DE19955604A1 - Verfahren zum Nachweis von Schwermetallen und organischen Schadstoffen unter Verwendung pflanzlicher Zellsuspensionen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Schwermetallen und organischen Schadstoffen in einer Testlösung, z. B. einer Bodenlösung oder Wasserprobe, unter Verwendung pflanzlicher Zellsuspensionskulturen, insbesondere unter Verwendung von Zellsuspensionskulturen von Gymnospermen, wie z. B. Picea abies. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Schritte: a) Zugeben einer Testlösung zu einer pflanzlichen Zellsuspensionskultur, b) Inkubieren der Zellsuspensionskultur und c) Bestimmen des H¶2¶O¶2¶-Gehalts, des GSH (Glutathion, reduziert)/GSSG (Glutathion, oxidiert)-Gehalts und der Glutathion S-Transferase-Aktivität.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Schwermetallen und organischen Schadstoffen in einer Testlösung, z. B. einer Bodenlösung oder Wasserprobe, unter Verwendung pflanzlicher Zellsuspensionskulturen, insbesondere unter Verwendung von Zellsuspensionskulturen von Gymnospermen, wie z. B. Picea- und Pinus-Kulturen, oder anderen zur Lignifizierung fähige Zellkulturen. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Schritte:

• a) Zugeben einer Testlösung zu einer pflanzlichen Zellsuspensions­ kultur,
• b) Inkubieren der Zellsuspensionskultur und
• c) Bestimmen des H₂O₂-Gehalts, des GSH (Glutathion, reduziert)/GSSG (Glutathion, oxidiert)-Gehalts und der Glutathion S- Transferase-Aktivität.

Der in der Vergangenheit oft sorglose Umgang mit Chemikalien hat dazu geführt, daß sich heute eine Vielzahl von Schadstoffen in unserer Umwelt befindet. Häufig findet man große Akkumulationen von Umweltchemikalien in ehemaligen Deponien oder verseuchten Böden an alten Standorten chemischer Unternehmen. Sie stellen in einem hohen Maße eine Gefährdung der menschlichen Gesundheit dar. Da die Problematik in den vergangenen Jahrzehnten vernachlässigt worden ist, stehen wir heute vor dem Problem der Altlasten­ findung und -beseitigung. Dabei steigt die Zahl der altlastenverdächtigen Flächen in Deutschland ständig an. Im Oktober 1990 gab es circa 29 000 registrierte Flächen, bis Dezember 1993 circa 77 000. Eine besondere Bedeutung haben in diesem Zusammenhang Bodenkontaminationen an ehemaligen Rüstungsstandorten. In der Bundesrepublik Deutschland belaufen sich ehemals militärisch genutzte Flächen auf 2,8% des gesamten Staatsgebietes, das sind etwa eine Million Hektar. In kontaminierten Böden ehemaliger Rüstungsstandorte und militärischer Übungsgebiete kommen vor allem Sprengstoffe, wie z. B. 2,4,6-Trinitrotoluol, Nitrocellulose, 2,4-Dinitrotoluol, 2,6-Dinitrotoluol, 2-Amino-4- nitrotoluol, Hexogen und 1,3-Dinitronaphthalin, Zündmittel, wie z. B. Bleitrinitro­ resorcinat, Bleiazid, Tetrazen und Quecksilberfulminat, Begleitstoffe, wie z. B. Phthalate, Diphenylamin und Dioctylphthalat, und Schwermetalle (Ionen), wie z. B. Cadmium²⁺, Blei²⁺, Arsen⁵⁺ und Quecksilber²⁺.

Da Deponieraum immer knapper und damit kostbarer wird, ist es unbedingt erforderlich, Verfahren und Prozesse zu entwickeln, die den kontaminierten Boden nicht als zu verbringenden Abfall behandeln, sondern eine effektive Dekontaminierung erlauben.

Bodendekontaminierung erfolgt derzeit zumeist durch Korntrennung und Bodenwäsche. Dies hat den Vorteil, daß ein großer Teil des Bodens wieder an seinen Herkunftsort ver­ bracht werden kann; für die Entsorgung bleibt lediglich das stark kontaminierte Feinkorn und das Prozeßwasser zurück. Die Reinigung der Prozeßwässer wird durch Filtration und biologische Methoden mit hohem Wirkungsgrad erzielt, und die größte Menge des Wassers kann nach entsprechender Analytik und Toxizitätstestung wieder dem Wasserkreislauf zugeführt werden. Das größte Problem dieses Vorgehens besteht in der Verfügbarkeit der entsprechenden Toxizitätstests und deren praktischer Handhabung im Routinegeschehen.

Aufgabe der Erfindung ist es, einen zuverlässigen und empfindlichen Toxizitätstest für Schwermetalle und organische Schadstoffe in Bodenlösungen und Wasserproben wie Prozeßwässern aus der Bodensanierung zur Verfügung zu stellen.

Es werden in zunehmendem Maße Pflanzen als Testorganismen eingesetzt, da sie sich dadurch auszeichnen, daß sie in spezifischer Weise bereits auf geringe Schadstoffmengen reagieren. Pflanzen sind als sessile Organismen den Einflüssen von Schadstoffen in hohem Maße ausgesetzt. Der pflanzliche Stoffwechsel reagiert auf äußere Einflüsse mit großer Flexibilität und ist in der Lage, Schadstoffe biogenen sowie anthropogenen Ursprungs abzuwehren. Dies geschieht entweder mit Hilfe von biogenen Stoffwechselintermediaten, die in der Lage sind, eingedrungene Schadstoffe abzufangen und zu entgiften, oder über metabolische Netzwerke, an denen zahlreiche Enzyme beteiligt sind. Aktive Intermediate sind z. B. reduziertes und oxidiertes Glutathion sowie H₂O₂. Die Konzentrationen dieser Substanzen ändern sich drastisch unter Streß. Genau wie die Entgiftungsenzyme der tierischen Leber sind die Entgiftungsenzyme der Pflanzen durch Schadstoffeinfluß beein­ flußbar: sie können in Reaktion auf manche Substanzen stark induziert oder gehemmt werden.

Obwohl bereits einige pflanzliche Ansätze verfolgt worden sind, wurden pflanzliche Entgiftungsenzyme bislang nicht als Biomarker für Schadstoffe verwendet. Dabei bietet z. B. das Glutathion S-Transferase-System einen guten Ansatzpunkt für Monitoring. Die pflanzliche Resistenz gegenüber zahlreichen Pestiziden ist auf ihre Anwesenheit und Aktivität zurückzuführen. Unter dem Einfluß von Herbizid-Antidoten, aber auch mancher Schadstoffe sind Glutathion S-Transferasen (GST) induzierbar. Allerdings reagiert nicht die Gesamtmenge aller verfügbaren GST in gleicher Weise auf externe Stressoren, sondern es kommt zu differenzierten Enzymantworten, die sich auch im Wegfall der Aktivität einzelner Isoformen äußern kann.

Es wurde jetzt gefunden, daß eine Verfahrenskombination aus standardisierter Zellanzucht, standardisierter Aufarbeitung und Bestimmung von drei komplementären Streßreaktionen als Biomarker für Schadstoffe in Prozeßwässern aus der Bodensanierung eine rasche und sensitive Bewertung von Boden- und Wasserproben ermöglicht. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt nicht nur einen zuverlässigen Toxizitätstest für Schwermetalle und organische Schadstoffe dar, es ist auch in der Lage, zuverlässig zwischen verschiedenen Schadstoffen zu unterscheiden.

Die Aufgabe der Erfindung wird daher gelöst durch ein Verfahren, das die Schritte umfaßt:

• a) Zugeben einer Testlösung zu einer pflanzlichen Zellsuspensionskultur,
• b) Inkubieren der Zellsuspensionskultur und
• c) Bestimmen des H₂O₂-Gehalts, des GSH (Glutathion, reduziert) / GSSG (Glutathion, oxidiert)-Gehalts und der Glutathion S-Transferase- Aktivität.

In einer bevorzugten Ausfiührungsform handelt es sich bei der Zellsuspensionskultur um eine Suspension von Gymnospermen, besonders bevorzugt um eine Suspension eines Kieferngewächses (Pinaceae) und am meisten bevorzugt um eine Suspension von Picea abies.

Allgemein kann jede Zellkultur eingesetzt werden, deren Zellen in der Lage sind, Lignin zu bilden, oder deren Zellen zur Ligninbildung angeregt werden können. So eignen sich bspw. auch besonders Pinus-Kulturen oder Kulturen von Ginkgo biloba für das erfindungs­ gemäße Nachweisverfahren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die verwendete Zellsuspensionskultur durch gezielte Hormon- und Zuckerzugabe für das Nachweisverfahren in geeigneter Weise konditioniert. Der Fachmann ist mit geeigneten Phytohormonen und anderen Stoffen zum Einstellen der Zellkultur vertraut.

Weitere Ausführungsformen der Erfindung sind in den beigefügten Unteransprüchen definiert.

Der oxidative Burst ist eine durch Pathogene bzw. durch Streß induzierte H₂O₂-Sekretion lebender Zellen als Abwehrreaktion auf Angriffe von außen. Die Bestimmung des H₂O₂- Gehalts kann auf verschiedene Weise erfolgen; dem Fachmann stehen verschiedene gängige Methoden zur Bestimmung des oxidative Burst zur Verfügung. Bevorzugt wird der oxidative Burst in Anlehnung an die Methode von Mesmer & Boll (1994, Plant Cell, Tissue & Organ Cult. 39: 69-73). Andere Methoden zur Bestimmung des oxidativen Bursts sind bspw. in Mesmer and Schröder (1999, Journal of Applied Botany 73: 6-10) offenbart.

Auch für die Bestimmung des GSH/GSSG-Gehalts stehen dem Fachmann zahlreiche Methoden zur Verfügung. Bevorzugt wird die Methode von Siller-Cepeda et al. (1991, Plant Cell Physiol. 32: 1179-1185). In der Regel eignen sich besonders HPLC-Methoden, ggf. mit Vor- und Nachsäulenderivatisierung. In jedem Fall sollten GSH und GSSG diskriminierend gemessen werden.

Die Bestimmung der GST-Aktivität erfolgt im allgemeinen durch Extrahieren des Enzyms aus der Zensuspension und anschließendes Messen der GST-Enzymaktivität im Protein­ extrakt.

Die GST-Aktivität kann aber auch mittels molekularbiologischer Techniken auf Nuklein­ säureebene bestimmt werden, wobei sich hier besonders Hybridisierungs-, DNA-Chip- und PCR-Techniken anbieten. Auch Biosensoren sind im Rahmen der Erfindung zur Bestim­ mung der GST-Aktivität nützlich.

Besonders vorteilhaft ist der Einsatz eines Biochips zur Diskriminierung beteiligter Glutathion S-Transferasen, da GSTs Enzyme mit eher geringer Substratspezifität sind und mittels Chip-Technologie und der zur Verfügung stehenden GST-Sequenzen die Diskriminierung zwischen GST-Isoformen auf einfache Weise möglich ist.

Die Herstellung und Kultivierung pflanzlicher Zellsuspensionskulturen erfolgt nach konventionellen Protokollen, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Zell- und Gewebe­ kultur geläufig sind. Im Zusammenhang mit der Herstellung und Kultivierung pflanzlicher Zellsuspensionskulturen ist auf die Richtlinien für die Prüfung von Pflanzenschutzmitteln im Zulassungsverfahren, Teil IV, 3-2/1. Prüfung des Rückstandsverhaltens - Schnelltest zur Metabolisierbarkeit und zum Abbau von organischen Pflanzenschutzmittel-Wirkstoffen in pflanzlichen Zellkulturen, der Biologischen Bundesanstalt für Land- und Forstwissen­ schaft, Braunschweig (1992) hinzuweisen.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Bestimmung von Schwermetallen, insbesondere von Blei, Cadmium, Arsen, und organischen Xenobiotika in Bodeneluaten und Wasserproben. Der Begriff Xenobiotika wird hier im Sinne von Umweltchemikalien verwendet, also für Stoffe und Verbindungen, die einem bestimmten Ökosystem oder Organismus fremd sind.

Da sich ein gutes Testsystem nicht nur durch eine hohe Empfindlichkeit, sondern zusätz­ lich durch eine möglichst kurze Inkubationsdauer des Testsystems einschließlich Test­ lösung auszeichnet, sollte die Inkubationsdauer möglichst nicht länger als 24 h sein. Bevorzugt wird eine Inkubationsdauer von max. 20 h, besonders bevorzugt von max. 16 h.

Beispiele

Die Herstellung einer Zellsuspensionskultur von Fichte (Picea abies (L.) Karst.) erfolgte wie von Mesmer and Boll (1994, Plant Cell; Tissue and Organ Culture 39: 69-78), Mesmer and Berndt (1990, Z. Naturforschung 45c: 614-620) beschrieben. Die heterotrophe Zellsuspensionskultur benötigt sowohl Licht als auch Saccharose zum Wachstum. Sie wird zu diesem Zweck in einem modifizierten Murashige und Skoog-Medium (MS-Medium; 1962, Physiol. Plant 15, Seiten 473-478; kommerziell erhältlich z. B. von Duchefa, Haarlem, Niederlande) angezogen. Das Nährmedium enthält zusätzlich 3%(w/v) Saccharose, die Phytohormone Benzylaminopurin (4,4 µM) und Naphtylessigsäure (16,1 µM). Um die Zellsuspensionskultur optimal mit Licht zu versorgen, läßt man sie bei 27°C, 56 rpm und kontinuierlichem Lichteinfall (Fluora fluorescent lamps; Osram L40 W/77, 1000 lux) in einer Schüttelmaschine wachsen. Nach 3 Tagen wird das verbrauchte Medium abgeschüttet und durch 300 ml frisches Medium ersetzt. Nach weiteren 4 Tagen werden die Kulturen halbiert, indem man 1) die Zellen absedimentieren läßt, 2) das überstehende Medium abschüttet, 3) das Zellvolumen auf die Hälfte reduziert und 4) zur Hälfte der Zellen wieder 300 ml frisches Medium hinzugibt. Dieser Rhythmus sichert stete Verfügbarkeit standardisierten Zellmaterials.

Inkubation

Für die Inkubation wird die oben beschriebenen Stammkultur von Picea abies nach 7 Tagen Wachstum geteilt. Je 12 g Zellnaßgewicht werden unter sterilen Bedingungen in 1000 ml-Schikanenkolben überführt, die 120 ml frisches MS-Medium (modifiziert) enthalten. Das jeweilige Xenobiotikum wird in verschiedenen Konzentrationen in 1 ml Ethanol, Aceton bzw. H₂O gelöst, zugesetzt.

Zum Vergleich wird je eine Kontrolle mitangesetzt, die nur Medium bzw. das Medium plus das Lösungsmittel des jeweiligen Xenobiotikums und Zellen enthält. Die Kolben werden in einer Schüttelmaschine bei 27°C, konstantem Licht (Osram L40 W/77, 1000 lux) und 56 rpm für 16 Stunden inkubiert. Die Umdrehungen werden so gewählt, daß die Zellen stets in der Schwebe sind und somit die ideale Sauerstoff erhalten. Nach 16stündiger Inkubation werden die Zellen über eine Nutsche trocken abgesaugt und mit H₂O bidest. gewaschen. Sie werden entweder am gleichen Tag aufgearbeitet oder in flüssigem Stickstoff gelagert.

Messung des oxidativen Burst

Die Bestimmung des oxidativen Burst wird in Anlehnung an die Methode von Mesmer & Boll (1994, supra) durchgeführt. Das gebildete H₂O₂ wird dabei durch die Abnahme der Menge an Phenolrot im Ansatz gemessen. In dieser durch Peroxidase katalysierten Reaktion wird Phenolrot durch H₂O₂ zerstört. Je mehr H₂O₂ gebildet wird, desto weniger Phenolrot ist im Medium vorhanden. Diese Abnahme kann am Photometer gemessen und über Eichkurven auf die H₂O₂-Konzentration bezogen werden.

Als Versuchsansatz werden 1,2 g (Naßgewicht) Fichtenzellen (7 Tage alt), unter sterilen Bedingungen, in 100 ml Erlenmeyerkolben überführt, die 30 ml frisches MS-Medium enthalten. Dazu pipettiert man 30 µl einer Peroxidaselösung (10 mg/ml) und 0,6 ml einer 1 mM Phenolrotlösung. Anschließend gibt man zu dem Ansatz 1 bis 10 ml des jeweiligen Testmediums (Bodenlösung oder Wasserprobe) hinzu.

Als positive Kontrolle dient ein Ansatz mit 0,6 ml einer Elicitorpräparation von Rhizosphaera kalkhoffi. Als negative Kontrolle dient ein Ansatz, welcher nur Zellen, Peroxidaselösung und Phenolrot enthält.

Die Kolben werden während der gesamten Versuchsdauer geschüttelt. Nach bestimmten Zeitintervallen (0 h, 2 h, 4 h, 8 h und über Nacht (ca. 20 h)) werden je 1,5 ml Suspension in 2 ml-Eppendorf-Gefäße überführt und kurz abzentrifugiert. 1 ml der klaren Lösung wird anschließend mit 20 µl 0,5 N NaOH versetzt, geschüttelt und die Extinktion umgehend bei 558 nm gemessen. Durch die Zugabe von NaOH ändert sich der pH-Wert, und das im Medium vorhandene Phenolrot wechselt im Basischen seine Farbe von gelb auf rot. Je weniger Phenolrot vorhanden ist, desto niedriger ist die Extinktion und desto mehr H₂O₂ wurde gebildet. Die Konzentration von H₂O₂ im Versuchsansatz wird anhand einer Eichkurve ermittelt.

Bestimmung des GSH/GSSG-Gehalts

Für die Bestimmung wird die Methode von Siller-Cepeda et all (1991, supra) verwendet. Es werden dazu 0,5 g Zellen nach Inkubation in einen Glaspotter überführt und mit 2 ml 10% Perchlorsäure (PCA), die 1 mM Bathophenanthrolindisulfonsäure (BPDS) enthält, versetzt und unter Eiskühlung homogenisiert. Das Homogenat wird bei 10 000 rpm 5 min. lang zentrifugiert. Der Überstand wird abgegossen und das Pellet in 1 ml PCA resuspen­ diert, anschließend gepottert und nochmals für 5 min. zentrifugiert. Dieser Vorgang wird noch einmal wiederholt. Die Überstände werden vereinigt.

Anschließend erfolgt eine Carboxymethylierung und Derivatisierung der Probe. Dazu werden 500 µl des Überstandes mit 50 µl γ-Glu-Glu (0,5 M), das als interner Standard dient, versetzt. Des weiteren gibt man 50 µl einer Lösung aus 100 mM Iodoacetsäure in 0,2 mM m-Cresol-Purpur hinzu. Durch Zugabe von 480 µl einer Lösung aus 2 M KOH und 2,4 M KHCO₃ wurde der pH-Wert auf 9-10 eingestellt. Daraufhin erfolgte während 15minütiger Inkubation im Dunkeln die Carboxymethylierungsreaktion. Nach Ablauf dieser Zeit wurde mit 1 ml einer 1% ethanolischen 2,4-Dinitro-1-fluorbenzol-Lösung über Nacht bei 4°C derivatisiert.

Nach 16 h wird die Probe 10 min bei 10 000 rpm abzentrifugiert und der Überstand mit Minisart RC4-Filtern (0,45 µm Porengröße) abfiltriert. Vom Filtrat werden dann 100 µl für die HPLC-Analytik auf einer 3-Aminopropyl-Spherisorb-Säule (5 µm, 4,6 × 200 mm) verwendet. Die Detektion erfolgt über einen UV-Detektor bei 365 nm. Die Elution der Thiole wird mit einem Gradienten aus Laufmittel A (80% Methanol) und Laufmittel B (64% Methanol, 0,5 M Natrium-Acetat, 10% Essigsäure) durchgeführt. Der Gradient steigt nach 5 min. von 20% Laufmittel B innerhalb von 20 min. auf 99% Laufmittel B an, verbleibt 5 min. bei 100% Laufmittel B und fällt dann innerhalb von 5 min. wieder auf 20% Laufmittel B ab. Anschließend wird die Säule vor dem nächsten Lauf mit 20% Laufmittel B gespült.

Zur Quantifizierung der GSH- und GSSG-Konzentrationen in behandelten und unbehan­ delten (Kontrolle) Fichtenzellen wird von GSH im Bereich von 5-250 µM und für GSSG im Bereich von 5-200 µM eine Kalibriergerade aufgenommen. Zur Berechnung der Konzentration wird das Verhältnis des GSH- bzw. GSSG-Peaks zum internen Standard γ- Glu-Glu-Peak gebildet und die jeweiligen Konzentrationen pro g Frischgewicht berechnet.

Messung der Aktivität von Glutathion S-Transferase (GST)

Die Aufarbeitung des Pflanzenmaterials kann nach Standardmethoden für die Isolierung pflanzlicher GST durchgeführt werden, z. B. nach Schröder and Berkau (1993, Bot. Acta 106: 301-306); Schröder et al. (1992, Zeitschrift für Angewandte Botanik 174-179); Schröder and Pflugmacher (1996, Appl. Botany 70: 97-100), Schröder and Götzberger (1997, Appl. Botany 71: 31-37). Nach Inkubationsende werden bis zu 5 g des Zellmaterials über eine Nutsche trocken abgesaugt, in einen Mörser überführt und unter wiederholter Zugabe von flüssigem Stickstoff zu einem homogenen Pulver zerrieben. Dieses wird mit der 10-fachen Menge an Aufarbeitungspuffer (Kaliumphosphatpuffer, 0,1 M, pH 7, 8, 1% PVP K30 (Polyvinylpyrrolidon K30), 5 mM EDTA, 5 mM DTE (Dithioerytritol), 1% Nonidet) versetzt und für 10 min. auf Eis inkubiert. Anschließend wird das Gemisch 20 min. bei 20 000 rpm zentrifugiert. Der gewonnene Überstand stellt den Rohextrakt dar, mit dem alle weiteren Arbeiten (bei 4°C) durchgeführt werden. Das Pellet wird verworfen.

Die GST wird durch eine fraktionierte Ammoniumsulfatfällung in zwei Schritten, von 0-40% und von 40-80% Sättigung, von anderen Proteinen des Rohextrakts getrennt. Die für die einzelnen Fällungsschritte erforderlichen Salzmengen werden langsam (30 min.) unter ständigem Rühren dem auf Eis gekühlten Rohextrakt zugegeben. Anschließend läßt man das Gemisch noch 30 min. weiterrühren, so daß sich das Lösungsgleichgewicht einstellen kann. Nach dem ersten Fällungsschritt wird 20 min. bei 20 000 rpm zentrifugiert und das Pellet verworfen. Nach dem zweiten Fällungsschritt wird das ausgefällte Protein 30 min. bei 20 000 rpm durch Zentrifugation pelletiert. Das Pellet wird in 2,5 ml 20 mM Tris/HCl, pH 7,0, resuspendiert.

Im Anschluß an die Fällung wird das Ammoniumsulfat mittels Gelfiltration wieder aus dem Extrakt entfernt. Man verwendet dazu fertiggepackte PD 10 Gelfiltrationssäulen mit Sephadex G-25-Material von Pharmacia Biotech, Freiburg. Wie vom Hersteller angegeben, werden die Säulen mit 20 ml Puffer (20 mM Tris/HCl, pH 7,0) äquilibriert. 2,5 ml der zu entsalzenden Proteinlösung werden aufgetragen und mit 3,5 ml Puffer von der Säule eluiert.

Um den Aufwand der GST-Extraktion für Routineuntersuchungen, wie sie bei der Verwendung eines GST-Test anfällt, zu senken, kann auch eine vereinfachte Extraktionsmethode für pflanzliches Protein eingesetzt werden. Dabei verfährt man im einzelnen folgendermaßen:

Nach dem Ende der Inkubation werden die Zellen wie beschrieben abgenutscht und in flüssigem Stickstoff gefroren. Die Zellen werden aufgemörsert und mit einem Aliquot des Aufarbeitungspuffers versetzt. Anstelle der ersten Zentrifugation wird der Extrakt durch mehrere Lagen Mircloth filtriert. Dieser Extrakt stellt den Rohextrakt dar. Es folgt eine fraktionierte Ammoniumsulfat-Fällung. Nach Zugabe von 40% Ammoniumsulfat wird der Extrakt in eine große Perfusionsspritze gefüllt, deren Auslaßbereich mit mehreren Lagen Miracloth bedeckt ist. Unter Druck wird der Extrakt filtriert; es resultiert der "Überstand", der auf 80% Ammoniumsulfat-Sättigung gebracht wird. Das im Miracloth gesammelte Protein wird verworfen. Auf den zweiten Fällungsschritt folgt die Filtration über einen Amicon-Filter mit einer Ausschlußgrenze um 10 kD. Das Filtrat wird verworfen, die gefällten Proteine befinden sich auf der Filtermembran. Die Filtermembran wird in 20 mM Tris-HCl, pH 7,0, überführt und das Protein durch Rühren oder Ultraschallbehandlung abgelöst. Der Extrakt kann dekantiert und für enzymologische Messungen verwendet werden. Diese Methode erbringt etwa dieselben Protein- und Aktivitätsausbeuten wie konventionelle Extraktionen.

Die Enzymaktivität der GST wird im Proteinextrakt nach PD-10 Gelfiltration bestimmt. Proteinbestimmung in den Zellkulturextrakten wird nach der Methode von Bradford (1976, Anal. Biochem. 72: 248-254) durchgeführt.

Da die GST-Aktivität einzelnen Isoenzymen mit unterschiedlicher Substratspezifität zuzuordnen ist, wird neben dem Modellsubstrat 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol (CDNB) auch 1,2-Dichloro-4-nitrobenzol (DCNB), p-Nitrobenzoylchlorid (pNBC) und 1,2-Epoxy-3(p- nitrophenoxy)propan (EPNP) zur Bestimmung der Enzymaktivität verwendet. Die obengenannten Substrate werden im Verlauf der enzymkatalysierten Reaktion mit reduziertem Glutathion (GSH) konjugiert. Die lineare Zunahme des Produktes kann bei der jeweiligen substratspezifischen Wellenlänge im Photometer gemessen werden. Für die Messung werden GSH und die einzelnen Substrate in bidest. Wasser bzw. in Ethanol angesetzt und auf Eis gelagert. 0,1 M Kaliumphosphatpuffer mit unterschiedlichen pH- Wert wird bei Zimmertemperatur gelagert (20°C). Für den Testansatz werden in 1,5 ml- Küvetten 540 µl KPP-Puffer sowie je 20 µl GSH- und Substrat-Lösung pipettiert und gut gemischt. Durch Zugabe eines Aliquots der Enzymprobe wird die Reaktion gestartet. Als Blindwert wird ein Ansatz verwendet, in dem die Enzymprobe durch Wasser ersetzt ist.

Die Testansätze und Extinktionskoeffizienten für die Bestimmung der einzelnen Substratspezifitäten sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Die photometrische Bestimmung der GST-Aktivität von CDNB wird nach der Methode von Habig et al. (1974, J. Biol. Chem. 249: 1730-1739), die von DCNB und pNBC wird in Anlehnung an die Methode von Götzberger (1994, Diplomarbeit, Universität Ulm) durchgeführt, siehe auch Schröder et al. (1997, Appl. Botany 71: 31-37). Zur Messung der GST(EPNP)-Aktivität wird die Methode von Fjellstedt et al. (1973, J. Biol. Chem. 248: 3702-3707) ausgewählt.

Die Dreifachkombination von Biomarkern bewirkt eine hohe Sicherheit in der Aussage des Testsystems. Nach Verrechnung der Blindwerte sind die Meßparameter in Prozent über/unter Kontrolle anzugeben. Es ergibt sich für die Wirkung der Substanzen die in Tabelle 2 dargestellte Beurteilungsmatrix.

Tabelle 2

Biomonitoring mit Reinsubstanzen und authentischen Bodeneluaten

Fichtenzellkulturen reagieren auf Schwermetallverbindungen und organische Xenobiotika mit Streßreaktionen. Allerdings sind diese Reaktionen nicht stets gleich stark oder gleichgerichtet, sondern es kommt zu fremdstoffspezifischen Streßantworten. Der oxidative Burst zeigt sich nur bei den hier im Versuch verwendeten Schwermetallen. Es konnte eine streßinduzierte H₂O₂-Bildung bei Zugabe von 150 µmol/l Cadmiumsulfat und 5 ppm Arsen⁵⁺ beobachtet werden.

Anders als die obengenannten Schwermetalle reagieren die organischen Verbindungen 2,4- DNT und 2,6-DNT. Sie erzeugen auf die Zellen augenscheinlich keinen oxidativen Streß. Die Messung der Thiolgehalte, GSH und GSSG, ergibt ein ähnliches Bild der Streß­ wirkung wie der oxidative Burst. Dabei erhält man eine starke signifikante Änderung der Thiolgehalte bei den Schwermetallen Cadmiumsulfat und Arsenat, eine mäßige signifikante Änderung bei 2,4-DNT und Bleichlorid. Keine signifikante Änderung bewirkt die organische Verbindung 2,6-DNT.

Bei Inkubation mit 150 µmol/l CdSO₄ steigt der GSH-Gehalt um 83% und der GSSG- Gehalt sinkt um 34% in den behandelten Zellen. Beim Arsenat erhöht sich der GSSG- Spiegel um 226% gegenüber der Kontrolle, der GSH-Spiegel erniedrigt sich dagegen um 20% gegenüber der Kontrolle. Man erkennt ein gegenläufiges Bild der Wirkung der beiden Metalle.

Bei Bleichlorid wird der GSH-Gehalt um 42% gesenkt, der GSSG-Gehalt um 13%. In den mit 2,4-DNT inkubierten Zellen steigen GSH bzw. GSSG um jeweils 34% bzw. um 17% an. Unter dem Einfluß von 2,6-DNT kommt es zu keinerlei Änderungen des GSH- bzw. GSSG-Gehaltes.

Diese Ergebnisse zeigen, daß sich die ausgewählten Xenobiotika unterschiedlich auf das erfindungsgemäße System auf der Basis von 3 Bioindikatoren auswirken. Dabei deutet eine Erhöhung des GSSG-Gehalts auf oxidative Prozesse hin.

Bei der Bestimmung der GST-Aktivitäten in der mit unterschiedlichen Xenobiotika inkubierten Fichtenzellensuspensionskultur können einerseits Steigerungen der Enzymaktivität, andererseits Verluste von Aktivitäten bei Verwendung bestimmter Substrate verzeichnet werden. Die einzelnen Xenobiotika reagieren folgendermaßen:

• - Bleichlorid bewirkt mit CDNB als Substrat eine signifikante Aktivitätssteigerung bis 200 µmol/l PbCl₂. Die anderen Substrate befinden sich stets unter den Kontrollen, wobei man bei EPNP eine konzentrationsabhängige Hemmung feststellen kann. Bei 400 µmol/l befinden sich alle Substrate an ihrem Aktivitätsminimum.
• - Cadmiumsulfat führt zu einer positiven Beeinflussung der Konjugation aller Substrate in Konzentrationsbereichen von 50-100 µmol/l.
• - Arsenatkonzentrationen von 0-3 ppm führen nicht zu signifikanten Effekten. Bei einer Konzentration von 5 ppm steigt die Aktivität von CDNB, DCNB, pNBC, die von EPNP geht vollständig verloren.
• - 2,4-DNT und 2,6-DNT wirken im gewählten Konzentrationsbereich schwach. Bei 2,4- DNT ändern sich die Aktivitäten bei einer Konzentration von 1 ppm in signifikanter Weise. Sie bewegen sich in einem Intervall von 25%--25%. Auffallend ist, daß sich die Aktivitäten bei einer Konzentration von 8 ppm nicht sonderlich von der bei 1 ppm unterscheiden. Bei 2,6-DNT erhält man ebenfalls signifikante Aktivitätsänderungen bei 1 ppm. Im Unterschied zu 2,4-DNT befinden sich alle Werte oberhalb der Kontrolle.

Um auch in den Bodeneluaten die Effekte zu erhalten, die mit den Reinsubstanzen erzielt werden, ist es empfehlenswert, die in den Bodeneluaten enthaltene Menge an Xenobiotika zu erhöhen, indem man das Eluat aufkonzentriert (z. B. durch Lyophilisation). Größere Volumenzugaben des Eluats auf die Zellkulturen könnten sich oberhalb eines Schwellen­ wertes (der natürlich auch vom Volumen der im Test eingesetzten Kultur abhängig ist) störend auf das System auswirken.

Bei der Aufkonzentrierung durch Lyophilisation handelt es sich um eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Testsystems ist auch von Bedeutung, daß neben Patho­ genen nur Schwermetalle und nicht auch die geprüften organischen Substanzen einen oxidativen Burst auslösen. Die Schwermetalle führen hier auch schon in den niedrigen Konzentrationen, wie sie in authentischen Bodeneluaten vorhanden sind, zu Reaktionen. Damit ist es möglich, qualitative Aussagen zu machen, ob es sich bei der aufgefundenen Bodenkontamination um Schwermetalle oder organische Verbindungen handelt.

Das vorgestellte Testsystem ist somit nützlich für die Bestimmung von Wirkpotentialen von Xenobiotika in Boden- und Wasserproben.

Dies konnte auch in Versuchen mit authentischen Bodeneluaten gezeigt werden. Bevor die Induzierbarkeit der Biomarker, insbesondere der GST, in pflanzlichen Zellkulturen durch schadstoffbelastete Bodeneluate analysiert wurde, wurde untersucht, ob unbelastete Bodeneluate per se bereits Effekte auf die zu messenden Parameter ausüben können. Zu diesem Zweck wurden Kontrollkulturen ohne Eluat und Kulturen mit unbelastetem Bodeneluat vergleichend analysiert. Dabei war deutlich zu erkennen, daß die Zugabe von Bodeneluat zu der Fichtenzellkultur in keinem Fall die Biomarker-Aktvitäten der Zellen signifikant verändert.

Die Inkubation von Fichtenzellen mit belasteten Bodeneluaten führte bereits bei extrem niedrigen Schadstoffkonzentrationen zu Veränderungen in der GST-Aktivität. Besonders auffällig war der Verlust der GST-Aktivität für die Konjugation von EPNP unter dem Einfluß von CdSO₄ und die Erhöhung der Aktivität für dieses Substrat bei gleichzeitiger Erniedrigung der Konjugation von DCNB unter dem Einfluß von 2,4-DNT. Eine entsprechende Erhöhung der EPNP- und Hemmung der DCNB-Aktivität war auch bei Verwendung der Reinsubstanz bei gleicher Konzentration gefunden worden.

Claims (13)

1. Verfahren zum Nachweis von Schwermetallen und organischen Xenobiotika in einer Testlösung, das die Schritte umfaßt:

• a) Zugeben der Testlösung zu einer pflanzlichen Zellsuspensionskultur,
• b) Inkubieren der Zellsuspensionskultur und
• c) Bestimmen der Testparameter oxidativer Burst, Glutathiongehalte (GSH/GSSG) und Glutathion S-Transferase (GST)-Aktivität.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Testparameter oxidativer Burst anhand des HZOZ Gehalts bestimmt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die GST-Aktivität unter Verwendung von mindestens einem GST-Substrat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 1-Chloro- 2,4-dinitrobenzol (CDNB), 1,2-Dichloro-4-nitrobenzol (DCNB), 1,2-Epoxy-3(p- nitrophenoxy)propan (EPNP) und p-Nitrobenzoylchlorid (pNBC), bestimmt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die GST-Aktivität unter Verwendung der GST- Substrate 1-Chloro-2,4-dinitrobenzol (CDNB), 1,2-Dichloro-4-nitrobenzol (DCNB), 1,2-Epoxy-3(p-nitrophenoxy)propan (EPNP) und p-Nitrobenzoylchlorid (pNBC) bestimmt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die GST-Aktivität unter Verwendung von DNA- Chips oder Biosensoren bestimmt wird.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Glutathiongehalte nach Carboxylierung und Derivatisierung mittels HPLC-Analytik bestimmt werden.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Zellsuspensionskultur Zellen enthält, die zur Ligninsynthese fähig sind.

8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Zellsuspensionskultur eine Gymnospermen-Suspensionskultur ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Zellsuspensionskultur eine Pinaceen- Suspensionskultur ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, worin die Zellsuspensionskultur eine Suspensionskultur von Picea abies ist.

11. Verwendung des Verfahrens nach einem der vorangehenden Ansprüche zum Nachweis von Schwermetallen und organischen Xenobiotika in Prozeßwässern und Bodeneluaten.

12. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zum Nachweis von Schwermetallen wie Blei, Cadmium und Arsen.

13. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zum Nachweis von organischen Xenobiotika wie Dinitrotoluolen.