DE2006808A1 - Verfahren zur Identifizierung normaler und abnormaler Hämoglobine in menschlichen roten Blutzellen - Google Patents

Description

RECHTSANWÄLTE Z U 06808

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DK. JUR. Di '.-Ci..:. !',-j. WOLFF ■

DR. JUK. -HAiNJ Cr,?. "EiL

023 FRANKFURT AM MAIN-HOCHST «η r t -^n

ACELONSIRASSE58 !θ, I Go. .70

Unsere Nr. l6 160

Chas. Pfizer & Co., Inc. New York, N.Y., V.St.A.

Verfahren zur Identifizierung normaler und abnormaler Hämo- | globine in menschlichen roten Blutzellen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Mittel zur Diagnose eines pathologischen Zustandes und insbesondere, ein diagnostisches Verfahren zur Bestimmung.und Identifizierung abnormaler Hämoglobine im menschlichen Blut.

Hämoglobinopathien . stellen eine Gruppe erblicher hämolytischer Syndrome dar, die durch die Gegenwart eines abnormalen Hämoglobins gekennzeichnet sind. Das abnormale Hämoglobin wird vererbt. Die Klassifizierung dieser Gruppe basiert auf elektrophoretischen Untersuchungen,.= und bis jetzt sind 2k Hainoglobinarten isoliert worden. Es ist anzuaehmen, daß in der Zukunft noch mehr Hämoglobine gefunden werden. Die verschiedenen Hämoglobine würden durch Buchstaben des Alphabets be-^ zeichnet, z.B. normales Hämoglobin (Hb) durch A, Sichelzellen-Hb durch. S und andere Varianten durch C, D usw.

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BAOORIOmAt

Die häufige* vorkommenden Hämoglobinopathien ■ sind die Sichelzellen-Krankheit und die Hämo<?lobinopat hie-C-Anämie. Diese kräfteverzJrenden und manchmal tödlichen Krankheiten stellen homozygote Stadien dar, die in Abkömmlingen aus der Vereinigung zweier Anlagenträger auftreten. Die Hämoglobinopathie A-S (Sichelzellenanlage) und die Hämoglobinopathie A-C (Hämoglobin-C-Anlage) stellen Heterostadien dar und sind gewöhnlich nicht mit klinischen Manifestationen oder hämatologischen Abnormalitäten außer Änderungen der mechanischen und osmotischen Zerbrechlichkeit der Erythrocyten verbunden.

Die Identifizierung der Sichelzellenanlage oder der Hämoglobin-C-Anlage ist von besonderer Bedeutung wegen der ungünstigen Wechselwirkung der Schwangerschaft mit diesen genetischen Krankheiten. Die Identifizierung der Sichelzellenanämie oder Sichelzellenanlage ist von besonderer Bedeutung in der Luftfahrt, da· Flugpersonal, das unter diesen Abnormalitäten leidet, aufgrund des geringen Sauerstoffdruckes bei mittleren oder hohen Höhen eine Milz-Infraktion entwickeln kann.

Die isoelektrischen Punkte der Hämoglobine der Säuger liegen üblicherweise eben auf der sauren Seite von pH 7. Geringe "Änderungen der isoelektrischen Punkte der verschieben Hämoglobine stellen die Grundlage für Ihre Erkennung durch Elektrophorese dar. In der Zonenelektrophorese wandern die Bestandteile als getrennte Zonen und werden gegenüber einer Ableitung durch die Trägermedien₃ die aus Filterpapier oder Stärkegel oder Stärkekorn-Blockpräparaten bestehen können, stabilisiert. Die Einfachheit des Verfahrens und die geringe Menge an Hämoglobin, die für eine einzige Analyse erforderlich ist, erlauben die überprüfung einer großen Anzahl von Personen in kurzer Zeit.

BAO ORlGiNAL 009836/ U47

Frühere Verfahren, die die Herstellung von Hämoglobin-Proben für die Elektrophorese mit sich brachten, verwendeten zur Hämolyse der roten Blutzellen destilliertes Wasser. Dies führte zu instabilen Hämolysaten, die Gemische von Oxyhämoglobinen, Carboxyhämo£lobinen und anderen Hämoglobinderivaten enthielten. Diese instabilen Hämoglobin-Gemische waren durch Elektrophorese schwer zu trennen und zu identifizieren, da breite, ur ;iufgelöste Bänder erhalten wurden.

Ein überlegenes Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Drabkin's Reagenz (80 % NaHCO₅, 16 % K₅Pe(CN)₆ % und 4 % KCN), das alle Hämoglobine einheitlich in ihre Cyan- | methämoglobin-Formen umwandelt. Die charakteristischen Vorteile dieses Testverfahrens sind: (a) alle Hämoglobine liegen in einer einzigen Derivatform vor, (b) die Cyanraethämoglobine sind stabil (6 Monate bei H bis 10 C), und (c) es werden scharfe aufgelöste Bänder durch die Elektrophorese erhalten* Die Identifizierung der abnormalen Hämoglobine in verdächtigem Blut wird leicht durch nebeneinander herlaufende elektrophoretische Vergleiche mit Hämolysaten von Kontrollbiut-Proben, die die Cyanmethämogbbine von normalem Hämoglobin (Hb A), Sichelzellen-Hämoglobin (Hb A-S) und Hämoglobin C (Hb A-C) enthalten, durchgeführt. Die Anzahl der Kontrollen von Hämoglobin ορε thie -Arten kann leicht nach V.'unseh erweitert werden. ä

Die vorliegende Erfindunc bezieht sich auf ein verbessertes diagmostisehes Verfahren zur Be st immune und Identifizierung von abncrnalen Hämoglobinon in menschlichen; Blut, bei dem man ein Reagenz verwendet, das die verdächtigen roten Blutzellen häinolysiert und gleichzeitig alle Hämoglobine in Cyanmethämoglobine umwandelt. Diese Hämolysate sind durch ihre Einheitlichkeit, ausgezeichnete Stabilität und scharfe Auflösung bei der Elektrophorese gekennzeichnet. Dieses verbesserte

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BAD ORIÖtNÄL

diagnostische Verfahren erleichtert die Identifizierung abnormaler Hämoglobine durch die nebeneinander herlaufenden elektrophoretischen Vergleiche der verdächtigen Cyanmethämoglobine mit den Cyanmethämoglobinen von normalem Hämoglobin (Hb A), Sichelzellenhämoglobin (Hb A-S) und Hämoglobin C (Hb A-C).

Die vorliegende Erfindung betrifft ein diagnostisches Verfahren zur Bestimmung udd Identifizierung abnormaler Hämoglobine im menschlichen Blut. Ein kritisches Merkmal dieser Erfindung besteht in der Herstellung stabiler Hämoglobinopa.thie -Kontrollen, bei der man die gewaschenen, gesammelten (packed) roten Blutzellen hämolysiert, die Hämoglobine im Hämolysat in Cyanmethämoglobine umwandelt und das Hämolysat durch Elektrophorese mit auf gleiche V/eise umgewandelten Hämolysaten von verdächtigen Blutsellen vergleicht.

Rote Blutzellen für die Hämoglobinopa thie -Kontrollen werden von Spendern mit den gewüschten, spezifischen Hämoglobinarten, z.B. A, A-S, A-C usw. ausgewählt. Nach dem Zentrifugieren des gesamten Blutes werden die gesammelten roten Blutzellen mehrmals mit physiologischer Kochsalzlösung ger waschen, um verunreinigende Plasmaproteine zu entfernen.

Der Ausdruck "physiologische Kochsalzlösung" betrifft eine 0,85 oder 0,90 gew.^ige wässrige Natriumchloridlösung.

Das Hämolysemittel ist ein trockenes Pulver mit einem Gehalt von 75 bis 85 % Natriumbicarbonat, 15-bis 20 % Kaliumferri> cyanid und 2 bis 6 % Kaliumcyanid. Die Hämolyselösung wird hergestellt, indem man 120 mg der Pulvermischung in 100 ml destilliertem Wasser löst. Die gebrauchsfertige Lösung bleibt

BAD ORIGINAL

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etvja ein 3φνstabil* wenn man sie bei Raumtemperatur in einer dichtversehlossenen bernsteinfarbigen ßlasflasehe oder Polyäthy|enflasche aufbewahrt. Die gevaachenen roten Blutzel3Len werden hämolysiert, indem man die Hämolyselösung in einem Verhältnis von etwa 2 bis 4 Vol. Reagenzlösung zu etwa 1 Vol.: der gewaschenen, gesammelten roten Blütezeiten gibt. Nach etwa 1-stündigem Stehen bei Raumtemperatur sind alle Hämoglobine in den Hämolysat*n in Cyanine thämo- . globine umgewandelt.

Die Zellmembranen oder stroraata werden durch Zentrifugieren

entfernt und die Hämolysate werden durch Ausschütteln mit J

einem nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Toluol oder Chloroform, weiter geklärt. ·

Es wurde früher festgestellt, daß Cyanmethämoglobin-Komplexe dem Bfergehen Qesetz folgen und photometrisch quantitativ . bestimmt werden können, Nachdem der Hämoglobingehalt spektrophotoraetrisch beft4.mmt wurde, werden die Hämolysate mit der HSmolys§lösung auf eine endgültige 'Hämoglobin-Konzentration von e|wa J₁Q bis S_?Q %» vorzugsweise 6»5? yefdiinnt.

Um u|5^er jdejn nachfolgendfn, jCagerungsbedingungen ei.n potentielles ßakterifnifaGhstum auf fin Minimum herabzusetzen, werden die klaren^ rubiinrotfn H|teQlysatp durch Filtrat;i.on unter Druck iaklfjpienrgiasfilter oder Q_:!>Ji5 ./V* - Milliporenfilter

HäjTiolyj|a|e_: def ve|?d|cht?igen Blutppqbpn werden in der gleichen ^i|ß sjtie fü? <|ie |fämogl.obinQpgfiie -Kpntrpll-H jbesGhr4eben| ^dech, init der Autnphnie, daß ä%e Filtra|i@n ujt^d; die HämpglQbin-^estimmung und -yerdünriung aus-

BADORlQfNAl.

2006

Die elektrophoretischen Beweglichkeiten der Cyanmethämoglobine in den Test- und Kontrollproben werden durch übliche elektrophcFetische Verfahren verglichen. Die Art des verwendeten Trägermediums ist nicht kritisch. Es wurde gefunden, daß Cyanmethämoglobine in scharfe bänder aufgelöst werden, wenn man Celluloseacetat (Sepraphore 111, Gelman Instrument Company^ Ann Arbor, Michigan)" verwendet, und 2 Stunden lang eine konstante Spannung von 200 Volt und eine Stromdichte von ma pro Streifen von 2,5¹J x 15,85 cm anwendet. Verschiedener.. Puffer für die Elektrophorese können mit befriedigenden Er^ebnissen angewendet werden. Eine besonders wirksame Pufferlösung ist eine Veronallösung mit einem pH-Wert von 8,6 und einer Ionenstärke von 0,019» die durch Lösen von 0,69 g Diäthylbarbitursäure und 3,85 g Natriumdiäthylbarbiturat in 1 1 Wasser hergestellt wurde.

Elektropheretische Muster der Cyanmethämoglobine von normalen und abnormalen Hämoglobinen zeigen, daß da§ Derivat von Hb A asi schnellsten zur Anode wandert, gefolgt von Hb S, während Hb C am langsamsten ist. Aufgrund dieser Unterschiede in den Wanderungsgeschwindigkeiten ergib t je^es Hämoglobin ein getrenntes 3 and. Die Zonen sind §ρ klar, daß m^ sieht, daß in der Stellung von Hb A, HIk 3 und Hb G eine einzige Zone besteht. Normales Hämoglobin gibt eine ©innige Zone im Bereich yon Hb A. Sichelzellenhämpglobin ergibt #in elektrophoretigcheg Muster mit 2 Zonen, jeweils $im 4l pereich von Hb A und im Bereich von H£ §, Ip gleicher ifigt die Hämoglobinopa thie C 2 Zonen, di# eine im Bepeiqh. ¥Qfl Hb A und die andere la; Bereich von HJp! Q.

folgenden peifpiele erläutern die Erfindung.

BAD ORiGtMAL

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Beispiel 1

Proben von mitj Oxalsäure oder Zitronensäure behandeltem Gesamtblut von Speftdern mit spezifischen Hämöglobinarten Hb A, Hb A-S, und Hb A-C werden 15 Minuten bei l600 u.p.M. zentri-r fugiert. Das Plasma wird dann entfernt und verworfen, Die ge-.sammelten roten Blutzellen werdend mal mit einem gleichen Volumen physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und nach Jedem Waschen 3 0 Minuten bei 2000 u.p.M. zentrifugiert.

Die frisch hergestellte Hämolyselösung (pro 100 ml destil- J Hortes Wasser 120 mg eines pulverisierten Gemisches mit einem Gehalt von 80 ■% NaHCO₃, 16 % K₃Fe(CN)₆ und 4 % KCN) wird in einem Verhältnis von 2,5 Volumen pro Volumen gewaschene, *e sammelte rote Blutzellen zugesetzt. ■ - -

Dj i2 roten 3Iutze 11 cn und die Hämolyselösung werden .sorgfältig gümiseht und ί Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Jedes Volumen Hämolyaat wird mit 1/4 Volumen Chloroforir. verseist und sorgfältig gemischt.

Das Gemisch wird 20 Minuten bei 2800 u.p.M. zentrifugiert. Die klaren, rubinroten überstehenden Hämolysate werden dekantiert. ■ ■■'·.- (

Die HämolysaVe werden unter Druck durch ein 0,45M Milliporenfilter filtriert.

Dar Hänoglobingehalt jedes Hämolysats wird spektrophotcmetrisch bo-3tiimr..t und Ί^ηη wird das Hämplysat mit Hämolyse lösung auf ejlne Hamogiobinkoratntration von etwa 6,5 % verdünnt.

!lit Hilfe einer automatischen Pipette werden Glasampulle!! mit.

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BAD ORIGINAL

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aliquoten Teilen von ο,5 ml der Hämoglobinopethie .-KontrolliBämolysate gefüllt. Die Ampullen werden bei H bis 1O⁰C r,e lagert.

Beispiel 2

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wird unter Verwendung von Toluol anstelle von Chloroform wiederholt.

Beispiel 3

Nach :1er Arbeitsweise von Beispiel 1 werden verdächtige Blut proben behandelt j wobei jfcdoch die Milliporenfiltration und die Hämoslobinbestimmuntf und die Verdünnung weggelassen werden können.

"Beispic-l "4

Tost-Verfahren

Ein Tropfin der hergestellten HämoglcbinlÖsung von 0,02 ml wird nut Hilfe einer HMmoplobinpipette auf Celluloseacetat ('SeprapMore TII) ge^ra-Jht. Die unbekannten Hämoglobine werden in einer geraden Linie im Zentrum des Celluloseacetats aufgebracht. Die Tropfen worden etwa im Abstand von 2,^5 cm aufge- :.ra-oht, wobei sichergestellt wärt, daß die Hämoglobintropfen in ^er.-iaev Linie ang2ordnet sind.

Die Bethältcr v;orden mit Vercnal-Fufferlösung (pH 8,ξ, Ionen-Stärke 0,019) erfüllt. Mit Hilfe eines Verbindunpsohlauches aue Ounani, der abgeklemmt wird, nechden der PlÜssigkeitsspie&el in beiden Behältern gleich ist, wird ein gleicher Spiegel aufrechterhalten. Die untere Glasplatte wird dann

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zwischen die Kanten der beiden Behälter gebracht.

Das ,Celluloseacetat» das die Hämoglöbintropfert enthält, wird durch eintauchen des Oelluloseacetats in die Puffer-Lösung mit dieser Puffer-Lösung gesättigt, Der Streifen wird dann derart auf die untere Glasplatte gebracht, daß die Hämoglobintropfen in der Mitte zwischen den beiden Elektroden liegen. Dann wird die obere Glasplatte derart übfgr den Ceiiuloseacetat-Streifen gelegt, daß sie die untere Platte deckt. Entlang 2 Kanten werden Klammern an·-" gebracht. J

In jedem Behälter werden die beiden Elektroden mit Hilfe kleine*¹ Klammern (Bulldog clamps) am Pol angebracht. Die Stromzufuhr wird derart eingestellt, daß 200 "Volt und eine gtroffidiehte von 1 ma pro Streifen von 2,f-k mal 15»85 cm erreicht, wer den. ■ . ·

für eine angemessiene Wanderung genügen im allgemeinen 2 gtd. _x

Das Tggt.verif-aM.rgn νο,η Beispiel k wird wiederholt.j anstelle νςίη Qeilulf;g.ea.eetat ( Sepr^phore Ili) Pilterpapier

el % wir(i wiederholt,, viobei a.nitärkegel verwendet wird.

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BADORlQiNAL

Claims (5)

1. - 10 -

   Patentansprüche:

   Verfahren zur Identifizierung normaler und abnormaler Hämoglobine in menschlichen roten -Blutzellen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen hämolysiert, die Hämolysate in Cyann:ethämoglobine umwandelt und die umgewandelten Hämolysate im Vergleich mit auf gleiche Weise umgewandelten Hämolysaten bekannter Biutzellen der Elektrophorese unterwirft.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hämolyse und die Umwandlung gleichzeitig bewirkt, indem man die Zellen mit einer wässrigen Lösung eines Reaktionsmittels bestehend aus etwa 75 bis 85 % Natriumbiearbonat, 15bis 20 % KaliumferricyanJd und 2 bis 6 % Kaliumcyanid in Berührung biingt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Reaktionsmittel aus etwa 80 % Natriumbiearbonat, etwa %&% Kaliumferrieyanid und etwa 4 % Kaliumcyanid verwendet.
4. k, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hämolysate vor der Elektrophorese mit einem in Wasser unlöslichen, inerten, organischen Lösungsmittel wäscht,
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel Toluol oder Chloroform verwendet,

   Ftoi Ch*..

   Recfhteanwalt

   0Q9838/U47

   BAD ORJQtNAL