DE19950262A1 - Verfahren zur Durchführung eines durchflusszytometrischen Phagozytosetests - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft einen durchflußzytometrischen Phagozytosetest für die Erkennung eines Phagozytosedefekts eines Patienten anhand einer dem Patienten entnommenen Blutprobe. DOLLAR A Die bekannten durchflußzytometrischen Verfahren weisen den Nachteil auf, daß sie aufgrund aufwendig handhabbarer Fremdkörperinkubation kostenintensiv sind und eine aufwendige Verfahrensführung erfordern. Dies soll die Erfindung vermeiden. DOLLAR A Hierzu wird einer degenerierten Hefesuspension mit einer Fluoreszenz-Lösung inkubiert, durch Zumischen der inkubierten Hefesuspension zu der Blutprobe ein Inkubationsansatz und durch Inkubation des Inkubationsansatzes eine Meßprobe hergestellt. Durch Bestrahlen der durch ein Meßvolumen eines Durchflußzytometers geleiteten Meßprobe und Erfassen sowie Interpretieren der von den in der Meßprobe enthaltenen Granulozyten reflektierten Streustrahlung sowie der Fluoreszenzstrahlung wird der Phagozytosedefekt bestimmt. DOLLAR A Zur Vermeidung von Verklumpungen der Meßprobe im Durchflußzytometer werden Hefezellen in einer wäßrigen Hefelösung verwendet, die einen Trockensubstanzgehalt von etwa 15 bis 35%, insbesondere 26% aufweist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung eines durchflußzytome­ trischen Phagozytosetests für die Erkennung eines Phagozytosedefekts eines Patienten anhand einer dem Patienten entnommenen Blutprobe.

Die Phagozytose als wesentlicher Teil der unspezifischen zellulären Abwehr ist überlebenswichtig. Obwohl die Hauptmechanismen der Phagozytose gut be­ kannt sind, konnten einige Vorgänge der komplexen Phagozytose bisher noch nicht in allen Einzelheiten entschlüsselt werden. Die sehr seltenen primären Phagozytosedefekte sind häufig vererbt und führen in aller Regel zu außeror­ dentlich schweren, zum Teil tödlichen, Infektionserkrankungen. Dies wird da­ durch erklärt, daß die primären Phagozytosedefekte zumeist das Sicherungssy­ stem der Redundanz der Phagozytose durchbrechen, indem sie mehrere Mecha­ nismen der Phagozytose simultan beschädigen. Sekundäre Phagozytosedefekte sind sehr viel häufiger, werden aber klinisch kaum manifest. Eine Untersu­ chungsmöglichkeit der Phagozytosefähigkeit des Blutes eines Patienten ist da­ her wesentlicher Bestandteil zur Untersuchung des Immunsystems.

Die Durchflußzytometrie ist eine Methode, um optisch strukturelle Eigenschaf­ ten oder Komponenten von Zellen zu quantifizieren. Sie ist aufgrund der Analy­ segeschwindigkeit und der hohen Empfindlichkeit ein einzigartiges Werkzeug für die Zellanalytik mit einem ständig wachsenden Anwendungsspektrum. Die Grundlagen der quantitativen Zytologie und somit zugleich der Durchflußzyto­ metrie wurden bereits zwischen den dreißiger und fünfziger Jahren durch Caspersson und seine Kollegen (Caspersson, T. O., Cell Growth and Cell Functi­ on, New York, 1950, S. 1 ff.) gelegt, die Pioniere auf dem Gebiet der Lichtabsorp­ tionsmessungen von Zellkomponenten und Nukleinsäuren waren. In der glei­ chen Zeit demonstrierten Coons et al. (Coons, A. H. et. al., Immunologic proper­ ties of an antibody containing flourescent group, Proc Soc Exp Biol Med 47, 1941, S. 200-202) die erstmalige Benutzung von Immunfloureszenz- Durchflußzytometern.

Das Durchflußzytometer umfaßt die Baugruppen optisches System, signalverar­ beitendes System und das Flüssigkeitssystem. Während das Flüssigkeitssystem die Zellen durch einen Versuchsaufbau leitet, stellt das optische System einen Lichtstrahl zur Erzeugung eines Meßsignals und eine Auswertungsmöglichkeit für das infolge der Messung veränderliche Meßsignal zur Verfügung.

Das Flüssigkeitssystem weist einen zentralen Meßpunkt in Form einer Meß­ kammer auf, die üblicherweise von einer Quarzküvette mit einem rohrartigem Hohlraum, dem sogenannten Lumen gebildet ist. Eine Zellsuspension wird über eine Leitung dem Lumen der Meßkammer zugeführt und trifft dort auf eine vom Durchflußzytometer zur Verfügung gestellte Trägerlösung. Die Trägerlösung transportiert nun die zellenthaltende Probensuspension durch das Lumen, wo­ bei dieses Lumen über das optische System mit einem gebündelten Lichtstrahl, insbesondere einem Laserstrahl beleuchtet wird. Die einzelnen Zellen streuen das einfallende Licht, wobei ein für eine bestimmte Zelleigenschaft signifikanter Teil des Streulichtes über einen Photomultiplier erfaßt wird.

Die Messung kann nur dann erfolgreich ablaufen, wenn die Zellen nacheinander das Lumen passieren und somit einzeln bestrahlt werden. Hierzu werden die Zellen in der Trägerlösung perlschnurartig hintereinander zum Ort der Laser­ bestrahlung und Messung geführt. Um dieses zu erreichen, wird die Trägerlö­ sung mit den Zellen in dem sich verjüngenden Lumen des Flüssigkeitssystems von einer Fließgeschwindigkeit von wenigen Zentimetern in der Sekunde auf etwa sieben Meter in der Sekunde beschleunigt (sog. Hydrodynamische Fokus­ sierung). Im Meßpunkt trifft innerhalb des Lumens der Küvette der Laserstrahl auf die Zellen, wobei es sich im eigentlichen Sinne nicht um einen einzigen Meßpunkt handelt, sondern vielmehr elliptisch-horizontales Meßvolumen mit einer Größe von etwa 20 × 60 γm.

Zum optischen System gehören neben einer Lichtquelle, insbesondere einer La­ serstrahlquelle verschiedene optische Bauteile, zum Beispiel Linsen und Spie­ gel, die das Streulicht zu der elektronischen Auswertung (z. B. Photodioden und Verstärker) weiterleiten. Die Aufgabe der elektronischen Auswertung besteht darin, alle von einer Zelle gesendeten Signale zu messen und zu korrelieren. Die Detektoren messen ununterbrochen Signale, ohne diese in echte Zellsignale oder Rausch- und Störsignale zu unterscheiden. Durch Verstärkung und Triggerung der Signale werden Rausch- oder Störsignale von den interessierenden Meßsi­ gnalen getrennt, die nachfolgend statistisch erfaßt und ausgewertet werden.

Ein derartiges durchflußzytometrisches Testverfahren zur Bestimmung von Zelleigenschaften ist beispielsweise aus Andoh et. al., Flow Cytometric Assay of Human Moncytes Mediated via Fcγ-Receptors and Complement Receptor CR1 (CD53), Cytometry, 1991, S. 677 ff. bekannt. Bei diesem Verfahren wird die Pha­ gozytosefähigkeit der im Blut eines Patienten enthaltenen Granulozyten durch Zugabe von Fremdkörpern bestimmt, die infolge der Phagozytose an der Zell­ membran der Granulozyten anhaften und später ingestiert werden. über eine Markierung der Fremdkörper mit einer fluoreszierenden Substanz kann das Streulichtverhalten und die Fluoreszenz der einzelnen Zellen beeinflußt werden, woraus die Phagozytosetätigkeit ableitbar ist.

Diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß mit ihnen eine einfache Unter­ suchung oft nicht möglich ist, da nur einzelne Zellen nacheinandergeschaltet untersucht werden können. Die durchflußzytometrische Untersuchung, bei­ spielsweise von einer Vielzahl von Zellen in einem Gewebeverband, ist nicht möglich, da die Signale einzelner, nebeneinander das Lumen passierender Zel­ len nicht voneinander getrennt werden können. Es müssen also Untersu­ chungsmethoden gewählt werden, die ein Verklumpen oder Verkleben der Zel­ len zu einem Zellverbund vermeiden. Hierzu werden bei den bekannten Verfah­ ren für die Untersuchungen meist abgetötete Bakterien, zum Beispiel E. coli, Pneumokokken oder Staphylokokkus aureus, Viren oder Candida albicans als antigene Substanzen verwendet, die zumindest vor der Degeneration der Zellen der Trägerlösung nur erschwert aufzubewahren sind und eine fakultative Pa­ thogenität aufweisen. Ferner werden als antigene Partikel kleine, aus Latex be­ stehende Kunststoffpartikel, sogenannte Latex-beads, oder Immunkomplexe eingesetzt, die jedoch hohe Kosten verursachen.

Schließlich wurde versucht, eine aus Trockenhefe hergestellte Hefezellenlösung, beispielsweise Saccharomyces cerevisiae, als Fremdkörper einzusetzen. Bei der Verwendung von Saccharomyces cerevisiae entsteht jedoch das Problem, daß fe­ ste Hefe, die in eine wässrige Suspension überführt wird, durch die molekulare Struktur der Hefezellwand bedingt, während der weiteren Verarbeitung agglu­ tiniert, so daß eine durchflußzytometrische Untersuchung durch Verklumpung der Hefelösung unmöglich wird. Aus diesem Grund wurde vor einer allgemeinen Veröffentlichung der durchflußzytometrischen Messung mittels Hefezellen diese Methode wegen der vermeintlich nicht zu überwindenden Schwierigkeit des Verklumpens der Suspension wieder verworfen.

Ferner weisen die bekannten Tests den Nachteil auf, daß mit ihnen entweder nur die Fremdkörper-Adhäsion, bzw. die Fremdkörper-Ingestion, oder die sauer­ stoffabhängige Abtötung, der sogenannte "respiratory burst" getrennt voneinan­ der untersucht werden kann.

Aufgabe der Erfindung ist es, einen möglichst einfachen Test zu schaffen, der leicht und kostengünstig durchführbar ist und möglichst umfassende Erkennt­ nisse über die Phagozytose-Fähigkeit von zu untersuchenden Zellen liefert.

Diese Aufgabe wird nach der Erfindung durch ein Verfahren zur Durchführung eines durchflußzytometrischen Phagozytosetests für die Erkennung eines Pha­ gozytosedefekts eines Patienten anhand einer dem Patienten entnommenen Blutprobe gelöst, das die Verfahrensschritte Herstellen einer degenerierten He­ fesuspension, Inkubation der Hefesuspension mit einer Fluoreszenz-Lösung, Herstellen eines Inkubationsansatzes durch Zumischen der inkubierten Hefe­ suspension zu der Blutprobe, Inkubation des Inkubationsansatzes zur Herstel­ lung einer Meßprobe, Bestrahlen der durch ein Meßvolumen eines Durchflußzy­ tometers geleiteten Meßprobe mit Licht, insbesondere einem Laserstrahl, Erfas­ sen der von den in der Meßprobe enthaltenen Granulozyten reflektierten Streu­ strahlung und Bestimmung des Anteils der auf den Granulozyten aufsitzenden und in die Granulozyten ingestierten Hefezellen durch Auswertung der Rich­ tung und bzw. oder der Intensität der Streustrahlung und der Fluoreszenz als Maß des Phagozytoseaktivität aufweist.

In einer erweiterten Ausgestaltung soll der Test auch die Möglichkeit bieten, zum einen die Adhäsion von FITC-markierten degenerierten Saccharomyces ce­ revisiae-Partikeln an neutrophilen Granulozyten zu bestimmen und zum ande­ ren bereits ingestierte Saccharomyces cerevisiae-Partikel von noch nicht inge­ stierten zu differenzieren sowie den "respiratory burst of phagocytosis" zu de­ terminieren.

Hierzu werden zur Differenzierung der von adhärierten und ingestierten Hefe­ zellen reflektierten Streustrahlung vor dem Bestrahlen der Meßprobe die adhä­ rierten Hefezellen mittels eines Quenching-Verfahrens chemisch so behandelt, daß sie nach Bestrahlung mit der Lichtquelle das einfallende Licht nicht mehr zu fluoreszieren vermögen. Die wird dabei Meßprobe mit einem sogenannten Quencher vermischt, der nicht in die Phagozyten einzudringen vermag und die Fluoreszenz der adhärierten Hefezellen reduziert oder gar unterdrückt. Dieses Verfahren wird bevorzugt im Anschluß an ein vollständiges Meßverfahren zur Bestimmung der Gesamtphagozytose durchgeführt, so daß anschließend die Er­ gebnisse beider Verfahren miteinander verglichen werden können. Der Quen­ cher ist dabei ein Stoff, der die Fluoreszenz der des in der Meßprobe enthaltenen fluoreszierenden Stoffes durch chemische Reaktion abbaut. Dies kann bei­ spielsweise Trypan Blau sein.

Im Anschluß an die genannten Verfahrensschritte kann dann optional noch der "respiratory burst of phogocytosis", also die Fähigkeit der Granulozyten zur sau­ erstoffabhängigen Fremdkörperabtötung bestimmt werden. Hierzu wird von der Blutprobe vor der Durchführung des oben beschriebenen Phagozytosetests eine Teilprobe abgezweigt, mit der dann insbesondere im Anschluß an den Phagozy­ tosetest zur Bestimmung des "respiratory burst" ein dritter Teiltest durchge­ führt wird. Dabei wird zunächst in die in der Teilprobe enthaltenen Phagozyten eine Substanz eingeschleust, die erst durch Oxidation innerhalb der Phagozyten zu einem fluoreszierenden Stoff, insbesondere Fluorchrom, umgewandelt wird.

Anschließend wird eine durchflußzytometrische Messung dieser Teilprobe zur Bestimmung der gebildeten reaktiven Sauerstoffspezies durchgeführt. Die für diesen Teiltest in die Phagozyten eingeschleuste Substanz kann beispielsweise 2',7'-Dichloroflourescein Diacetat sein.

Durch die Entwicklung des erfindungsgemäßen Phagozytosetests kann im Ge­ gensatz zu den bekannten Tests durch Verwendung der speziellen Hefepartikel einerseits die durchflußzytometrischen Messung leicht und kostengünstig einge­ setzt und andererseits, im Fall einer vorteilhaften Weiterbildung des Tests, die Hauptmechanismen der Phagozytose, also die Fremdkörperadhäsion und -ingestion, sowie die oxidative Verbrennung in einem gemeinsamen Verfahren erfaßt werden. Es können je nach Bedarf aber auch alle drei Teilversuche, die Bestimmung der Phagozytosefähigkeit allgemein, die Bestimmung der Menge der ingestierten Zellen und die sauerstoffabhängige Abtötungsaktivität infolge des "respiratory burst" einzeln durchgeführt werden.

Das für die Durchführung des ersten Teilversuchs schwerwiegende Problem der Hefeverklumpung wird erfindungsgemäß durch den Einsatz einer wässrigen, aus der allgemein bekannten Hefeproduktion erhältlichen Hefesuspension ge­ löst. Die Suspension hat im Vergleich zu den bisher verwendeten Fremdkör­ permaterialen eine Reihe erheblicher Vorteile. Zu diesen Vorteilen gehört, ne­ ben der Ungiftigkeit und der fehlenden Pathogenität, überraschenderweise eine komfortable Handhabung, denn Einfrieren und erneutes Auftauen mit der Schwierigkeit, die dann schon verklumpte Hefe wieder in Lösung zu bringen, können entfallen.

Bevorzugt wird die Hefesuspension aus einer Flüssighefe hergestellt, die beson­ ders leicht als intermediäres Produkt aus der Herstellung der Trockenhefe für die Nahrungsmittelproduktion erhältlich ist. Die Flüssighefe weist insbesondere einen Trockensubstanzgehalt von 15 bis 35% auf, besonders gute Ergebnisse wurden mit einem Trockensubstanzgehalt von 26% erzielt. Wird der Trocken­ substanzgehalt über diese Grenzen erhöht, tritt eine Agglutination der Hefe auf, die zur Verstopfung des Durchflußzytometers und damit zwangsläufig zum vor­ zeitigen Ende des Tests führt. Die zur Herstellung der Hefesuspension ver­ wandte Flüssighefe fällt im Laufe der Herstellung fester Bäckerhefe als Zwi­ schenprodukt an und wird beispielsweise von der Firma Uniferm, 40789 Monheim, Deutschland angeboten. Die Flüssighefe wird mittels Fermentation durch Zentrifugalwaschung, Filtration und Separation der Hefezellen und anschlie­ ßendes Verdünnen mit Frischwasser zu der gewünschten Konzentration im obengenannten Bereich hergestellt.

Die einmal zubereitete Suspension ist ohne weitere Lagervorkehrungen über mehrere Monate verwendbar, so daß im Laboralltag ein große Menge der Hefe­ suspension zubereitet werden kann, die dann für die in den nächsten Monaten anstehenden Untersuchungen eingesetzt werden kann. Dies reduziert die Ko­ sten des Verfahrens und die Anforderungen an die Qualifikation des Laborper­ sonals deutlich, was zu einer deutlichen Senkung der Untersuchungskosten im Laborbereich führen wird.

Bevorzugt werden Hefezellen der Art Saccharomyces cerevisiae als antigene und zu phagozytierende Partikel verwendet. Diese Hefeart Saccharomyces cervisiae wird auch als "Bäckerhefe" bezeichnet und ist kostengünstig erhältlich. Da zahl­ reiche homologe Gene der Saccharomyces cervisiae dem menschlichen Genom ähnlich sind, können mit Hilfe von Saccharomyces cerevisiae-Partikeln Grund­ funktionen humaner Zellen und Erberkrankungen erfolgreich untersucht wer­ den.

Für den erfindungsgemäßen Test ist Saccharomyces cerevisiae besonders geeig­ net, weil sie zu den am besten erforschten Zellen gehört, ungiftig und nicht pa­ thogen ist, jederzeit problemlos und preiswert in großen Mengen erhältlich ist und leicht in einer wässrigen Suspension gehalten werden kann. Darüber hin­ aus läßt sie sich für Versuchszwecke durch Hitzeeinwirkung leicht degenerieren und kann wie Granulozyten aufgrund der Zellgröße durchflußzytometrisch un­ tersucht werden. Schließlich ist Saccharomyces cervisiae antigen und kann pha­ gozytiert werden, wobei sich die Zellwände von Sacchormyces cerevisiae markie­ ren lassen.

Die Markierung zur Erzeugung der notwendigen Fluoreszenz erfolgt insbeson­ dere mit FITC. FITC ist ein Fluorochrom, welches nach Bestrahlung mit Licht Fluoreszenz aussendet. Die Intensität dieser Fluoreszenz kann dann durchflußzytometrisch gemessen werden und zusammen mit den Kenngrößen Streurich­ tung und -intensität als Maß für die Phagozytosefähigkeit der Granulozyten her­ angezogen werden. FITC ist in der Medizin eines der am häufigsten verwende­ ten Fluorochrome. Seine Vorteile liegen in der Wasserlöslichkeit, dem hohen Ex­ tinktionskoeffezienten, dem geringen Molekulargewicht und der Fluoreszenz bei einem physiologischen pH-Wert. Die Anbindung an die Hefezellen erfolgt über die in der Zellwand lokalisierten Lipide, da FITC an primäre neutrale Amino­ gruppen anbindet. Das Maximum der Lichtabsorption liegt bei 490 nm, so daß als Lichtquelle des Durchflußzytometers bevorzugt ein auf dieser Wellenlänge angeregter Argonionenlaser eingesetzt wird.

Im folgenden wird nun die konkrete Durchführung eines erfindungsgemäßen Tests anhand beispielhafter Details beschrieben:
Für die Degeneration und Vorbereitung der Hefe wird zunächst 1 ml Hefemilch vorsichtig mit einer Eppendorfpipette in ein Saarstedt-Röhrchen gegeben. Es sollte darauf geachtet werden, daß keine Hefe die Wandung des Röhrchens im mittleren oder oberen Bereich benetzt, da die Gefahr besteht, daß dann die Hefe nicht komplett degeneriert und später Hefesprossen bildet. Die Hefe wird an­ schließend bei 90° Celsius 45 Minuten im Wasserbad degeneriert.

Ein Anteil der so degenerierten Hefe wird 30 Minuten mit 9 Anteilen FITC- Lösung inkubiert. Die Inkubation erfolgt im Wasserbad bei 37° Celsius. Für die Herstellung der FITC-Lösung wird 100 ml 0,5 m Carbonatpuffer benötigt. Dieser Puffer sollte einen pH-Wert von 9,5 haben. Hierzu wird eine 0,2 m Natriumcar­ bonatlösung (2,12 g/100 ml Aqua dest.) und eine 0,2 m Natriumbicarbonatlösung (1,68 g/100 ml Aqua dest.) hergestellt. Dann werden 8,0 ml der Natriumcarbonat­ lösung zu 17,0 ml der Natriumbicarbonatlösung gegeben. Dieses Volumen wird anschließend mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt. Auf diese 100 ml kommen dann 10 mg FITC (0,1%ige Lösung).

Nach der Inkubation mit der FITC-Lösung wird die Hefe drei- bis viermal mit Sörensens Phosphatpuffer gewaschen und danach in 9 ml Sörensens Phosphat­ puffer aufgenommen. Der Phosphatpuffer hat einen pH-Wert von 7,2. Dies entspricht 28,5 ml einer 1/15 m Monokaliumphosphatlösung (9,08 g Monokalium­ phosphat auf 1 l Aqua dest.) zuzüglich 71,5 ml einer 1/15 m Dinatriumphosphatlö­ sung (11,88 g Dinatriumphosphat auf 1 l Aqua dest.). Die in dem Puffer gelöste Hefe wird aufgeschüttelt. Hiervon werden 5 ml entnommen, die nochmals mit 5 ml Sörensens Puffer verdünnt werden. Mit dieser Verdünnung ist die Hefesus­ pension testfertig. Die so erzeugte Hefesuspension ist für eine Vielzahl von Ver­ suchen ausreichend.

Zusätzlich ist eine regelmäßige Kontrolle des pH-Wertes der Lösungen ist sinn­ voll, gegebenenfalls kann man mit den sauren oder alkalischen Anteilen der Puffer den pH-Wert einstellen. Normalerweise werden die Puffer nach einiger Zeit bei Aufbewahrung in Glas alkalisch (Hydroxidionenemigration in die Puf­ ferlösung). Die markierte Hefe sollte unter Auschluß von Licht aufbewahrt wer­ den. Beim Experimentieren kann die Hefe bedenkenlos mehrfach mit Licht in Kontakt kommen. Ein Verlust der Fluoreszenz ist nicht zu erwarten, wie Zu­ satzexperimente gezeigt haben. Die markierte Hefe muß nicht eingefroren wer­ den. Sie kann bei 4° Celsius im Kühlschrank aufbewahrt werden. Agglutinati­ onsserscheinungen treten erfahrungsgemäß nach etwa 3 Monaten auf. Das Klumpen ist im Lichtmikroskop gut zu sehen, da im Falle des Verklumpens die Hefezellen weintraubenartige Gestalt annehmen.

Zum Mikroskopieren wird der Hefelösung etwas Sörensens Phosphatpuffer auf einen Objektträger gegeben und dazu eine kleine Menge aufgeschüttelter Hefe hinzugefügt. Geklumpte Hefe ist nicht mehr verwendbar. Nicht markierte aber degenerierte Hefe ist bei Lagerung im Kühlschrank länger haltbar und kann auch nach drei Monaten noch mit FITC markiert werden.

Für die Austestung eines Patienten werden dann 5 ml venöses Heparinblut (1000 U) benötigt. Die Blutentnahme sollte bei den nüchternen Probanden sorg­ fältig erfolgen. Eine zu schnelle Blutentnahme sowie die Entnahme in Vakuum­ röhrchen kann zur Hämolyse und Beeinträchtigung der Leukozyten mit nach­ folgenden falschnegativen Testwerten führen. Das Heparinröhrchen wird an­ schließend zur Sedimentation aufrecht bei 37°C in den Brutschrank gestellt. Nach einer Stunde wird der zellreiche Plasmaüberstand abpipettiert und bei 80-120 G abzentrifugiert. Nach diesem Zentrifugieren wird das überstehende Se­ rum abpipettiert. Das Serum sollte nicht verworfen werden, da es später noch benötigt wird.

Zur Herstellung des Inkubationsansatzes wird dann das zurückgebliebene Se­ diment zweimal in, mit Albumin angereichertem Sörensens Phosphatpuffer, pH 7,2, gewaschen (200 mg Albumin/100 ml Puffer). Auch nach den Waschungen sollte nicht über 120 G zentrifugiert werden. Nach der zweiten Waschung erfolgt die Zugabe von 200 µl Serum desselben Spenders, 100 µl Sörensens Phosphatpuf­ fer und 100 µl Versuchshefe. Diese Mischung wird kräftig aufgeschüttelt und 30 Minuten im Wasserbad bei 37° Celsius inkubiert. Nachdem der Inkubationsan­ satz 30 Minuten im Wasserbad war, werden von diesem, nach Aufschütteln, 100 µl in, ein zuvor mit 4 ml Sörensens Phosphatpuffer gefülltes, Röhrchen gege­ ben. Danach erfolgt die Messung am Durchflußzytometer.

Zur Bestimmung der Quantität der adhärierten Hefezellen im zweiten Teil des Testverfahrens wird der wie zuvor beschriebene Inkubationsansatz hergestellt. Vor Zugabe der Hefe erfolgt die Präinkubation mit 50 µg Cytochalasin B. Hierzu werden 1000 µg Cytochalasin B in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, an­ schließend erfolgt eine weitere Verdünnung mit 400 ml Sörensens Phosphatpuf­ fer. Von dieser Lösung werden 500 µl zur Präinkubation auf die Granulozyten gegeben.

Es erfolgt die Inkubation für 20 min im Wasserbad bei 37°C. Danach erfolgt die 30minütige Inkubation mit 100 µl Versuchshefe ebenso bei 37°C im Wasserbad. Hiernach wird die erste Messung am Durchflußzytometer durchgeführt. Der Ansatz kann vor der Messung noch weiter mit Sörensens Phosphatpuffer ver­ dünnt werden. Die zweite Messung erfolgt nach Zugabe von 2 ml Trypan Blau- Lösung (4 mg Trypan Blau/1 ml Sörensens Phosphatpuffer).

Nach dem Auslöschen der Fluoreszenz, die von den auf den Phagozyten außen aufsitzenden FITC-markierten Hefepartikel stammt, wird nur diejenige Fluo­ reszenz gemessen, die von den bereits ingestierten Partikeln ausgeht. Diese Fluoreszenz betrug im Falle einer beispielhaften Versuchsreihe mit 30 Probanden durchschnittlich 19,88% mit einer Standardabweichung von 12,33%. Durch­ schnittlich konnte 31,04% der Gesamtfluoreszenz ausgelöscht werden, die durchschnittliche Relativabweichung betrug 63,33%. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß etwa 1/3 der Gesamtfluoreszenz von außen aufsitzenden mar­ kierten Hefepartikeln stammte, deren Fluoreszenz durch die vorliegende Me­ thode ausgelöscht wurde, so daß eine quantitaive Unterscheidung zu den bereits ingestierten Partikeln möglich ist.

Im Rahmen des dritten Schrittes des Testverfahrens wird die sauerstoffabhän­ gige Abtötungsfähigkeit untersucht. Nach Ingestion eines Fremdkörpers in ei­ nen Phagozyten kommt es durch diese sauerstoffabhängigen Abtötungsmecha­ nismen der Phagozytose zur Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, die den Fremdkörper oxidativ zerstören können. Ziel dieses Testteils ist die durch­ flußzytometrische Bestimmung des "respiratory burst of phagocytosis". Hierzu wird zum Beispiel 2',7'-Dichlorofluorescein Diacetat verwendet, welches nach der Inkubation mit den neutrophilen Granulozyten in diese hineindiffundiert und dort in das fluoreszierenede 2',7'-Dichlorofluorescein umgewandelt wird. Die durchflußzytometrisch gemessene Fluoreszenz des 2',7'-Dichlorofluorescein ist ein direktes Maß für die innerhalb des "respiratory burst" gebildeten reakti­ ven Sauerstoffspezies.

Für die konkrete Durchführung dieses Testteils werden die Granulozyten mit einer 15 millimolaren 2',7'-Dichlorofluorescein Diacetat-Lösung inkubiert. Hier­ zu werden 0,0073 g 2',7'-Dichlorofluorescein Diacetat in 100 µl DMSO gelöst und weiter mit 900 µl Sörensens Phosphatpuffer verdünnt. Von diesem Volumen werden 200 µl auf die gewonnen Granulozyten, die, wie oben beschrieben, zuvor mit dem 200 µl Serum desselben Spenders und 100 µl Sörensens Phosphatpuffer gemischt wurden, gegeben. Es erfolgt dann die Inkubation im Wasserbad bei 37°C und anschließend die Messung am Durchflußzytometer.

Durch die erfindungsgemäße Verwendung von handelsüblicher Flüssighefe kann die durchflußzytometrische Messung zur Phagozytosebestimmung einge­ setzt werden, was die Kosten des Testverfahrens derart gesenkt werden, daß dieses Verfahren im Labor- und Diagnostikalltag zu einer spürbaren Kostensenkung führt. Eine aufwendige Handhabung mit radioaktivem Material oder virulenten Materialen entfällt, die Hefesuspension kann in ausreichender Men­ ge auf Vorrat hergestellt werden, ohne daß dieser Vorrat aufwendig gelagert werden müßte oder aufgrund von Alterungserscheinungen zu unvorhersehbaren Ausfällen führen könnte.

Weitere Vorteile und Merkmale des erfindungsgemäßen Testverfahrens zur Be­ stimmung der Phagozytosefähigkeit ergeben sich auch den Unteransprüchen.

Claims (14)

1. Verfahren zur Durchführung eines durchflußzytometrischen Phagozytose­ tests für die Erkennung eines Phagozytosedefekts eines Patienten anhand einer dem Patienten entnommenen Blutprobe, mit den Verfahrensschritten

• - Herstellen einer degenerierten Hefesuspension,
• - Inkubation der Hefesuspension mit einer Fluoreszenz-Lösung,
• - Herstellen eines Inkubationsansatzes durch Zumischen der inkubier­ ten Hefesuspension zu der Blutprobe,
• - Inkubation des Inkubationsansatzes zur Herstellung einer Meßpro­ be,
• - Bestrahlen der durch ein Meßvolumen eines Durchflußzytometers geleiteten Meßprobe mit Licht, insbesondere einem Laserstrahl,
• - Erfassen der von den in der Meßprobe enthaltenen Granulozyten reflektierten Streustrahlung sowie der Fluoreszenz-Strahlung und
• - Bestimmung des Anteils der auf den Granulozyten aufsitzenden und in die Granulozyten ingestierten Hefezellen durch Auswertung der Richtung und/oder Intensität der Fluoreszenz-Strahlung als Maß des Phagozytosedefekts.

2. Verfahren zur Durchführung eines durchflußzytometrischen Phagozytose­ tests nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefesuspension aus einer Flüssighefe hergestellt wird.

3. Verfahren zur Durchführung eines durchflußzytometrischen Phagozytose­ tests nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssighefe einen Trockensubstanzgehalt von 15 bis 35%, insbesondere einen Trockensub­ stanzgehalt von 26% aufweist.

4. Verfahren zur Durchführung eines durchflußzytometrischen Phagozytose­ tests nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Herstel­ lung der Hefesuspension verwandte Flüssighefe ein intermediäres Produkt aus der Herstellung fester Bäckerhefe ist, wobei die Flüssighefe mittels Fermentation durch Zentrifugalwaschung, Filtration und Separation der Hefezellen und anschließendes Verdünnen mit Frischwasser zu der insbe­ sondere 26%igen Konzentration hergestellt wird.

5. Verfahren zur Durchführung eines durchflußzytometrischen Phagozytose­ tests nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenz-Lösung eine Fluoreszeinisothiocyanat-(FITC-)Lösung ist.

6. Verfahren zur Durchführung eines durchflußzytometrischen Phagozytose­ tests nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mit der Fluoreszenz-Lösung inkubierte Hefesuspension vor Vermi­ schen mit der Blutprobe zumindest einmal mit einem Phosphatpuffer gewa­ schen wird, wobei der Phosphatpuffer insbesondere ein Sörensens Phos­ phatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2 ist.

7. Verfahren zur Durchführung eines durchflußzytometrischen Phagozytose­ tests nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung der Blutprobe venöses Heparinblut verwendet wird, dem nach Sedimentation der zellreiche Plasmaüberstand abgenommen wird, wobei der Plasmaüberstand anschließend zentrifugiert wird und das nach dem Zentrifugieren überstehende Serum abgenommen wird und wobei das verbleibende Sediment zumindest einmal in mit Albumin angereicher­ tem Sörensens Phosphatpuffer gewaschen wird und das gewaschene Sedi­ ment nachfolgend mit abgenommenen Serum, Phosphatpuffer und der He­ fesuspension gemischt wird.

8. Verfahren zur Durchführung eines durchflußzytometrischen Phagozytose­ tests nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Lichtquelle ein Laser, insbesondere ein Argonionenlaser, der einen Laserstrahl mit einer Wellenlänge von 488 nm emittiert, verwendet wird.

9. Verfahren zur Durchführung eines durchflußzytometrischen Phagozytose­ tests nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Differenzierung der von adhärierten und ingestierten Hefezellen reflektierten Streustrahlung vor dem Bestrahlen der Meßprobe die adhärier­ ten Hefezellen mittels eines Quenching-Verfahrens so chemisch behandelt werden, daß sie nach Bestrahlung mit der Lichtquelle das einfallende Licht nicht mehr zu fluoreszieren vermögen, wobei die Meßprobe mit einem Quencher vermischt wird, der nicht in die Phagozyten einzudringen und die Fluoreszenz der adhärierten Hefezellen zu reduzieren oder zu unterdrücken vermag.

10. Verfahren zur Durchführung eines durchflußzytometrischen Phagozytose­ tests nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst ein vollstän­ diges Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 durchgeführt wird und anschließend zum Bestimmen der Menge der adhärierten Hefezellen mit derselben Meßprobe eine Verfahren nach Anspruch 9 durchgeführt wird und anschließend die Ergebnisse beider Verfahren miteinander verglichen werden.

11. Verfahren zur Durchführung eines durchflußzytometrischen Phagozytose­ tests nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Quencher Trypan Blau eingesetzt wird.

12. Verfahren zur Durchführung eines durchflußzytometrischen Phagozytose­ tests nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im Anschluß an die Verfahrensschritte der "respiratory burst of phogo­ cytosis" bestimmt wird.

13. Verfahren zur Durchführung eines durchflußzytometrischen Phagozytose­ tests nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß von einer Blutprobe vor der Durchführung des Phagozytosetests nach einem der Ansprüche 1 bis 12 eine Teilprobe entnommen wird, dann nach Durchführung des Phagozytosetests zur Bestimmung des "respiratory burst of phogocytosis" zunächst in die in der Teilprobe enthaltenen Phagozyten eine Substanz eingeschleust wird, die erst durch Oxidation innerhalb der Phagozyten zu einem fluoreszierenden Stoff, insbesondere Fluorchrom, um­ gewandelt wird, und anschließend eine durchflußzytometrische Messung dieser Teilprobe zur Bestimmung der gebildeten reaktiven Sauerstoffspezies durchgeführt wird.

14. Verfahren zur Durchführung eines durchflußzytometrischen Phagozytose­ tests nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die in die Phagozyten eingeschleuste Substanz 2',7'-Dichloroflourescein Diacetat ist.