b)将MC38-OVA细胞通过皮下种植到Rag2敲除小鼠上，构建皮下瘤模型，将WT OT-I CTL细胞通过尾静脉注射方式过继转输到荷瘤小鼠上，分别在转输24小时和48小时后分离纯化肿瘤浸润CD8+T细胞，通过QPCR检测LDLR转录水平(a)，通过流式细胞术检测LDLR细胞表面水平(b)。利用t检验方法进行统计分析；(c，f)利用免疫组织化学方法检测正常结直肠组织和结直肠肿瘤组织区域PCSK9表达水平；标尺：120μm。利用t检验方法进行统计分析；(d)利用免疫组织化学方法检测正常乳腺组织和乳腺癌组织区域PCSK9表达水平；标尺：120μm；(e)利用免疫组织化学方法检测正常肺组织和肺癌组织区域PCSK9表达水平；标尺：120μm；(g，h)利用免疫组织化学方法分别检测结直肠肿瘤组织区域PCSK9和CD3表达水平，分析PCSK9表达水平与CD3+细胞浸润的相关性；标尺：120μm；(i，j)利用CRISPR/Cas9技术敲除B16F10细胞中PCSK9表达，利用流式细胞术检测细胞MHC-I和PD-L1表达；图中，ns,no significance；**,P<0.01；****,P<0.0001。
试验8
敲除肿瘤细胞PCSK9表达促进肿瘤浸润CD8+T细胞抗肿瘤活性
为了进一步探究肿瘤PCSK9表达和T细胞浸润的关系，利用CRISPR/Cas9技术敲除了MC38和B16F10细胞中PCSK9表达。随后我们将MC38或B16F10细胞皮下种植到C57BL/6小鼠上，发现敲除PCSK9后肿瘤生长速度显著下降，小鼠生存时间显著延长(图8.a-d)。而当将MC38细胞接种到Rag2敲除小鼠上时，敲除PCSK9的MC38肿瘤生长速度与对照无差异(图8e，f)，由于Rag2敲除小鼠缺乏T细胞和B细胞，以上结果提示着肿瘤PCSK9可能调控微环境中适应性免疫细胞效应功能。由于在肿瘤免疫过程中，CD8+T细胞发挥重要功能，利用CD8抗体清除受体小鼠中CD8+细胞，发现清除C57BL/6小鼠中CD8+细胞后，敲除MC38细胞PCSK9表达对肿瘤生长和小鼠存活无影响(图8g，h)。以上结果表明肿瘤表达PCSK9可以抑制CD8+细胞抗肿瘤活性，导致肿瘤免疫逃逸。
具体的，图8敲除肿瘤细胞PCSK9表达促进肿瘤浸润CD8+T细胞抗肿瘤活性；(a，b)分别将PCSK9敲除MC38细胞或对照细胞皮下接种到C57BL/6小鼠上，记录肿瘤大小及小鼠存活情况；(c，d)分别将PCSK9敲除B16F10细胞或对照细胞皮下接种到C57BL/6小鼠上，记录肿瘤大小及小鼠存活情况；(e，f)分别将PCSK9敲除MC38细胞或对照细胞皮下接种到Rag2敲除小鼠上，记录肿瘤大小及小鼠存活情况；(g，h)利用CD8抗体清除C57BL/6小鼠中CD8+T细胞分别将PCSK9敲除MC38细胞或对照细胞皮下接种到C57BL/6小鼠上，记录肿瘤大小及小鼠存活情况；ns,no significance；**,P<0.01；****,P<0.0001。
试验9
敲低肿瘤细胞PCSK9促进肿瘤浸润CD8+T细胞抗肿瘤活性
本发明人同时利用shRNA敲低MC38细胞中PCSK9表达，通过皮下接种构建C57BL/6荷瘤小鼠模型，发现敲低PCSK9后MC38肿瘤生长速度明显减慢，小鼠存活时间延长(图9a，b)。跟PCSK9敲除实验一样，当接种到Rag2敲除小鼠上时，PCSK9敲低MC38肿瘤生长速度、小鼠生存时间与对照肿瘤相比无差异(图9c，d)。因为MC38细胞中shPcsk9#1的敲低效率明显高于shPcsk9#2，因此shPcsk9#1MC38肿瘤生长速率被抑制地更明显(图9a，b，e)。随后我们分离肿瘤浸润淋巴细胞，发现敲低PCSK9的MC38肿瘤中浸润的CD8+T细胞可以产生更多的细胞因子IFNγ和TNFα，CD44hi活化细胞比例也明显增多(图9f)。
具体的，图9.敲低肿瘤细胞PCSK9促进肿瘤浸润CD8+T细胞抗肿瘤活性；(a，b)分别将PCSK9敲低MC38细胞或对照细胞皮下接种到C57BL/6小鼠上，记录肿瘤大小(a)及小鼠存活情况(b)；利用two-way ANOVA方法分析统计数据；(c，d)分别将PCSK9敲低MC38细胞或对照细胞皮下接种到Rag2敲除小鼠上，记录肿瘤大小(c)及小鼠存活情况(d)；利用two-wayANOVA方法分析统计数据；(e)利用QPCR检测MC38细胞中PCSK9敲低效率；(f)分别从对照肿瘤或shPcsk9#1MC38肿瘤中分离肿瘤浸润淋巴细胞，检测CD44水平或利用PMA/Ionomycin/BFA刺激4小时后检测细胞因子IFNγ和TNFα产生；利用t检验进行统计分析；ns,nosignificance；*,P<0.05；**,P<0.01；****,P<0.0001。
试验10
敲除CD8+T细胞PCSK9表达增强CD8+T细胞抗肿瘤活性
CD8+T细胞本身表达的PCSK9对其效应功能的调控并不清楚。因此，本发明人获得了Pcsk9全身性敲除小鼠，随后利用抗体刺激
Figure BDA0002905492550000231
CD8+T细胞检测细胞因子产生，发现PCSK9敲除后CD8+T细胞的细胞因子IFNγ产生和颗粒酶B(GzmB)释放增加，而细胞因子TNFα产生不受影响(图10.a)。为探究PCSK9对CD8+T细胞抗肿瘤活性的影响，将Pcsk9敲除小鼠与OT-I背景小鼠交配，获得Pcsk9-/-OT-I小鼠。通过免疫突触检测(图10.b)和CTL细胞杀伤活性检测(图10.c)，发现CD8+T细胞中敲除PCSK9不影响CTL细胞免疫突触形成，但是可以增强CTL细胞杀伤活性。最后，利用过继转输实验检测敲除PCSK9对CD8+T细胞的体内肿瘤杀伤活性的影响，发现与对照相比，过继转输Pcsk9-/-OT-I CTL细胞后MC38-OVA肿瘤生长速度减慢，小鼠存活时间延长(图10.d，e)。
具体的，图10敲除CD8+T细胞PCSK9表达增强CD8+T细胞抗肿瘤活性；(a)从WT小鼠和Pcsk9-/-小鼠脾脏中分离CD8+T细胞，利用anti-CD3和anti-CD28抗体(0，0.5，1，2μg/ml)交联激活T细胞24小时，检测细胞因子IFNγ、TNFα产生及颗粒酶B(GzmB)释放；利用two-wayANOVA方法分析统计数据；(b)用CFSE染料标记CTL细胞相比，利用CTDR染料标记孵育过OVA的EL4细胞，将CTL细胞与EL4细胞共培养30分钟，利用流式细胞术检测免疫突触形成比例；利用t检验进行统计分析；(c)检测WT CTL细胞和Pcsk9-/-CTL细胞杀伤活性；利用CTDR染料标记孵育过OVA的EL4细胞，用CFSE染料标记未孵育OVA的EL4细胞，两种细胞等比例混合；取CTL细胞按照图示比例与EL4细胞共培养4小时，利用流式细胞术检测CTL细胞杀伤活性；利用t检验进行统计分析；(d，e)将MC38-OVA细胞通过皮下接种到Rag2敲除小鼠中，利用尾静脉注射将PBS、WT OT-I CTL细胞、Pcsk9-/-OT-I CTL细胞过继转输到荷瘤小鼠中，记录肿瘤大小(d)及小鼠生存状况(e)；利用two-way ANOVA方法分析统计数据；图中，ns,nosignificance；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001。
试验11
PCSK9调控CD8+T细胞抗肿瘤活性依赖于CD8+T细胞LDLR表达
为了探究PCSK9调控CD8+T细胞抗肿瘤活性的机制，本发明人分别在接种对照MC38-OVA或PCSK9敲除MC38-OVA细胞的Rag2敲除小鼠中过继转输PBS、WT OT-I CTL细胞、Ldlr-/-OT-I CTL细胞，发现当转输PBS时，对照和PCSK9敲除MC38肿瘤生长无差异(图11.a-c)；当转输WT OT-I CTL细胞时，PCSK9敲除MC38肿瘤生长减慢(图11.d-f)，这也与之前结论一致；而当过继转输Ldlr-/-OT-I CTL细胞时，对照和PCSK9敲除MC38肿瘤生长无差异(图11.g-i)。上述结果表明PCSK9抑制CD8+T细胞抗肿瘤活性依赖于CD8+T细胞LDLR表达。
具体的，图11PCSK9调控CD8+T细胞抗肿瘤活性依赖于CD8+T细胞LDLR表达；(a-i)将对照或PCSK9敲除MC38-OVA细胞通过皮下接种到Rag2敲除小鼠中，利用尾静脉注射将PBS(a-c)、WT OT-I CTL细胞(d-f)、Ldlr-/-OT-I CTL细胞(g-i)过继转输到荷瘤小鼠中，记录肿瘤大小及小鼠生存状况；利用two-way ANOVA方法分析统计数据；图中，ns,nosignificance；**,P<0.01；****,P<0.0001。
试验12
PCSK9通过抑制LDLR-TCR信号通路调控CD8+T细胞抗肿瘤活性
本发明人用重组PCSK9蛋白处理CTL细胞，发现PCSK9可以显著抑制CTL细胞表面LDLR表达(图12.a)，同时也会抑制表面CD3表达(图12.b)。随后我们用PCSK9处理CTL细胞后利用anti-CD3和anti-CD28抗体刺激细胞检测TCR信号通路发现，PCSK9可以抑制CTL细胞CD3ζ的磷酸化(图12.c)。通过PLA实验，本发明人发现PCSK9处理后CTL细胞中LDLR与CD3相互作用信号减弱(图12.d)。同时当在
Figure BDA0002905492550000241
CD8+T细胞激活过程中加PCSK9蛋白处理后，CD8+T细胞的活化水平及细胞因子IFNγ和TNFα产生显著下调(图12.e)。同时，将CTL与对照EL4细胞或PCSK9过表达EL4细胞共培养，发现EL4细胞过表达PCSK9后可以明显抑制CTL细胞的杀伤活性(图12.f)。在肿瘤浸润CD8+T细胞中LDLR与CD3相互作用信号也显著降低(图12.g)。以上结果表明PCSK9可以抑制CD8+T细胞LDLR表达及TCR信号转导，进而抑制CD8+T细胞抗肿瘤活性。
为了进一步验证体内PCSK9对TCR的调控作用，分别将对照细胞和PCSK9敲除MC38-OVA细胞接种到Rag2敲除小鼠皮下，随后过继转输WT OT-I CTL细胞，7天后分离肿瘤浸润淋巴细胞，发现相对于CTL细胞，对照MC38肿瘤浸润CD8+T细胞表面CD3表达被抑制，而在敲除MC38-OVA细胞PCSK9表达后，肿瘤浸润CD8+T细胞表面CD3表达的抑制程度减轻，同时细胞因子IFNγ和TNFα产生增加(图12.h-j)。以上结果进一步证明PCSK9对肿瘤浸润CD8+T细胞的抗肿瘤活性的调控作用。
具体的，图12.PCSK9通过抑制LDLR-TCR信号通路调控CD8+T细胞抗肿瘤活性；(a)分别用0、5和10μg/ml PCSK9蛋白处理CTL细胞6小时，利用流式细胞术检测CTL细胞表面LDLR表达；(b)用5μg/ml PCSK9蛋白处理CTL细胞6小时，利用流式细胞术检测CTL细胞表面CD3表达；(c)用5μg/ml PCSK9蛋白处理CTL细胞6小时，分别用1μg/ml anti-CD3、anti-CD28、anti-Armenian hamster IgG和anti-Syrian hamster IgG抗体刺激0、5、10、15和30分钟，利用免疫印迹方法检测CTL细胞磷酸化CD3ζ，总CD3ζ和β-actin表达；(d)PCSK9蛋白处理CTL细胞后利用PLA方法检测LDLR和CD3相互作用。标尺：5μm；(e)利用2μg/ml anti-CD3and anti-CD28刺激
Figure BDA0002905492550000251
CD8+T细胞24小时，在刺激同时加入5μg/ml PCSK9蛋白处理细胞，利用流式细胞检测T细胞活化和细胞因子产生；利用t检验进行统计分析；(f)将CTL细胞分别与对照EL4细胞和PCSK9过表达EL4细胞共培养4小时，利用流式细胞术检测CTL杀伤活性；利用t检验进行统计分析；(g)利用PLA技术检测CTL细胞和肿瘤浸润CD8+T细胞中LDLR和CD3相互作用；标尺：5μm；(h-j)分别将对照细胞和PCSK9敲除MC38-OVA细胞接种到Rag2敲除小鼠皮下，随后过继转输WT OT-I CTL细胞，7天后分离肿瘤浸润淋巴细胞，检测CD8+T细胞表面CD3表达(h，i)以及细胞因子IFNγ和TNFα产生(j)；图中，ns,no significance；*,P<0.05；**,P<0.01；***,p<0.001；****,P<0.0001。
试验13
PCSK9抑制剂PF-06446846促进肿瘤免疫治疗效果
靶向PCSK9-LDLR已经成功应用于临床进行高胆固醇血症的治疗，如靶向PCSK9的抗体Evolocumab和Alirocumab等。本发明人发现PCSK9-LDLR可以调控CD8+T细胞抗肿瘤活性，为了验证靶向PCSK9-LDLR是否具有肿瘤临床治疗潜力，利用PCSK9抑制剂进行小鼠肿瘤治疗，鉴定其应用价值。由于目前应用于临床的PCSK9抗体Evolocumab和Alirocumab是人源化抗体，Evolocumab对小鼠PCSK9蛋白的亲和力(Kd＝17nM)比人PCSK9蛋白亲和力(Kd＝16pM)低1000倍，而Alirocumab对小鼠PCSK9蛋白的亲和力(Kd＝2.61nM)比人PCSK9蛋白亲和力(Kd＝0.58nM)低4.5倍。本发明人也通过体外实验发现Alirocumab对小鼠PCSK9蛋白亲和力比人PCSK9蛋白低。因此本试验利用一种抑制PCSK9蛋白翻译的化学抑制剂PF-06446846，鉴定其肿瘤治疗潜力。
首先利用MC38皮下瘤模型检测PF-06446846对体内肿瘤细胞PCSK9表达的抑制作用，分别腹腔注射5mg/kg PF-06446846到荷瘤小鼠中，注射8次后利用免疫组织化学染色检测肿瘤区域PCSK9表达，发现PF-06446846可以显著抑制PCSK9表达，且抑制肿瘤生长(图13a，b)。随后我们利用PF-06446846预处理EL4细胞，再与CTL细胞共培养，发现PF-06446846处理后明显促进CTL杀伤活性(图13.c)。
进一步利用小鼠肿瘤模型检测PF-06446846的肿瘤治疗效果。分别接种MC38细胞或B16F10细胞到C57BL/6小鼠上，建立皮下瘤模型，发现PF-06446846处理后肿瘤生长速度明显减慢，小鼠生存时间明显延长(图13.d-g)。而把MC38细胞接种到Rag2敲除小鼠上再用PF-06446846处理则对肿瘤生长和小鼠生存时间无影响(图13.h，i)，与之前PCSK9敲除肿瘤模型的结果相一致。以上结果表明PF-06446846可以促进CD8+T细胞抗肿瘤活性，提高肿瘤免疫治疗效果。
随后本发明人检测了PF-06446846与免疫检查点阻断治疗疗法联用是否会进一步提高免疫治疗效果。通过MC38皮下瘤模型我们发现相对于单独治疗，PF-06446846与anti-PD1抗体联用可以更好地抑制肿瘤生长，延长小鼠生存时间(图13.j，k)，提示着PCSK9可以作为肿瘤免疫治疗的新型靶点。
具体的，图13PCSK9抑制剂PF-06446846促进肿瘤免疫治疗效果；(a)将MC38细胞接种到C57BL/6小鼠上，通过腹腔注射方式每两天注射PF-06446846(5mg/kg)，注射8天后利用免疫组织化学方法检测肿瘤区域PCSK9表达；标尺：50μm；(b)从(a)中剥离肿瘤组织，展示肿瘤大小；标尺：10mm；(c)利用PF-06446846预处理EL4细胞24小时，随后在PF-06446846处理下将EL4细胞与CTL细胞共培养12小时，利用流式细胞术检测CTL杀伤活性；利用t检验进行统计分析；(d，e)皮下接种MC38细胞到C57BL/6小鼠上建立荷瘤模型，每两天腹腔注射Vehicle或5mg/kg PF-06446846，记录肿瘤大小和小鼠存活情况；利用two-way ANOVA方法分析统计数据；(f，g)皮下接种B16F10细胞到C57BL/6小鼠上建立荷瘤模型，每两天腹腔注射Vehicle或5mg/kg PF-06446846，记录肿瘤大小和小鼠存活情况；利用two-way ANOVA方法分析统计数据；(h，i)皮下接种MC38细胞到Rag2敲除小鼠上建立荷瘤模型，每两天腹腔注射Vehicle或5mg/kg PF-06446846，记录肿瘤大小和小鼠存活情况；利用two-way ANOVA方法分析统计数据；(j，k)皮下接种MC38细胞到C57BL/6小鼠上建立荷瘤模型，分别用PF-06446846、anti-PD1抗体或者PF-06446846和anti-PD1抗体联用，记录肿瘤大小和小鼠存活情况；利用two-way ANOVA方法分析统计数据；图中，ns,no significance；*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0001。
且结合前述试验可知，除了小分子抑制剂或小分子抑制剂联合PD-1抗体施用能促进CD8+T细胞抗肿瘤活性、提高肿瘤免疫治疗效果外，利用CRISPR/Cas9技术敲除PCSK9或利用PCSK9小分子抑制剂PF-06446846抑制PCSK9表达，都可以显著提高CD8+T细胞抗肿瘤活性，促进肿瘤免疫治疗效果。
总体上，本实施例：发现肿瘤微环境中胆固醇含量并不匮乏，但是肿瘤浸润CD8+T细胞胆固醇含量下降；进一步研究发现肿瘤浸润CD8+T细胞胆固醇转运受体——低密度脂蛋白受体(Low Density Lipoprotein Receptor，LDLR)表达下调，并利用LDLR全身性敲除小鼠检测LDLR对CD8+T细胞功能的影响，发现LDLR敲除后CD8+T细胞增殖、细胞因子IFNγ和TNFα产生、颗粒酶B(GzmB)释放均下调，同时细胞毒性T(CTL)细胞免疫突触形成受抑制、肿瘤杀伤活性显著下调。在机制上，本发明人发现除了介导CD8+T细胞LDL摄取外，LDLR调控CTL细胞细胞因子产生及杀伤活性并不完全依赖于LDL摄取，且LDLR可以与TCR复合体中CD3相互作用，调控TCR循环利用及信号转导通路。肿瘤细胞高表达LDLR调控蛋白PCSK9，PCSK9可以抑制CD8+T细胞膜上LDLR及CD3表达，抑制TCR信号通路，进而抑制CD8+T细胞的细胞因子产生及杀伤活性。利用CRISPR/Cas9技术敲除PCSK9或利用PCSK9小分子抑制剂PF-06446846可以显著提高CD8+T细胞抗肿瘤活性，促进肿瘤免疫治疗效果。上述研究结果表明PCSK9-LDLR作为肿瘤免疫治疗药物靶点具有潜在的、非常重要的临床应用价值，有助于应用于肿瘤免疫治疗、增强免疫细胞免疫效应的药物制备中，以获得更为有效的免疫治疗药物，改善免疫治疗疗效，促进肿瘤免疫治疗领域发展。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.LDLR基因、其蛋白或其蛋白中间体作为免疫细胞上靶点在制备肿瘤免疫治疗和/或增强免疫细胞免疫效应的药物中的应用。
2.LDLR基因表达或LDLR蛋白的调节剂在制备肿瘤免疫治疗和/或增强免疫细胞免疫效应的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，LDLR基因表达或LDLR蛋白的调节剂包括PCSK9抑制剂。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，肿瘤免疫治疗和/或增强免疫细胞免疫效应的药物包括调节免疫细胞上LDLR含量、调节免疫细胞细胞膜CD3含量、调节免疫细胞上LDLR与TCR/CD3复合体相互作用、调节TCR信号转导、调节免疫突触形成和/或调节CD3转运至细胞膜的药物。
5.根据权利要求2～4任一项所述的应用，其特征在于，增强免疫细胞免疫效应包括促进T细胞的增殖和/或包括IFNγ、TNFα的细胞因子及颗粒酶B的产生和释放，免疫细胞包括CD8+T细胞。
6.促进LDLR与TCR/CD3复合体相互作用的药剂在制备肿瘤免疫治疗和/或增强免疫细胞免疫效应的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，促进LDLR与TCR/CD3复合体相互作用的药剂包括促进免疫细胞LDLR表达的药剂和/或解除免疫细胞LDLR表达受抑制状态的药剂。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括促进免疫细胞LDLR表达的药剂、解除LDLR表达受抑制状态的药剂、促进LDLR与TCR/CD3复合体相互作用的药剂和/或免疫检查点阻断剂。
9.LDLR作为免疫细胞内药物促进靶点在制备肿瘤过继性细胞免疫治疗药物中的应用。
10.一种用于过继性细胞免疫治疗的T淋巴细胞，其特征在于，LDLR基因过表达。
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