CN113866416B - 可溶形式Tim3在免疫检查点阻断治疗抵抗的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可溶形式Tim3在免疫检查点阻断治疗抵抗的应用，属于生物医药和分子生物学技术领域。本发明通过研究发现，可溶形式Tim3不仅在PD‑1阻断治疗不响应的NSCLC中显著上调，而且在胆管癌中也显示出较高的血清水平，而胆管癌已被报道对PD‑1阻断治疗具有较强抵抗。重要的是，本发明发现sTim‑3在ICC小鼠模型中诱导PD‑1抗体阻断治疗抵抗，并通过CEACAM1依赖的方式抑制T细胞功能从而促进肿瘤进展。因此人sTim‑3可作为肿瘤进展和对PD‑1阻断治疗耐药的候选生物标志物，并提出了肿瘤环境中Tim‑3介导的免疫抑制和PD‑1阻断治疗抵抗的新机制，具有良好的实际应用之价值。

Description

可溶形式Tim3在免疫检查点阻断治疗抵抗的应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及可溶形式Tim3在免疫检查点阻断治疗抵抗的应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
免疫细胞，特别是T细胞在肿瘤微环境中经常会发生耗竭。耗竭的T细胞表现出程序性细胞死亡受体1 (PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞抗原4 (CTLA-4)等多种抑制受体(免疫检查点)的高表达，效应功能的逐渐丧失以及杀伤肿瘤细胞能力的降低。基于免疫检点分子阻断 (ICB)的癌症免疫治疗可以恢复耗竭的T细胞功能，促进肿瘤的清除。针对PD-1的抗体已经在临床上取得了巨大的成功，为新一代肿瘤免疫治疗方法的发展铺平了道路。尽管如此，在包括非小细胞肺癌(NSCLC)、黑素瘤和肝细胞肝癌(HCC)肿瘤的患者中，仅有一小部分可以受益于PD-1阻断治疗。大多数肿瘤患者对PD-1阻断治疗无反应。PD-1阻断治疗抵抗现象极大地限制了其临床应用。然而，PD-1阻断治疗抵抗的基本机制尚未完全阐明。寻找肿瘤患者抗PD-1阻断治疗抵抗的预测生物标志物及其机制具有重要的临床意义。由于血液在临床中容易获得，因此血清生物标志物的鉴定是临床研究的重点。许多免疫检查点分子都有天然的可溶形式，如PD-1、PDL-1、Tim-3、LAG3和CEACAM1。这些可溶分子可通过不同途径调节免疫应答。据报道，可溶性PD-L1介导了对PD-1/PD-L1治疗的抵抗。
Tim-3是于2002年首次克隆的I型跨膜糖蛋白，由IgV区，黏蛋白区，跨膜区和具有酪氨酸磷酸化基序的胞内区组成。在慢性病毒感染和肿瘤进展过程中，Tim-3诱导表达于T细胞上，进而导致T细胞耗竭。多项研究显示Tim-3阻断和PD1/PDL1阻断的联合使用可显著增强T细胞功能，抑制肿瘤生长。基于Tim-3在T细胞耗竭及肿瘤免疫逃逸中的重要作用，Tim-3成为目前研究最多的免疫治疗靶点之一。
像许多抑制性受体一样，Tim-3可以在小鼠中通过mRNA水平上的选择性剪接，或在人中通过基质金属蛋白酶在蛋白水平上切割表面分子，产生天然可溶性分子。小鼠Tim-3胞外段蛋白在体外可促进T细胞增殖和分泌细胞因子，而剪接形式的小鼠sTim-3可削弱T细胞介导的抗肿瘤反应。多项研究报道了人血清中存在sTim-3，血清sTim-3水平与多种疾病进展有关，如脓毒症、系统性红斑狼疮(SLE)、移植物抗宿主病(GVHD)和HIV疾病。然而，sTim-3是否可能是肿瘤患者PD-1阻断治疗的生物标志物，是否在肿瘤患者PD-1阻断治疗中发挥作用，目前尚未有报道。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供可溶形式Tim3在免疫检查点阻断治疗抵抗的应用。本发明通过研究发现，可溶形式Tim3（sTim-3）不仅在PD-1阻断治疗不响应的NSCLC中显著上调，而且在胆管癌中也显示出较高的血清水平，而胆管癌已被报道对PD-1阻断治疗具有较强抵抗。重要的是，本发明发现sTim-3在ICC小鼠模型中诱导PD-1抗体阻断治疗抵抗，并通过CEACAM1依赖的方式抑制T细胞功能从而促进肿瘤进展。因此人sTim-3可作为肿瘤进展和对PD-1阻断治疗耐药的候选生物标志物，并提出了肿瘤环境中Tim-3介导的免疫抑制和PD-1阻断治疗抵抗的新机制。
本发明的第一个方面，提供可溶形式Tim3作为生物标志物在制备肿瘤预后评估和/或免疫检查点阻断治疗抵抗检测产品中的应用。
本发明通过研究发现，sTim-3参与了NSCLC、HBV相关性HCC、胆管癌等多种肿瘤的发病机制，并作为肿瘤进展和免疫检查点阻断治疗（如PD-1抗体阻断治疗）临床反应的潜在生物标志物。
其中，所述肿瘤预后评估包括：受试者血清中可溶性形式Tim-3水平升高，则代表肿瘤的不良预后。
其中，所述肿瘤包括但不限于非小细胞肺癌和消化道肿瘤。
所述消化道肿瘤包括但不限于胃癌、结直肠癌、肝癌和胆管癌。
所述免疫检查点阻断治疗包括CTLA-4阻断治疗和PD1阻断治疗。
本发明的第二个方面，提供一种产品，所述产品包含上述用于检测可溶性形式Tim3的物质，所述产品用于肿瘤预后评估和/或免疫检查点阻断治疗抵抗检测。
其中，检测上述可溶性形式Tim3的物质可以是采用诸如 ELISA、胶体金试纸条、蛋白芯片等现有检测蛋白表达情况的物质。
所述产品包括但不限于用于检测待测样本中所述可溶性形式Tim3表达水平的制剂、试剂盒或相关装置设备。
所述待测样本可为人源样本，更具体的，所述待测样本包括受试者血清。
所述受试者为肿瘤患者，所述肿瘤包括但不限于非小细胞肺癌和消化道肿瘤。
所述消化道肿瘤包括但不限于胃癌、结直肠癌、肝癌和胆管癌。
本发明的第三个方面，提供一种用于肿瘤预后评估和/或免疫检查点阻断治疗抵抗检测的系统，所述系统包括：
i）分析单元，所述分析单元包含：用于确定受试者的待测样品中选自上述可溶性形式Tim3表达水平的检测物质，以及；
ii）评估单元，所述评估单元包含：根据i）中确定的所述可溶性形式Tim3表达水平评估受试者肿瘤预后和/或免疫检查点阻断治疗（包括CTLA-4阻断治疗和PD1阻断治疗）抵抗检测。
本发明的第四个方面，提供所述可溶性形式Tim3作为靶点在肿瘤治疗和/或筛选肿瘤治疗药物中的应用。
其中，所述肿瘤治疗可以为肿瘤免疫治疗。
本发明的第五个方面，提供促进可溶性形式Tim3的表达水平的物质在制备产品中的应用。
所述产品的功能为如下任意一种或多种：
（a1）促进肿瘤生长；
（a2）促进免疫检查点阻断治疗抵抗；
（a3）促进肿瘤免疫抑制微环境；
（a4）抑制T细胞效应功能；
（a5）构建肿瘤细胞和/或肿瘤动物模型。
其中，所述T细胞为效应T细胞，包括但不限于CD4+ T细胞和CD8+ T 细胞；
进一步的，所述抑制T细胞效应功能具体为可溶性形式Tim3通过促进CEACAM1表达进而抑制效应T细胞的效应功能，表现为降低细胞因子的表达。
所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。
本发明的第六个方面，提供抑制可溶性形式Tim3的表达水平的物质在制备产品中的应用。
所述产品的功能为如下任意一种或多种。
（b1）抑制肿瘤生长；
（b2）抑制免疫检查点阻断治疗抵抗；
（b3）抑制肿瘤免疫抑制微环境；
（b4）促进T细胞效应功能；
（b5）肿瘤治疗。
其中，所述T细胞为效应T细胞，包括但不限于CD4+ T细胞和CD8+ T 细胞；
进一步的，所述促进T细胞效应功能具体为抑制可溶性形式Tim3产生，从而进一步抑制CEACAM1表达，进而促进效应T细胞的效应功能，表现为促进效应T细胞的细胞因子的表达。
所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。
根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
优选的，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案首次报道了在非小细胞肺癌患者和一些消化系统肿瘤的血清中可溶性形式Tim-3水平升高，并且sTim-3水平与非小细胞肺癌的不良预后相关。值得注意的是，sTim-3不仅在PD-1阻断治疗不响应的非小细胞肺癌患者（NSCLC）中显著上调，而且在胆管癌中也显示出较高的血清水平，而胆管癌已被报道对PD-1阻断疗法具有较强的抵抗。值得注意的是，在自发的小鼠肝内胆管细胞癌（ICC）模型和皮下植入肿瘤模型中，sTim-3的过表达促进了肿瘤的进展，而不依赖于表面的全长形式Tim-3，并且sTim-3会在ICC小鼠模型中诱导PD-1阻断治疗的抵抗。
在机制上，本发明发现sTim-3以依赖于CEACAM1的方式抑制T细胞功能。这些发现表明sTim-3可能是PD-1阻断治疗抵抗的预测和靶向生物标志物，并提出Tim-3介导PD-1阻断治疗耐药的新机制，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中sTim-3在多种肿瘤患者血清中上调并与PD-1治疗响应相关；
其中：A为ELISA检测NSCLC患者和健康人血清中可溶形式Tim-3水平；B为可溶形式Tim-3在健康人、鳞状细胞癌（SQ）、原位腺癌（AIS）、微侵袭性肺腺癌（MIA）和侵袭性肺腺癌（IAC）鳞癌患者血清中的表达水平；C为sTim-3高水平和sTim-3低水平NSCLC患者的生存期；D为接受抗PD-1阻断治疗的NSCLC患者的血清sTim-3水平；E为PD-1阻断治疗无效的患者和PD-1阻断治疗响应的NSCLC患者的血清sTim-3水平；F为ELISA检测健康人、胃癌、结直肠癌、肝癌和胆管癌患者血清中sTim-3的水平。
图2 为本发明实施例中血清sTim-3在慢乙肝CHB和HCC患者中的表达水平；
其中：A为健康人、慢乙肝患者和肝癌患者血清中sTim-3的水平；B为慢乙肝患者血清中sTim-3与ALT相关性；C 为慢乙肝患者血清中sTim-3与AST相关性。
图3为本发明实施例中人的T细胞通过ADAM10/17依赖的方式产生sTim-3；
其中：A为使用LPS、anti-human CD3抗体联合anti-human CD28抗体刺激PBMCs后，细胞培养上清中可溶形式Tim-3水平；B为在人Tim-3基因的不同位置引物设计，通过RT-PCR扩增健康人、慢乙肝患者和肝癌患者PBMCs的cDNA的Tim-3；C为使用anti-human CD3抗体联合anti-human CD28抗体或者PHA刺激健康人、慢乙肝患者和肝癌患者PBMCs后，RT-PCR扩增cDNA中的Tim-3；D为使用anti-human CD3抗体联合anti-human CD28抗体)刺激的来源于健康人、慢乙肝患者和肝癌患者的PBMCs，并加入ADAM10的抑制剂GI和ADAM17的抑制剂TAPI-1处理，检测细胞培养上清中的sTim-3水平；E为使用qRT-PCR检测肝癌患者癌和癌旁组织的ADAM10和ADAM17的mRNA表达水平；F为使用qRT-PCR检测健康人、慢乙肝患者和肝癌患者的PBMCs中ADAM10和ADAM17的mRNA表达水平。
图4为本发明实施例中sTim-3过表达促进小鼠ICC的进展；
其中：A为sTim-3蛋白处理HepG2细胞、Huh7细胞、Hepa1-6细胞，CCK8检测肿瘤细胞的增殖；B为自发小鼠肝内胆管细胞癌（ICC）造模方案图；C为高压注射sTim-3/AKT/NICD1质粒和对照vector/AKT/NICD1质粒3周后，活体成像检测小鼠肝脏的荧光素酶信号；D为sTim-3/AKT/NICD1小鼠和对照vector/AKT/NICD1小鼠的肝重体重比；E为sTim-3/AKT/NICD1小鼠和对照vector/AKT/NICD1小鼠的肝脏外观图片；F为sTim-3/AKT/NICD1小鼠和对照vector/AKT/NICD1小鼠的肝脏HE染色切片；G为sTim-3/AKT/NICD1小鼠和对照vector/AKT/NICD1小鼠的肝脏切片的ki67免疫组化染色；H为sTim-3/AKT/NICD1小鼠和对照vector/AKT/NICD1小鼠的生存期；I为Tim-3敲除小鼠中，接种对照和sTim-3过表达B16-MO5细胞后的肿瘤生长曲线；J为Tim-3敲除小鼠中，接种对照和sTim-3过表达B16-MO5细胞后的小鼠生存期。
图5为本发明实施例中sTim-3过表达促进小鼠黑素瘤的生长；
其中：A为sTim-3蛋白处理B16F10细胞，CCK8检测肿瘤细胞的增殖；B为利用慢病毒过表达载体或者腺相关病毒载体在B16-MO5肿瘤细胞中过表达sTim-3，CCK8检测肿瘤细胞的增殖；C为慢病毒过表达载体在B16-MO5肿瘤细胞中过表达sTim-3后，EdU检测肿瘤细胞增殖；D为高压注射小鼠sTim-3质粒和对照质粒的ICC模型小鼠的生存期；E为高压注射小鼠sTim-3质粒和对照质粒的ICC模型小鼠的活体成像图片；F为接种对照和sTim-3过表达B16-MO5细胞后的小鼠血清中的sTim-3水平；G为接种对照和sTim-3过表达B16-MO5细胞后的肿瘤生长曲线；H为接种对照和sTim-3过表达B16-MO5细胞后的小鼠生存期。
图6为本发明实施例中sTim-3促进PD-1抗体阻断治疗抵抗；
其中：A为ICC小鼠模型中进行PD-1阻断抗体治疗方案示意图；B为经过PD-1抗体或者IgG处理的vector/AKT/NICD1小鼠的活体成像代表图；C为经过PD-1抗体或者IgG处理的vector/AKT/NICD1小鼠的活体成像数据统计图；D为经过PD-1抗体或者IgG处理的sTim-3/AKT/NICD1小鼠的活体成像代表图；E为经过PD-1抗体或者IgG处理的sTim-3/AKT/NICD1小鼠的活体成像数据统计图；F为经过PD-1抗体或者IgG处理的vector/AKT/NICD1和sTim-3/AKT/NICD1小鼠的生存期。
图7为本发明实施例中过表达促进了小鼠肿瘤微环境的抑制性；
其中：A为接种对照和sTim-3过表达B16-MO5的小鼠的肿瘤浸润免疫细胞方案图；B为接种对照和sTim-3过表达B16-MO5小鼠的肿瘤浸润CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的数量；C为流式检测小鼠肿瘤浸润CD8+ T细胞上PD-1表达水平；D为流式检测小鼠肿瘤浸润CD8+ T细胞上LAG-3表达水平；E为流式检测小鼠肿瘤浸润CD8+ T细胞分泌IFN-γ能力；F为流式检测小鼠肿瘤浸润CD8+ T细胞分泌TNF-α能力；G为流式检测小鼠肿瘤中Treg细胞比例；H为流式检测小鼠肿瘤中MDSC细胞比例。
图8为本发明实施例中sTim-3过表达抑制了小鼠肿瘤微环境中CD4+ T细胞功能；
其中：A为流式检测小鼠肿瘤浸润CD4+ T细胞上PD-1表达水平；B为流式检测小鼠肿瘤浸润CD4+ T细胞上LAG-3表达水平；C为流式检测小鼠肿瘤浸润CD4+ T细胞分泌IFN-γ能力；D为流式检测小鼠肿瘤浸润CD4+ T细胞分泌TNF-α能力。
图9为本发明实施例中sTim-3体外抑制T细胞效应功能；
其中，A为sTim-3蛋白和anti-Tim-3抗体处理OT-Ⅰ小鼠的T细胞，流式细胞术检测TNF-α、IFN-γ和IL-2的分泌；B为利用逆转录病毒载体在OT-ⅠT细胞上过表达sTim-3，流式细胞术检测IFN-γ的分泌；C为利用逆转录病毒载体在OT-ⅠT细胞上过表达sTim-3，检测杀伤肿瘤细胞能力；D为使用anti-CD3和CD28抗体刺激OT-Ⅰ T细胞，并加入sTim-3蛋白处理，利用western blot检测PLCγ、ZAP-70、LCK和Erk1/2的磷酸化水平；E为对sTim-3处理的OT-Ⅰ T细胞进行转录组测序，进行差异基因分析；F为对测序结果的GSEA分析结果；G为使用sTim-3处理肝癌患者PBMCs，经过anti-CD3/CD28刺激后，Elisa检测细胞上清中IFN-γ和TNF-α水平；H为使用sTim-3处理肝癌患者肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），经过anti-CD3/CD28刺激后，Elisa检测细胞上清中IFN-γ和TNF-α水平。
图10为本发明实施例中sTim-3体外处理降低T细胞细胞因子的mRNA水平；
其中：A为使用sTim-3处理OT-Ⅰ T细胞，经过anti-CD3/CD28刺激后，qRT-PCR检测IFN-γ、TNF-α和IL-2 的mRNA水平；B为GSEA分析细胞迁移相关的负调控特征基因。
图11为本发明实施例中CEACAM-1在人PBMCs中不表达，表达于人TIL和小鼠的CTLs；
其中：A为流式检测人PBMCs上磷脂酰丝氨酸(PS)，半乳糖凝集素-9,CEACAM1,HMGB1表达水平；B为流式检测肝癌患者PBMCs上CEACAM1表达；C为流式检测活化的OT-Ⅰ T细胞上CEACAM1表达；D为流式检测肝癌患者癌和癌旁组织浸润的CD4+和CD8+ T细胞上CEACAM1表达典型图；E为流式检测PHA刺激后Jurkat细胞上CEACAM1表达。
图12为本发明实施例中sTim3通过CEACAM1抑制T细胞效应功能；
其中：A为流式检测肝癌患者癌和癌旁组织浸润的CD4+和CD8+ T细胞上CEACAM1表达水平；B为sTim-3蛋白处理Jurkat后，qRT-PCR检测IL-2的mRNA水平变化；C为sTim-3蛋白处理过表达CEACAM1的Jurkat后，qRT-PCR检测IL-2的mRNA水平变化；D为敲减OT-Ⅰ T细胞上的CEACAM-1并过表达sTim-3，检测其杀伤肿瘤功能；E为敲减OT-Ⅰ T细胞上的CEACAM-1后并过表达sTim-3，流式检测其IFN-γ、TNF-α和IL-2的分泌能力。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例
实验方法
1、标本处理方法
防凝血标本经过1200r/5min离心后分别收获血清和细胞沉淀，血清用于ELISA检测sTim-3，细胞沉淀再经过两次红细胞裂解液裂解后收获外周血免疫细胞，加入trizol后提取RNA，反转录成cDNA。
2、sTim-3检测
取出试剂盒中的微孔板，每个孔中加入100μl RD1W，接着向每孔中加入50μl样品，置于微孔板摇床室温孵育1h，弃上清，每孔加入400μl清洗液清洗，重复4次，每孔加入200μlTim-3抗体，置于微孔板摇床室温孵育1h，重复洗板步骤，加入200μl底物，置于实验台室温避光孵育30min，加入50μl终止液，30min内酶标仪双波长(450nm/540nm)测定吸光度。
3、抗体刺激外周血免疫细胞PMBCs
上述方法收获的外周血免疫细胞，计数后种板，加入anti-human CD3抗体和anti-human CD28抗体刺激细胞。具体方法如下：将anti-human CD3抗体和anti-human CD28抗体加入抗体包被液中，使两种抗体浓度均为5μg/ml和2μg/ml，将稀释好的抗体加入24孔板，每孔约250μl-300μl，4℃冰箱过夜处理，弃掉抗体稀释液，即可加入待刺激细胞，细胞密度为1x106个/ml，培养4天后收获上清。上清经冷冻干燥，10倍浓缩后，ELISA检测sTim-3的水平。
4、RT-PCR
5、小鼠CTLs诱导
无菌环境取6-8周龄的雄性OT-Ⅰ小鼠脾脏，研磨后用培养基重悬，注意边研磨边补加培养基。将上一步得到的细胞悬液1200r/5min离心，弃上清，加入5ml红细胞裂解液，冰上或者冰箱4℃裂解10min。1200r/5min离心，弃上清，培养基重悬细胞，离心后5ml培养基(RPMI 1640 + 10% FBS + 50μM β-巯基乙醇+双抗)重悬，计数，以3x106个/ml的密度种板，同时加入OVA257-264刺激细胞，浓度10nm，刺激3天后，离心换液，继续培养2天即可获得CTLs。
6、质粒构建
设计人sTim-3目的基因的引物使用高保真酶PCR扩增出目的基因条带，限制性内切酶切割相应载体质粒（pUltra、pMXs、PT3），使载体质粒线性化，将上述PCR产物和线性化载体琼脂糖凝胶电泳，切胶后，琼脂糖凝胶试剂盒回收目的片段。无缝克隆试剂盒连接目的基因片段和载体片段，50℃，15min水浴后，将目的基因片段和载体片段的连接体转化进入大肠杆菌感受态，涂板长出克隆后，挑出几个单克隆摇菌提取质粒，酶切鉴定阳性克隆，测序序列正确后，转染293细胞验证质粒表达情况。
7、CCK8法检测细胞增殖
不同肿瘤细胞系3000个/每孔种于96孔板，分别在第0、1、2、3和4天，CCK8检测细胞的增殖。具体方法如下：吸弃细胞上清培养基，加入含有CCK8和DMEM(CCK8：DMEM=1：9)的混合液100μl，37℃恒温孵育30min后，采用双波长(450nm/630nm)进行测定，统计实验结果并绘制细胞生长曲线。
8、 EDU检测细胞增殖实验
(1)向待检测细胞中加入EDU（终浓度为10μm），37℃恒温孵育2h。
(2)收细胞，离心后弃上清，每管中加入500μL固定液，室温避光孵育15min。
(3)1500r，5min 离心，弃固定液，加入500μL通透液，室温避光孵育10min。
(4)1500r，5min 离心，弃通透液。1ml PBS重悬细胞沉淀，1500r，5min 离心弃上清(进行Click反应之前要洗掉通透液，尽可能地吸干上清)。
(5)Click点击反应。
(6)1500r，5min 离心弃上清。
(7)1ml PBS重悬细胞沉淀，离心弃上清。
(8)300μL PBS重悬细胞沉淀，过滤后上机。
9、流式检测细胞因子分泌
(1)取足量的EL4细胞，分别与2nm，200pm，20pmOVA257-264抗原孵育1h，PBS洗一遍；
(2)对CTL细胞和EL4细胞进行计数，使CTL细胞与EL4细胞的数量分别为5x105个和2.5x105个，最终体积之和为500μl，向CTL中加入EL4的同时，加入高尔基体抑制剂混匀；
(3)将CTL细胞与EL4混匀，37℃孵箱孵育4-6h；
(4)收细胞，1000r/5min离心，弃上清，50μl PBS重悬细胞；
(5)准备CD8抗体稀释液(1个样品0.25μl抗体)，每个样品加5μl抗体稀释液，将50μl细胞加入抗体稀释液，混匀；剩余细胞混在一起作为空白对照，4℃冰箱染色45min；
(6)500μl PBS+5mM EDTA重悬细胞，1000r/5min离心，弃上清，加入100μl 2% 多聚甲醛固定液，4℃冰箱固定30min；
(7)500μl 穿膜液重悬细胞，1000r/5min离心，弃上清，50μl 穿膜液重悬细胞；
(8)准备TNF-α(PE)，IFN-γ(APC)，IL-2(FITC)抗体稀释液(1个样品0.25μl抗体)，每个样品加5μl抗体稀释液，将50μl细胞加入抗体稀释液，混匀，4℃冰箱染色45min；
(9)500μl 穿膜液重悬细胞，1000r/5min离心，弃上清；
(10)500μl PBS重悬细胞，1000r/5min离心，弃上清；
(11)300μl PBS重悬细胞，滤网过滤后，流式上机检测。
10、肿瘤小鼠模型制备
小鼠黑素瘤模型：5-6 周龄的雄性C57BL/6小鼠和雄性Tim-3 KO小鼠，皮下注射2x105个B16-MO5细胞，待长出肿瘤后（大约6d），每隔一天游标卡尺测量肿瘤短径(a)和长径(b)，计算肿瘤体积V=a2b/2；统计小鼠死亡时间，绘制小鼠生存曲线。
水动力注射Akt/NICD1质粒诱导肝内胆管细胞癌（ICC）模型：按照质粒提取试剂盒步骤提取NICD1、Akt/Fluc/OVAp基因质粒及编码 Sleeping Beauty转座酶的质粒SB100，将NICD1、Akt基因质粒与SB100质粒按每只小鼠12μg：12μg：1μg的比例，一定体积的（体重的10%，例如20g体重使用2ml PBS）0.9%氯化钠溶液中，涡旋混匀，过0.22 μm微孔滤膜，将配置好的质粒经小鼠尾静脉水动力高压注射法注入8周龄的野生型雄性C57BL6小鼠。质粒注射后3~4周可见小鼠肝脏形成胆管癌。
11、肿瘤浸润淋巴细胞的分离及刺激方法
剥离小鼠肿瘤组织，研钵研碎，过滤网，收集细胞液，600r/1min，倾倒上清液进一个干净的50ml离心管，1200r/5min离心，弃上清后，加入8ml percoll工作液，2000r/20min离心，弃上层后，加入5ml红细胞裂解液，冰上裂解10min，1200r/5min离心，弃上清，加入2mlPBS，取少量细胞进行CD8+ T细胞计数，剩余细胞离心后，加入1640完全培养基，PMA(200ng/ml)和离子霉素(1μm)刺激4-6h后收细胞进行流式抗体染色，收细胞4h之前加入高尔基体抑制剂。
12、数据分析
本课题中所有实验至少重复两次。数值处理用 Graphpad Prism 6.0 软件。在分析动物实验结果时，如果样本为非参数分布，使用 Mann–Whitney U test进行非参数检验分析。在分析其他实验结果时，使用 unpaired Two-tailed Student’s t-test进行显著性分析。*表示 p <0.05，**表示 p <0.01，*** 表示 p <0.001，**** 表示 p <0.0001。p <0.05 则认为具有统计学显著性差异，p < 0.01 则认为具有极显著性差异。
实验结果
1、血清sTim-3水平是潜在的肿瘤患者PD-1治疗抵抗的生物标志物
为了评估肿瘤患者血清中sTim-3水平，本发明收集了非小细胞肺癌（NSCLC）患者和健康供者的血清样本。酶联免疫吸附试验（ELISA）结果显示，与健康对照者相比，NSCLC患者血清sTim-3水平显著升高（图1A）。本发明进一步分析了不同NSCLC亚型的血清sTim-3水平，包括鳞状细胞癌（SQ）、原位腺癌（AIS）、微侵袭性肺腺癌（MIA）和侵袭性肺腺癌（IAC）。这四种肺癌患者的血清sTim-3水平均明显高于健康对照组（图1B）。有趣的是，IAC患者血清sTim-3水平高于MIA和AIS患者，说明血清sTim-3水平可能反映了肺癌的恶性程度（图1B）。更重要的是，sTim-3高的患者比sTim-3低的患者生存期短(图1C)，提示高水平的sTim-3与NSCLC患者的预后差相关。考虑到Tim-3参与PD-1阻断免疫治疗的抵抗，本发明提出sTim-3是否在PD-1阻断免疫治疗中发挥作用。本发明检测了接受抗PD-1阻断治疗的NSCLC患者的血清sTim-3水平。结果显示，接受PD-1阻断治疗的患者血清sTim-3水平明显高于未接受PD-1阻断治疗的患者（图1D）。重要的是，本发明在PD-1阻断治疗无效的患者中检测到更高水平的血清sTim-3（图1E），表明sTim-3可能是PD-1阻断治疗抵抗的生物标志物。
为了阐明血清sTim-3升高是肺癌特异性还是肿瘤中普遍存在的现象，本发明进一步通过ELISA检测各种消化道肿瘤患者的sTim-3水平。如图1F所示，与健康对照组相比，胃癌、结直肠癌、肝癌、胆管癌等多种肿瘤患者血清中sTim-3水平均显著升高。有趣的是，胆管癌患者的血清sTim-3水平在消化系统肿瘤患者中最高，而据报道胆管癌患者对PD-1阻断治疗反应较差。
此外，慢性乙型肝炎（CHB）患者血清sTim-3水平也显著高于健康对照组，HBV相关性HCC患者血清sTim-3水平高于CHB患者（图2A）。 CHB患者sTim-3水平与肝细胞损伤指标谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平呈正相关（图2B, 2C）。
以上初步临床结果提示sTim-3可能参与了NSCLC、HBV相关性HCC、胆管癌等多种肿瘤的发病机制，并可能作为肿瘤进展和PD-1抗体阻断治疗临床反应的潜在生物标志物。
2、人的T细胞可以通过ADAM10和ADAM17产生sTim-3
Tim-3主要表达于T细胞和单核细胞上。为了探究哪些细胞产生sTim-3，本发明从健康人分离外周血单个核细胞（PBMCs），并用T细胞刺激（anti-CD3/CD28）或单核细胞刺激物（LPS）进行体外刺激，然后用ELISA检测上清中的sTim-3。之前有研究表明，LPS和anti-CD3/28刺激均可显著诱导sTim-3的产生。然而，在本发明的研究中，在LPS刺激的PBMCs并没有产生明显的sTim-3，而T细胞刺激以剂量依赖的方式显著增加了培养上清中sTim-3的水平（图3A）。这些结果表明，人类活化的T细胞至少部分地负责了sTim-3的产生。
血清中的sTim-3可能是mRNA的剪接变异体，或者是一种被蛋白水平切割的膜Tim-3。剪接变异体在小鼠中有报道，但在人类中没有。为了确认剪接变异体是否存在于人体内，在人Tim-3基因的不同位置设计了两对引物（图3B）。从健康人、CHB或HCC患者的外周血细胞中分离总RNA。RT-PCR结果显示，所有样品中仅扩增出Tim-3 mRNA全长分子，未检测到短的Tim-3剪接变异体（图3B）。 Anti-CD3/28或PHA刺激均不能诱导Tim-3剪接形式的产生（图3C）。这些结果表明，人体内的Tim-3在mRNA水平上可能没有其他剪切形式，血清sTim-3应该是Tim-3的蛋白切割形式。
前人的研究表明脱落酶ADAM10和ADAM17把Tim-3从膜上切下来产生sTim-3。为了研究ADAM10/17在人类sTim-3产生中的作用，本发明使用ADAM10抑制剂GI254023X（GI）或ADAM17抑制剂TAPI-1处理anti-CD3/CD28抗体刺激的PBMCs，并使用ELISA检测上清中sTim-3的产生。结果显示，anti-CD3/CD28抗体刺激诱导肝癌患者PMBC中sTim-3的产生明显高于健康对照组，而GI或TAPI-1处理则完全阻断了sTim-3的产生。重要的是，单独添加GI或TAPI-1可使体外HCC患者 PBMCs的sTim-3产生降低到与健康对照组相似的水平（图3D），这表明ADAM10和ADM17都参与了肿瘤患者sTim-3的生成。相应的，RT-qPCR结果显示，与HCC患者的癌旁组织相比，肿瘤组织中ADAM10和ADAM17 mRNA均显著升高（图3E）。然而，尽管慢乙肝和肝癌患者PBMCs中ADAM10 的mRNA水平显著高于健康人，但这三组间ADAM17的 mRNA水平无显著差异（图3F）。这提示在慢乙肝和肝癌的sTim-3升高中，ADAM10可能发挥比ADAM17更重要的作用。
综上，本发明的研究结果表明，肿瘤患者的T细胞可以通过ADAM10和ADAM17依赖的方式产生sTim-3，而在本发明的研究中没有检测到sTim-3的mRNA剪接形式。
3、sTim-3以不依赖膜型Tim-3的方式促进小鼠体内肿瘤生长
鉴于ADAM10/17切割人Tim-3的位置在近细胞膜端，因此本发明使用人Tim-3的胞外段作为sTim-3来进一步研究其在肿瘤进展中的作用。本发明之前报道过肿瘤细胞上的Tim-3可内源性地直接促进肝癌，因此本发明首先检测sTim-3是否直接调控肿瘤细胞增殖。本发明在体外用纯化的his标记的sTim-3蛋白处理人肝癌细胞HepG2和Huh7细胞，小鼠肝癌细胞Hepa1-6细胞，并用细胞计数试剂盒-8 (CCK8)检测肿瘤细胞的增殖情况。如图4A所示，sTim-3蛋白并不影响以上三种肝癌细胞株在体外增殖能力。此外，his标记的sTim-3蛋白处理也不影响小鼠黑素瘤细胞系B16F10的体外增殖（图5A）。为了验证上述结果，本发明使用人的sTim-3慢病毒表达载体转染小鼠黑素瘤细胞B16-MO5，获得稳定的sTim-3过表达细胞系。与蛋白处理的结果一致，CCK8实验和EdU细胞增殖实验均显示慢病毒过表达sTim-3不影响B16-MO5细胞的体外增殖能力（图5B和5C）。为了，本发明使用腺相关病毒(AAV)载体过表达sTim-3时，也得到了类似的结果，排除了慢病毒系统随机整合的影响（图5B）。综上所述，本发明发现人sTim-3对肿瘤细胞的体外增殖没有直接影响。
基于之前的研究中小鼠sTim-3- Ig融合蛋白与小鼠sTim-3相反的免疫调节作用，接下来本发明探究sTim-3是否会影响肿瘤的体内增殖。本发明首先建立了含萤火虫荧光素酶和卵清蛋白（OVA）肽作为替代肿瘤抗原的自发小鼠肝内胆管细胞癌（ICC）模型。简单地说，本发明利用动力注射（HDI）法，将对照GFP载体（PT3/GFP）或人sTim-3表达质粒（PT3/sTim-3）与表达AKT-Fluc-OVAp质粒（PT3/AKT-Fluc-OVAp）、NOTCH1受体胞内结构域质粒（PT3/NICD1）和睡美人转座酶质粒（SB100）导入肝细胞内诱导ICC形成，并在注射后3周利用IVIS活体成像系统检测荧光素酶信号来监测肿瘤的发展（图4B）。本发明发现sTim-3相比载体对照在肝脏中诱导更高的荧光素酶活性，表明其肿瘤生长更快（图4C）。同样，sTim-3/AKT/NICD1小鼠的肝脏重量高于对照vector/AKT/NICD1小鼠（图4D）。肝脏的宏观图像显示，sTim-3/AKT/NICD1小鼠大部分肝脏明显增大，正常组织几乎完全被多个含有稻草色浆液的囊肿所占据（图4E）。相比之下，对照vector/AKT/NICD1小鼠的肝脏大小相对正常，含有更多的正常组织（图4E）。然后对各组肝脏进行组织学分析。显微镜下观察的结果显示，苏木精和伊红（H&E）染色中，与对照vector/AKT/NICD1小鼠相比，sTim-3/AKT/NICD1小鼠中，肿瘤扩张面积明显取代了正常肝实质(图4F)。此外，Ki-67的免疫组化染色显示，与载体对照相比，sTim-3过表达增加了肝脏中Ki-67的表达，表明肿瘤细胞的增殖活性增加（图4G）。高水平Ki-67通常与不良预后相关，与这一研究结果一致，sTim-3过表达显著降低了ICC模型小鼠的生存时间（图4H）。与人的sTim-3相比，小鼠天然的可溶性Tim-3是mRNA剪接变异体而不是蛋白切割形式，其缺乏黏蛋白结构域，但保留了细胞质结构域。接下来，本发明模仿人的sTim-3的结构，构建了小鼠Tim-3胞外结构域的表达质粒。与人的sTim-3的结果一致，小鼠Tim-3胞外结构域与载体对照相比，也大大促进了ICC小鼠的肿瘤发生，缩短了生存期（图5D和5E）。
为了证明sTim-3的促肿瘤表型是否具有肿瘤类型特异性，本发明还使用了B16-MO5细胞构建皮下黑素瘤模型。将sTim-3慢病毒过表达载体(LV-sTim-3)或空载体(LV-Vector) 稳定转染的B16-MO5细胞分别皮下注射C57BL6小鼠。然后每隔一天监测肿瘤大小和存活率。ELISA结果证实，在接种sTim-3过表达的B16-MO5细胞的小鼠中，成功检测到了高水平的人sTim-3，而在对照组小鼠中则没有（图5F）。正如预期的那样，在小鼠黑素瘤模型中，sTim-3过表达显著促进黑素瘤在小鼠体内的生长并缩短小鼠生存时间（图5G和5H）。因此，无论是自发ICC模型还是皮下肿瘤模型都证实sTim-3在体内显著促进肿瘤生长，并缩短小鼠生存时间。
为了进一步探讨sTim-3的作用是否依赖于膜型Tim-3，本发明在Tim-3敲除（KO）小鼠中构建了B16黑素瘤模型。与野生型C57BL/6小鼠相同，sTim-3过表达促进了Tim-3 KO小鼠中B16-MO5黑素瘤细胞的生长(图4I)，并显著缩短了存活时间(图4J)，说明sTim-3的促肿瘤作用与膜型Tim-3无关。
4、sTim-3在ICC模型中诱导PD-1阻断治疗抵抗
.以上临床结果提示sTim-3可能在PD-1阻断治疗抵抗中发挥作用。接下来，本发明在上述ICC小鼠模型进行用PD-1阻断抗体治疗实验（图6A）。虽然有报道显示，小鼠ICC模型对PD-1抗体阻断不响应，但在本发明的研究中将OVA肽作为替代肿瘤抗原引入ICC模型中，可能会增强ICC模型的免疫原性，促进对PD-1阻断抗体的应答。在HDI Akt/NICD1质粒3周和4周后，活体成像结果显示，PD-1抗体阻断治疗显著降低了对照vector/AKT/NICD1小鼠肝脏中的荧光素酶活性，表明肿瘤进展延迟（图6B和6C）。PD-1抗体阻断治疗也延长了vector/AKT/NICD1小鼠的生存时间（图6F）。值得注意的是，在sTim-3过表达的ICC小鼠（sTim-3/AKT/NICD1）中，HDI 后3周，IgG对照和PD-1阻断抗体治疗之间的肝脏荧光素酶活性没有差异，显示出相似的肿瘤进展（图6D和6E）。与活体成像结果一致，在sTim-3过表达的情况下，PD-1阻断抗体治疗未能延长生存时间，所有小鼠在HDI后4周前死亡（图6F）。这些数据强烈支持sTim-3和膜型Tim-3发挥类似的作用，促进PD-1阻断治疗抵抗的发生。
5、sTim-3促进肿瘤免疫抑制微环境
鉴于本发明的体外研究排除了人sTim-3对肿瘤细胞增殖的直接影响，人sTim-3可能在体内通过抑制免疫应答而促进肿瘤生长。为了探索潜在的免疫机制，本发明把对照载体或sTim-3表达载体稳转的B16-MO5细胞接种C57BL6小鼠，接种后26天时的分离肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）进行免疫表型分析（图7A）。流式分析显示，与对照组相比，sTim-3过表达显著降低了肿瘤浸润CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的数量（图7B）。为了评估sTim-3是否在体内促进T细胞耗竭，本发明分析了T细胞中抑制性受体的表达。流式分析显示，与对照B16-MO5细胞接种的小鼠相比，sTim-3过表达B16-MO5细胞接种的小鼠中，肿瘤浸润性CD8+ T细胞和CD4 + T细胞抑制受体PD-1和TIGIT水平显著升高（图7C，7D，8A和8B）。表明在sTim-3过表达的肿瘤中，T细胞处于更耗竭的状态。与这些结果一致的是，sTim-3过表达显著降低了肿瘤浸润CD8+ T细胞和CD4+ T细胞中效应分子IFN-γ和TNF-α的表达（图7E，7F，8C和8D），证明sTim-3抑制肿瘤浸润T细胞的效应功能。此外，本发明还观察到，在sTim-3过表达B16-MO5肿瘤小鼠中，骨髓源性抑制细胞（MDSC）和CD4+ Foxp3+ T调节性细胞(Tregs)的百分比显著增加（图7G和7H），表明其具有更强的免疫抑制微环境。
因此，上述结果表明，sTim-3过表达促进了抑制性肿瘤微环境，抑制了T细胞介导的抗肿瘤反应，促进了肿瘤在体内的生长。
6、sTim-3在体外抑制CD8+ T 细胞的效应功能
为了进一步探讨sTim-3对T细胞的影响，本发明在体外用his标签的sTim-3蛋白处理OT-Ⅰ TCR转基因CD8+细胞毒T细胞（CTL）。当用OVA257-264肽孵育的EL-4肿瘤细胞刺激CTL时，sTim-3蛋白显著地降低了OT-ⅠCD8+ T细胞分泌效应因子(IFN-γ、TNF-α和IL-2)的能力，而作为对照的Tim-3阻断抗体处理增加CTL的IFN-γ、TNF-α的分泌（图9A）。此外，本发明检测到在抗cd3和抗CD28抗体(抗cd3/CD28)刺激下，sTim-3蛋白处理的OT-ⅠCD8+ T细胞显著下降了IFN-γ、TNF-α和IL-2 的mRNA水平（图10A）。
为了进一步证实sTim-3对T细胞的抑制作用，本发明用sTim-3表达或对照逆转录病毒载体转染OT-ⅠCD8+ T细胞，然后与OVA257-264肽孵育的EL-4肿瘤细胞共孵育，检测T细胞中IFN-γ的产生。正如预期的那样，人sTim-3过表达显著抑制了由200pM和20nM OVA257-264肽刺激的OT-ⅠCD8+ T细胞分泌的IFN-γ（图9B）。重要的是，本发明还观察到，与对照载体相比，过表达sTim-3降低了OT-ⅠCD8+ T细胞对OVA257-264肽孵育的B16F10细胞的杀伤作用（图9C）。
TCR信号对T细胞的激活和增殖至关重要，本发明接下来测试sTim-3是否能抑制TCR信号。western blot检测表明，sTim-3处理降低了PLCγ1、ZAP70、LCK和Erk1/2的磷酸化水平，表明sTim-3确实抑制了TCR信号（图9D）。
为了揭示sTim-3介导的CD8+T细胞功能抑制的潜在分子机制，本发明对存在sTim-3蛋白或对照处理的OT-ⅠT细胞进行了转录组测序(RNA-seq)。一些促进T细胞功能的基因，如ICOS, Sell (CD62L)， IL18R1, Lef1, CXCR4, Slamf6 (Ly108)， CD81, CD226, Sox4，在sTim-3蛋白处理的细胞中表达降低（图9E）。进一步的基因集富集分析(GSEA)显示，与sTim-3处理的细胞相比，对照细胞中T细胞激活相关的特征基因显著富集（图9F），而sTim-3处理的T细胞中富集了细胞迁移相关的负调控特征基因（图10B）。证实了人sTim-3在T细胞中的负调控作用。
为了在人的T细胞中进一步证实上述的结果，本发明在是否存在人sTim-3蛋白的情况下，用anti-CD3/CD28刺激人PBMCs，同时进行sTim-3蛋白处理细胞，然后检测细胞培养上清中IFN-γ和TNF-α的分泌。令本发明惊讶的是，sTim-3蛋白处理并没有改变经TCR刺激的人PBMCs中IFN-γ和TNF-α的产生（图9G）。然而，当使用来自HCC患者的TILs时，本发明发现sTim-3显著抑制TILs的IFN-γ和TNF-α分泌（图9H），这一结果表明sTim-3对人的T细胞的负调控作用可能与肿瘤微环境有关。
7、sTim-3通过CEACAM1 抑制T细胞功能
在本发明的研究中sTim-3和膜型Tim-3都负调控T细胞功能，因此本发明推测sTim-3应该作为配体发挥作用，而不是阻断膜型Tim-3与其配体的相互作用。因此，本发明想知道sTim-3与T细胞上的哪个受体相互作用以抑制T细胞。根据小鼠T细胞、人PBMCs和TILs的不同结果，人PBMCs可能缺乏相应的sTim-3受体。磷脂酰丝氨酸(PS)，半乳糖凝集素-9,CEACAM1, HMGB1是目前已知的Tim-3的结合分子。本发明通过流式细胞分析检测了这四种sTim-3候选受体在健康人PBMCs中的表达水平。PBMCs的T细胞中只有CEACAM1未被检测到（图11A和11B）。相比之下，OT-I CD8+ T细胞表达高水平的CEACAM1（图11C）。重要的是，本发明发现人的CD4+和CD8+ TILs的CEACAM1表达均显著高于肿瘤旁组织的细胞(图11D，图12A)。有报道称CEACAM1也负调控T细胞功能。这些结果表明sTim-3可能结合T细胞上的CEACAM1转导阴性信号。
为了验证本发明的假设，本发明使用即使经过PHA刺激也不表达CEACAM1的人T细胞系Jurkat细胞进行体外研究（图11E和12B）。正如预期的那样，anti-CD3/CD28刺激显著提高了IL-2 mRNA水平，而sTim-3处理没有抑制Jurkat细胞中IL-2 mRNA的诱导（图12B）。然后本发明成功地将人CEACAM1逆转录病毒表达载体转染Jurkat细胞（图12C）。在过表达CEACAM1的Jurkat细胞中，本发明确实观察到sTim-3显著降低IL-2 的mRNA水平（图12C）。本发明通过shRNA敲减OT-I CD8+ T细胞中的CEACAM1进一步证实了这一观点。在CEACAM1沉默的情况下，sTim-3过表达并不改变OT-I CD8+ T细胞的细胞毒性和细胞因子分泌（图12D和12E）。通过过表达和敲低CEACAM1，本发明的数据强有力地支持sTim-3通过CEACAM1抑制T细胞功能。
总之，本发明的研究证实了sTim-3在介导肿瘤免疫逃逸和PD-1阻断治疗抵抗中的关键作用，为揭示肿瘤发生机制和免疫检查点治疗提供了新的思路。本发明提出人类sTim-3作为多种肿瘤进展和PD-1阻断治疗抵抗的候选生物标志物，具有重要的临床意义。此外，本发明的研究也强烈支持在临床肿瘤治疗中通过Tim-3抗体阻断膜型和可溶性Tim-3介导的免疫抑制。靶向ADAM10/17-sTim-3-CEACAM1轴可能会对PD-1阻断治疗抵抗的肿瘤患者具有潜在的益处。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.促进可溶性形式Tim3的表达水平的物质在制备产品中的应用，所述产品的功能为抑制T细胞效应功能；
所述T细胞为效应T细胞，包括CD4+ T细胞和CD8+ T细胞；
所述抑制T细胞效应功能为可溶性形式Tim3通过CEACAM1抑制效应T细胞的效应功能，表现为降低细胞因子的表达；
所述产品为药物或者实验试剂。
2.抑制可溶性形式Tim3的表达水平的物质在制备产品中的应用，所述产品的功能为促进T细胞效应功能；
所述T细胞为效应T细胞，包括CD4+ T细胞和CD8+ T细胞；
所述促进T细胞效应功能为抑制可溶性形式Tim3产生，从而避免可溶性形式Tim3通过CEACAM1抑制效应T细胞的效应功能，表现为促进效应T细胞的细胞因子的表达；
所述产品为药物或者实验试剂。
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