-
Die
Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung nach dem Oberbegriff
des Anspruches 1.
-
Gattungsgemäße Vorrichtungen
dienen zur Durchführung
von Nukleinsäure-Amplifizierungsverfahren
(im folgenden auch PCR-Reaktion genannt). Als Zusatzfunktion bieten
sie die Möglichkeit,
die Bildung der Amplifikationsprodukte (PCR-Produkte) während der
PCR-Reaktion zu verfolgen.
-
Die
Verfolgung der Bildung der PCR-Produkte während der PCR-Reaktion ist
interessant, da die Auswertung der PCR-Reaktion erleichtert bzw.
deutlich beschleunigt wird, wenn man bereits während der Reaktion die amplifizierten
PCR-Produkte quantifizieren
kann und nicht erst in einer nachgeschalteten Analyse. Außerdem können die
während
der PCR-Reaktion gemessenen Werte zur Opti mierung des laufenden
Reaktion verwenden werden, z.B. zur Anpassung der Annealing-Temperatur
etc..
-
Üblicherweise
ist in den in gattungsgemäßen Vorrichtungen
untersuchten PCR-Ansätzen mind.
ein spezieller Fluoreszenzindikator enthalten. Bei dem Fluoreszenzindikator
kann es sich z. B. um fluoreszenzmarkierte DNA-Hybridisierungssonden
handeln, die an komplementäre
Regionen der Target-DNA binden und in gebundenen Zustand nach Bestrahlung mit
Anregungslicht ein meßbares
Fluoreszenzsignal emittieren.
-
Denkbar
ist auch die Verwendung intercalierender Farbstoffe, z.B. Sybr-Green,
die sich unspezifisch in Doppelstrang-DNA einlagern und in eingelagertem
Zustand ein Fluoreszenzsignal abgeben.
-
In
beiden Fällen
läßt sich
eine mit fortschreitender PCR-Reaktion erfolgte Zunahme der PCR-Produkte über einen
meßbaren
Fluoreszenzanstieg verfolgen. Es gibt noch weitere geeignete Fluoreszenzindikatoren,
auf die hier im einzelnen nicht eingegangen werden soll. Es wird
ergänzend
auf die Veröffentlichung
von: "Neusser; Transkript
Laborwelt Nr. 2/2000; "Echtzeit-PCR-Verfahren
zur Quantifizierung von PCR-Produkten" verwiesen, in der die unterschiedlichen
Möglichkeiten
ausführlich
beschrieben sind.
-
Eine
gattungsgemäße Vorrichtung
ist z. B. aus der
EP 0640828 bekannt.
Die bekannte Vorrichtung weist einen Thermocycler mit mehreren temperierbaren
Aufnahmen für
Reaktionsgefäße auf,
der im wesentlichen den üblichen
PCR-Cyclern entspricht. Weiterhin ist eine Beleuchtungseinrichtung vorgesehen,
mit der Anregungslicht in die Aufnahmen des Thermocylcers gestrahlt
werden kann. Zwischen Beleuchtungseinrichtung und Aufnahmen ist ein
dichroitischer Spiegel vorgesehen, der in Abhängigkeit von der Wellenlänge das
auftreffende Licht durchläßt oder
reflektiert. Bei der gattungsgemäßen Vorrichtung
läßt der Spiegel
das von der Beleuchtungseinrichtung kommende Anregungslicht zu den Aufnahmen
durch, und reflektiert das aus den Aufnahmen emittierte etwas langwelligere
Fluoreszenzsignal seitlich auf einen Detektor. Nachteilig an der bekannten
Vorrichtung ist, daß alle
Aufnahmen gleichzeitig von der Beleuchtungseinrichtung mit Anregungslicht
bestrahlt werden. Die von den Aufnahmen emittierten Fluoreszenzsignale
müssen
daher im Detektor ortsabhängig
aufgelöst
werden. Der Aufbau des Detektor ist daher relativ aufwendig. Ein
weiterer Nachteil ist, daß sich
die emittierten Fluoreszenzsignale aus den einzelnen Aufnahmen gegebenenfalls
nicht sauber trennen lassen (Crosstalk), was zu einer Verfälschung
der Ergebnisse führen
kann.
-
Eine
weitere gattungsgemäße Vorrichtung mit
in etwa dem oben beschriebenen grundsätzlichen Aufbau ist aus der
EP 0706649 bekannt. Bei
dieser Vorrichtung ist eine Lichtquelle vorgesehen, die über eine
Multiplexeinrichtung optisch mit den Aufnahmen gekoppelt ist. Die
Multiplexeinrichtung weist jeder Aufnahme zugeordnete Lichtleitfasern
zu, in die das Anregungslicht sequentiell eingekoppelt werden kann.
Die Fluoreszenzsignale werden über
den selben Lichtweg zurück
auf einen dichroitischen Spiegel gestrahlt, der diese auf den Detektor
reflektiert. Die Multiplexeinrichtung ermöglicht einen in sich geschlossenen
Lichtweg von und zu den Aufnahmen und verhindert dadurch den oben
erwähnten
Crosstalk. Nachteilig ist, daß die
beschriebene Vorrichtung sehr aufwending ist.
-
Aufgabe
der Erfindung ist es, ausgehend vom Stand der Technik eine Vorrichtung
bereitzustellen, bei der ein Auftreten von Crosstalk zwischen den Aufnahmen
vermieden werden kann und die mit deutlich geringerem Aufwand als
den bekannten Vorrichtungen zur realisieren ist.
-
Gelöst wird
die Aufgabe mit einer Vorrichtung, die die kennzeichnenden Merkmale
des Anspruches 1 aufweist.
-
Danach
ist vorgesehen, daß die
Beleuchtungseinrichtung mehrere Leuchtdioden aufweist, die jeweils
mindestens einer Aufnahme zugeordnet sind. Ansonsten stimmt der
Aufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtung
im wesentlichen mit der gattungsgemäßer Vorrichtungen überein.
-
Auch
bei der Erfindung ist ein Strahlteiler zwischen den als Beleuchtungseinrichung
dienenden Leuchtdioden und den Aufnahmen des Cyclers vorgesehen,
der das aus den Aufnahmen emittierte Licht seitlich auf einen Detektor
reflektiert, der einen lichtempfindlichen Sensor aufweist.
-
In
einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist jeder Aufnahme
eine Leuchtdiode zugeordnet. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung ist
eine Steuerung vorgesehen, die die Leuchtdioden in vorgegebener
Reihenfolge ein- und
ausschaltet, so daß jeweils
nur eine bzw. eine Gruppe von Aufnahmen beleuchtet wird.
-
Die
Erfindung stellt damit eine gegenüber dem Stand der Technik deutlich
einfacher zu realisierende Vorrichtung da, mit der einzelne Aufnahmen bzw.
Gruppen von Aufnahmen selektiv beleuchtet werden können. Das
aus der bzw. den Aufnahmen imitierte Licht wird vom Strahlteiler
auf den Detektor reflektiert und dort jeweils verarbeitet. Es besteht
keine Gefahr, daß sich
Signale aus den einzelnen Aufnahmen überlagern.
-
Anders
als bei gattunsgemäßen Vorrichtungen
muß ein
in der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendbarer
Detektor nicht in der Lage sein, Signale ortsabhängig aufzulösen, da jeweils nur ein Fluoreszenzsignal
aus einer Aufnahme bzw. ein gemeinsames Signal aus einer Gruppe
von Aufnahmen erfaßt
wird.
-
Im
einfachsten Fall enthält
der Detektor nur einen lichtempfindlichen Sensor und entsprechende optische
Einrichtungen, mit denen das vom Strahlteiler reflektierte Signal
auf den Sensor abgebildet wird.
-
Im
Idealfall ist die erfindungsgemäße Vorrichtung
so ausgelegt, daß zur
Zeit immer nur eine Aufnahme mit Anregungslicht bestrahlt wird.
Denkbar ist aber auch, daß,
wie oben ausgeführt,
mehrere Aufnahmen gleichzeitig mit einer zugeordneten Leuchtdiode
bestrahlt werden. Dies ist z. B. dann möglich, wenn in diesen Aufnahmen
mehrere Parallelen eines PCR-Ansatzes behandelt werden, und das
aus diesen Aufnahmen reflektierte Signal als Mittelwert der betreffenden
Aufnahmen erfaßt
werden soll.
-
Es
versteht sich, daß die
bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung
eingesetzten Leuchtdioden so gewählt
werden, daß sie
für den
jeweils eingesetzten Fluoreszenzfarbstoff bzw., falls mehrere Indikatoren pro
PCR-Ansatz vorgesehen sind, mehrere unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe
abgestimmtes Anregungslicht ausstrahlen können.
-
Vorzugsweise
wird den Leuchtdioden ein Kurzpaßfilter nachgeschaltet, der
aus dem von den Leuchtdioden ausgestrahlten Licht den langwelligen Bereich
abblockt.
-
Zwischen
den Leuchtdioden und den Aufnahmen des Thermocyclers ist wie bei
gattungsgemäßen Vorrichtungen
ein Strahlteiler vorgesehen. Es kann sich dabei um einen üblichen
Strahlteiler handeln, der jeweils einen bestimmten Prozentsatz des auftreffenden
Lichtes durchläßt und den
verbleibenden Teil reflektiert. Es kann sich aber auch um einen Wellenlängen abhängigen Strahlteiler
handeln, z. B. einen dichroitischen Spiegel, der das Anregungslicht passieren
läßt und das
demgegenüber
etwas langwelligere Fluoreszenzsignal reflektiert.
-
Wie
oben angesprochen weist der Detektor mindestens einen lichtempfindlichen
Sensor auf, der ein intensitätsabhängiges Signal
generiert und enthält
weiterhin optische Einrichtungen, die das aus den Aufnahmen emittierte
und vom Strahlteiler reflektierte Licht auf dem Sensor abbilden.
Bei dem Sensor kann es sich z.B. um einen CCD-Chip oder einen Fotomultiplier
handeln.
-
Vorzugsweise
weist die optische Einrichtung mehrere Lichtleiter auf, deren Eintrittsflächen jeweils mindestens
einer Aufnahme zugeordnet sind und deren Lichtaustrittsflächen nebeneinander
gebündelt angeordnet
sind.
-
Mit
den Lichtleitern können
die aus den unterschiedlichen Aufnahmen des Thermocyclers emittierten
Floureszenzsignale auf eine eng begrenzte Austrittsfläche zusammengeführt und
von dort auf den Sensor weitergeleitet werden. Eine eng begrenzte
Austrittsfläche
kollimiert die austretenden Lichtstrahlen zu einem Bündel, dessen
Ausbreitungsrichtungen sich nur wenig unterscheiden. Dies ist insbesondere
dann von Vorteil, wenn die nachfolgenden Filter Interferenzfilter
sind, deren spektrale Durchlaßcharakteristik
abhängig
vom Einfallswinkel auf das Filter ist.
-
Im
weiteren Lichtweg ist vorzugsweise ein Langpaßfilter vorgesehen, der noch
eventuell vorhandenes von den Leuchtdioden stammendes Anregungslicht
herausfiltert. Gegebenenfalls können
in dem Lichtweg noch weitere optische Linsen zur Fokussierung etc.
vorgesehen werden.
-
Häufig werden
PCR-Ansätze,
bei denen die Bildung der PCR-Produkte verfolgt werden soll, nicht mit
einem sondern mit mehreren bzw. ihrer Wellenlänge unterschiedlichen Fluoreszenzindikatoren durchgeführt. So
kann z.B. zusätzlich
ein nicht von der eigentlichen PCR-Reaktion beeinflußter Indikator vorgesehen
werden, der lediglich zum Abgleich der einzelnen Ansätze untereinander
gedacht ist.
-
Für diesen
Fall und andere Fälle,
in denen mehrere Fluoreszenzindikatoren eingesetzt werden, gibt
es grundsätzlich
die Möglichkeit,
in dem Detektor einen Spektrometer vorzusehen, der die Signale von den
unterschiedlichen Indikatoren wellenlängenabhängig auflöst, was allerdings sehr aufwendig
ist.
-
Die
Erfindung sieht in diesem Zusammenhang in einer weiteren vorteilhaften
Ausgestaltung vor, daß im
Detektorstrahlengang mindestens ein dichroitischer Spiegel vorgesehen
ist, der das Signal des einen Fluoreszenzindikators auf einen lichtempfindlichen
Sensor durchläßt und das
Signal eines anderen Fluoreszenzindikators auf einen weiteren lichtabhängigen Sensor
reflektiert. Diese Ausgestaltung ist relativ einfach zu verwirklichen.
Sie setzt lediglich voraus, daß der
zusätzlich
eingesetzte dichroitische Spiegel in seinen Eigenschaften auf die
eingesetzten Fluoreszenzindikatoren abgestimmt ist.
-
Falls
die spektrale Trennleistung der Spiegel nicht ausreicht, kann vor
den Sensoren zusätzlich noch
ein der Fluoreszenz des Farbstoffes angepaßtes Bandpaßfilter angeordnet werden.
-
Der
Detektor schließlich
kann mit einer Auswerteinrichtung versehen sein, die z.B. die entsprechenden
Fluoreszenzsignale in PCR-Produkte umrechnet. Denkbar ist es aber
auch, den Detektor über eine
Schnittstelle mit einer externen Auswert- und ggf. Steuereinrichtung
zu verbinden.
-
Wie
oben ausgeführt,
enthält
die erfindungsgemäße Vorrichtung
einen Thermocycler, der grundsätzlich übliche Bauweise
aufweisen kann. Denkbar ist daher, in einer weiteren vorteilhaften
Ausgestaltung, die Beleuchtungseinrichtung, den Strahlteiler und
den Detektor als nachrüstbare
Einheit für
bestehende Thermocycler auszubilden.
-
Im
folgenden soll die Erfindung anhand einer Figur näher erläutert werden,
die ein Ausführungsbeispiel 10 der
erfindungsgemäßen Vorrichtung zeigt.
-
Die
Vorrichtung 10 weist einen schematisch dargestellten üblichen
Thermocycler 11 mit Aufnahmen 12 auf. Im Betrieb
werden in die Aufnahmen 12 nicht dargestellte Reaktionsgefäße eingesetzt,
in denen jeweils ein PCR-Ansatz mit dem oben erwähnten Fluoreszenzindikator,
bzw. den Indikatoren enthalten ist.
-
Auf
den Thermocycler 11 ist ein Deckelgehäuse 13 aufgesetzt
mit einer Beleuchtungseinrichtung mit mehreren Leuchtdioden 14.
Jeweils eine Leuchtdiode 14 ist einer Aufnahme 12 zugeordnet. Vorzugsweise
sind die Leuchtdioden 14 anayförmig angeordnet. Bei der Messung
werden die Leuchtdioden 14 vorzugsweise so geschaltet,
daß immer
nur jeweils eine zugeordnete Aufnahme 12 bestrahlt wird.
-
Ein
beispielhafter Lichtweg ist mit 15, 15' dargestellt.
Das Licht 15 wird von der Leuchtdiode 14 abgestrahlt,
und passiert dann zunächst
einen Kurzpaßfilter 16,
mit dem langwellige Anteile herausgefiltert werden sollen. Danach
tritt das Licht 15 durch einen Strahlteiler 17 hindurch,
der in dieser Richtung vorzugsweise vollständig durchlässig ist.
-
Wie
oben mehrfach ausgeführt,
soll das von der Leuchtdiode 14 abgestrahlte Licht 15 einen,
in einem PCR-Ansatz in der Aufnahme 12 befindlichen Fluores zenzindikator
anregen, woraufhin dieser ein Fluoreszenzsignal 15' emittiert.
Der Strahlteiler 17 ist so beschaffen, daß das Fluoreszenzsignal 15' zur Seite hin
reflektiert wird.
-
Vorzugsweise
wird als Strahlenteiler 17 ein dichroitischer Spiegel eingesetzt,
der das Anregungslicht durchläßt, das
emittierte längerwellige Fluoreszenzsignal
jedoch reflektiert.
-
Das
reflektierte Fluoreszenzsignal 15' wird dann von einem Detektor 18 erfaßt. Der
Detektor 18 weist optische Einrichtungen 19 auf,
mit denen das Fluoreszenzsignal 15' auf einen lichtempfindlichen Sensor 27 abgebildet
werden kann.
-
Im
einzelnen umfaßt
die optischen Einrichtungen 19 eine Reihe von Lichtleitfasern 20 mit
Lichteintrittsflächen 21,
die jeweils einer Aufnahme 12 bzw. den aus den Aufnahmen 12 emittierten
und am Strahlteiler 17 reflektierten Fluoreszenzsignalen 15' zugeordnet
sind.
-
Vorzugsweise
sind die Eintrittsflächen 21 wiederum
wie die Leuchtdioden 14 arrayförmig angeordnet.
-
Die
Lichtleitfasern 20 sind an ihrem Austrittsende zu einem
Bündel 23 zusammengefaßt. Durch
die Bündelung
wird erreicht, daß die
Signale aus allen Aufnahmen 12 relativ dicht nebeneinander austreten.
Wie oben erwähnt,
ist eine eng begrenzte Austrittsfläche erforderlich, um die austretenden Lichtstrahlen
zu einem Bündel
zu kollimieren, dessen Ausbreitungsrichtungen sich nur wenig unterscheiden.
Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn die nachfolgenden Filter
Interferenzfilter sind, deren spektrale Durchlaßcharakteristik abhängig vom
Einfallswinkel auf das Filter ist.
-
Das
Fluoreszenzsignal 15' wird
von dem Lichtleiterbündel 23 dann über eine
Linse 24 durch einen Langpaßfilter 25 und eine
weitere Linse 26 auf den Sensor 27 abgebildet.
Der Langpaßfilter 25 ist erforderlich,
um gegebenenfalls aus dem Anregungslicht stammende Wellenlängenbereiche
herauszufiltern.
-
Der
Aufbau der gezeigten Ausführungsform ist
relativ einfach und mit geringem Aufwand zu verwirklichen.
-
Für den Fall,
daß mehrere
Fluoreszenzindikatoren im PCR-Ansatz untersucht werden sollen, kann
im Bereich der optischen Einrichtungen 19 nach z. B. dem
Langpaßfilter 25 ein
weiterer Strahlenteiler vorgesehen werden, der eines der beiden
Fluoreszenzsignale durchläßt und das
andere Fluoreszenzsignal reflektiert. Ordnet man in den entsprechenden Lichtwegen
jeweils einen lichtempfindlichen Sensor an, dann lassen sich auch
zwei oder gegebenenfalls mit weiteren Strahlenteilern auch noch
mehr unterschiedliche Fluoreszenzsignale gleichzeitig verarbeiten.
-
Bei
mehreren Fluoreszenzindikatoren kann zusätzlich vor dem Sensor ein Bandpaßfilter
vorgesehen werden, um den Emissionsbereich des jeweiligen Indikators
durchzulassen und den der anderen Indikatoren abzublocken. Denkbar
ist auch, um die Anzahl der erforderlichen Sensoren zu limitieren, wechselbare
Bandpaßfilter
vorzusehen.
-
Um
die thermischen Einflüße zu kompensieren,
kann die Vorrichtung einen Referenzlichtweg aufweisen, der analog
zu dem Lichtweg 15, 15' verläuft, mit dem Unterschied, daß die dem
Referenzlichtweg zugeordnete Leuchtdiode nicht einen PCR-Ansatz
beleuchtet sondern eine Referenzfläche. Das von dieser Fläche reflektierte
Licht wird vom Detektor ausgewertet, wobei Veränderungen während der PCR zur Korrektur
der Meßwerte
verwendet werden.