DE19957762A1 - Gefäßartiges Teilchen mit eingeschlossenen Zellen sowie dessen Verwendung - Google Patents

Abstract

Ein gefäßartiges Teilchen - insbesondere eine Kapsel etwa kugeliger Ausgestaltung - mit in ihm eingeschlossenen tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Zellen ist zu einem Stoffaustausch zwischen den eingeschlossenen Zellen und der Umgebung fähig bzw. ausgebildet. Dieses Teilchen kann eine Hohlkugel sein, in die verkapselte tierische Zellen in Zelldichten von 1 bis 10000 Zellen - aber von 10000 bis 100 Mio. Zellen - je ml Teilchen- oder Kugelinhalt eingeschlossen sein können. Derartige Teilchen werden beispielsweise bei der Kultivierung von tierischen Zellen als Ersatz von Blutserum oder anderen Blutbestandteilen eingesetzt oder aber, um das Kulturmedium durch Entfernen störender Substanzen länger für die Kultivierung der Zellen einsetzbar zu machen. Auch ist die Verwendung des Teilchens in extrakorporellen Organen zum Entfernen störender Substanzen aus Patientenflüssigkeiten oder zum Ausschneiden von Stoffen möglich, welche die Heilung des Patienten unterstützen. Schließlich ist es denkbar, das Teilchen als Implantat in Lebewesen vorzusehen zum Entfernen störender Substanzen oder zum Ausschneiden von Stoffen, welche die Heilung des Patienten unterstützen.

Description

Die Erfindung betrifft ein gefäßartiges Teilchen - insbe­ sondere eine Kapsel etwa kugeliger Ausgestaltung - mit in ihm eingeschlossenen tierischen, pflanzlichen oder mikro­ biellen Zellen. Zudem erfaßt die Erfindung Verwendungen der/des Teilchens.

In tierischen Zellkulturen werden sogenannte Feederzellen zur Kultivierung von Zellen herangezogen, die sehr hohe An­ sprüche an das Kulturmedium stellen. Die Feederzellen scheiden unter anderem Substanzen aus, welche für das Wachstum der anderen Zellen wesentlich sind. Derzeit werden Feederzellen meistens als primäre Zelllinien aus frisch ge­ töteten Tieren aufwendig herauspräpariert, in Behältern kultiviert, und nach dem Erreichen eines bestimmten Wachs­ tumsstadiums werden die schwierig zu kultivierenden Zellen dazugegeben. Dadurch kommen die beiden Zelllinien in engen Kontakt mit dem Nachteil, dass neben dem Austausch von ge­ wünschten Substanzen auch z. B. Krankheitserreger wie Myco­ plasmen von den Feederzellen auf die andere Zelllinie über­ tragen werden können, oder dass die spätere Trennung der beiden Zelllinien schwierig oder gar unmöglich wird. Um diese Nachteile zu mindern, wird manchmal über die Feeder­ zellen eine flache Membrane gelegt, so dass zwei Kultivie­ rungskompartimente in einem Kulturbehälter entstehen. Der Kontakt wird jedoch wegen der geringen Oberfläche der Mem­ brane stark vermindert, und die aufwendige Präparation der Feederzellen für die einzelnen Anwender besteht weiterhin.

In Kenntnis dieses Standes der Technik hat sich der Erfin­ der das Ziel gesetzt, die eingangs erwähnten gefäßartigen Teilchen - und damit ihre Verwendung - zu verbessern.

Zur Lösung dieser Aufgabe führt die Lehre des unabhängigen Patentanspruches; die Unteransprüche geben günstige Weiter­ bildungen an. Zudem fallen in den Rahmen der Erfindung alle Kombinationen aus zumindest zwei der in der Beschreibung und/oder den Ansprüchen offenbarten Merkmale.

Bei dem erfindungsgemäßen - bevorzugt als Kapsel etwa kugelförmiger Ausgestaltung ausgebildeten - Teilchen mit darin eingeschlossenen tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Zellen ist ein Stoffaustausch zwischen den eingeschlossenen Zellen und der Umgebung möglich. Zudem scheiden die darin enthaltenen Zellen Stoffe aus, welche das Wachstum anderer Zellen fördern, oder sie nehmen Stoffe auf und können diese unschädlich machen, welche das Wachs­ tum anderer Zellen behindern.

Das erfindungsgemässe Produkt besteht also aus Zellen, die in Kugeln immobilisiert sind und als Feederzellenersatz bei der Kultivierung von Zellen eingesetzt werden können, die sehr hohe Ansprüche an das Kulturmedium stellen. Diese Zellen werden entweder aus primären Zelllinien oder aus Stammlinien bestehen, die in entsprechenden Medien zu hoher Zelldichte vorgezüchtet und bei optimaler Wachstumsphase geerntet werden. Bei den Stammlinien gibt es die Möglich­ keit, solche zu selektionieren oder solche gentechnisch herzustellen, die spezielle Wachstumsfaktoren ausscheiden.

Durch deren Einsatz wird der Bedarf an Versuchstieren zur Primärzellenentnahme reduziert. Teilchen mit verkapselten Zellen, die als Feederzellenersatz eingebracht werden, bezeichnet man als Feederkugeln. Diese können tiefgefroren längere Zeit gelagert oder an Kunden versandt werden, um im Bedarfsfall aufgetaut und sofort in Gebrauch genommen werden zu können. Der Einsatz von erfindungsgemäßen Feederkugeln erspart dem Anwender die mühsame, zeitaufwendige und teure Präparation von Feederzellen. In der Biologie, der Biotechnologie und der Medizin einzusetzende verkapselte Zellen erleichtern die Kultivierung von tierischen Zellen oder können als extrakorporelle Organe verwendet werden.

Als günstig hat es sich erwiesen, die Kugelmatrix so zu bauen, dass Zellen weder nach außen noch nach innen gelangen können, und dass kein direkter Zellkontakt zwischen den eingeschlossenen Zellen und den sich um die Kugeln bzw. Teilchen außen befindenden Zellen möglich ist.

Im Rahmen der Erfindung liegen Hohlkugeln mit einem bevor­ zugten Durchmesser von 0,2 bis 3 mm, insbesondere mit Be­ reichen von 0,2 bis 1 mm und von 1 bis 3 mm.

Auf der Oberfläche der Teilchen sind Substanzen chemisch gebunden, die das Anheften anderer Zellen fördern, jedoch können auf ihrer Oberfläche auch Substanzen chemisch gebun­ den sein, welche das Anheften anderer Zellen verhindern. Zur Produktion der Feederkugeln können die Zellen mit einer Immobilisierungsmatrix wie 1.5% Natriumalginat vermischt und mit einer Verkapselungsapparatur in kleine Kugeln ver­ tropft werden. Die kleinen Kugeln besitzen bei geringen Diffusionsdistanzen eine grosse Oberfläche, so dass ver­ nachlässigbare Diffusionsbarrieren für den Stoffaustausch vorhanden sind. Für die Kugelherstellung eignen sich Ver­ kapselungsgeräte der Firma Inotech Encapsulation AG in Dottikon/Schweiz. Die Immobilisierungsmatrix muss garantie­ ren, dass es keinen Zellkontakt zwischen den verkapselten Zellen und den zu nährenden Zellen gibt. Wenn Alginat ein­ gesetzt wird, müssen die Kugeln aussen durch eine Membrane abgedichtet werden. Dazu eignet sich z. B. Polylysin, wo­ durch Membranen mit einem Cut-off von 20'000-100'000 Dalton entstehen, so dass die allermeisten Wachstumsfakto­ ren hindurchdiffundieren können, Krankheitserreger werden jedoch zurückgehalten. Die Kugeln können entweder durchge­ hend aus polymerisierter Immobilisierungsmatrix bestehen oder als Hohlkugeln mit einem verflüssigten Kern ausgebil­ det sein.

Falls die schwierig zu züchtende Zelllinie auf Kontakt mit anderen Zellen oder mit einer Oberfläche angewiesen ist, so kann die Kugeloberfläche durch Einbau von Substanzen wie Fibronectin so verändert werden, dass die Adhäsionsmöglich­ keit für externe Zellen optimiert wird.

Durch Bestrahlung der Feederzellen wird diesen die Zelltei­ lungsfähigkeit genommen, wodurch selbst bei langen Einsatz­ zeiten nicht die Gefahr besteht, dass sie durch Zellvermeh­ rung die Kugeln zum Platzen bringen oder aus diesen aus­ wachsen. Ebenso wird dadurch bei ungewollter Beschädigung der Kugeln vermieden, dass die zu kultivierenden Zellen durch die Feederzellen überwachsen würden. Das Entfernen der Feederkugeln wird in den meisten Fällen einfach sein, da die Kugeln eine höhere spezifische Dichte besitzen als die freien Zellen, so dass sie viel schneller sedimentieren und die Zellen zusammen mit dem Kulturmedium abgesaugt wer­ den können. Bei Hohlkugeln ist dies wegen der geringeren Dichteunterschiede schwieriger. Durch Mitverkapselung von magnetisierbaren Partikeln wie Magnetit können die Kugeln einfach mit Hilfe eines sterilen Magnetstabes aus dem Kul­ turmedium entfernt werden.

Die oben beschriebene Herstellungsmethode erlaubt sogar Mi­ kroorganismen, die in ihrem Wachstum gehemmt sind und den­ noch - gegebenenfalls durch genetische Manipulation - spezifische Wachstumsfaktoren ausscheiden, als Feederzellen zu verkapseln. Ihr Vorteil gegenüber tierischen Zellen ist ihre bedeutend grössere Robustheit. Es können auch Mischungen aus verschiedenen Zelllinien oder Mikroorganismenstämme gemeinsam verkapselt oder mehrere Feederkugeln mit je verschiedenen Zelllinien oder Mikroorganismen eingesetzt werden, um so optimal die Bedürfnisse der zu züchtenden Zellen abzudecken.

Auch ist es denkbar, die Feederkugeln nicht nur in Zellkul­ turen einzusetzen, sondern zudem bei extrakorporellen Orga­ nen, um dem vorbeifliessenden Blut oder Blutfiltrat des Patienten spezielle Substanzen zu geben, welche die Gene­ sung des Patienten unterstützen. Damit die Blutgerinnung möglichst nicht aktiviert wird, werden in die Kugeln und auf die Kugeloberflächen Substanzen wie Heparin eingebaut oder chemisch gebunden. Dadurch wird es möglich, Patienten­ blut in direkten Kontakt mit den Kugeln zu bringen, ohne dass es vorher durch aufwändige Filtrationsmethoden in zwei Fraktionen - Blutplasma und Blutkörperchen - aufgetrennt werden muss. Gleichzeitig kann der Einsatz von blutgerin­ nungshemmenden Mitteln verringert werden, deren Einsatz - besonders bei inneren Verletzungen - sehr gefährlich sein kann.

Ebenso wie verkapselte Zellen zum Ausscheiden von speziel­ len Substanzen eingesetzt werden können, vermögen sie zum Entfernen unerwünschter oder gar toxischer Substanzen be­ nutzt zu werden. Das kann in Zellkulturen, in extrakorpo­ rellen Organen oder bei Implantation in den tierischen oder menschlichen Körper sein.

So liegt es im Rahmen der Erfindung, auf der Oberfläche der Teilchen Substanzen chemisch zu binden, welche das Auslösen von Blutgerinnungskaskaden beim Kontakt der Teilchen mit Blut oder Blutbestandteilen verhindern oder zumindest um das Fünffache gegenüber unbehandelten Teilchen- oder Kugeloberflächen verringern.

Die Kugeln oder Teilchen können erfindungsgemäß auch Zellen enthalten, die durch chemische, physikalische, biologische und/oder genetische Verfahren so verändert wurden, dass sie nicht mehr im Stande sind, sich unter den vorgesehenen Ein­ satzbedingungen zu teilen.

Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung können die ver­ kapselten tierischen Zellen in Zelldichten von 1 bis 10'000 Zellen je ml Kugelinhalt eingeschlossen sein oder von 10'000 bis 100 Mio. Zellen je ml Teilchen- oder Kugelinhalt eingeschlossen sein. Die entsprechenden Bereiche für die verkapselten pflanzlichen Zellen liegen bei Zelldichten von 1 bis 10'000 Zellen je ml Teilchen- oder Kugelinhalt bzw. bei 10'000 bis 20 Mio. Zellen je ml Teilchen- oder Kugelinhalt sowie für die verkapselten mikrobiellen Zellen bei Zelldichten von 1 bis 1 Mio. Zellen je ml Teilchen- oder Kugelinhalt bzw. bei 1 Million bis 100 Milliarden Zellen je ml Teilchen- oder Kugelinhalt.

Bei einer weiteren erfindungsgemäßen Ausgestaltung sind in den Teilchen oder Kugeln magnetisierbare Teilchen einge­ schlossen bzw. sie enthalten eine Mischung aus zwei oder mehreren tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Zellar­ ten.

Wie bereits angedeutet, erfasst die Erfindung Teilchen oder Kugeln, in die Zellen so immobilisiert wurden, dass sie als Feederkugeln bei der Kultivierung von anspruchsvollen tierischen Zellen benutzt werden können. Sie mögen zudem bei der Kultivierung von tierischen Zellen Blutserum oder andere Blutbestandteile ersetzen oder das Kulturmedium durch das Entfernen störender Substanzen länger für die Kultivierung der Zellen einsetzbar machen.

Auch ist es möglich, erfindungsgemäße Teilchen oder Kugeln in extrakorporellen Organen zum Entfernen störender Sub­ stanzen aus Patientenflüssigkeiten einzusetzen oder als Im­ plantate. Die Teilchen oder Kugeln können in extrakoporel­ len Organen oder in den tierischen oder menschlichen Körper implantiert Stoffe ausscheiden, welche die Heilung des Patienten unterstützen; die Teilchen oder Kugeln vermögen es aber auch, in den tierischen oder menschlichen Körper implantiert störende Substanzen zu entfernen und unschädlich zu machen.

Claims (27)

1. Gefäßartiges Teilchen, insbesondere Kapsel etwa kugeli­ ger Ausgestaltung, mit in ihm eingeschlossenen tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass es zu einem Stoffaustausch zwischen den einge­ schlossenen Zellen und der Umgebung fähig bzw. ausgebildet ist.

2. Teilchen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Hohlkugel ist.

3. Teilchen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, dass es einen Durchmesser von 0,2 bis 1 mm auf­ weist.

4. Teilchen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, dass es einen Durchmesser von 1 bis 3 mm aufweist.

5. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, dass die verkapselten tierischen Zellen in Zelldichten von 1 bis 10'000 Zellen je ml Teilchen- oder Kugelinhalt eingeschlossen sind.

6. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, dass die verkapselten tierischen Zellen in Zelldichten von 10'000 bis 100 Mio. Zellen je ml Teilchen- oder Kugelinhalt eingeschlossen sind.

7. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, dass die verkapselten pflanzlichen Zellen in Zelldichten von 1 bis 10'000 Zellen je ml Teilchen- oder Kugelinhalt eingeschlossen sind.

8. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, dass die verkapselten pflanzlichen Zellen in Zelldichten von 10'000 bis 20 Mio. Zellen je ml Teilchen- oder Kugelinhalt eingeschlossen sind.

9. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, dass die verkapselten mikrobiellen Zellen in Zelldichten von 1 bis 1 Mio. Zellen je ml Teilchen- oder Kugelinhalt eingeschlossen sind.

10. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, dass die verkapselten mikrobiellen Zellen in Zelldichten von 1 Mio. bis 100 Mia. Zellen je ml Teilchen- oder Kugelinhalt eingeschlossen sind.

11. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch ge­ kennzeichnet, dass in ihm magnetisierbare Teilchen ein­ geschlossen sind.

12. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch ge­ kennzeichnet, dass in ihm eine Mischung aus zwei oder mehreren tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Zellarten enthalten ist.

13. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die darin enthaltenen Zellen aus­ scheidbare Stoffe enthalten, die dem Wachstum anderer Zellen förderlich sind.

14. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 13, gekenn­ zeichnet durch darin enthaltene Zellen, mit denen Stoffe aufnehmbar und unschädlich zu machen sind, welche das Wachstum anderer Zellen behindern.

15. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 14, gekenn­ zeichnet durch eine Kugelmatrix, durch welche Zellen weder nach außen noch Zellen nach innen gelangen, wobei ein direkter Zellkontakt zwischen den eingeschlossenen Zellen und den sich um das Teilchen außen befindenden Zellen unterbindbar ist.

16. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch ge­ kennzeichnet, dass auf seiner Oberfläche Substanzen chemisch gebunden sind, welche das Anheften anderer Zellen fördern.

17. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch ge­ kennzeichnet, dass auf seiner Oberfläche Substanzen chemisch gebunden sind, welche das Anheften anderer Zellen verhindern.

18. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch ge­ kennzeichnet, dass auf seiner Oberfläche Substanzen chemisch gebunden sind, welche das Auslösen einer Blut­ gerinnungskaskade beim Kontakt der Teilchen oder Kugeln mit Blut oder Blutbestandteilen verhindern.

19. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch ge­ kennzeichnet, dass auf seiner Oberfläche Substanzen chemisch gebunden sind, welche das Auslösen von Blutge­ rinnungskaskade beim Kontakt der Teilchen oder Kugeln mit Blut oder Blutbestandteilen um das Fünffache gegen­ über unbehandelten Kugeloberflächen verringern.

20. Teilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch ge­ kennzeichnet, dass es durch chemische, physikalische, biologische und/oder genetische Verfahren so veränderte Zellen enthält, dass sie unter vorgesehenen Einsatzbe­ dingungen nicht teilbar sind.

21. Verwendung des Teilchens nach wenigstens einem der An­ sprüche 1 bis 20 zum Einsatz bei der Kultivierung von tierischen Zellen als Feederzellen oder Feederkugeln.

22. Verwendung des Teilchens nach wenigstens einem der An­ sprüche 1 bis 20, bei der Kultivierung von tierischen Zellen als Ersatz von Blutserum oder anderen Blutbe­ standteilen.

23. Verwendung des Teilchens nach wenigstens einem der An­ sprüche 1 bis 20, bei der Kultivierung von tierischen Zellen, um das Kulturmedium durch Entfernen störender Substanzen länger für die Kultivierung der Zellen ein­ setzbar zu machen.

24. Verwendung des Teilchens nach wenigstens einem der An­ sprüche 1 bis 20 in extrakorporellen Organen zum Ent­ fernen störender Substanzen aus Patientenflüssigkeiten.

25. Verwendung des Teilchens nach wenigstens einem der An­ sprüche 1 bis 20 in extrakorporellen Organen zum Ausscheiden von Stoffen, welche die Heilung des Patien­ ten unterstützen.

26. Verwendung des Teilchens nach wenigstens einem der An­ sprüche 1 bis 20 als Implantat in tierische oder menschliche Körper zum Entfernen und unschädlich machen von störenden Substanzen.

27. Verwendung des Teilchens nach wenigstens einem der An­ sprüche 1 bis 20 als Implantat in tierische oder menschliche Körper zum Ausscheiden von Stoffen, welche die Heilung des Patienten unterstützen.