DE19948391A1 - Elektrophorese-Einrichtung zum Analysieren von markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Elektrophorese-Einrichtung (10) zum Analysieren von Fluoreszenzmarker-markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, die nach einem Aspekt der Erfindung dafür geeignet ist, mindestens vier verschiedene Fluoreszenzmarker unabhängig voneinander mittels eines jeweils zugeordneten Detektorfeldes nach der jeweiligen Gel-Elektrophorese-Bahn und dem jeweiligen Fluoreszenzmarker aufgelöst zu detektieren. Hierzu sind Spektralfilter hinsichtlich ihrer spektralen Selektivität, die Fluoreszenzmarker hinsichtlich ihrer spektralen Absorptions- und Emissionsselektivität und die Wellenlängen der zur Anregung der Fluoreszenzmarker eingesetzten Laserstrahlen (60, 62, 64, 66) in entsprechender Weise aufeinander abgestimmt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Elektrophorese-Einrichtung zum Analysieren von Fluoreszenzmarker-markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen (z. B. DNA, DNA-Fragmente oder Proteine), die eine Mehrzahl von im wesentlichen parallel zueinander und längs einer Molekülausweitungsrichtung verlaufenden Gel-Elektrophorese-Bahnen, eine Energiequelle zum Anlegen eines elektrischen Potentials an einem Anfangsbereich und einem Endbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen und eine Laseranordnung zum Anregen von den Molekülen zugeordneten Fluoreszenzmarkern aufweist, wobei die Laseranordnung im Elektrophoresebetrieb Laserstrahlung erzeugt, die als wenigstens einer im wesentlichen quer zu der Molekülausbreitungsrichtung verlaufender Laserstrahl wenigstens mehrere der Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidet, um in einem Detektionsbereich der jeweiligen Gel-Elektrophorese-Bahn zugeordnete Fluoreszenzmarker der dort vorhandenen Moleküle anzuregen, sowie eine Erfassungsanordnung zum Erfassen von von den angeregten Fluoreszenzmarkern ausgehende Emissionsstrahlung, wobei die Erfassungsanordnung wenigstens ein sich im wesentlichen parallel zum wenigstens einen Laserstrahl erstreckendes Detektorfeld aufweist, das über eine Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung zum Detektorfeld geführte Emissionsstrahlung erfaßt. Das Detektorfeld, das sich längs einer vorzugsweise linearen Detektionsstrecke erstreckt und eine ortsaufgelöste Detektion der Emissionsstrahlung längs der durch den Verlauf des die Gel- Elektrophorese-Bahnen schneidenden Laserstrahlabschnitts definierten Detektionsstrecke ermöglicht (und betreffend eine lineare Detektionsstrecke deshalb im folgenden auch als lineares Detektorfeld bezeichnet wird), kann von einer Reihe von Detektionselementen, etwa Photodioden oder CCD- Elementen, oder einer Matrix aus mehreren parallelen Reihen von Detektionselementen (etwa Photodioden oder CCD-Elementen) gebildet sein. Es bestehen aber grundsätzlich keine Einschränkungen hinsichtlich der Funktionsweise und des die ortsaufgelöste Detektion ermöglichenden Funktionsprinzips des Detektorfeldes.

Eine derartige Elektrophorese-Einrichtung ist in mehreren Ausführungsformen aus der WO 96/23213 bekannt, die einen guten Überblick über die Hintergründe der Analyse von biologischen Molekülen mittels der Gel-Elektrophorese sowie über grundlegende Funktionsweisen und Konstruktionsmöglichkeiten derartiger Elektrophorese-Einrichtungen gibt und deren Offenbarung deshalb durch Bezugnahme vollständig in die Offenbarung der vorliegenden Erfindungsbeschreibung einbezogen wird. In der WO 96/23213 sind mehrere Elektrophorese-Einrichtungen offenbart, die zwei bzw. drei Laserstrahl-Quellen aufweisen, offenbar um zwei oder drei Fluoreszenzfarbstoffe (Fluoreszenzmarker) analysieren zu können. Bei zwei Ausführungsformen werden zwei im wesentlichen quer zu der Molekülausweitungsrichtung und im wesentlichen parallel zueinander verlaufende, in Molekülausweitungsrichtung gegeneinander versetzte Laserstrahlen von zwei gesonderten Laserlichtquellen in das Elektrophorese- Gel eingekoppelt, denen jeweils ein gesondertes lineares Detektorfeld und ein gesonderter Spektralfilter zugeordnet ist. Als lineare Detektorfelder sind alternativ lineare CCD-Elementfelder und lineare Photodiodenfelder vorgesehen. Zum Sammeln und Fokussieren des Emissionslichts schlägt die WO 96/23213 die Verwendung von Gradientenindexlinsenfeldern (speziell sog. SELFOC gradient-index Mikrolinsen-Arrays) vor.

Die simultane Bestimmung von zwei Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung zweier unterschiedlich markierter Primermoleküle für eine Sequenzierungsreaktion in einem einzigen Reaktionsgefäß wurde von Wiemann et al. (Anal. biochem. 224 (1995), 117-121) beschrieben. Weitere Verfahren, bei denen Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung zweier unterschiedlicher Fluoreszenzmarkierungen in einem einzigen Reaktionsgefäß, verbunden mit einer gemeinsamen Auftrennung dieser beiden unterschiedlicher Fluoreszenzmarkierungen sind in der DE 195 15 552 A1 und WO 96/34114 beschrieben. Dabei werden zur Auswertung der Sequenzierungsreaktionen Nachweissysteme verwendet, die zwei verschiedene Laser enthalten. Die WO 96/23213 stellt offensichtlich ein Nachweissystem bereit, das eine Auswertung derartiger Sequenzierungsreaktionen ermöglicht.

Zum technischen Hintergrund der DNA-Sequenz-Analyse auf Grundlage einer Laser-gestützten Detektion von Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA- Fragmenten kann ergänzend auch auf die folgenden grundlegenden Artikel verwiesen werden: Nature, Bd. 321, 12.06.1986, Seiten 674-679, L. M. Smith et al. "Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis" und Journal of Biochemical and Biophysical Methods, Bd. 13, 1986, Seiten 315-323, W. Ansorge et al. "A non-radioactive automated method for DNA sequence determination". Weitere für das Verständnis des technischen Hintergrunds wichtige Schriften und Aufsätze sind in der WO 96/23213 genannt.

Erwähnt werden sollte auch die EP 0 275 440 B1, die sich mit der Minimierung der Hintergrundfluoreszenz vom Gel durch entsprechende Auswahl des verwendeten Fluoreszenzfarbstoffs und der zur Fluoreszenzanregung verwendeten Laserwellenlänge befaßt.

Neben einer Primer-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff-Markierung wird in der Praxis auch eine Basen-spezifische Fluoreszenzfarbstoff-Markierung verwendet, wofür vorzugsweise Fluoreszenzfarbstoff-markierte Stopp- Nukleotide (markierte Kettenabbruchmoleküle, insbesondere Dideoxyribonukleosidtriphosphate (ddNTPs)) oder markierte Deoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) eingesetzt werden. Speziell für die Sequenzbestimmung auf Grundlage einer Basen-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff-Markierung werden von Perkin Elmer Biosystems (früher Applied Biosystems) Schichtgel-Sequenziergeräte angeboten, die die einem Klon zugeordneten, vier verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe für die vier verschiedenen Nukleotide mittels eines für alle Farbstoffe gemeinsamen Lasers anregen und die resultierende Fluoreszenzstrahlung über vier jeweils einem Farbstoff zugeordnete Spektralfilteranordnungen erfassen. Aufgrund eines starken spektralen Übersprechens können die vier Farbstoffe aber nicht unabhängig voneinander Farbstoff-aufgelöst detektiert werden. Eine Bestimmung der Sequenz ist nur auf Grundlage einer aufwendigen Software- Korrektur der die Farbstoffe noch nicht auflösenden Roh-Meßdaten möglich, die darauf beruht, daß die vier spezifischen, verschieden markierten Sequenzierungsansätze eines Klons gemeinsam in einer Gelspur aufgetrennt und analysiert werden. Eine probenspezifische Detektion, bei der beispielsweise vier verschiedenen Klonen zugeordnete und verschieden markierte Ansätze in einer Gelspur aufgetrennt und analysiert werden, ist trotz der Software-Korrektur nicht möglich.

Ein großer Nachteil der basenspezifischen Markierung ist überdies, daß die angekoppelten Farbstoffe aufgrund unterschiedlicher chemischer Parameter die Mobilität der DNA-Fragmente beeinflussen und sogenannte "Mobility- Shifts" hervorrufen, die durch Software korrigiert werden müssen. Die Korrektur der Mobility-Shifts sowie die Korrektur des oben beschriebenen spektralen Übersprechens führen zu Fehlern und Ungenauigkeiten mit der Folge geringerer Leselängen und höherer Fehlerrate. Das führt dazu, daß mit höherer Redundanz sequenziert werden muß. Das heißt, es muß die gleiche Sequenz mehrfach gelesen werden.

Problematisch bei der gemeinsamen Analyse von mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierten Sequenzierprodukten, allgemein von mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierten Molekülen, in einer einzigen Bahn bzw. Gelspur ist generell, daß Fluoreszenzfarbstoffe über einen weiten Wellenbereich hinweg anregbar sind und die Anregungsenergie ebenfalls über einen breiten Bereich wieder abgeben. Darüber hinaus unterliegen die Anregungs- und Emissionsspektren äußeren Bedingungen, die durch Parameter der chemischen Umgebung des Farbstoffs gegeben sind, unter anderem durch den pH-Wert, die Temperatur und die Dielektrizitätszahl der Lösung. Man mußte deshalb annehmen, daß eine gleichzeitige quantitative Erfassung von vier oder mehr voneinander unabhängigen Farbstoff-Spektren - wie sie beispielsweise für eine genaue Auswertung von Sequenzierungsreaktionen erforderlich ist - nicht durchführbar ist.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß durch eine geschickte Auswahl der verwendeten Spektralfilter hinsichtlich ihrer spektralen Selektivität, der Fluoreszenzmarker hinsichtlich ihrer spektralen Absorptions- und Emissionsselektivität und der Wellenlängen der Laserstrahlen doch vier oder mehr Fluoreszenzmarker-Spektren (Farbstoff-Spektren) voneinander unterscheidbar erfaßt und ausgewertet werden können, so daß beispielsweise eine gemeinsame Auswertung von vier oder mehr Sequenzierungsreaktionen, bei denen jeweils unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt wurden, möglich ist, und zwar speziell auch eine gemeinsame Auswertung von vier oder mehr probenspezifisch (insbesondere Primer-spezifisch) markierten Sequenzierungsreaktionen. Dies ist von großer praktischer Relevanz, da durch die Verwendung von vier oder mehr unterschiedlichen Markierungen in einer einzigen Sequenzierungsreaktion die Kosten für die Durchführung der Sequenzierungsreaktionen wesentlich reduziert werden können. Sowohl die Kosten für Chemikalien als auch für den Arbeitsaufwand werden verringert. Dies ist insbesondere bei Sequenzierungsprojekten im großen Maßstab bedeutend, wie etwa dem "Human Genome"-Projekt oder anderen Genomprojekten.

Die Erfindung stellt dementsprechend nach einem ersten Aspekt eine Elektrophorese-Einrichtung zum Analysieren von Fluoreszenzmarkern- markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, bereit, die umfaßt: eine Mehrzahl von im wesentlichen parallel zueinander und längs einer Molekülausbreitungsrichtung verlaufenden Gel-Elektrophorese-Bahnen, eine Energiequelle zum Anlegen eines elektrischen Potentials an einem Anfangsbereich und einem Endbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen, eine Laseranordnung zum Anregen einer Mehrzahl von verschiedenen, den Molekülen zugeordneten Fluoreszenzmarkern, von denen wenigstens einige voneinander verschiedene Absorptions-Wellenlängenbereiche oder/und voneinander verschiedene Emissions-Wellenlängenbereiche aufweisen, wobei die Laseranordnung im Elektrophoresebetrieb Laserstrahlung erzeugt, die als im wesentlichen quer zu der Molekülausbreitungsrichtung und im wesentlichen parallel zueinander verlaufende und in Molekülausbreitungsrichtung gegeneinander versetzte Laserstrahlen wenigstens mehrere der Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidet, um in einem Detektionsbereich der jeweiligen Gel-Elektrophorese-Bahn zugeordnete Fluoreszenzmarker der dort vorhandenen Moleküle anzuregen, eine Erfassungsanordnung zur Gel-Elektrophorese-Bahn-aufgelösten und Fluoreszenzmarker-aufgelösten Erfassen von von den angeregten Fluoreszenzmarkern ausgehender Emissionsstrahlung, wobei die Erfassungsanordung eine Mehrzahl von in Molekülausbreitungsrichtung gegeneinander versetzten und sich vorzugsweise im wesentlichen parallel zu den Laserstrahlen erstreckenden Detektorfeldern aufweist, die jeweils einem bestimmten der Laserstrahlen zugeordnet sind und dafür ausgebildet sind, längs einer dem jeweiligen Laserstrahl zugeordneten, vorzugsweise zu diesem im wesentlichen parallelen Detektionsstrecke wenigstens einen Teil der in den Detektionsbereichen aufgrund der Anregung durch den jeweiligen Laserstrahl entstehenden, über eine jeweils zugeordnete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung zum Detektorfeld geführten Emissionsstrahlung ortsaufgelöst zu erfassen, wobei die Spektralfilteranordnung hinsichtlich ihrer spektralen Selektivität, die Fluoreszenzmarker hinsichtlich ihrer spektralen Absorptions- und Emissionsselektivität, und die Wellenlängen der Laserstrahlen derart aufeinander abgestimmt sind, daß unter Einsatz von wenigstens vier Laserstrahlen und von wenigstens vier Detektorfeldern wenigstens vier verschiedene Fluoreszenzmarker unabhängig voneinander mittels eines jeweils zugeordneten Detektorfeldes nach der jeweiligen Gel-Elektrophorese- Bahn und dem jeweiligen Fluoreszenzmarker aufgelöst detektierbar sind.

In Verallgemeinerung des der vorgeschlagenen Elektrophorese-Einrichtung zugrundeliegenden Erfindungsgedankens wird ferner eine Elektrophorese- Einrichtung zum Analysieren von Fluoreszenzmarker-markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, bereitgestellt, die umfaßt: eine Mehrzahl von im wesentlichen parallel zueinander und längs einer Molekülausbreitungsrichtung verlaufenden Gel-Elektrophorese-Bahnen, eine Energiequelle zum Anlegen eines elektrischen Potentials an einem Anfangsbereich und einem Endbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen, eine Laseranordnung zum Anregen einer Mehrzahl von verschiedenen, den Molekülen zugeordneten Fluoreszenzmarkern, von denen wenigstens einige voneinander verschiedene Absorptions-Wellenlängenbereiche oder/und voneinander verschiedene Emissions-Wellenlängenbereiche aufweisen, wobei die Laseranordnung im Elektrophoresebetrieb Laserstrahlung erzeugt, die als im wesentlichen quer zu der Molekülausbreitungsrichtung verlaufende Laserstrahlen wenigstens mehrere der Gel-Elektrophorese- Bahnen schneidet, um in einem Detektionsbereich der jeweiligen Gel- Elektrophorese-Bahn zugeordnete Fluoreszenzmarker der dort vorhandenen Moleküle anzuregen, wobei wenigstens einige der Laserstrahlen räumlich gegeneinander versetzt sind oder/und in gegeneinander versetzten Zeitfenstern auftreten oder/und wobei wenigstens ein Laserstrahl zur Ermöglichung einer phasenempfindlichen Detektion moduliert ist oder/und wobei wenigstens einige der Laserstrahlen voneinander verschiedene Wellenlängen aufweisen, eine Erfassungsanordnung zum Gel- Elektrophorese-Bahn-aufgelösten und Fluoreszenzmarker-aufgelösten Erfassen von von den angeregten Fluoreszenzmarkern ausgehender Emissionsstrahlung, wobei die Erfassungsanordung wenigstens ein sich vorzugsweise im wesentlichen parallel zu den Laserstrahlen erstreckendes Detektorfeld aufweist, das dafür ausgebildet ist, längs einer dem Laserstrahl zugeordneten, vorzugsweise zu diesem im wesentlichen parallelen Detektionsstrecke wenigstens einen Teil der in den Detektionsbereichen aufgrund der Anregung durch den jeweiligen Laserstrahl entstehenden, über eine zugeordnete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung zum Detektorfeld geführten Emissionsstrahlung ortsaufgelöst zu erfassen, wobei die Spektralfilteranordnung hinsichtlich ihrer spektralen Selektivität, die Fluoreszenzmarker hinsichtlich ihrer spektralen Absorptions- und Emissionsselektivität, und die Wellenlängen der Laserstrahlen derart aufeinander abgestimmt sind, daß unter Einsatz von wenigstens vier Laserstrahlen wenigstens vier verschiedene Fluoreszenzmarker unabhängig voneinander nach der jeweiligen Gel-Elektrophorese-Bahn und dem jeweiligen Fluoreszenzmarker aufgelöst detektierbar sind.

Betrachtet man die Emissions- und Absorptionsspektren der üblicherweise bei der Gel-Elektrophorese eingesetzten Fluoreszenz-Farbstoffe, so erscheint es auf den ersten Blick völlig unmöglich zu sein, vier oder mehr Fluoreszenzmarker nach den jeweiligen Fluoreszenzmarkern aufgelöst, also die Fluoreszenzmarker voneinander unterscheidend, zu detektieren, beispielsweise mit einem spektralen "Restübersprechen" kleiner als 10%. Man wird ohne weiteres Fluoreszenzmarkerkombinationen aus zwei verschiedenen Fluoreszenzmarkern finden, deren Absorptionsspektren sich nicht überlappen und deren Emissionsspektren sich nicht überlappen, so daß offensichtlich eine nach dem Frequenzmarker-aufgelöste Detektion möglich ist. Es wurde aber gefunden, daß auch Fluoreszenzmarker mit sich überlappenden Absorptionsspektren und Fluoreszenzmarker mit sich überlappenden Emissionsspektren Fluoreszenzmarker aufgelöst detektiert werden können. Es wurde nämlich erkannt, daß durch die Laserstrahlung selektiv anregbare Fluoreszenzmarker mit sich überlappenden Emissionsspektren voneinander unterscheidbar sind auf Grundlage einer räumlichen oder/und zeitlich getrennten Laserstrahlanregung oder/und auf Grundlage unterschiedlicher Wellenlängen der Laserstrahlen oder/und auf Grundlage einer phasenempfindlichen Detektion bei Anregung mit modulierter Laserstrahlung. Ferner wurde erkannt, daß durch die Laserstrahlung selektiv oder nicht-selektiv anregbare Fluoreszenzmarker mit zumindest teilweise sich nicht-überlappenden Emissionsspektren unterscheidbar sind auf Grundlage spektral/selektiver Detektion der Emissionsstrahlung sowie ggf. auf Grundlage räumlich getrennter Laserstrahlanregung. Es hat sich gezeigt, daß auf Grundlage dieser Lehre ein spektrales "Restübersprechen" zwischen den Fluoreszenzfarbstoffen in der Detektion kleiner als 10%, nämlich sogar besser als 0,1%, erreichbar ist.

Die erfindungsgemäße Elektrophorese-Einrichtung wird bevorzugt dafür eingesetzt, Sequenzierungsreaktionen auf Grundlag einer probenspezifischen (Klon-spezifischen, insbesondere Primer-spezifischen) Fluoreszenzfarbstoff- Markierung auszuwerten. Hierzu werden die zu einem Klon gehörigen vier spezifischen Sequenzierungsansätze in vier verschiedenen Gel- Elektrophorese-Bahnen (Gelspuren) aufgetrennt und analysiert.

Mittels der erfindungsgemäßen Elektrophorese-Einrichtung ist aber auch eine Auswertung von Sequenzierungsreaktionen auf Grundlage einer basenspezifischen Fluoreszenzfarbstoff-Markierung möglich, bei der die zu einem Klon gehörigen vier spezifischen, verschieden markierten Sequenzierungsansätze gemeinsam in einer Gel-Elektrophorese-Bahn (Gelspur) aufgetrennt und analysiert werden. Im Falle von in Molekülausbreitungsrichtung gegeneinander versetzten, verschiedenen der für die basenspezifische Markierung in Bezug auf einen Klon eingesetzten Farbstoffen zugeordneten Laserstrahlen können die dann gegebenen verschiedenen Separationsdistanzen zur Sequenzbestimmung etwa software-mäßig kompensiert werden. Es kann also eine Korrektur der Laufzeit erfolgen, um für die Sequenzbestimmung eine vergleichende Analyse der Mobilität der Sequenzierungsfragmente zu ermöglichen. In der Regel wird es ausreichen, die Korrektur der Laufzeiten nach einem linearen Ansatz (Dreisatz in Bezug auf die Separationsdistanzen unter der Annahme konstanter Fragmentausbreitungsgeschwindigkeit längs der Gel- Elektrophorese-Bahnen) vorzunehmen. Ferner können die in der Regel zwangsläufig auftretenden "Mobility-Shifts" auf an sich bekannte Art und Weise so weit wie möglich kompensiert werden.

Die einem Fluoreszenzfarbstoff zugeordnete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung kann in Verbindung mit dem zugeordneten Detektorfeld als diesem Fluoreszenzfarbstoff zugeordnete Detektionseinheit oder Detektoreinheit aufgefaßt werden, gewünschtenfalls tatsächlich als "als Einheit handhabbare" Detektionseinheit ausgebildet sein. Für die Detektionseinheiten gilt bevorzugt, daß für eine Detektionseinheit das Intensitätsverhältnis des von dem zur jeweiligen Detektionseinheit zugehörigen Fluoreszenzfarbstoff stammenden Lichts zu dem von einem anderen Fluoreszenzfarbstoff stammenden Licht 1 : 0,2 oder größer ist. Vorzugsweise weisen die Detektionseinheiten für die zu erfassende Fluoreszenzstrahlung einen Akzeptanzwinkel von etwa ± 20° bezogen auf eine optische Achse der Detektionseinheit auf.

Es wird vorgeschlagen, daß die Wellenlängen der Laserstrahlen oder/und Spektralfilter der Spektralfilteranordnungen auf wenigstens vier verschiedene Fluoreszenzmarker abgestimmt sind, deren Absorptionsmaxima unter Elektrophorese-Betriebsbedingungen wenigstens jeweils 30 nm, vorzugsweise jeweils wenigstens 50 nm voneinander entfernt sind oder/und deren Emissionsmaxima unter Elektrophorese- Betriebsbedingungen wenigstens jeweils 30 nm, vorzugsweise jeweils wenigstens 50 nm voneinander entfernt sind.

Es ist äußerst zweckmäßig, wenn wenigstens ein Spektralfilter eine spektrale Charakteristik derart aufweist, daß aufgrund der Anregung des jeweils zugeordneten Laserstrahls entstehende Fluoreszenzstrahlung des jeweils zugeordneten Fluoreszenzmarkers für einen Durchlaß- Wellenlängenbereich um ein Emissionsmaximum des Fluoreszenzspektrums dieses Fluoreszenzmarkers oder für einen zu diesem Fluoreszenzmaximum benachbarten Durchlaß-Wellenlängenbereich zum zugeordneten Detektorfeld geführt wird. Weiterbildend wird vorgeschlagen, daß in Bezug auf wenigstens einen der anderen Fluoreszenzmarker wenigstens eine der folgenden Bedingungen a) und b) erfüllt ist, um die nach den Fluoreszenzmarkern aufgelöste Detektion zu ermöglichen: a) die Laserstrahl- Wellenlänge liegt auf einer spektralen Seite eines Absorptionsspektrums des anderen Fluoreszenzmarkers jenseits einer von einem Absorptionsmaximum zur Laserstrahl-Wellenlänge hin bis wenigstens auf eine Restabsorptionsamplitude, die einer höchstens geringen Restabsorption entspricht, abfallenden Flanke des Absorptionsspektrums, b) der Durchlaß- Wellenlängenbereich liegt auf einer spektralen Seite eines Emissionsspektrums des anderen Fluoreszenzmarkers jenseits einer von einem Emissionsmaximum zum Durchlaß-Wellenlängenbereich hin bis auf wenigstens eine Restemissionsamplitude, die einer höchstens geringen Restemission entspricht, abfallenden Flanke des Emissionsspektrums.

Die zur Laserstrahl-Wellenlänge abfallende Flanke kann eine zur längeren Wellenlängen hin abfallende Flanke sein, und die zum Durchlaß- Wellenlängenbereich hin abfallende Flanke kann eine zu kürzeren Wellenlängen hin abfallende Flanke sein.

Alternativ ist es möglich, daß die zur Laserstrahl-Wellenlänge abfallende Flanke eine zu kürzeren Wellenlängen hin abfallende Flanke ist und die zum Durchlaß-Wellenlängenbereich hin abfallende Flanke eine zu längeren Wellenlängen hin abfallende Flanke ist.

Generell wird vorgeschlagen, daß die Flanke zur Laserstrahl-Wellenlänge bzw. zum Durchlaß-Wellenlängenbereich hin steiler abfällt als eine auf der anderen Seite des Maximums des Spektrums liegende, mit dem Abstand vom Maximum abfallende Flanke des Spektrums.

Wenigstens eine Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung kann als Strahlungsführungsanordnung eine Linsenanordnung, vorzugsweise ein Gradientenindexlinsenfeld (ggf. SELFOC Linsenfeld (SLA)), umfassen. Das Gradientenindexfeld sollte dafür ausgebildet sein, alleine oder in Verbindung mit anderen optischen Komponenten Fluoreszenzlicht auf das zugeordnete Detektorfeld längs der betreffenden Detektionsstrecke abzubilden und kann insoweit auch als "lineares Gradientenindexfeld" bezeichnet werden. Auf einer den Gel-Elektrophorese-Bahnen zugeordneten Gegenstandsseite der Strahlungsführungsanordnung kann wenigstens ein gegenstandseitiger Spektralfilter angeordnet sein. Ferner kann auch ein der dem Detektorfeld zugeordneten Bildseite der Strahlungsführungsanordnung wenigstens ein bildseitiger Spektralfilter angeordnet sein. Die Strahlungsführungsanordnung kann auch weitere optische Mittel, beispielsweise eine Blendenanordnung umfassen, um die optische bzw. spektrale Trennschärfe zu erhöhen.

Vorzugsweise ist wenigstens ein Spektralfilter als Interferenzfilter ausgebildet oder umfaßt einen Interferenzfilter. Hierzu wird speziell vorgeschlagen, daß wenigstens eine Spektralfilteranordnung als Kombination aus einer Absorptionsfilteranordnung und einer Interferenzfilteranordnung ausgebildet ist. Beispielsweise kann ein Spektralfilter einen Absorptionsfilter, ggf. Farbglasfilter, umfassen, der als Trägersubstrat für Dünnschichtfilme eines zugeordneten Interferenzfilters dient.

Der Einsatz eines Interferenzfilters mag überraschen, da die spektrale Selektivität eines solchen Filters vom Einfallswinkel der Emissionsstrahlung in den Filter abhängt. Speziell dann, wenn man eine Strahlungsführungsanordnung mit hoher numerischer Apertur, beispielsweise ein entsprechendes Gradientenindexlinsenfeld, verwendet, um dievon den Fluoreszenzmarkern abgestrahlten Fluoreszenz-Photonen mit hoher Effizienz zu sammeln, erscheint die Verwendung eines Interferenzfilters im Hinblick auf die gewünschte spektrale Selektivität des Filters äußerst problematisch. Es wurde aber erkannt, daß der Interferenzfilter, der als Durchlaß-Wellenlängenbereich einen Wellenlängenbereich definiert, der einer Überlagerung von Durchlaßbereichen des Interferenzfilters für verschiedene Licht-Einfallswinkel in den Interferenzfiltern entspricht, diesen Durchlaß-Wellenlängenbereich nicht zwingend alleine, sondern bei entsprechender Anordnung in Bezug auf die Strahlungsführungsanordnung den Durchlaß-Wellenlängenbereich gemeinsam mit der Strahlungsführungsanordnung definiert. Damit kann als Durchlaß-Wellenlängenbereich ein Wellenlängenbereich definiert sein, der alle Durchlaßbereiche des Interferenzfilters für alle gemäß einer Akzeptanzwinkelcharakteristik der Strahlungsführungsanordnung auftretenden Lichteinfallswinkel umfaßt. Beispielsweise kann als Durchlaß- Wellenlängenbereich ein Wellenlängenbereich definiert sein, der einen Durchlaßbereich des Interferenzfilters für einen einem Lichteinfallswinkel von α = 0° und einen Durchlaßbereich des Interferenzfilters für einen einen maximalen Akzeptanzwinkel der Strahlungsführungsanordnung entsprechenden Lichteinfallswinkel umfaßt. Berücksichtigt man einen solchen, die Akzeptanzwinkelcharakteristik der Strahlungsführungsanordnung berücksichtigenden Durchlaß- Wellenlängenbereich bei der Auslegung der Elektrophorese-Einrichtung, so eröffnen sich vielfältige konstruktive Möglichkeiten bei der Auslegung und Spezifizierung der Spektralfilter in Bezug auf die Emissionsspektren der zu verwendenden Fluoreszenzfarbstoffe, und es lassen sich unter Einsatz von Interferenzfiltern Spektralfilteranordnungen mit vergleichsweise hoher spektraler Selektivität schaffen, um eine die Fluoreszenzmarker auflösende Detektion zu ermöglichen.

Auf Grundlage der erläuterten Prinzipien kann die erfindungsgemäße Elektrophorese-Einrichtung dafür ausgelegt sein, von den folgenden Fluoreszenzmarkern wenigstens sieben Marker zu detektieren: Indodicarbocyanin CY 2, Alexa 488, Fluoreszein-Iso-Thio-Cyanat (FITC), 5- Carboxy-Rhodamin 6G, Alexa 532, Tetramethyl-Rhodamin-Iso-Thio-Cyanat (TRITC), Indodicarbocyanin CY 3, Sulforhodamin 101 (TexasRed™), Indodicarbocyanin CY 5, Indodicarbocyanin CY 5.5, IRD 700, Indodicarbocyanin CY 7, IRD 40 und IRD 800.

Speziell können wenigstens die Marker Indodicarbocyanin CY 2, Fluoreszein- Iso-Thio-Cyanat (FITC), 5-Carboxy-Rhodamin 6 G, Sulforhodamin 101 (TexasRed™), Indodicarbocyanin CY 5, Indodicarbocyanin CY 5.5 und IRD 800 detektierbar sein.

Die Elektrophorese-Einrichtung kann speziell dafür ausgelegt sein, von den folgenden Fluoreszenzmarkern wenigstens drei, vorzugsweise wenigstens vier, höchstvorzugsweise wenigstens fünf Marker gleichzeitig Fluoreszenzmarker aufgelöst und Gel-Elektrophorese-Bahn-aufgelöst zu detektieren: Indodicarbocyanin CY 2, Alexa 488, Fluoreszein-Iso-Thio- Cyanat (FITC), 5-Carboxy-Rhodamin 6G, Alexa 532, Tetramethyl-Rhodamin- Iso-Thio-Cyanat (TRITC), Indodicarbocyanin CY 3, Sulforhodamin 101 (TexasRed™), Indodicarbocyanin CY 5, Indodicarbocyanin CY 5.5, IRD 700, Indodicarbocyanin CY 7, IRD 40 und IRD 800.

Speziell wird vorgeschlagen, daß wenigstens die fünf Marker Indodicarbocyanin CY 2, 5-Carboxy-Rhodamin 6G, Sulforhodamin 101 (TexasRed™), Indodicarbocyanin CY 5.5 und IRD 800 oder wenigstens die vier Marker Fluoreszein-Iso-Thio-Cyanat (FITC), Sulforhodamin 101 (TexasRed™), Indodicarbocyanin CY 5.5 und IRD 800 oder wenigstens die vier Marker Indodicarbocyanin CY 2, 5-Carboxy-Rhodamin 6G, Indodicarbocyanin CY 5 und IRD 800 oder wenigstens die drei Marker Fluoreszein-Iso-Thio-Cyanat (FITC), Indodicarbocyanin CY 5 und IRD 800 gleichzeitig Fluoreszmarker-aufgelöst und Gel-Elektrophorese-Bahn-aufgelöst detektierbar sind.

Bei der Auslegung der Spektralfilter und bei der Auswahl der Anregungswellenlängen bestehen grundsätzlich viele Möglichkeiten, die von den zur Verfügung stehenden Lasersystemen und den zur Verfügung stehenden Spektralfiltern abhängen. Grundlegende Randbedingungen sind nur die Selektivität der Anregung, der für eine bestimmte Anregungswellenlänge erreichbare Anregungswirkungsgrad, die Selektivität der Detektion und der bei einem bestimmten Durchlaßbereich in Bezug auf die spektrale Empfindlichkeit eines eingesetzten Detektors erreichbare Detektionswirkungsgrad. In der Praxis werden aber auch andere Randbedingungen eine wichtige Rolle spielen, nämlich die Kosten der Lasersysteme hinsichtlich Anschaffung und Unterhalt und die Kosten für die Anschaffung der Spektralfilter und Detektoren. Im folgenden werden einige Beispiele für einsetzbare Lasersysteme und Spektralfilter im Bezug auf verschiedene der genannten Fluoreszenzmarker gegeben, die keineswegs beschränkend sind, sondern nur einen Anhaltspunkt geben sollen. So ist es offensichtlich, daß bei hinsichtlich der Wellenlänge abstimmbaren Lasern, wie beispielsweise Laserdioden, auch von den folgenden Angaben abweichende Anregungswellenlängen innerhalb der regelmäßig recht breiten Anregungsspektren in Frage kommen. Die genannten Anregungswellenlängen stehen deshalb jeweils nur für einen in Frage kommenden Wellenlängenbereich von beispielsweise etwa ± 10 bis 20 nm auf beiden spektralen Seiten der genannten Wellenlänge. Entsprechendes gilt für die Durchlaßbereiche der im folgenden angegebenen Spektralfilteranordnungen. Es ist offensichtlich, daß man auf jeden Fall Spektralfilteranordnungen mit spektral schmaleren Durchlaßbereichen im Bereich der genannten Durchlaßbereiche oder/und Strahlungsführungsanordnungen mit kleinerem Akzeptanzwinkelbereich verwenden kann, wenn man einen geringeren Detektionswirkungsgrad (höhere Photonenverluste) in Kauf nehmen mag. Man kann aber auch Spektralfilteranordnungen mit größeren Durchlaßbereichen oder spektralversetzten Durchlaßbereichen oder/und Strahlungsführungsanordnung mit größeren Akzeptanzwinkelbereichen in Abhängigkeit von den Emissionsspektren der Fluoreszenzmarker verwenden, solange die Detektionsselektivität der Elektrophorese-Einrichtung als Ganzes gewahrt bleibt. Dementsprechend geben die im folgenden genannten spektralen Grenzen der Durchlaßbereiche jeweils nur einen Anhaltspunkt für die Auslegung der Spektralfilteranordnungen, und die genannten Durchlaßbereiche können um jeweils beispielsweise etwa ± 10 bis 20 nm spektral versetzt oder zu kleineren oder/und größeren Wellenlängen hin erweitert sein. Die im folgenden gegebenen Daten für in Frage kommende Anregungswellenlängen, Durchlaßbereiche und maximale Akzeptanzwinkel definieren aber jedenfalls bevorzugte Ausführungsformen einer erfindungsgemäßen Elektrophorese-Einrichtung, mit der im Elektrophoresebetrieb ausgezeichnete Analyseergebnisse erzielt wurden.

Für die Detektion des Fluoreszenzmarkers Indodicarbocyanin CY 2 wird vorgeschlagen, einen frequenzverdoppelten (ggf. diodengepumpten) Neodym: YAG-Laser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 473 nm einzusetzen. Diesem Fluoreszenzmarker kann eine Spektralfilteranordnung mit einem Durchlaßbereich von etwa 494 nm bis etwa 424 nm zugeordnet sein. Spielen unterschiedliche Licht-Einfallswinkel α in der Spektralfilteranordnung eine Rolle, so kann die Spektralfilteranordnung unterschiedlichen Licht-Einfallswinkeln α zugeordnete Durchlaßbereiche von etwa 494 nm bis etwa 524 nm für α = 0° und etwa 492 nm bis etwa 514 nm für einen einem maximalen Akzeptanzwinkel der Strahlungsführungsanordnung entsprechenden Lichteinfallwinkel (beispielsweise von etwa 20°) aufweisen. Die Spektralfilteranordnung kann einen Absorptions-Kurzpaßfilter, einen Absorptions-Leitpaßfilter und einen Interferenz-Bandpaßfilter umfassen.

Für die Detektion des Fluoreszenzmarkers Fluoreszein-Iso-Thio-Cyanat (FITC) kann ein Argon-Ionen-Laser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 488 nm oder ein frequenzverdoppelter (ggf. diodengepumpter) Neodym: YAG- Laser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 473 nm eingesetzt werden. Diesem Fluoreszenzmarker kann eine Spektralfilteranordnung mit einem Durchlaßbereich von etwa 505 nm bis etwa 555 nm, ggf. mit unterschiedlichen Licht-Einfallwinkeln α zugeordneten Durchlaßbereichen von etwa 505 nm bis etwa 555 nm für α = 0° und etwa 500 nm bis etwa 555 nm für einen einem maximalen Akzeptanzwinkel der Strahlungsführungsanordnung entsprechenden Lichteinfallwinkels (beispielsweise von etwa 20°) zugeordnet sein. Die Spektralfilteranordnung kann einen Absorptions-Kurzpaßfilter, einen Absorptions-Langpaßfilter und einen Interferenz-Bandpaßfilter umfassen.

Für die Detektion des Fluoreszenzmarkers 5-Carboxy-Rhodamin 6G wird vorgeschlagen, einen frequenzverdoppelten (ggf. diodengepumpten) Neodym: YAG-Laser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 532 nm einzusetzen. Die diesem Fluoreszenzmarker zugeordnete Spektralfilteranordnung kann einen Durchlaßbereich von etwa 555 nm bis etwa 578 nm, ggf. unterschiedlichen Licht-Einfallwinkeln α zugeordnete Durchlaßbereiche von etwa 555 nm bis etwa 578 nm für α = 0° und etwa 535 nm bis etwa 569 nm für einen einem maximalen Akzeptanzwinkel der Strahlungsführungsanordnung entsprechenden Lichteinfallwinkel (beispielsweise von etwa 20°) aufweisen. Die Spektralfilteranordnung kann ein Absorptions-Kurzpaßfilter und einen Interferenz-Bandpaßfilter umfassen.

Für die Detektion des Fluoreszenzmarkers Sulforhodamin 101 (TexasRed™) kann ein Helium-Neon-Laser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 594 nm eingesetzt werden. Diesem Fluoreszenzmarker kann eine Spektralfilteranordnung mit einem Durchlaßbereich von etwa 613 nm bis etwa 651 nm, ggf. mit unterschiedlichen Lichteinfallwinkeln α zugeordneten Durchlaßbereichen von etwa 613 nm bis 651 nm für α = 0° und etwa 613 nm bis etwa 636 nm für einen einem maximalen Akzeptanzwinkel der Strahlungsführungsanordnung entsprechenden Lichteinfallwinkel (beispielsweise von etwa 20°) zugeordnet sein. Die Spektralfilteranordnung kann einen Absorptions-Langpaßfilter und einen Interferenz-Bandpaßfilter umfassen.

Für die Detektion des Fluoreszenzmarkers Indodicarbocyanin CY 5 kann ein Helium-Neon-Laser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 633 nm oder ein Halbleiterlaser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 640 nm eingesetzt werden. Diesem Fluoreszenzmarker kann eine Spektralfilteranordnung mit einem Durchlaßbereich von etwa 655 nm bis etwa 690 nm, ggf. mit unterschiedlichen Licht-Einfallwinkeln α zugeordneten Durchlaßbereichen von etwa 655 nm bis etwa 690 nm für α = 0° und etwa 650 nm bis etwa 683 nm für einen einem maximalen Akzeptanzwinkel der Strahlungsführungsanordnung entsprechenden Lichteinfallwinkel (beispielsweise von etwa 20°) zugeordnet sein. Die Spektralfilteranordnung kann einen Absorptions-Langpaßfilter und einen Interferenz-Bandpaßfilter umfassen.

Für die Detektion des Fluoreszenzmarkers Indodicarbocyanin CY 5.5 oder/und des Fluoreszenzmarkers IRD 700 kann ein Halbleiterlaser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 660 nm oder etwa 670 nm oder etwa 675 nm eingesetzt werden. Die betreffende Spektralfilteranordnung kann einen Durchlaßbereich von etwa 655 nm bis etwa 690 nm, ggf. unterschiedlichen Licht-Einfallwinkeln α zugeordnete Durchlaßbereiche von etwa 695 nm bis etwa 745 nm für α = 0° und etwa 695 nm bis etwa 730 nm für einen einem maximalen Akzeptanzwinkel der Strahlungsführungsanordnung entsprechenden Lichteinfallwinkel (beispielsweise von etwa 20°C) aufweisen. Die Spektralfilteranordnung kann einen Absorptions-Langpaßfilter und einen Interferenz-Bandpaßfilter umfassen.

Für die Detektion des Fluoreszenzmarkers IRD 800 kann ein Halbleiterlaser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 775 nm oder von etwa 780 nm eingesetzt werden. Diesem Fluoreszenzmarker kann eine Spektralfilteranordnung mit einem Durchlaßbereich von etwa 795 nm bis etwa 790 nm, ggf. mit unterschiedlichen Licht-Einfallwinkeln α zugeordneten Durchlaßbereichen von etwa 795 nm bis etwa 835 nm für α = 0° und etwa 790 nm bis etwa 830 nm für einen einem maximalen Akzeptanzwinkel der Strahlungsführungsanordnung entsprechenden Lichteinfallwinkel (beispielsweise von etwa 20°) zugeordnet sein. Die Spektralfilteranordnung kann einen Absorptions-Langpaßfilter und einen Interferenz-Bandpaßfilter umfassen.

Bevorzugt sind bei der erfindungsgemäßen Elektrophorese-Einrichtung Maßnahmen getroffen zur Verringerung von das Auflösungsvermögen der Detektion in Bezug auf die Gel-Elektrophorese-Bahn oder/und in Bezug auf die Fluoreszenzmarker oder/und das Signal-zu-Rauschverhältnis beeinträchtigender Störstrahlung, ggf. Fluoreszenzlicht-Hintergrundstrahlung oder/und gestreuter Laserstrahlung. Beispielsweise kann wenigstens einer der Laserstrahlen linear polarisiert sein mit einem Polarisationsvektor, der nach einer eingangsseitigen Lichtführungsrichtung der Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung ausgerichtet ist, ggf. zu dieser zumindest näherungsweise parallel ist. Hierdurch wird das in Richtung der Detektoren abgestrahlte Streulicht minimiert, da bei der elastischen (Rayleigh-Streuung das Streulicht bevorzugt in eine zum Polarisations-Vektor des einfallenden Lichtes senkrechte Ebene abgestrahlt wird. Eine derartige Polarisationsrichtung kann man durch entsprechende Anordnung des Lasers oder/und durch Einsatz von entsprechenden optischen Komponenten, beispielsweise Polarisatoren oder/und λ/2-Plättchen, erreicht werden.

Hinsichtlich der Gel-Elektrophorese-Bahnen ist es bevorzugt, daß mindestens 20, vorzugsweise mindestens 40 und besonders bevorzugt mindestens 80 (beispielsweise 120 oder sogar 192 oder 384 Bahnen) parallel ausgewertet werden können. Die Gel-Elektrophorese-Bahnen können in einer vorzugsweise plattenförmigen Gelmatrixverlaufen, die zwischen Glasplatten aus gefloatetem Borosilikatglas angeordnet ist. Sogenanntes Floated-Glas vermeidet aufgrund seiner hohen Planarität Mehrfachreflexionen der zwischen den Glasplatten verlaufenden Laserstrahlen, so daß eine Erhöhung des Streulicht- und Fluoreszenzlichtuntergrunds aufgrund eines mehrfachen Eindringens der Laserstrahlung in die Glasplatten vermieden wird.

Borosilikatglas ist in Qualitäten mit geringer Eigenfluoreszenz erhältlich, als gefloatetes Borosilikat-Glas beispielsweise unter der Handelsbezeichnung Borofloat von der Firma Schott in Jena (Deutschland).

Für die Einkopplung der Laserstrahlen in die Gelmatrix ist es besonders zweckmäßig, wenigstens eine (vorzugsweise eine gemeinsame) zur Laserstrahl-Ausbreitungsrichtung im wesentlichen parallele Koppelplatte zu verwenden, die polierte Eintritts- oder/und Austrittsflächen für den jeweiligen Laserstrahl sowie einen an die Gelmatrix angepaßten Brechungsindex aufweist.

Um eine vorzeitige Degradation der Fluoreszenzfarbstoffe und damit unter Umständen reduzierte Signalpegel zu vermeiden, können die räumlich gegeneinander versetzten, unterschiedliche Wellenlängen aufweisenden Laserstrahlen derart gegeneinander versetzt sein, daß die Laserstrahlungswellenlänge in Molekülausbreitungsrichtung von Laserstrahl zu Laserstrahl abnimmt. Die Fluoreszenzmarker durchlaufen dementsprechend zuerst die Laserstrahlen mit längerer Wellenlänge, bevor sie die Laserstrahlen mit kürzerer Wellenlänge erreichen. Eine Degradation von durch Laserstrahlung längerer Wellenlänge anzuregender Fluoreszenzfarbstoffe durch Laserstrahlung kürzerer Wellenlänge vor der Detektion des betreffenden Fluoreszenzmarkers wird dementsprechend vermieden.

Die beschriebene Elektrophorese-Einrichtung kann zur Analyse von Nukleinsäuren eingesetzt werden, beispielsweise derart, daß mit mindestens vier unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern markierte Produkte von Nukleinsäure-Sequenzierungsreaktionen zusammen in einer Bahn nach ihrer Größe aufgetrennt und, voneinander unabhängig analysiert werden. Die Auftrennung kann durch Elektrophorese in einem denaturierenden Gel erfolgen. Vorzugsweise erfolgt eine parallele Auftrennung in mehreren Bahnen, die jeweils mindestens vier unterschiedlich markierte Produkte enthalten. Auf diese Weise können unter Verwendung konventioneller Gele, die eine Auswertung von z. B. 1.000-1.200 Basen pro Sequenzierungsreaktion erlauben, und einer gleichzeitigen Auftrennung von vier Sequenzierungsreaktionen in einer Bahn, bei Verwendung eines Plattengels mit 192 Spuren, mehr als 100.000 Basen 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019948391 00004 99880, z. B. 155.000 Basen, auf einem einzigen Gel bestimmt werden. Im Falle von Gelen mit größerer Spuranzahl, wie vorstehend erwähnt, lassen sich entsprechend mehr Basen bestimmen, So konnten auf Grundlage einer Verdoppelung der Spurdichte (384 Spuren auf einem einzigen Gel) mehr als 200.000 Basen, z. B. 300.000 bis 384.000 Basen, auf einem einzigen Gel bestimmt werden.

Die zur Analyse verwendete, als Sequenziervorrichtung eingesetzte Gel- Elektrophorese-Einrichtung ist vorzugsweise weitgehend automatisiert (vorzugsweise speziell auch hinsichtlich der Sequenzbestimmung) und weist für jeden Fluoreszenzfarbstoff vorzugsweise einen separaten Anregungslaser und eine separate Detektionseinheit auf. Zur Erhöhung der (spektralen) Trennschärfe werden neben den erwähnten Spektralfiltern gewünschtenfalls auch weitere optische Mittel, beispielsweise Blenden, eingesetzt.

Die Fluoreszenzmarker können beispielsweise so ausgewählt werden, daß die Absorptionsmaxima unter den Meßbedingungen mindestens jeweils 30 nm, vorzugsweise jeweils mindestens 50 nm voneinander entfernt sind. Ferner können die Fluoreszenzmarker so ausgewählt werden, daß die Emissionsmaxima unter den Meßbedingungen mindestens jeweils 30 nm, vorzugsweise jeweils mindestens 50 nm voneinander entfernt sind.

Als Fluoreszenzfarbstoffe können die oben genannten Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden, beispielsweise die Farbstoffkombination: Fluorescein, TexasRed™, CY 5.5 und IRD 800, oder beispielsweise die Farbstoffkombination: 5-Carboxy-Rhodamin 6G, TexasRed™, CY 5.5, IRD 800 und ggf. CY 2, oder beispielsweise die Farbstoffkombination: 5- Carboxy-Rhodamin 6G, TexasRed™, CY 5.5, CY 7 und ggf. CY 2 oder/und IRD 800.

Die zusammen in einer Bahn aufgetrennten Sequenzierprodukte können aus einer in einem einzigen Gefäß durchgeführten Sequenzierungsreaktion stammen. Für die Sequenzierungsreaktionen können mindestens vier unterschiedlich markierte Primer verwendet werden. Die Sequenzierungsreaktion kann als Quadruplex-Reaktion, als Tandem-Duplex- Reaktion, als Sequenzlücken-Auffüllreaktion oder als kompetierende Tandem-Duplex-Reaktion durchgeführt werden.

Im Hinblick auf eine derartige Verwendung der erfindungsgemäßen Elektrophorese-Einrichtung betrifft die Erfindung ferner ein Reagenzienkit zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, das mindestens vier unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoff-Markierungen enthält, wobei jede Markierung für die Bestimmung einer unterschiedlichen Sequenz vorgesehen ist. Das Kit kann mindestens vier verschiedene Primer enthalten, die jeweils eine unterschiedliche Markierung tragen.

Möchte man im Hinblick auf ein hohes Auflösungsvermögen und hohe Leselängen die Länge der zur Verfügung stehenden Gel-Elektrophorese- Bahnen zur Maximierung der Separations-Distanz optimal ausnutzen und dabei Fluoreszenzmarker durch mehrere räumlich gegeneinander versetzte Laserstrahlen abfragen, so ist es wünschenswert, den Abstand der Laserstrahlen in Molekülausbreitungsrichtung relativ gering zu halten, so daß für die den Laserstrahlen zugeordneten Fluoreszenzmarker Separationsdistanzen gleicher Größenordnung zur Verfügung stehen. Hierzu wird nach einem zweiten Aspekt der Erfindung vorgeschlagen, daß die Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnungen die von den angeregten Fluoreszenzmarkern ausgehende Emissionsstrahlung auf Empfangsoberflächen des dem jeweiligen Laserstrahl zugeordneten Detektorfelds umlenkt, die zur Molekülausbreitungsrichtung zumindest näherungsweise orthogonal angeordnet sind. Hierdurch ist eine kompakte Ausbildung der Detektionseinheit in Molekülausbreitungsrichtung möglich, so daß dementsprechend auch die Laserstrahlen in vergleichsweise kleinem Abstand voneinander die Gel-Elektrophorese-Bahnen schneiden.

Dieser Erfindungsgedanke ist auch unabhängig von der Maximierung der Separations-Distanz im Falle der simultanen Trennung mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe von Interesse, so daß nach dem zweiten Aspekt allgemein eine Elektrophorese-Einrichtung zum Analysieren von Fluoreszenzmarker-markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, bereitgestellt wird, die umfaßt: eine Mehrzahl von im wesentlichen parallel zueinander und längs einer Molekülausbreitungsrichtung verlaufenden Gel-Elektrophorese-Bahnen, eine Energiequelle zum Anlegen eines elektrischen Potentials an einem Anfangsbereich und einem Endbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen, eine Laseranordnung zum Anregen von den Molekülen zugeordneten Fluoreszenzmarkern, wobei die Laseranordnung im Elektrophoresebetrieb Laserstrahlung erzeugt, die als wenigstens einer im wesentlichen quer zu der Molekülausbreitungsrichtung verlaufender Laserstrahl wenigstens mehrere der Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidet, um in einem Detektionsbereich der jeweiligen Gel-Elektrophorese-Bahn zugeordnete Fluoreszenzmarker der dort vorhandenen Moleküle anzuregen, eine Erfassungsanordnung zum Erfassen von von den angeregten Fluoreszenzmarkern ausgehender Emissionsstrahlung, wobei die Erfassungsanordung wenigstens ein sich vorzugsweise im wesentlichen parallel zu dem wenigstens einen Laserstrahl erstreckendes Detektorfeld aufweist, das dafür ausgebildet ist, längs einer dem Laserstrahl zugeordneten, vorzugsweise zu diesem im wesentlichen parallelen Detektionsstrecke wenigstens einen Teil der in den Detektionsbereichen aufgrund der Laserstrahlanregung entstehenden, über eine zugeordnete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung zum Detektorfeld geführten Emissionsstrahlung ortsaufgelöst zu erfassen, wobei die Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung die von den angeregten Fluoreszenzmarker ausgehende Emissionsstrahlung auf Empfangsoberflächen oder Empfangsoberflächenabschnitte des Detektorfeldes umlenkt, die zur Molekülausbreitungsrichtung zumindest näherungsweise orthogonal angeordnet sind.

Besonders zweckmäßig ist es, das (jeweilige) Detektorfeld auf einer Trägerplatine anzuordnen, die zur Molekülausbreitungsrichtung zumindest näherungsweise orthogonal angeordnet ist. Wie schon angedeutet, können in Molekülausbreitungsrichtung hintereinander mehrere einer Mehrzahl von Laserstrahlen vorzugsweise unterschiedliche Wellenlänge zugeordnete Detektorfelder jeweils mit zur Molekülausbreitungsrichtung zumindest näherungsweise orthogonal angeordneten Empfangsoberflächen oder Empfangsoberflächenabschnitten vorgesehen sein, die vorzugsweise jeweils auf einer eigenen Trägerplatine angeordnet sind. Der Abstand der Trägerplatine wird primär durch die Dicke etwaiger auf der Trägerplatine angeordneter Komponenten, ggf. der Detektorfelder, oder einer Abmessung der Strahlungsführungsanordnung bestimmt, nicht aber durch die Größe der einzelnen Detektorfelder, so daß die Trägerplatinen in geringem Abstand voneinander angeordnet sein können.

Die Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung kann wenigstens eine einem jeweiligen Detektorfeld zugeordnete und sich im wesentlichen parallel zu diesem Detektorfeld erstreckende Umlenkprismaanordnung, ggf. ein (in Längsrichtung) durchgehendes Umlenkprisma, umfassen. Die Umlenkprismaanordnung kann auf einer Ausgangsseite einer Linsenanordnung, ggf. einem Gradientenindexlinsenfeld, der Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung angeordnet sein.

Zur Anpassung eines bildseitigen optischen Weges zwischen einer/der Linsenanordnung, ggf. einem/dem Gradientenindexlinsenfeld, der Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung einerseits und den Empfangsoberflächen andererseits an eine bildseitige Fokuslänge der Linsenanordnung, kann die Umlenkprismaanordnung aus einem hochbrechenden optischen Material, ggf. Flintglas SF4, gebildet sein.

Vorzugsweise ist die Umlenkprismaanordnung Teil eines integralen optischen Moduls, welches eine/die Linsenanordnung und wenigstens einen Spektralfilter umfaßt. Beispielsweise können die Umlenkprismaanordnung, die als Gradientenindexlinsenfeld ausgebildete Linsenanordnung, der wenigstens eine Spektralfilter und gewünschtenfalls eine Trägerschiene zur Herstellung des integralen optischen Moduls miteinander verklebt sein. Dabei kann auf einer optischen Eingangsseite des Gradientenindexlinsenfelds oder/und auf einer optischen Ausgangsseite des Gradientenindexfelds (ggf. zwischen dem Gradientenindexlinsenfeld und der Umlenkprismaanordnung) wenigstens ein Spektralfilter aufgeklebt sein.

Wenigstens ein Spektralfilter des optischen Moduls kann als Interferenzfilter ausgebildet sein oder einen Interferenzfilter umfassen. Vorzugsweise ist wenigstens ein Spektralfilter als Kombination aus einem Absorptionsfilter und einem Interferenzfilter ausgebildet. Hierzu wird vorgeschlagen, daß wenigstens ein Spektralfilter des optischen Moduls einen Absorptionsfilter, ggf. Farbglasfilter, umfaßt, der als Trägersubstrat für Dünnschichtfilme eines zugeordneten Interferenzfilters dient.

Das optische Modul kann zur Justage eines optischen Weges in einem Modulträger in einer zu den die Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidenden Laserstrahlabschnitten und zu der Molekülausbreitungsrichtung im wesentlichen orthogonalen Richtung verschiebbar angeordnet sein.

Eine bevorzugte Ausführungsform zeichnet sich dadurch aus, daß eine Mehrzahl von Detektorfeldern, eine Mehrzahl von jeweils einem der Detektorfelder zugeordneten optischen Modulen sowie den Detektorfeldern zugeordnete Detektionselektronik in ein Detektormodul mit einem gemeinsamen Gehäuse integriert sind, wobei das Detektormodul als eine Einheit handhabbar ist und vorzugsweise durch Verlagerung in einer zu die Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidenden Laserstrahlabschnitten und zu der Molekülausbreitungsrichtung im wesentlichen orthogonalen Richtung eine gemeinsame Justage zugeordneter objektseitiger optischer Weglängen für alle optischen Module des Detektormoduls ermöglicht.

Hinsichtlich des grundlegenden Aufbaus einer Elektrophorese-Einrichtung, beispielsweise der erfindungsgemäßen Elektrophorese-Einrichtungen nach dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung, bestehen grundsätzlich viele Möglichkeiten. Im Hinblick auf einen kompakten und einfachen Aufbau der Elektrophorese-Einrichtung oder/und im Hinblick auf eine hohe Richtungs- Stabilität der Laserstrahlen (diesbezüglich müssen beispielsweise zur DNA- Sequenzierung hohe Anforderungen gestellt werden) wird nach einem dritten Aspekt vorgeschlagen, daß die Laseranordnung wenigstens einen Laser mit einem optischen Laserresonator aufweist, der bezogen auf eine den Strahlverlauf des aus dem Resonator austretenden Laserstrahls kennzeichnende Resonatorachse zumindest näherungsweise parallel zu den Detektorfeldern angeordnet ist, wobei der aus dem Laserresonator austretende Laserstrahl mittels einer Strahlführungsanordnung umgelenkt wird, damit ein quer zu der Molekülausbreitungsrichtung verlaufender Laserstrahlabschnitt die Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidet. Alternativ oder zusätzlich wird vorgeschlagen, daß die Laseranordnung wenigstens zwei Laser mit einem jeweiligen Laserresonator aufweist, die jeweils bezogen auf eine den Strahlverlauf des aus dem jeweiligen Resonator austretenden Laserstrahls kennzeichnende Resonatorachse unter einem Winkel zu den Detektorfeldern angeordnet sind, vorzugsweise zumindest näherungsweise orthogonal zu den Detektorfeldern angeordnet sind, wobei der aus dem jeweiligen Laserresonator austretende Laserstrahl mittels einer Strahlführungsanordnung umgelenkt wird, damit ein quer zu der Molekülausbreitungsrichtung verlaufender Laserstrahlabschnitt die Gel- Elektrophorese-Bahnen schneidet und wobei die Laserresonatoren bezogen auf die Resonatorachsen zumindest näherungsweise entsprechend dem Versatz der die Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidenden Laserstrahlabschnitte in Molekülausbreitungsrichtung gegeneinander versetzt sind sowie unterschiedlichen Seitenabstand von den Gel- Elektrophorese-Bahnen haben.

Da der angegebene Aufbau der Elektrophorese-Einrichtung nicht nur für die Elektrophorese-Einrichtung nach dem ersten oder/und nach dem zweiten Aspekt vorteilhaft sein kann, stellt die Erfindung nach dem dritten Aspekt allgemein eine Elektrophorese-Einrichtung zum Analysieren von Fluoreszenzmarker-markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, bereit, die umfaßt: eine Mehrzahl von im wesentlichen parallel zueinander und längs einer Molekülausbreitungsrichtung verlaufenden Gel- Elektrophorese-Bahnen, eine Energiequelle zum Anlegen eines elektrischen Potentials an einem Anfangsbereich und einem Endbereich der Gel- Elektrophorese-Bahnen, eine Laseranordnung zum Anregen einer Mehrzahl von verschiedenen, den Molekülen zugeordneten Fluoreszenzmarkern, wobei die Laseranordnung im Elektrophoresebetrieb Laserstrahlung erzeugt, die als im wesentlichen quer zu der Molekülausbreitungsrichtung und im wesentlichen parallel zueinander verlaufende und in Molekülausbreitungsrichtung gegeneinander versetzte Laserstrahlen unterschiedlicher Wellenlänge wenigstens mehrere der Gel-Elektrophorese- Bahnen schneidet, um in einem Detektionsbereich der jeweiligen Gel- Elektrophorese-Bahn zugeordnete Fluoreszenzmarker der dort vorhandenen Moleküle anzuregen, eine Erfassungsanordnung zum Gel-Elektrophorese- Bahn-aufgelösten und Fluoreszenzmarker-aufgelösten Erfassen von von den angeregten Fluoreszenzmarkern ausgehender Emissionsstrahlung, wobei die Erfassungsanordung eine Mehrzahl von in Molekülausbreitungsrichtung gegeneinander versetzten und sich vorzugsweise im wesentlichen parallel zu den Laserstrahlen erstreckenden Detektorfeldern aufweist, die jeweils einem bestimmten der Laserstrahlen zugeordnet sind und dafür ausgebildet sind, längs einer dem jeweiligen Laserstrahl zugeordneten, vorzugsweise zu diesem im wesentlichen parallelen Detektionsstrecke wenigstens einen Teil der in den Detektionsbereichen aufgrund der Anregung durch den jeweiligen Laserstrahl entstehenden, über eine jeweils zugeordnete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung zum Detektorfeld geführten Emissionsstrahlung ortsaufgelöst zu erfassen, wobei die Laseranordnung wenigstens einen Laser mit einem optischen Laserresonator aufweist, der bezogen auf eine den Strahlverlauf des aus dem Resonator austretenden Laserstrahls kennzeichnende Resonatorachse zumindest näherungsweise parallel zu den Detektorfeldern angeordnet ist, wobei der aus dem Laserresonator austretende Laserstrahl mittels einer Strahlführungsanordnung umgelenkt wird, damit ein quer zu der Molekülausbreitungsrichtung verlaufender Laserstrahlabschnitt die Gel- Elektrophorese-Bahnen schneidet.

Es können mehrere Laser mit bezogen auf eine jeweilige Resonatorachse zu den Detektorfelder zumindest näherungsweise parallelen Resonatoren vorgesehen sein, wobei die Laserresonatoren bezogen auf die Resonatorachsen zumindest näherungsweise entsprechend dem Versatz der die Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidenden Laserstrahlabschnitte in Molekülausbreitungsrichtung gegeneinander versetzt sind.

Ferner stellt die Erfindung nach dem dritten Aspekt eine Elektrophorese- Einrichtung zum Analysieren von Fluoreszenzmarker-markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, bereit, die umfaßt: eine Mehrzahl von im wesentlichen parallel zueinander und längs einer Molekülausbreitungsrichtung verlaufenden Gel-Elektrophorese-Bahnen, eine Energiequelle zum Anlegen eines elektrischen Potentials an einem Anfangsbereich und einem Endbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen, eine Laseranordnung zum Anregen einer Mehrzahl von verschiedenen, den Molekülen zugeordneten Fluoreszenzmarkern, wobei die Laseranordnung im Elektrophoresebetrieb Laserstrahlung erzeugt, die als im wesentlichen quer zu der Molekülausbreitungsrichtung und im wesentlichen parallel zueinander verlaufende und in Molekülausbreitungsrichtung gegeneinander versetzte Laserstrahlen unterschiedlicher Wellenlänge wenigstens mehrere der Gel- Elektrophorese-Bahnen schneidet, um in einem Detektionsbereich der jeweiligen Gel-Elektrophorese-Bahn zugeordnete Fluoreszenzmarker der dort vorhandenen Moleküle anzuregen, eine Erfassungsanordnung zum Gel- Elektrophorese-Bahn-aufgelösten und Fluoreszenzmarker-aufgelösten Erfassen von von den angeregten Fluoreszenzmarkern ausgehender Emissionsstrahlung, wobei die Erfassungsanordung eine Mehrzahl von in Molekülausbreitungsrichtung gegeneinander versetzten und sich vorzugsweise im wesentlichen parallel zu den Laserstrahlen erstreckenden Detektorfeldern aufweist, die jeweils einem bestimmten der Laserstrahlen zugeordnet sind und dafür ausgebildet sind, längs einer dem jeweiligen Laserstrahl zugeordneten, vorzugsweise zu diesem im wesentlichen parallelen Detektionsstrecke wenigstens einen Teil der in den Detektionsbereichen aufgrund der Anregung durch den jeweiligen Laserstrahl entstehenden, über eine jeweils zugeordnete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung zum Detektorfeld geführten Emissionsstrahlung ortsaufgelöst zu erfassen, wobei die Laseranordnung wenigstens zwei Laser mit einem jeweiligen Laserresonator aufweist, die jeweils bezogen auf eine den Strahlverlauf des aus dem jeweiligen Resonator austretenden Laserstrahls kennzeichnende Resonatorachse unter einem Winkel zu den Detektorfeldern angeordnet sind, vorzugsweise zumindest näherungsweise orthogonal zu den Detektorfeldern angeordnet sind, wobei der aus dem jeweiligen Laserresonator austretende Laserstrahl mittels einer Strahlführungsanordnung umgelenkt wird, damit ein quer zu der Molekülausbreitungsrichtung verlaufender Laserstrahlabschnitt die Gel- Elektrophorese-Bahnen schneidet und wobei die Laserresonatoren bezogen auf die Resonatorachsen zumindest näherungsweise entsprechend dem Versatz der die Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidenden Laserstrahlabschnitte in Molekülausbreitungsrichtung gegeneinander versetzt sind sowie unterschiedlichen Seitenabstand von den Gel- Elektrophorese-Bahnen haben. Hierzu wird weiterbildend vorgeschlagen, daß die Resonatorachsen zumindest näherungsweise in einem jeweiligen zur Molekülausbreitungsrichtung orthogonalen Ebene liegen.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform zeichnet sich aus durch eine seitlich der Gel-Elektrophorese-Bahnen angeordnete gestufte optische Bank mit unter einem/dem Winkel zur Molekülausbreitungsrichtung angeordneten, vorzugsweise zumindest näherungsweise orthogonal zur Molekülausbreitungsrichtung verlaufenden Stufen, die mit zunehmendem Seitenabstand von den Gel-Elektrophorese-Bahnen entgegengesetzt zur Molekülausbreitungsrichtung zumindest näherungsweise entsprechend dem Versatz der die Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidenden Laserstrahlabschnitte ansteigen und einem jeweiligen der Laser zugeordnet sind zur Halterung einer dem Laser zugeordneten jeweiligen Strahlführungsanordnung oder/und des mit seiner Resonatorachse zumindest näherungsweise sich längs der Stufe erstreckenden Laserresonators.

Hinsichtlich der Ausbildung der Strahlführungsanordnung sind diverse Varianten denkbar. Es wird beispielsweise vorgeschlagen, daß die jeweilige Strahlführungsanordnung eine optische Faser, vorzugsweise Monomodefaser, oder/und wenigstens einen Umlenkspiegel oder/und wenigstens ein optisches Element zur Fokussierung des Laserstrahls oder/und Einstellung einer Laserstrahltaille in Bezug auf die Gel- Elektrophorese-Bahnen, ggf. eine optische Linse, ein optisches Objektiv oder ein optisches Teleskop, oder/und ein optisches Element zur Konditionierung, ggf. räumlichen Filterung, des Laserstrahl, aufweist. In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, daß wenigstens ein Umlenkspiegel oder/und das optische Element zur Justierung des Strahlverlaufs des jeweiligen Laserstrahls verstellbar, vorzugsweise motorisch verstellbar ist.

Hierzu wird weiterbildend vorgeschlagen, daß ein Umlenkspiegel, von dem der die Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidende Laserstrahlabschnitt ausgeht, zumindest näherungsweise in einer zu der Molekülausbreitungsrichtung und dem Laserstrahlabschnitt orthogonalen Richtung, vorzugsweise zumindest näherungsweise längs der jeweiligen Stufe der optischen Bank, verschiebbar ist zur Justage des die Gel- Elektrophorese-Bahnen schneidenden Laserstrahlabschnitts oder/und daß wenigstens ein optisches Element zumindest näherungsweise in der Molekülausbreitungsrichtung verschiebbar ist zur Justage des die Gel- Elektrophorese-Bahnen schneidenden Laserstrahlabschnitts.

Der Einsatz einer optischen Faser, vorzugsweise Monomodefaser, in einer Strahlführungsanordnung hat auch unabhängig von der übrigen Ausbildung einer Elektrophoreseeinrichtung Bedeutung, da sich durch eine optische Faser auf einfache Weise eine Konditionierung der Laserstrahlung oder/und einer Führung der Laserstrahlung zu den Gel-Elektrophorese-Bahnen erreichen läßt. Die Konditionierung der Laserstrahlung ist auch unabhängig von der hierfür eingesetzten optischen Anordnung im Hinblick auf ein hohes Auslösungsvermögen und eine Minimierung des Signal-zu-Rausch- Verhältnisses einer/der Elektrophorese-Einrichtung von Interesse. Die Erfindung stellt deshalb nach einem vierten Aspekt eine Elektrophorese- Einrichtung zum Analysieren von Fluoreszenzmarker-markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, bereit, die umfaßt: eine Mehrzahl von im wesentlichen parallel zueinander und längs einer Molekülausbreitungsrichtung verlaufenden Gel-Elektrophorese-Bahnen, eine Energiequelle zum Anlegen eines elektrischen Potentials an einem Anfangsbereich und einem Endbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen, eine Laseranordnung zum Anregen einer Mehrzahl von den Molekülen zugeordneten Fluoreszenzmarkern, wobei die Laseranordnung im Elektrophoresebetrieb Laserstrahlung erzeugt, die als wenigstens einer im wesentlichen quer zu der Molekülausbreitungsrichtung verlaufender Laserstrahl wenigstens mehrere der Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidet, um in einem Detektionsbereich der jeweiligen Gel-Elektrophorese-Bahn zugeordnete Fluoreszenzmarker der dort vorhandenen Moleküle anzuregen, eine Erfassungsanordnung zum Gel-Elektrophorese-Bahn-aufgelösten und Fluoreszenzmarker-aufgelösten Erfassen von von den angeregten Fluoreszenzmarkern ausgehender Emissionsstrahlung, wobei die Erfassungsanordung wenigstens ein sich vorzugsweise im wesentlichen parallel zu den Laserstrahlen erstreckendes Detektorfeld aufweist, das dafür ausgebildet ist, längs einer dem Laserstrahl zugeordneten, vorzugsweise zu diesem im wesentlichen parallelen Detektionsstrecke wenigstens einen Teil der in den Detektionsbereichen aufgrund der Anregung durch den zugeordneten Laserstrahl entstehenden, über eine zugeordnete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung zum Detektorfeld geführten Emissionsstrahlung ortsaufgelöst zu erfassen, wobei die Laseranordnung wenigstens einen Laser aufweist, dessen Laserstrahl in eine optische Faser, vorzugsweise Monomodefaser, eingekoppelt wird, um den Laserstrahl zu den Gel-Elektrophorese-Bahnen zu führen oder/und den Laserstrahl zu konditionieren, oder/und wobei die Laseranordnung wenigstens einen Laser aufweist, dessen Laserstrahl durch wenigstens ein optisches Element zur Konditionierung, ggf. räumlichen Filterung, des Laserstrahls geführt wird.

Hierzu wird weiterbildend vorgeschlagen, daß der ggf. vornherein ein nicht- Gauß'sches Profil aufweisende Laserstrahl derart konditioniert wird, daß er zumindest näherungsweise ein Gauß-Profil oder/und eine reduzierte Divergenz oder/und einen reduzierten Strahltaille-Durchmesser oder/und einen reduzierten, mit dem Produkt aus einem die Divergenz beschreibenden Divergenzwinkel und dem Strahltaille-Durchmesser ansteigenden Kollimationsfaktor, ggf. sogenannter M²-Faktor, aufweist.

Durch Einsatz von derart konditionierten oder von vornherein eine derartige Qualität aufweisenden Laserstrahlen wird die Trennschärfe der Elektrophorese-Einrichtung maximiert, da diese im wesentlichen durch die Breite des anregenden Laserstrahls in Molekülausbreitungsrichtung bestimmt ist. Der im Gel "ausgeleuchtete" Bereich stellt nämlich eine Art Ziellinie für die wandernden Moleküle, ggf. DNA-Fragmente dar. Für eine gute Auflösung, ggf. zeitliche bzw. vertikale Auflösung, muß der ausgeleuchtete Bereich so schmal wie möglich sein. Ferner sollten sich die in den einzelnen geschnittenen Gel-Elektrophorese-Bahnen ausgeleuchteten Bereiche in ihrer Breite in Molekülausbreitungsrichtung möglichst wenig unterscheiden, um für alle Bahnen vergleichbare Ergebnisse zu erreichen. Hierzu wird speziell auch vorgeschlagen, daß wenigstens einer der Laserstrahlen derart geführt und ggf. fokussiert wird, daß ein Laserstrahlbereich minimalen Laserstrahldurchmessers, ggf. eine/die Strahltaille, längs des zugeordneten Detektorfeldes, etwa im Bereich einer mittleren der vom Laserstrahl geschnittenen Gel-Elektrophorese-Bahnen angeordnet ist.

Das mit einer Elektrophorese-Einrichtung, ggf. der Elektrophorese- Einrichtung nach einem der genannten Aspekte der Erfindung, erzielte Auflösungsvermögen und allgemein die Qualität der Meßergebnisse hängt in hohem Maße von einer Justage der verschiedenen Komponenten und insbesondere des Verlaufs der Laserstrahlen (allgemein: wenigstens eines Laserstrahls) in Bezug auf zugeordnete Gel-Elektrophorese-Bahnen ab. Hierzu wird nach einem fünften Aspekt der Erfindung ein Justageverfahren zum Justieren des Verlaufs wenigstens eines Laserstrahls in Bezug auf zugeordnete Gel-Elektrophoresebahnen einer Elektrophorese-Einrichtung, die wenigstens einen Anregungslaser zum Erzeugen des Laserstrahls und wenigstens ein Detektorfeld zum Aufnehmen von von angeregten Fluoreszenzmarkern ausgehender Emissionsstrahlung aufweist, bereitgestellt, bei dem erfindungsgemäß die Justage auf Grundlage von mittels eines dem (jeweiligen) Laserstrahl zugeordneten Detektorfeldes aufgenommenen Detektionssignalen erfolgt, die eine durch den Laserstrahl induzierte Hintergrundstrahlung, ggf. Hintergrundfluoreszenz oder/und Streulicht, repräsentieren.

Hierzu wird weiterbildend vorgeschlagen, daß im Zuge des Justierens wenigstens ein dem Laserstrahl zugeordnetes optisches Element, ggf. eine Linse, ein Objektiv, ein Teleskop oder ein Umlenkspiegel, zur Aufnahme eines Hintergrundstrahlungsprofils verstellt wird, und das optische Element dann derart eingestellt wird, daß in Folge eine Hintergrundstrahlung zumindest nährerungsweise entsprechend einem Maximum oder/und einer Mitte des Profils detektiert wird.

Besonders bevorzugt ist, daß zuerst ein die Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidender Laserstrahlverlauf und dann ein zu den Gel-Elektrophorese- Bahnen zumindest näherungsweise orthogonaler Laserstrahlverlauf oder/und ein zum zugeordneten Detektorfeld zumindest näherungsweise paralleler Laserstrahlverlauf eingestellt wird.

Ein die Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidender Laserstrahlverlauf kann zweckmäßigerweise besonders günstig auf Grundlage von durch wenigstens einen Detektorfeldabschnitt an einem Ende, vorzugsweise an dem einer Laserstrahleinkoppelstelle in eine/die die Gel-Elektrophorese-Bahnen aufweisende Gelmatrix nächsten Ende, des Detektorfelds aufgenommenen Detektionssignalen eingestellt werden und ein zu den Gel-Elektrophorese- Bahnen zumindest näherungsweise orthogonaler Laserstrahlverlauf oder/und ein zum Detektorfeld zumindest näherungsweise paralleler Laserstrahlverlauf kann besonders zweckmäßig auf Grundlage von durch wenigstens einen Detektorfeldabschnitt am anderen Ende des Detektorfelds aufgenommenen Detektionssignalen eingestellt werden. Dies gilt unter der Voraussetzung, daß hinsichtlich der Parallelität des Laserstrahls zu einer von den Gel- Elektrophorese-Wegen definierten Ebene, ggf. der Gelmatrix, kein oder nur noch ein geringer Freiheitsgrad besteht. Besteht diesbezüglich ein eine Justage erfordernder Freiheitsgrad, so sollte diese Parallelität zuerst eingestellt werden, beispielsweise unter Ausnutzung entsprechender konstruktiver Vorkehrungen der Gel-Elektrophorese-Einrichtung.

Die Justage kann bei entsprechend ausgestatteter Gel-Elektrophorese- Einrichtung motorisch und vorzugsweise automatisch bzw. automatisiert erfolgen.

Bei der Gel-Elektrophorese werden häufig sogenannte Thermostatisierplatten verwendet, die dazu dienen, die Geltemperatur in Richtung senkrecht zur Wandungsrichtung (Molekülausbreitungsrichtung) der Moleküle möglichst konstant zu halten, also für eine gleichmäßige Temperaturverteilung quer zur Molekülausbreitungsrichtung zu sorgen. Wenigstens eine derartige Thermostatisierplatte, wie sie beispielsweise in der DE 30 46 729 C2 oder im Aufsatz "Improvements of DNA Sequencing Gels" von H. Garoff und W. Ansorge, Analytical Biochemistry 115, 450-457 (1991), beschrieben ist, kann auch bei den Elektrophorese-Einrichtungen nach den genannten Aspekten der Erfindung vorteilhaft eingesetzt werden.

Es wurde nun gefunden, daß es vorteilhaft sein kann, mittels der Thermostatisierplatte im Gel (in der Gelmatrix) einen Temperaturgradienten in Molekülausbreitungsrichtung oder/und in einer eine Dicke der Gelmatrix zugeordneten, zur Thermostatisierplatte im wesentlichen orthogonalen Richtung einzustellen, im Falle einer Thermostatisierplatte, die zur Thermostatisierung von einem Wärmeaustauschermittel (im allgemeinen Wasser) durchströmt wird (etwa wie die aus der DE 30 46 729 C2 oder dem genannten Aufsatz bekannte Thermostatisierplatte), vorzugsweise im Zustand fortwährender Durchströmung der Thermostatisierplatte mit dem Wärmeaustauschermittel.

Allgemein stellt die Erfindung nach einem sechsten Aspekt eine Elektrophorese-Einrichtung zum Analysieren von markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, bereit, die umfaßt: eine Mehrzahl von im wesentlichen parallel zueinander und längs einer Molekülausbreitungsrichtung verlaufenden Gel-Elektrophorese-Bahnen, die in einer Gelmatrix, ggf. einem Plattengel, verlaufen, wenigstens eine mit einer Gelmatrixoberfläche in Wärmeaustauschverbindung stehende Thermostatisierplatte, eine Energiequelle zum Anlegen eines elektrischen Potentials an einem Anfangsbereich und einem Endbereich der Gel- Elektrophorese-Bahnen, wobei die Thermostatisierplatte dazu geeignet ist, eine gleichmäßige Temperaturverteilung in der Gelmatrix in die Gel- Elektrophorese-Bahnen schneidender Querrichtung zur Molekülausbreitungsrichtung herzustellen oder/und aufrechtzuerhalten, wobei die wenigstens eine Thermostatisierplatte ferner dazu geeignet ist, in der Gelmatrix einen Temperturgradienten in Molekülausbreitungsrichtung oder/und in einer einer Dicke der Gelmatrix zugeordneten, zur Thermostatisierplatte im wesentlichen orthogonalen Richtung einzustellen, wobei im Falle einer von einem Wärmeaustauschermittel durchströmten Thermostatisierplatte diese vorzugsweise dazu geeignet ist, den betreffenden Temperaturgradient im Zustand fortwährender Durchströmung der Thermostatisierplatte mit dem Wärmeaustauschermittel einzustellen. Alternativ oder zusätzlich kann die wenigstens eine Thermostatisierplatte dazu geeignet sein, ein Temperaturprofil mit einer lokalen Temperaturüberhöhung oder einer lokalen Temperaturabsenkung in wenigstens einem Querbereich der Gelmatrix einzustellen, im Falle der von einem Wärmeaustauschermittel durchströmten Thermostatisierplatte vorzugsweise im Zustand fortwährender Durchströmung.

Hinsichtlich des Funktionsprinzips der Thermostatisierplatte bestehen keine Einschränkungen; dieses ist insbesondere nicht auf den Einsatz von durch die Platte fließenden Wärmeaustauschermittel beschränkt. Es kommt beispielsweise eine unmittelbare Thermostatisierung der Platte mittels elektrischer Mittel (z. B. Heizelemente, Peltierelemente und dergleichen) in Betracht.

Es wird vorgeschlagen, daß zwei Thermostatisierplatten vorgesehen sind, zwischen denen die Gelmatrix angeordnet ist. Vorzugsweise ist ein Temperaturprofil mit in Molekülausbreitungsrichtung abnehmender Temperatur einstellbar, vorzugsweise derart, daß die Temperatur längs der Gel-Elektrophorese-Bahnen um mehrere Grad (beispielsweise 2-10°), abnimmt. Da die Viskosität der Gelmatrix pro Grad um etwa 2,4% abnimmt und eine höhere Viskosität die Mobilität der Molekülbanden im Gel dementsprechend verringert, hat die Abnahme der Temperatur in Molekülausbreitungsrichtung zur Folge, daß die voranlaufende Flanke jeder Bande sich von einem Bereich höherer Mobilität in einen Bereich geringerer Mobilität bewegt. Dies hat zur Folge, daß die sich unter Einfluß des elektrischen Felds durch das Gel bewegenden Banden in Richtung zum Detektionsbereich scharfer werden oder zumindest weniger stark auseinanderlaufen, also der normalerweise während der Elektrophorese auftretenden Bandendiffusion zumindest in einem gewissen Ausmaß entgegengewirkt wird. Dieser "Fokussiereffekt" führt zu einer höheren Auflösung und im Falle der Analyse von Produkten von Sequenzierungsreaktionen zu längeren Sequenzleselängen.

Es kann unter Umständen aber auch zweckmäßig sein, ein Temperaturprofil mit in Molekülausbreitungsrichtung zunehmender Temperatur einzustellen, wofür die Thermostatisierplatte vorzugsweise geeignet ist. Eine besonders hohe Flexibilität ist dann gegeben, wenn die Platte eine wahlweise Einstellung verschiedener Temperaturprofile ermöglicht, beispielsweise eines mit in Molekülausbreitungsrichtung ansteigender und eines mit in Molekülausbreitungsrichtung abnehmender Temperatur.

Alternativ oder zusätzlich kann bezogen auf die der Dicke der Gelmatrix zugeordnete Richtung ein Temperaturprofil mit einem in einem mittleren Bereich der Gelmatrix liegenden Temperaturmaximum einstellbar sein. Dies führt aufgrund der zum mittleren Bereich hin zunehmenden Mobilität zu einer Konzentration der Moleküle im mittleren Bereich der Gelmatrix, was ebenfalls einem Auseinanderlaufen der Bande entgegenwirkt und eine Art Fokussierung mit höherer Auflösung und längeren Sequenzleselängen ergibt. Eine Erklärung hierfür könnte sein, daß im mittleren Bereich des Gels gegenüber Randbereichen des Gels angrenzend zu das Gel begrenzenden Oberflächen definiertere Migrationsbedingungen für die Moleküle herrschen. Diese Konzentration im mittleren Bereich ist bei Fluoreszenzmarker- markierten Molekülen auch im Hinblick auf eine hohe Anregungs- und Detektionsausbeute durch einen beispielsweise ein Gauß'sches Strahlprofil aufweisenden Laserstrahl vorteilhaft. Grundsätzlich ist der die Thermostatisierplatte betreffende Erfindungsvorschlag aber von der Art der Markierung der Moleküle sowie von der Art der Detektion der markierten Moleküle unabhängig. Zum Einstellen des Temperaturprofils mit einem in einem mittleren Bereich der Gelmatrix liegenden Temperaturmaximums kann es besonders zweckmäßig sein, die Gelmatrix zwischen zwei Thermostatisierplatten anzuordnen.

Die Thermostatisierplatte kann dafür geeignet sein, eine lokale Temperaturüberhöhung in einem einem Anfangsbereich entsprechenden Querbereich der Gelmatrix einzustellen. Ist eine Laseranordnung zum Anregen einer Mehrzahl von den Molekülen zugeordneten Fluoreszenzmarkern vorgesehen, die im Elektrophoresebetrieb Laserstrahlung erzeugt, die als wenigstens einer im wesentlichen quer zu der Molekülausbreitungsrichtung verlaufender Laserstrahl wenigstens mehrere der Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidet, um in einem Detektionsbereich der jeweiligen Gel-Elektrophorese-Bahn zugeordnete Fluoreszenzmarker der dort vorhandenen Moleküle anzuregen, so kann die Detektierbarkeit der Fluoreszenzmarker-markierten Moleküle dadurch verbessert werden, daß in einem den jeweiligen Detektionsbereich einschließenden Querbereich eine lokale Temperaturüberhöhung eingestellt wird. Hierfür ist die Thermostatisierplatte vorzugsweise geeignet. Die Temperaturüberhöhung im genannten Querbereich führt zu einer Verbreiterung der Fluoreszenzmarker-Banden sowie zu einer Vergrößerung der Bandenabstände, wodurch sich die Banden besser durch den regelmäßig räumlich eng begrenzten Laserstrahl "abtasten" lassen. Die erreichbare Sequenzleselänge wird dann nicht wesentlich verschlechtert, wenn wenigstens über einen größeren Teil der Gel-Elektrophorese-Wege bis zum jeweiligen Detektionsbereich eine niedrigere Temperatur als im genannten Querbereich herrscht.

Beim Betrieb einer Elektrophorese-Einrichtung mit einer von einem Wärmeaustauschermittel durchströmbaren Thermostatisierplatte wurde überraschenderweise gefunden, daß eine deutliche Verbesserung der Meßergebnisse hinsichtlich Leselänge und Zuverlässigkeit dadurch erreicht werden konnte, daß die Strömung des Wärmeaustauschermittels (Wärmeaustauschermediums, ggf. Wassers) durch die durch das Wärmeaustauschermittel vorgeheizte Thermostatisierplatte nach Erreichen einer vorgegebenen Geltemperatur oder/und einer vorgegebenen Geltemperaturverteilung unterbrochen wurde. Dementsprechend stellt die Erfindung nach einem siebten Aspekt ein Verfahren bereit zum Betreiben einer Elektrophorese-Einrichtung zum Analysieren von markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, die umfaßt: eine Mehrzahl von im wesentlichen parallel zueinander und längs einer Molekülausbreitungsrichtung verlaufenden Gel-Elektrophorese-Bahnen, die in einer Gelmatrix, ggf. einem Plattengel, verlaufen, wenigstens eine mit einer planaren Gelmatrixoberfläche in Wärmeaustauschverbindung stehende, von einem Wärmeaustauschermittel durchströmbare Thermostatisierplatte, die dafür geeignet ist, eine gleichmäßige Temperaturverteilung in der Gelmatrix in die Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidender Querrichtung zur Molekülausbreitungsrichtung herzustellen oder/und aufrechtzuerhalten, eine Energiequelle zum Anlegen eines elektrischen Potentials an einem Anfangsbereich und einem Endbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen. Das Verfahren weist erfindungsgemäß den Schritt des Unterbrechens der Strömung des Wärmeaustauschermittels durch die durch das Wärmeaustauschermittel vorgeheizte Thermostatisierplatte nach Erreichen einer vorgegebenen/vorgebbaren Geltemperatur oder/und einer vorgegebenen/vorgebbaren Geltemperaturverteilung auf.

Erfindungsgemäß kann die Thermostatisierplatte in bekannter Art und Weise dafür verwendet werden, eine gleichmäßige Temperaturverteilung in Querrichtung zur Molekülausbreitungsrichtung einzustellen und aufrechtzuerhalten. Nach Vorheizen der Thermostatisierplatte (auch unter dem Namen thermostatische Platte oder Thermoplatte bekannt) wird allerdings die Wärmeaustauschermittelversorgung unterbrochen, beispielsweise ein Wasserkreislauf von einem thermostatisierten Wasserbad durch die Platte unterbrochen. Hierdurch ergeben sich positive Effekte auf die Elektrophorese-Analyse zum einen durch Unterbindung von Vibrationen, die durch das umlaufende Wärmeaustauschermittel induziert werden und vor allem die Glasoberflächen der Thermostatisierplatten betreffen. Eine Vermeidung dieser kleinen Vibrationen ist besonders wichtig insofern, als diese Vibrationen im Falle einer lasergestützten Fluoreszenzmarkerdetektion auf den durch die Gelschicht verlaufenden, die Oberfläche der Thermostatisierplatte streifenden oder sogar in die angrenzende Glasplatte der Thermostatisierplatte eindringenden Laserstrahl übertragen werden. Da beispielsweise längere DNA-Fragmente im Gel nur sehr schmale Banden in der Molekülausbreitungsrichtung (etwa 0,1 mm und weniger) liefern, können derartige Vibrationen des Laserstrahls um die Banden die Auflösung für längere DNA-Fragmente verringern und damit die Sequenzleselänge begrenzen.

Ein positiver Effekt ergibt sich zum anderen daraus, daß nach Unterbrechung des Wärmeaustauschermittelflusses die gleichmäßige Temperatur zuerst in einem gewissen Ausmaß durch die in der benachbarten Gelschicht während der Elektrophorese sich entwickelnden Joule'schen-Wärme aufrechterhalten wird. Aufgrund eines Wärmeaustausches insbesondere durch Konvektion (Konvektion des Wärmeaustauschermediums in der Thermostatisierplatte oder/und der umgebenden Luft in einem die Thermostatisierplatte mit dem Gel aufnehmenden Gehäuse der Elektrophorese-Einrichtung) wird sich nach einiger Zeit ein Temperaturprofil im Gel einstellen, das die genannten positiven Effekte, etwa Fokussierung der Molekülbanden, haben kann. So kann sich bei einer vertikalen Anordnung der Gelmatrix und der Thermostatisierplatte mit vertikaler Molekülausbreitungsrichtung von oben nach unten eine höhere Temperatur in einem oberen Bereich der Gelmatrix und eine niedrigere Temperatur in einem unteren Bereich der Gelmatrix einstellen, wobei die Thermostatisierplatte nach wie vor dafür sorgt, daß in Querrichtung zur Molekülausbreitungsrichtung (und zum Elektrophoresefeld) gleichmäßige Temperaturverhältnisse aufrechterhalten werden. Aufgrund der infolge der Unterbrechung des Wärmeaustauschermittelkreislaufs sich einstellenden Temperaturverteilung in vertikaler Richtung wird, wie schon beschrieben, über die Beeinflussung der Viskosität des Wasserpuffers im Gel und damit der Mobilität der Banden im Gel der beschriebene Fokussierungseffekt auf die Molekülbanden erreicht.

Beim genannten Verfahren zum Betreiben einer Elektrophorese-Einrichtung kann es ebenfalls zweckmäßig sein, daß zwei Thermostatisierplatten vorgesehen sind, zwischen denen die Gelmatrix angeordnet ist. Je nach Auslegung und Aufbau der Elektrophorese-Einrichtung wird sich nach Unterbrechen der Strömung in der Gelmatrix ein Temperaturgradient in Molekülausbreitungsrichtung (vorzugsweise gemäß einem Temperaturprofil mit in Molekülausbreitungsrichtung abnehmender Temperatur) oder/und in einer eine Dicke der Gelmatrix zugeordneten, zur Thermostatisierplatte im wesentlichen orthogonalen Richtung (vorzugsweise gemäß einem einer der Dicke der Gelmatrix zugeordneten Richtung zugeordneten Temperaturprofil mit einem in einem mittleren Bereich der Gelmatrix liegenden Temperaturmaximum) einstellen. Es ist auch möglich, daß sich bei entsprechender Anordnung der Thermostatisierplatte ein Temperaturprofil mit in Molekülausbreitungsrichtung zunehmender Temperatur einstellt, was ebenfalls zweckmäßig sein kann. Ferner kann sich unter Umständen ein Temperaturprofil mit einer lokalen Temperaturüberhöhung oder einer lokalen Temperaturabsenkung in wenigstens einem Querbereich der Gelmatrix einstellen. Um ein derartiges Temperaturprofil zu erreichen, kann - beispielsweise - die Wärmeabstrahlung von der Gelmatrix durch Abschirmungsmittel, etwa wenigstens einer Abschirmungsplatte, gezielt beeinflußt werden, beispielsweise um eine Temperaturüberhöhung in einem einem Anfangsbereich entsprechenden Querbereich der Gelmatrix oder/und - im Falle Laser-gestützter Fluoreszenzmarkerdetektion im Hinblick auf die Detektierbarkeit - in einem die Detektionsbereiche der Gel-Elektrophorese- Bahnen einschließenden Querbereich zu erhalten. Im letzteren Fall bietet es sich an, eine/die die Fluoreszenzstrahlung aufnehmende Detektoreinheit so auszubilden und anzuordnen, daß sie für die entsprechende Abschirmung der Gelmatrix und damit - in Folge geringerer Wärmeabstrahlung von der Gelmatrix im genannten Querbereich - für die Einstellung der Temperaturüberhöhung im Querbereich sorgt.

Das erfindungsgemäße Betriebsverfahren kann vorteilhaft bei den Elektrophorese-Einrichtungen bzw. Verfahren nach dem ersten bis fünften Aspekt der Erfindung angewendet werden.

Die Erfindung und ihre verschiedenen Aspekte werden im folgenden anhand mehreren Ausführungsbeispielen anhand der beigefügten Figuren und im Text bzw. in den Figuren aufgenommenen Tabellen näher erläutert.

Fig. 1 zeigt schematisch den Aufbau eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Elektrophorese-Einrichtung.

Fig. 2 zeigt ein Detektormodul der Einrichtung der Fig. 1 in einer Ansicht entsprechend einer Draufsicht auf Eingangsseiten von fünf übereinander angeordneten Optik- und Detektorfeld- Modulen des Detektormoduls.

Fig. 3 zeigt ein Optik- und Detektorfeld-Modul gemäß Fig. 2 in einer Explosionsansicht mit einem linearen Detektorfeld und einer von einem Gradientenindexlinsenfeld und einem Spektralfilter gebildeten Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung, die als integrales optisches Modul ausgebildet sein kann.

Fig. 4 zeigt einen Horizontalschnitt durch eine Elektrophorese- Gelplatten-Anordnung der Einrichtung der Fig. 1 gemäß einer Ausführungsvariante im Vertikalbereich einer als integrales optisches Modul ausgebildeten Spektralfilter und Strahlungsführungsanordnung mit schematischer Andeutung eines von einer Reihe von Photodioden gebildeten linearen Detektorfelds mit zugeordneter Ansteuer- und Auswerteelektronik.

Fig. 5 zeigt schematisch den Strahlengang des optischen Moduls der Fig. 4 durch eine sogenannte Notched-Platte, einen ersten optischen Spektralfilter, das Gradientenindexlinsenfeld, einen zweiten optischen Spektralfilter, ein Umlenkprisma auf das Photodiodenfeld.

Fig. 6 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der in Fig. 4 schematisch gezeigten Thermoplatte (Thermostatisierplatte).

Fig. 7 zeigt ein Diagramm, das die spektrale Empfindlichkeit des aus Silicium-Photodioden gebildeten linearen Detektorfelds als Funktion der Wellenlänge angibt.

Fig. 8 zeigt normierte Absorptions- und Emissionsspektren der bei der Elektrophorese unter Einsatz einer erfindungsgemäßen Elektrophorese-Einrichtung im Falle einer gleichzeitigen Analyse von mit vier unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierten Molekülen, beispielsweise Produkten von Nukleinsäure-Sequenzierungsreaktionen, bevorzugt verwendeten vier Fluoreszenzfarbstoffe (Fluoreszenzmarker, Fluorochrome) FITC, TexasRed™, CY 5.5 und IRD 800 mit Angabe der bevorzugt zur Anregung des jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffs verwendeten Anregungswellenlänge und des bevorzugt verwendeten Lasertyps.

Fig. 9 zeigt die chemische Struktur von mit einer erfindungsgemäßen Elektrophorese-Einrichtung bevorzugt eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffen.

Fig. 10 spezifiziert eine bevorzugt für die Detektion des Fluoreszenzfarbstoffs CY 2 verwendete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung hinsichtlich eines bevorzugten spektralen Durchlaßbereichs und eines bevorzugten Aufbaus der Spektralfilteranordnung, wobei in einer Tabelle (Fig. 10a) einer Transmission von 50% entsprechende Kantenwellenlängen der Spektralfilteranordnung und Daten zur Transmission der Spektralfilteranordnung angegeben sind und im Diagramm der Fig. 10b das Absorptions- und das Fluoreszenzspektrum des Farbstoffs CY 2 und Filterkennlinien der Spektralfilteranordnung für maximalen und minimalen Lichteinfallswinkel angegeben sind.

Fig. 11 spezifiziert die bevorzugt für die Detektion des Farbstoffs FITC verwendete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung in einer Darstellung entsprechend Fig. 10.

Fig. 12 spezifiziert die bevorzugt für die Detektion des Farbstoffs Rhodamin 6G verwendete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung in einer Darstellung entsprechend Fig. 10.

Fig. 13 spezifiziert die bevorzugt für die Detektion des Farbstoffs TexasRed™ verwendete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung in einer Darstellung entsprechend Fig. 10.

Fig. 14 spezifiziert die bevorzugt für die Detektion des Farbstoffs CY 5 verwendete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung in einer Darstellung entsprechend Fig. 10.

Fig. 15 spezifiziert die bevorzugt für die Detektion des Farbstoffs CY 5.5 verwendete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung in einer Darstellung entsprechend Fig. 10.

Fig. 16 spezifiziert die bevorzugt für die Detektion des Farbstoffs IRD 800 verwendete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung in einer Darstellung entsprechend Fig. 10.

Fig. 17 zeigt ein Diagramm, das einige Daten der Fig. 10 bis 16 zusammenfaßt und die spektrale Lage der Absorptions- und Emissionsspektren entsprechend einer relativen Amplitude von wenigstens 0,2, die vorgeschlagenen spektralen Durchlaßbereiche der dem jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff jeweils zugeordneten Spektralfilteranordnungen entsprechend einer Transmission von wenigstens 0,5 für Einfallswinkel α = 0° und beispielsweise in Frage kommende Anregungswellenlängen und Lasertypen angibt.

Fig. 18 zeigt eine Variante der Thermostatisierplatte der Fig. 6, mit der sich ein Temperaturgrandient in der Ausbreitungsrichtung der Moleküle während der Elektrophorese einstellen läßt.

Fig. 19 zeigt in Fig. 19a eine Querschnittsansicht mit einer sandwichartig zwischen zwei Thermostatisierplatten angeordneten Elektrophorese-Gelschicht und in Fig. 19b schematisch einen durch die Anordnung der Fig. 19a einstellbaren Temperaturgradienten im Gel in einer der Dicke der Gelschicht zugeordneten Richtung.

Es wird zuerst auf Fig. 1 bis 3 Bezug genommen. Fig. 1 zeigt schematisch eine Gel-Elektrophorese-Einrichtung 10 mit einer vertikal angeordneten Gelschicht oder Gelplatte 12, die zwischen einer sogenannten Notched- Platte oder Kerbenplatte 14 und einer Thermostatisierplatte oder Thermoplatte 16 angeordnet ist. Bei der Herstellung der Gelschicht 12 wurde eine an einem oberen Rand der Gelschicht 12 angeordnete Reihe von nach oben hin offenen Aussparungen oder Taschen im Gel ausgebildet, die jeweils am Anfang einer zugeordneten Gel-Elektrophorese-Bahn liegen und die zu analysierenden Proben aufnehmen. Auf einer Gel-Breite von beispielsweise 305 mm können beispielsweise 192 Geltaschen 18 und damit 192 nebeneinander liegende Gel-Elektrophorese-Bahnen vorgesehen sein, entsprechend beispielsweise einer Bahnbreite von 1 mm und einem Bahnzwischenraum von 0,6 mm, so daß sich beispielsweise bei einer Sequenzierungsanalyse pro selektiv detektierbaren Fluoreszenzmarker 48 Klone (4 Bahnen pro Klon) analysieren lassen. Hinsichtlich der Art und Weise des Beladens des Elektrophorese-Gels der erfindungsgemäßen Einrichtung mit zu analysierenden Proben bestehen grundsätzlich keine Einschränkungen, es kann beispielsweise auf die aus der WO 96/27787 und WO 98/30911 bekannten Techniken und Verfahren verwiesen werden.

Während des Elektrophorese-Betriebs wird mittels einer Spannungsquelle 20 ein elektrisches Potential zwischen einem oberen Puffertank und einem unteren Puffertank 24 angelegt entsprechend der Ladung von zu analysierenden Molekülen, wobei im Falle der Analyse von Sequenzierungsprodukten der obere Puffertank 22 auf gegenüber dem unteren Puffertank negativerem Potential liegt, so daß sich die negativ geladenen DNA-Fragmente entlang der elektrischen Feldlinien von oben nach unten durch das Gel, im Regelfall ein Poly-Acrylamid-Gel, von oben nach unten bewegen (Molekülausbreitungsrichtung M). Im Zuge ihrer Bewegung längs der jeweiligen Gel-Elektrophorese-Bahn erfolgt eine Trennung der Moleküle, ggf. DNA-Segmente, nach ihrem Molekulargewicht bzw. ihrer Größe bzw. Länge. Die Migrationsgeschwindigkeit der Moleküle sinkt überproportional mit steigender Molekülgröße bzw. steigendem Molekulargewicht, so daß Moleküle kleineren Molekulargewichts (kürzere DNA-Fragmente) sich schneller als Moleküle größeren Molekulargewichts (längere DNA-Fragmente) bewegen und zuerst einen in einem unteren Bereich des Gels liegenden Detektionsbereich erreichen. Hier werden die mit Fluoreszenzfarbstoffen markierten Moleküle über vom jeweiligen Fluoreszenzmarker ausgehende Fluoreszenzstrahlung optisch detektiert, die durch optische Anregung des jeweiligen Fluoreszenzmarkers durch Laserstrahlung induziert wird. Aufgrund der Abhängigkeit der Molekülausbreitungsgeschwindigkeit (Migrationsgeschwindigkeit) von dem Molekulargewicht (der Molekülgröße, ggf. DNA-Fragmentlänge) durchlaufen zuerst die Moleküle kleineren Molekulargewichts (die kleineren Moleküle bzw. die kürzeren DNA-Fragmente) den zur Anregung dienenden Laserstrahl, so daß eine räumliche Separation der Moleküle in Vertikalrichtung (deren vertikale Separations-Distanz) in eine zeitliche Information umgesetzt wird, nämlich in die Reihenfolge, in der die Moleküle durch den Laserstrahl treten. Im Falle der Analyse von DNA- Sequenzierungsprodukten kann diese zeitliche Information beispielsweise mittels einer Computereinheit 26 in Sequenzinformation umgesetzt werden.

Der Thermostatisierplatte 16 ist ein thermostatisierbares Wärmeaustauschermediumreservoir, vorzugsweise ein thermostatisierbares Wasserbad 28 zugeordnet, wobei über eine Pumpe 30 ein Wärmeaustauscherkreislauf, ggf. Wasserkreislauf, durch die Thermostatisierplatte 16 geführt ist, um gleichmäßige Temperaturbedingungen vor allem in Horizontalrichtung über alle Gel- Elektrophorese-Bahnen einzustellen bzw. aufrechtzuerhalten. Von der genannten Zahl der Elektrophorese-Bahnen und der Bahnbreiten und Bahnzwischenräumen abgesehen, entspricht die Gel-Elektrophorese- Einrichtung 10, soweit bisher beschrieben, herkömmlichen Elektrophorese- Einrichtungen. Zum grundsätzlichen Aufbau derartiger Elektrophorese- Einrichtungen und den Hintergrund der Analyse von Sequenzierungsprodukten mittels einer derartigen Einrichtung wird ausdrücklich auf die WO 96/23213 verwiesen. Die Thermostatisierplatte 16 kann entsprechend den aus der DE 30 46 729 C2 bekannten Thermostatisierplatten ausgebildet sein. Auf die DE 30 46 729 C2 wird ausdrücklich verwiesen, und die Offenbarung dieser Schrift wird durch Bezugnahme in die Offenbarung der vorliegenden Beschreibung einbezogen.

Im folgenden werden nun weitere Einzelheiten einer erfindungsgemäßen Elektrophorese-Einrichtung gemäß dem in Fig. 1 gezeigten Ausführungsbeispiel erläutert, die gegenüber dem Stand der Technik zu wesentlichen Vorteilen führen.

Die Elektrophorese-Einrichtung 10 der Fig. 1 ist dafür ausgebildet, Laserstrahlung von fünf verschiedenen Lasern zur Detektion der Fluoreszenzmarker der markierten, längs der Richtung M migrierenden Moleküle einzusetzen, von denen in Fig. 1 nur vier Laser gezeigt sind, nämlich ein bei 488 nm emittierender Argon-Ionen-Laser 50, ein bei 594 nm emittierender Helium-Neon-Laser 52, ein im Bereich von 675 nm emittierender und beispielsweise mittels eines Peltierelements auf die Emissionswellenlänge von 675 nm abstimmbarer Halbleiterlaser (auch als Laserdiode bezeichnet) 54 und ein im Bereich von 775 nm emittierender, beispielsweise mittels eines Peltierelements auf eine Wellenlänge von 775 nm abstimmbarer Halbleiterlaser 56. Von den Lasern ist jeweils nur der eigentliche, den Laserresonator aufweisende Laser bzw. Laserkopf gezeigt, nicht aber zugeordnete Steuergeräte und dergleichen. Der Argon-Ionen- Laser 50 und der Helium-Neon-Laser 52 sind mit einer die Laserstrahlausbreitungsrichtung definierenden Resonatorachse zumindest näherungsweise horizontal in einer jeweiligen Horizontalebene angeordnet, und zwar zumindest näherungsweise parallel zur Gelschicht 12. Die Halbleiterlaser 54 und 56 sind mit ihrer entsprechenden Resonatorachse ebenfalls zumindest näherungsweise horizontal in einer jeweiligen Horizontalebene angeordnet, und zwar zumindest näherungsweise orthogonal zur Gelschicht 12. Die den vier Lasern zugeordneten Horizontalebenen sind vertikal gestaffelt angeordnet, und zwar vorzugsweise mit einem Vertikalabstand von ungefähr 10 mm entsprechend einem Vertikalabstand der von den Lasern abgegebenen Laserstrahlen 60, 62, 64 und 66. Die Laserstrahlen werden durch Umlenkspiegel 70 und 72 im Falle der Strahlen 60 und 62 vom Argon-Ionenlaser 50 und Helium-Neon- Laser 52 zweimal und im Falle der Laserstrahlen 64 und 66 von den Halbleiterlasern 54 und 56 einmal um jeweils zumindest näherungsweise 90° umgelenkt, um die Laserstrahlen vertikal gestaffelt mit dem genannten Vertikalabstand von beispielsweise etwa 10 mm seitlich in die Gelschicht 12 einzukoppeln. Zur Fokussierung der Laserstrahlen ist im Strahlengang der Laserstrahlen jeweils eine optische Linse 74, beispielsweise eine Plankonvex-Linse, angeordnet, mittels der die Taille des Laserstrahlprofils, idealerweise eines zumindest näherungsweise einem Gauß'schen Strahlprofil entsprechendes Strahlprofil, ungefähr in die Mitte des Gels im Bezug auf die Breite b gelegt wird. Zur Feineinstellung des Verlaufs der Laserstrahlen in vertikaler Richtung sind die Linsen 74 vorzugsweise höhenverstellbar, vorzugsweise motorisch höhenverstellbar. Die die Umlenkung der Laserstrahlen in Richtung zum Gel bewirkenden Umlenkspiegel 72 sind vorzugsweise in einer zur Gelschicht 12 zumindest näherungsweise orthogonalen Richtung verstellbar, vorzugsweise motorisch verstellbar, um die Laserstrahlen in einer jeweiligen Horizontalebene in Querrichtung zur Gelschicht parallel zu versetzen und so möglichst genau in der Mitte der Gelschicht (bezogen auf die Dicke des Gels) in das Gel einzukoppeln. Eine Justage der Laserstrahlen mittels der verstellbaren optischen Elemente erfolgt vorzugsweise auf Grundlage von Detektionssignalen vom jeweiligen Detektorfeld, die beispielsweise auf Streulicht oder Hintergrund-Fluoreszenzlicht der Gelschicht oder/und angrenzender Glasplatten beruhen. Es wird dabei vorzugsweise ein Hintergrundstrahlungsprofil aufgenommen und dann einen einem Maximum oder/und einer Mitte des Hintergrundstrahlungsprofils entsprechender Laserstrahlverlauf eingestellt, vorteilhafterweise jeweils bezüglich wenigstens einem Detektorfeldabschnitt an zueinander entgegengesetzten Enden des Detektorfelds. Das Einkoppeln in das Gel erfolgt vorzugsweise über eine gemeinsame, das Gel seitlich begrenzende Einkoppelplatte.

Zu den Halbleiterlasern ist noch nachzutragen, daß deren an sich vergleichsweise stark divergenten Laserstrahlen mittels eines jeweiligen, in Fig. 1 nicht dargestellten Teleskops gebündelt werden, um den Strahl- Durchmesser auf unter 1 mm bringen. Die Laserstrahlen können zusätzlich jeweils einen Raumfilter, beispielsweise eine Lochblende, durchlaufen, um einen möglichst idealen Gauß'schen Strahl zu erreichen. Im Falle des Argon-Ionen-Lasers und des Helium-Neon-Lasers entspricht das Laserstrahlprofil im Regelfall schon recht gut einem Gauß'schen Strahlprofil, so daß derartige Strahlkontitionierungen in der Regel entbehrlich sind.

Die genannten optischen Komponenten (Umlenkspiegel 70 und 72, Linsen 74 usw.) sowie die Halbleiterlaser 54 und 56 sind auf einer stufenförmigen optischen Bank 80 montiert, deren Stufen 82 seitlich entsprechend dem Versatz zwischen den Laserstrahlen ansteigen, wie in Fig. 1 zu erkennen. Mittels der gestuften optischen Bank kann auf besonders einfache Weise eine kompakte Anordnung mit hoher Stabilität erreicht werden unter Ermöglichung der genannten Laserstrahlengänge. Die oberste Stufe der gestuften optischen Bank 82 ist gemäß Fig. 1 ungenutzt, hier könnte ein weiterer Halbleiterlaser mit entsprechenden optischen Komponenten oder eine weitere Anordnung aus Umlenkspiegeln 70 und 72 für einen weiteren, parallel zu den Lasern 50 und 52 angeordneten Laser montiert sein, um fünf Laserstrahlen vertikal gestuft in die Gelschicht einzukoppeln.

Die Laserstrahlen mit den vier verschiedenen Wellenlängen dienen zur Anregung von zugeordneten Fluoreszenzmarkern, beispielsweise der Fluoreszenzmarker FITC, TexasRed™, CY 5.5 und IRD 800, die sich nur geringfügig überlappende Anregungs- und Emissionsspektren aufweisen und so eine selektive Anregung und Detektion ermöglichen (vgl. Fig. 8). Den eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffen und damit den Laserstrahlen ist jeweils eine Detektionsanordnung zum Detektieren der von den angeregten Fluoreszenzmarkern emittierten Emissionsstrahlung zugeordnet. Die Detektoranordnungen sind in ein Detektormodul 90 integriert, das in der Ansicht der Fig. 1 hinter der Kerbenplatte 14 angeordnet ist und anhand der Fig. 2 und 4 näher erläutert wird.

Fig. 2 zeigt das Detektormodul 90 in Draufsicht auf Eingangsseiten von fünf Optik- und Detektorfeld-Modulen 94, 96, 98 und 100, von denen die Module 92 bis 98 den Laserstrahlen 60, 62, 64 und 66 zugeordnet sind, wobei in Fig. 2 gestrichelt der ideale Verlauf der Laserstrahlen in Bezug auf die Eingangsseiten der Optik- und Detektorfeld-Module angegeben ist, nämlich parallel zu einer Längsachse der Module in der Mitte der jeweiligen Eingangsseite.

Ein möglicher Aufbau der Optik- und Detektorfeld-Module ist in Fig. 3 gezeigt. Das dort gezeigte Optik- und Detektorfeld-Modul ist von einem linearen Detektorfeld 102, das beispielsweise eine Reihe von Photodioden 104 aufweist, und einer Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung gebildet, die im Falle des Beispiels der Fig. 3 einen Spektralfilter 106 und ein Gradientenindexlinsenfeld, beispielsweise ein sog. SELFOC-Linsenfeld (SLA) 108 umfaßt, das beispielsweise vertikal übereinander sechs Reihen von Gradientenindexlinsen aufweist.

Bei dem Gradientenindexlinsenfeld 108 handelt es sich bevorzugt um ein Linsenfeld mit einer numerischen Apertur von etwa 0,6 entsprechend einem maximalen Einfallswinkel von α = ± 22,5°, also einem Öffnungswinkel eines eintreffenden Strahlenbündels von etwa 45°, wobei die einzelnen Linsen von zylinderförmigen Elementen mit einem Durchmesser von 1 mm und einer Länge von 10 mm in den genannten 6 Zeilen zu je 300 Linsen gebildet sind. Ein Linsenfeld enthält etwa 1.800 derartiger Linsen und es ist eine Gesamt-Lichteintrittsfläche von 305 mm × 6 mm gegeben. Derartige Linsenfelder sind als Spezialanfertigung von der Nippon Sheet Glass Company, Japan, erhältlich.

Das lineare Detektorfeld 102 umfaßt bevorzugt hochempfindliche Photodioden mit einer Abmessung der lichtempfindlichen Oberflächen von etwa 3 mm, wobei im Hinblick auf eine Unterscheidung der Gel- Elektrophorese-Bahnen wenigstens zwei Photodioden (Pixel) pro Elektrophorese-Bahn vorgesehen sein sollten, so daß das lineare Detektorfeld vorzugsweise wenigstens 384 nebeneinandergereihte Photodioden aufweist. Das lineare Detektorfeld 104 ist vorzugsweise aus sechs linear aneinandergereihten Modulen gebildet, die in Hybridbauweise ausgeführt sein können und jeweils 64 Photodioden auf einem gemeinsamen Chip mit einer Breite von 2 Zoll (5,08 cm) tragen können, vorzugsweise zusammen mit zugehörigen integrierenden Operationsverstärkern. Gute Ergebnisse wurden erzielt mit einer lichtempfindlichen Gesamtfläche pro Detektorzeile von 30,5 cm × 3 mm, unterteilt in die genannten 384 Photodioden, die jeweils 0,8 mm breit sind. Zur Minimierung des lichtunempfindlichen Bereichs sollten die lichtunempfindlichen Zonen zwischen den einzelnen Photodioden möglichst schmal sein. Beim bevorzugten Ausführungsbeispiel beträgt die lichtunempfindliche Zone zwischen den Photodioden nur jeweils 0,02 mm, so daß der gesamte lichtunempfindliche Bereich 383 × 0,2 mm gleich 7,66 mm breit ist entsprechend einem sehr geringen Anteil von nur 2,5% an der gesamten Detektorfläche. Derartige Photodiodenmodule sind als Spezialanfertigung von der Firma Hamamatsu Photonics, Japan, erhältlich. Die spektrale Empfindlichkeit der Silicium-Photodioden ist in Fig. 7 gezeigt und kann durch Änderung der Dotierung gewissen Grenzen eingestellt werden.

Die Gradientenindexlinsen des Gradientenindexlinsenfeldes 108 erzeugen jeweils sich gegenseitig überlappende Einzelbilder auf der Bildseite, also auf den Photodioden, wobei es zu einer räumlich-kontinuierlichen 1-zu-1- Abbildung kommt. Aufgrund dessen sowie aufgrund der hohen numerischen Apertur einerseits und der Abmessungen der Photodioden in Molekülausbreitungsrichtung M (im hier beschriebenen Beispielsfall 3 mm) andererseits bestehen hinsichtlich der Ausrichtung des Gradientenindexlinsenfeldes 108 im Bezug auf das Detektorfeld 108 keine hohen Anforderungen.

Anstelle eines aus Photodioden gebildeten linearen Detektorfelds kann auch ein CCD-Feld oder ein anderes ortsauflösendes Detektorfeld eingesetzt werden, das längs einer Detektionsstrecke, die durch den Verlauf der Laserstrahlen im Gel definiert ist, eine ortsaufgelöste Erfassung des Fluoreszenzlichts ermöglicht. Die verwendeten Detektorfelder können durchaus eine Matrix von Detektionspixeln mit mehreren zueinander parallelen Pixelreihen aufweisen. Der in Bezug auf die Detektorfelder verwendete Begriff "linear" ist insoweit nicht beschränkend und bezieht sich auf die Möglichkeit der ortsaufgelösten Fluoreszenzlichterfassung längs einer entsprechend dem Ausführungsbeispiel linearen Detektionsstrecke.

Als Spektralfilter kommen Absorptionsfilter (beispielsweise Farbglasfilter) und Interferenzfilter und, vor allem, Kombinationen aus wenigstens einem Absorptionsfilter und wenigstens einem Interferenzfilter in Betracht. Die Durchlaßbereiche der Spektralfilter der verschiedenen Optik- und Detektorfeld-Module ist entsprechend den Anregungswellenlängen und den Emissionsspektren der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe zu wählen, wobei im folgenden für eine Reihe von verwendbaren Fluoreszenzmarkern geeignete Spektralfilterspezifikationen als Beispiel angegeben werden. Bemerkenswerterweise können auch Fluoreszenzmarker mit sich überlappenden Emissionsspektren voneinander unterschieden werden, sofern diese selektiv anregbar sind und eine räumlich getrennte Laserstrahlanregung, beispielsweise mittels von gegeneinander versetzten Laserstrahlen wie beim Ausführungsbeispiel der Fig. 1 und 2, erfolgt. Alternativ kommt auch eine zeitlich getrennte Laserstrahlanregung und eine Anregung mit unterschiedlich modulierten Laserstrahlen zur Ermöglichung einer phasenempfindlichen Detektion in Betracht. Ferner können auch selektiv oder nicht-selektiv anregbare Fluoreszenzmarker mit sich überlappenden Emissionsspektren unterschieden werden, sofern die Emissionsspektren sich nur bereichsweise überlappen, also sich nicht überlappende Spektralbereiche aufweisen und die Emissionsstrahlung spektral-selektiv detektiert wird, ggf. in Verbindung mit einer räumlich getrennten Laserstrahlanregung oder/und einer zeitlich getrennten Laserstrahlanregung oder/und einer Anregung mit modulierter Laserstrahlung zur Ermöglichung einer phasenempfindlichen Detektion.

Eine besonders bevorzugte Ausbildung der Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnungen des Detektormoduls jeweils als integrales optisches Modul ist in den Fig. 4 und 5 in räumlicher und funktionsmäßiger Beziehung zu einem gegenüber dem integralen optischen Modul gesonderten linearen Detektorfeld gezeigt. Zur Erläuterung der Ausführungsvariante der Fig. 4 und 5 werden die gleichen Bezugszeichen wie für die Ausführungsform der Fig. 1 bis 3 für analoge oder identische Komponenten unter Nachstellung des Buchstabens "a" verwendet, wobei nur die Unterschiede gegenüber der vorangehend beschriebenen Ausführungsform beschrieben werden und ansonsten ausdrücklich auf die vorangehende Beschreibung verwiesen wird.

Fig. 4 zeigt schematisch die Anordnung der optischen und elektronischen Elemente einer einem Laserstrahl zugeordneten Detektoreinheit mit dem Detektorfeld (der Detektorzeile) in einer schnittartigen Darstellung mit Sichtrichtung entsprechend der Molekülausbreitungsrichtung M (bei der Anordnung entsprechend Fig. 1 also von oben) und Fig. 5 zeigt die Elemente der Detektoreinheit in einer zur Gelschicht, der Kerbenplatte und der Thermostatisierplatte orthogonalen Schnittebene, wobei die Photodetektoren der Detektorzeile in Fig. 4 nur schematisch angedeutet sind.

Gemäß der Variante der Fig. 4 und 5 ist für die Führung der aus der Anregung durch einen Anregungs-Laser resultierenden Fluoreszenzmarker- Emissionsstrahlung ein integrales optisches Modul für den jeweiligen Laser vorgesehen, das aus einem Gradientenindexlinsenfeld 108a, einem Absorptionsfilter 106a auf der Bildseite des Gradientenindexlinsenfelds 108a, einem optischen Interferenzfilter 107a auf der Objektseite des Gradientenindexlinsenfeldes 108a und einem verspiegelten Umlenkprisma aus hochbrechendem Flintglas SF 4 110a besteht. Die Spektralfilter 106a, 107a und das Umlenkprisma 110a sind direkt auf das Gradientenindexlinsenfeld 108a sowie auf eine Trägerschiene aus Aluminium geklebt, um eine optische Einheit mit definierter optischer Weglänge zu erhalten. Der Strahlengang für die Emissionsstrahlung von den angeregten Fluoreszenzmarkern ist in Fig. 5 zu erkennen. Die optische Weglänge Z (λ) beträgt etwa 20 mm, wobei aufgrund des hochbrechenden Umlenkprismas die für die Abbildung benötigte optische Weglänge auf Grundlage einer relativ kurzen geometrischen Weglänge erreicht wird. Zur Abstimmung der optischen Weglänge an die verschiedenen Fluoreszenzwellenlängen können für die einzelnen, den Detektorzeilen zugeordneten optischen Module Umlenkungsprismen mit unterschiedlichem Brechungsindex verwendet werden. In einem gewissen Ausmaß lassen sich durch chromatische Aberration bedingte unterschiedliche Weglängen allerdings auch dadurch ausgleichen, daß sich die optischen Einheiten 112a durch Verschieben auf der optischen Achse einjustieren lassen. Zur Ausbildung der jeweiligen optischen Einheit 105a aus den Filtern 106a, 107a, dem Gradientenindexlinsenfeld 108a und dem Umlenkprisma 110a ist noch nachzutragen, daß die Verklebung beispielsweise mittels eines optischen Klebstoffs auf Silikonbasis erfolgen kann, der vorzugsweise eine niedrige Viskosität aufweist und hinsichtlich seines Brechungsindexes vorzugsweise an die Brechungsindizes der Filtergläser und des Gradientenindexlinsenfelds angepaßt ist.

Das dem jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff zugeordnete lineare Detektorfeld 102a besteht wie das Detektorfeld 102 aus sechs linear aneinandergereihten Modulen, die auf einer gemeinsamen Trägerplatine 114a, auf der auch Taktgeber und Multiplexer 116a untergebracht sind, eingesteckt sind. Die einzelnen Module sind in Hybridbauweise ausgeführt und tragen jeweils 64 Photodioden auf einem gemeinsamen Chip mit der Breite von zwei Zoll ( = 5,08 cm), zusammen mit den zugehörigen integrierenden Operationsverstärkern. Die gesamte lichtempfindliche Fläche einer Detektorzeile ist somit 30,5 cm breit und 3 mm hoch, unterteilt in 385 Photodioden von 0,8 mm Breite. Die lichtunempfindliche Zone zwischen den einzelnen Photodioden ist jeweils 0,02 mm breit. Der gesamte lichtunempfindliche Bereich ist demgemäß 383 × 0,02 mm = 7,66 mm breit entsprechend einem sehr geringen Anteil von nur 2,5% an der gesamten Detektorfläche.

Das Gradientenindexlinsenfeld 108a kann dem Gradientenindexlinsenfeld 108 entsprechen und beispielsweise eine hohe numerische Apertur NA von etwa 0,6 und sechs Reihen von Linsenelementen übereinander aufweisen, um einen großen vertikalen Erfassungsbereich für Fluoreszenzstrahlung (Objekthöhe) von 3 mm bei voller numerischer Apertur zu gewährleisten. Durch die sich überlagernde aufrechte Abbildung der einzelnen Linsen im Feld ist ein horizontales Alignement der Linsenelemente mit den Photodioden nicht unbedingt erforderlich.

Die Trägerplatine 114a mit den darauf angeordneten Detektorfeldern 102a und die optischen Module 112a sind in einem gemeinsamen Detektormodul entsprechend Fig. 2 mit einem gemeinsamen, abschirmenden Gehäuse aufgenommen und gehalten. Bezugnehmend auf Fig. 1 kann das Detektormodul 90 also fünf Trägerplatinen 114a mit einem jeweiligen Detektorfeld 102a und fünf zugeordnete integrale optische Module 112a aufweisen. Aufgrund des durch die Umlenkprismen 110a erreichten geknickten Strahlengangs wird der minimale vertikale Abstand zwischen den einzelnen Detektionsanordnungen durch die Bauhöhe der Gradientenindexlinsenfelder 108a bestimmt, die etwa 10 mm beträgt. Bei Verwendung von etwa 60 cm langen Glasplatten zur Begrenzung der Gelschicht kann man beispielsweise Separationsdistanzen (Laufstrecke der zu analysierenden Moleküle oder Fragmente) von 46 cm bis zum obersten Detektor bzw. von 50 cm bis zum untersten Detektor erreichen.

Die linearen Detektorfelder können von Silicium-Photodioden gebildet sein, die einen weiten spektralen Empfindlichkeitsbereich aufweisen (siehe Fig. 7). Es können aber auch andere Materialien, beispielsweise Gallium-Arsenid- Phosphit verwendet werden. Letzteres Halbleitermaterial hat den großen Vorteil, daß die spektrale Empfindlichkeit durch Variation der Anteile von Arsenid und Phosphit in einen weiten Bereich verschoben werden kann, um eine spezielle Anpassung an die jeweils zu detektierende Emissionsstrahlung vorzusehen. Überdies ist dieses Material auf thermische Hintergrund- Strahlung im Vergleich zu Silicium relativ unempfindlich. Man könnte auch daran denken, die Pixeldichte der Detektorfelder weiter zu erhöhen, um eine höhere Spurdichte, beispielsweise eine Verdopplung bis Verdreifachung der Spurdichte, zu erreichen.

Die Elektrophorese-Einrichtung in der in Fig. 1 gezeigten Form kann beispielsweise zur Analyse von Molekülen dienen, die durch vier verschiedene Fluoreszenzmarker, beispielsweise FITC, TexasRed™, CY 5.5 und IRD 800, markiert sind (vgl. Fig. 8). Um eine vorzeitige Degradation der Fluoreszenzmarker durch Laserstrahlung zu vermeiden, die eine kürzere Wellenlänge als die zur Anregung jeweils dienende Laserstrahlung aufweist, sind die Laser und die Laserstrahlen derart vertikal gestaffelt, daß entlang der Molekülausbreitungsrichtung M die Anregungswellenlängen zunehmen, daß also die Fluoreszenzmarker-markierten Moleküle zuerst die langwelligste Laserstrahlung von 775 nm, dann die kürzerwelligere Laserstrahlung von 675 nm, dann die Laserstrahlung von 594 nm und schließlich die Laserstrahlung kürzester Wellenlänge von 488 nm durchlaufen. Eine entsprechende Anordnung wird vorzugsweise auch dann vorgesehen, wenn andere Anregungswellenlängen und andere Laserquellen eingesetzt werden.

Grundsätzlich bestehen hinsichtlich der einsetzbaren Fluoreszenzfarbstoffe keine Beschränkungen. Eine Übersicht über zur DNA-Sequenzierung verwendbare Fluoreszenzfarbstoffe mit den Maxima des jeweiligen Anregungs- und Emissionsspektrums und geeignete Anregungs-Lichtquellen ist in Tabelle 1 gegeben.

Tabelle 1

In Verbindung mit einer erfindungsgemäßen Elektrophorese-Einrichtung entsprechend Fig. 1 haben sich vor allem die Farbstoffe CY 2, FITC, Rhodamin 6G, TexasRed™, CY 5, CY 5.5 und IRD 800 bewährt. Für viele Anwendungen wird es ausreichen, wenn die Elektrophorese-Einrichtung hinsichtlich der Ausbildung ihrer Detektoren so ausgelegt ist, daß von den Laser-Farbstoff-Kombinationen nur vier gleichzeitig benutzbar sind. Für einige der in der Tabelle 1 angegebenen Farbstoffe ist die chemische Struktur in Fig. 9 angegeben.

Es ist darauf hinzuweisen, daß die in Fig. 1 gezeigten Anregungs-Laser nur als Beispiel dienen. Tabelle 2 gibt Beispiele von zu DNA-Sequenzierung verwendbaren Anregungslasern mit ihrer Emissionswellenlänge λ_em und hierdurch anregbaren Fluorochromen. In der rechten Spalte der Tabelle ist das Produkt aus dem Extinktionskoeffizienten ε (λ_em) und der Quantenausbeute q (λ_em) des jeweiligen Farbstoffs bei der entsprechenden Anregungswellenlänge λ_em angegeben, das ein Maß für die erzielbare Fluoreszenzausbeute ist. Da die Anregung selektiv im jeweiligen Absorptionsmaximum erfolgt, sind nur geringe Ausgangsleistungen der Laser erforderlich.

Tabelle 2

Eine Übersicht über in einer erfindungsgemäßen Elektrophorese-Einrichtung beispielsweise einsetzbare Lasertypen mit Wellenlängen, Ausgangsleistungen und dem jeweiligen Absorptionsmaximum selektiv anregbarer Fluoreszenz-Farbstoffe ist in Tabelle 3 angegeben. Durch selektive Anregung der Fluorochrome nahe dem jeweiligen Absorptionsmaximum sind nur geringe Laser-Ausgangsleistungen zwischen 3 bis 5 mW erforderlich. Höhere Laserleistungen können sogar schädlich sein, da Effekte wie ein Ausbleichen der Farbstoffe (Photo-bleaching), durch Strahlung induzierte chemische Reaktionen der Farbstoffe mit der Gelmatrix und Veränderung ihres Brechungsindexes sowie eine Erhöhung des Hintergrunds durch Streustrahlung auftreten kann. Überdies erhöht sich die Ausbeute der Fluoreszenz nicht proportional zur Leistung der Anregungs- Lichtquelle, da eine Sättigung durch Entleerung des energetischen Grundzustands der Fluorochrome eintreten kann. Lasertypen, deren Ausgangsleistung nicht oder nur schlecht regelbar ist, können deshalb ggf. beispielsweise durch optische Neutralfilter im Strahlengang abgeschwächt werden.

Tabelle 3

Bezugnehmend auf die Fig. 10 bis 16 sollen nun für die bevorzugt eingesetzten Farbstoffe CY 2, FITC, Rhodamin 6 G, TexasRed, CY 5, CY 5.5 und IRD 800 die spektralen Eigenschaften der zur Detektion der jeweiligen Emissionsstrahlung gemäß dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel eingesetzten Detektoreinheiten, speziell der eingesetzten Spektralfilteranordnungen in Verbindung mit den Eigenschaften des jeweiligen Gradientenindexlinsenfeldes, angegeben werden. Die Verwendung der optischen Strahlungsfilteranordnung ermöglicht es, das Fluoreszenzlicht vom Anregungslicht der Laser sowie teilweise von der Hintergrundfluoreszenz sowie von Rhaleigh- und Raman-Streulicht zu trennen, um so das vergleichsweise deutlich schwächere Fluoreszenzlicht überhaupt nachweisen zu können. Durch selektive Anregung und Detektion der einzelnen Fluoreszenzmarker (Fluorochrome) wird ferner sichergestellt, daß mehrere verschiedenfarbig markierte Moleküle, ggf. DNA-Fragmente, gleichzeitig, aber unabhängig voneinander im gleichen Elektrophorese-Gel analysiert werden können. Die optischen Strahlungsfilter können Bandpaß- Filter, bei denen sich an einen Bereich hoher Transmission (Durchlaßbereich) zu kürzeren und längeren Wellenlängen hin Bereiche mit niedriger Transmission (Sperrbereiche) anschließen oder/und Kantenfilter, bei denen sich an einem Bereich hoher Transmission ein Bereich niedriger Transmission anschließt, oder umgekehrt, aufweisen, wobei als Kantenfilter Langpaß- Filter, bei denen der Durchlaßbereich bei längeren Wellenlängen als der Sperrbereich liegt, oder/und Kurzpaß-Filter, bei denen der Durchlaßbereich bei kürzeren Wellenlängen als der Sperrbereich liegt, zum Einsatz kommen können. Als Bandpaß-Filter werden bevorzugt Interferenzfilter eingesetzt, die mit Absorptions-Kurzpaß- oder/und Absorptions-Langpaß-Filtern kombiniert sein können. Je nach eingesetztem Gradientenindexlinsenfeld kann für optimale Abbildungs-Eigenschaften des optischen Systems die mögliche Gesamtdicke der Filteranordnung auf einen bestimmten Wert, beispielsweise ca. 2 mm, festgelegt sein, wobei aber grundsätzlich auch ein Ausgleich durch Einsatz von Materialien mit entsprechend angepaßtem Brechungsindex möglich ist. Ein besonders einfacher optischer Aufbau, der sich auch einfach justieren läßt, wird dann erreicht, wenn die spektralen Filter für alle Detektoren eine vorgegebene Gesamt-Dicke aufweisen. Die Filterkennlinie der jeweiligen Absorptionsfilter kann dann primär über die für die Herstellung des Absorptionsfilters verwendete Schmelze angepaßt werden. In diesem Zusammenhang ist es zweckmäßig, daß als Substrat für die Herstellung der Interferenzfilter ein jeweiliger Absorptionsfilter verwendet wird. Als Absorptionsfilter können Kurzpaß- und Langpaß-Filter der Firma Schott (Mainz, Deutschland) eingesetzt werden.

Die zentralen Daten der zur Detektion des Fluoreszenzlichts des Fluoreszenzmarkers CY 2 gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel eingesetzten Spektralfilteranordnung sind in der Tabelle der Fig. 10a angegeben. Als Filter wird eine Kombination aus Absorptions-Kurzpaßfilter, Absorptions-Langpaßfilter und Interferenz-Bandpaßfilter eingesetzt mit Kantenwellenlängen λ_C1, λ_C2 von 494 nm und 524 nm für einen Lichteinfallwinkel α = 0° und λ_C1 = 492 nm und λ_C2 = 514 nm für einen einem maximalen Akzeptanzwinkel des Gradientenindexlinsenfeldes entsprechenden Lichteinfallwinkel α = 20°. Als Kantenwellenlänge ist hier jeweils eine eine Transmission von 0,5 (50%) gebende Wellenlänge bezeichnet. Bei der bevorzugt eingesetzten Anregungswellenlänge von 473 nm ist die Transmission der Spektralfilteranordnung kleiner als 10^-4 im Lichteinfallwinkelbereich 0° bis 20°. Für das Emissionsspektrum des Farbstoffs erhält man bei einem Lichteinfallwinkel von 0° für den Wellenlängenbereich 495 bis 515 nm eine Transmission größer als 0,8. Bei einem Lichteinfallwinkel von 20° erhält man eine Transmission größer als 0,8 für den Wellenlängenbereich 490 bis 505 nm. Für Wellenlängen größer als das Emissionsspektrum des Farbstoffes erhält man eine Transmission kleiner als 10^-3 für den Lichteinfallwinkelbereich 0° bis 20°. Fig. 10b zeigt ein Diagramm, das die Transmission der Spektralfilteranordnung für α = 0° und für α = 20° als Funktion der Wellenlänge angibt. Zusätzlich ist das Absorptionsspektrum A und das Emissionsspektrum E des Farbstoffs CY 2 sowie die bevorzugt eingesetzte Anregungswellenlänge 473 nm eingezeichnet. Ferner ist die bevorzugt für die Anregung des Farbstoffs Rhodamin 6G (vgl. Fig. 12) verwendete Anregungswellenlänge von 532 nm eingezeichnet.

Fig. 11 zeigt entsprechende Daten für einen dem Farbstoff FITC zugeordneten Detektor. Die Spektralfilteranordnung umfaßt wiederum bevorzugt einen Absorptions-Kurzpaßfilter, einen Absorptions-Langpaßfilter und einen Interferenz-Bandpaßfilter. Neben einer Anregung mittels eines Argon-Ionen-Lasers mit einer Wellenlänge von 488 nm kommt beispielsweise auch die Verwendung eines frequenzverdoppelten Neodym: YAG-Lasers mit einer Wellenlänge von 473 nm in Betracht.

Die Daten eines dem Farbstoff Rhodamin 6G zugeordneten Detektors sind in Fig. 12 gezeigt. Die Spektralfilteranordnung besteht bevorzugt aus einem Interferenz-Bandpaßfilter und einem Absorptions-Kurzpaßfilter, dessen Transmission in Fig. 12b zusätzlich angegeben ist (Kurve K).

Der Fluoreszenzmarker TexasRed™ kann beispielsweise mittels eines Detektors detektiert weden, dessen spektralen Spezifikationen in Fig. 13 angegeben sind. Die Spektralfilteranordnung ist bevorzugt von einem Interferenz-Bandpaßfilter und einem Absorptions-Langpaßfilter gebildet. Die Transmission des Langpaßfilters ist in Fig. 13b zusätzlich angegeben (Kurve L).

Für die Detektion des vom Farbstoff CY 5 ausgehenden Fluoreszenzlichts kann beispielsweise eine von einem Absorptions-Langpaßfilter und einem Interferenz-Bandpaßfilter gebildete Spektralfilteranordnung eingesetzt werden, deren spektralen Daten in Fig. 14 angegeben sind. Neben einer Anregung mittels eines Helium-Neon-Lasers mit der Emissionswellenlänge von λ = 632,8 nm kommt beispielsweise auch die Anregung mittels eines Halbleiterlasers, beispielsweise mit einer Wellenlänge von 640 nm in Betracht.

Der Farbstoff CY 5.5 kann beispielsweise mittels einer Spektralfilteranordnung detektiert werden, die von einem Absorptions- Langpaßfilter und einem Interferenz-Bandpaßfilter gebildet ist. Die spektralen Daten eines geeigneten Detektors sind in Fig. 15 angegeben. Die Anregung des Farbstoffs CY 5.5 kann beispielsweise mittels einer Laserdiode erfolgen, die bei 675 nm emittiert. Auch eine bei 660 nm emittierende Halbleiter- Laserdiode kommt in Betracht. Der in Fig. 15 spezifizierte Detektor kann auch für die Detektion des Farbstoffes IRD 700 verwendet werden.

Für die Detektion des mit dem Fluorochrom IRD 41 chemisch identischen Farbstoffs IRD 800 kann ein Detektor verwendet werden, dessen spektrale Spezifikationen in Fig. 16 angegeben sind. Die Spektralfilteranordnung kann von einem Absorptions-Langpaßfilter und einem Interferenz-Bandpaßfilter gebildet sein. Eine Anregung des Farbstoffes kann mit einer Laserdiode erfolgen, die beispielsweise bei 775 nm emittiert. Hinsichtlich des Emissionsspektrums (E) in Fig. 16b und dem entsprechenden Spektrum in Fig. 8 ist anzumerken, daß der gezeigte Abfall der Emission zu längeren Wellenlängen hin etwas überzeichnet dargestellt sein dürfte.

Die Anregungs- und Absorptionsspektren der genannten Farbstoffe, die als Beispiele zu verstehenden Durchlaßbereiche der zugeordneten Spektralfilteranordnungen sowie die in Frage kommenden, als Beispiele zu verstehenden Anregungswellenlängen sind im Diagramm der Fig. 17 zusammenfassend dargestellt, wobei von den Absorptionsspektren (A) und den Emissionsspektren (E) jeweils der Bereich einer relativen, auf 1 normierten Signalstärke ≧ 0,2 und für die Spektralfilter jeweils der Durchlaßbereich für den Lichteinfallswinkel α = 0° angegeben ist. Wie man sieht, gibt es spektral breite Überlappungen zwischen den Absorptionsspektren der Farbstoffe sowie zwischen den Emissionsspektren der Farbstoffe. Trotz dieser Überlappungen können durch Einsatz von vier unabhängigen Detektionssystemen vier mit unterschiedlichen Fluoreszenz- Farbstoffen markierte Proben gleichzeitig und unabhängig voneinander detektiert werden, beispielsweise mit den Farbstoffen Fluorescein, TexasRed, CY 5.5 und IRD 800 markierte Proben (vier unterschiedliche Farbstoffe). Ferner lassen sich mittels der für die fünf Farbstoffe CY 2, Rhodamin 6G, TexasRed, CY 5.5 und IRD 800 spezifizierten Detektoreinheiten diese fünf Farbstoffe gleichzeitig und unabhängig voneinander detektieren. Auf Grundlage der Lehre der vorliegenden Erfindung wird der Fachmann auch ohne weiteres eine Elektrophorese- Einrichtung mit fünf oder mehr unabhängigen Detektionssystemen aufbauen können, die für eine andere Farbstoffkombination von fünf Farbstoffen oder für mehr als fünf zugeordnete unterschiedliche Fluoreszenz-Farbstoffe eine gleichzeitige Detektion unabhängig voneinander ermöglicht.

Das Übersprechhalten der vier Detektoren für die Farbstoffe Fluoreszein, TexasRed, CY 5.5 und IRD 800 wurde quantitativ wie folgt bestimmt: Nach Messung des thermischen Untergrunds bei völliger Dunkelheit, also ausgeschalteten Lasern, wurden die den vier Detektoren zugeordneten Laserstrahlen in ein Elektrophoresegel eingekoppelt, auf das keine Proben aufgetragen waren. Die Laser wurden dabei nacheinander mit einem zeitlichen Abstand von etwa 15 Min. eingeschaltet. Die Meßwerte für die Untergrundstrahlung wurden jeweils über 40 Photodioden gemittelt. In der folgenden Tabelle 4 ist der Anstieg der Ausgangsspannung des Detektors in digitalen Einheiten des verwendeten A/D-Wandlers absolut und prozentual (bezogen auf den rein thermischen Strahlungsuntergrund) angegeben. Der von dem dem jeweiligen Detektor zugeordneten Laser verursachte Anstieg ist in der Tabelle durch Fettschrift hervorgehoben.

Tabelle 4

Bei weiteren Versuchen zeigte sich, daß der Anstieg des Strahlungsuntergrunds (maximal 34% beim Detektor für CY 5.5) zeitlich konstant ist und sich im Verlauf des Elektrophoresebetriebs nicht ändert. Dieser Anstieg kann somit rechnerisch als konstanter Untergrund vom Elektrophorese-Nutzsignal substrahiert werden, so daß der Einfluß der durch die Lasereinstrahlung erhöhten Untergrundstrahlung auf das Signal-zu- Rausch-Verhältnis des jeweiligen Detektors und damit auf das Trennvermögen des Systems weitgehend vernachlässigt werden kann.

Um mögliche Einstrahlungen des Fluoreszenz-Emissionslichtes der Farbstoffe in die nicht ihnen zugeordneten Detektoren zu untersuchen, wurde für die vier Farbstoffe je ein Sequenzierungslauf mit Proben durchgeführt, die mit nur diesem einen der vier Farbstoffe markiert waren. Es wurden markierte Primer verwendet. Während des Sequenzierungslaufs wurden auch die Signale der jeweils nicht korrespondierenden Detektoren aufgezeichnet. Die stärksten Signale traten am Anfang jedes Sequenzierungslaufs beim Durchlaufen der Primer durch die Laserstrahlen auf. In allen Fällen konnte nur dieses Durchlaufen der Primer in den jeweils anderen Detektoren erkannt werden, nicht aber das Durchlaufen der eigentlichen Sequenzierungsprodukte. Es traten also keinerlei nachweisbaren Interferenzen im Bereich der eigentlichen Sequenzsignale auf. Die spektrale Trennschärfe des Detektorsystems reichte also aus, die mit verschiedenen Farbstoffen markierten DNA-Proben gleichzeitig, aber unabhängig voneinander zu analysieren.

In Tabelle 5 und Tabelle 6 sind Ergebnisse zum Auflösungsvermögen des Detektionssystems hinsichtlich der Abstände der Elektrophorese-Bahnen (Spuren) und dem Separationsabstand gezeigt.

Tabelle 5

Tabelle 6

Tabelle 5 zeigt, daß das erzielbare Auflösungsvermögen weitgehend unabhängig vom Abstand der Spuren auf dem Elektrophorese-Gel ist, solange das Nyquist-Abtast-Theorem eingehalten wird, das wenigstens zwei Pixel (beim vorliegenden Ausführungsbeispiel von Photodioden gebildet) pro Spur verlangt. Tabelle 6 macht deutlich, daß eine Verdopplung der Separationsdistanz von 21 cm auf 42 cm durch Einsatz von 60 cm langen thermostatisierten Glasplatten einen erheblichen Vorteil bringt, nämlich eine Erhöhung der durchschnittlichen Anzahl gelesener Basen um 40%, so daß bei 60 cm langen Gels in einem Lauf über 1200 Basen gelesen wurden. Zu berücksichtigen ist allerdings, daß der Strahldurchmesser im Elektrophorese- Gel in Strahlausbreitungsrichtung nicht konstant ist. Idealerweise wird die Strahltaille des Laserstrahls in die Mitte des Gels gelegt, so daß hier die höchste Auflösung zu erwarten ist. Zu den Rändern hin nimmt die Auflösung dann entsprechend dem Strahldurchmesser und dem Divergenzwinkel des Laserstrahls ab. Im Durchschnitt wurden Leselängen von über 800 Basen erreicht.

Im folgenden werden Beispiele für die Analyse von Nukleinsäuren unter Einsatz einer erfindungsgemäßen Elektrophorese-Einrichtung gegeben:

Beispiel 1 1.1 Material und Methoden Primerdesign und Synthese

Als Primer wurden entweder Standardprimer (UPO, UP-40, RPO, T7, T7term) oder die im folgenden angegebenen spezifischen Primer 1 bis 8 eingesetzt. Als Matrizen wurden für die jeweiligen Primer passende Vektoren mit zu sequenzierenden Inserts verwendet. Als Markierungen wurden die Fluoreszenzfarbstoffe Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC), Texas­ Red(TR), CY 5.5 und IRD 800 verwendet.

Die Sequenzen und Markierungen der verwendeten Primer sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.

Tabelle 7

Sequenzierprotokolle

Alle, Sequenzierungsreaktionen wurden als Thermocycling-Reaktionen (Murray et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989), 8889) unter Verwendung eines Thermocycler (MJ Research, PTC-200) mit dem folgenden Profil durchgeführt: 25 oder 40 Zyklen bei 97°C für 15 sec, 55°C für 30 sec, 68°C für 60 sec bzw. 30 sec.

Die Protokolle für die Reaktionen (Anzahl Primer - Anzahl Matrizen - Anzahl Reaktionsgefäße) waren wie folgt:

Tandem-Duplex-Reaktion (4-2-1)

3 µl DNA-Matrize 1 (1 µg/µl) wurden mit 2 µl DNA-Matrize 2 (0,5 µg/µl) und jeweils 3 µl der Primer FITC-T7term (4 µM), TR-T7, CY 5.5-RPO und IRD 800-UPO (jeweils 2 µM), 2,1 µl 10 × Cyclingpuffer, 3 µl AmpliTaqFS (Applied Biosystems) und 1,9 µl Wasser vermischt. Das Gemisch wurde in vier Aliquots (jeweils 5 µl) unterteilt. 3 µl der jeweiligen Terminationsmischung (A, C, G, T) wurden in die einzelnen Aliquots gegeben. Dann wurde das Thermocycling gestartet. Nach 25 Zyklen wurden 1 µl Stopp-Lösung zu jeder Reaktion gegeben und das Volumen während einer Denaturierung bei 95°C für etwa 10 min um etwa die Hälfte verringert. Dann wurde der Ansatz auf Eis gestellt.

Quadruplex-Reaktion (4-4-1)

2 µl DNA-Matrize 1 (0,5 µg/µl) wurden mit 3 µl DNA-Matrize 2 (0,3 µg/µl), 5 µl DNA-Matrize 3 (0,2 µg/µl), 3 µl DNA-Matrize 4 (0,3 µg/µl) und jeweils 1 µl der Primer 1 bis 4 (jeweils 5 µM), 2,4 µl 10 × Cyclingpuffer, 3 µl AmpliTaqFS und 1,5 µl DMSO vermischt. Das Gemisch wurde in vier Aliquots (jeweils 5 µl) unterteilt und 3 µl der jeweiligen Terminationsmischung (A, C, G, T) wurden in die einzelnen Aliquots pipettiert. Dann wurde das Thermocycling gestartet. Nach 25 Zyklen wurde 1 µl Stopp-Lösung zu jeder Reaktion zugegeben und das Volumen während einer Denaturierung bei 95°C für etwa 10 min um etwa die Hälfte verringert. Dann wurden die Ansätze auf Eis gestellt.

Sequenzlücken-Auffüllreaktion (4-1-1)

1,5 µl DNA-Matrize 1 (0,7 µg/µl) wurden mit jeweils 2 µl der Primer 5 bis 8 (jeweils 2 µM), 2,1 µl 10 × Cyclingpuffer, 3 µl AmpliTaqFS, 1,5 µl DMSO und 4,9 µl Wasser vermischt. Die Mischung wurde in vier Aliquots (jeweils 5 µl) unterteilt und 3 µl der jeweiligen Terminationsmischung (A, C, G, T) wurden in die einzelnen Aliquots pipettiert. Dann wurde das Thermocycling gestartet. Nach 25 Zyklen wurde 1 µl Stopp-Lösung zu jeder Reaktion gegeben und das Volumen wurde während einer Denaturierung bei 95°C für etwa 10 min um etwa die Hälfte verringert. Dann wurden die Ansätze auf Eis gestellt.

Kompetierende Tandem-Duplex-Reaktion (4-1-1)

4 µl DNA Matrize 1 (1 µg/µl) wurden mit jeweils 2 µl Primern (FITC-RP, TR- 40, RPO-CY 5.5, IRD 800-40, jeweils 2 µM), 2,0 µl 10 × Cyclingpuffer, 3 µl AmpliTaqFS und 3 µl Wasser vermischt. Das Gemisch wurde in vier Aliquots (jeweils 5 µl) unterteilt und 3 µl der jeweiligen Terminationsmischung (A, C, G, T) wurden jeweils in die einzelnen Aliquots pipettiert. Dann wurde das Thermocycling gestartet. Nach 40 Zyklen (Extension bei 68°C für 60 sec) wurde 1 µl Stopp-Lösung zu jedem Reaktionsansatz gegeben und das Volumen wurde während einer Denaturierung bei 95°C für etwa 10 min auf etwa die Hälfte verringert. Dann wurden die Ansätze auf Eis gestellt.

Entsprechende Ergebnisse wurden auch mit den Reagenzien des kommerziellen Cycle-Sequenzierkits der Fa. Applied Biosystems (TaqFS Dye Primer Cycle Sequencing Kit) erzielt.

1.2 Automatisierte DNA-Sequenziervorrichtung

Zur Anregung der vier Fluoreszenzfarbstoffe wurden vier Laser mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen verwendet, die entsprechend dem jeweiligen Absorptionsspektrum des Fluoreszenzfarbstoffs ausgewählt worden waren. Die Lasertypen und -leistungen sind in der folgenden Tabelle 8 dargestellt.

Tabelle 8

Die Laser wurden in das Gel über eine einzige Kopplungsplatte an vier unterschiedlichen Positionen mit einem vertikalen Abstand von jeweils 10 mm zwischen den Strahlen eingekoppelt. Eine Feineinstellung der Strahlposition erfolgte individuell für alle vier Laser durch eine motorisierte optische Bühne.

Gemäß den Emissionsspektren der vier Fluoreszenzfarbstoffe wurden optische Bandpassfilter für die optimale Transmission der jeweiligen Emissionslichtspektren und die maximale Unterdrückung von gestreutem Anregungslaserlicht sowie von Infrarot-Hintergrund aufgrund von Glas- und Gelfluoreszenz ausgewählt. Die hohe Selektivität des Transmissionsprofils wurde durch eine Kombination von Absorptions- und Mehrschicht- Interferenzfiltern erreicht (Schott, Mainz, Deutschland).

Das Licht wurde gesammelt und durch ein optisches System, welches ein räumlich kontinuierliches und aufrechtes Bild, hohe Auflösung und eine hohe nomerische Apertur (d. h. minimalen Photonenverlust) ergibt, auf die Detektoren fokussiert. Zum Sammeln und Abbilden von Fluoreszenzlicht wurde ein Gradientenindex-Linsenarray (Nippon Sheet Glass Company, Japan) verwendet.

Die Detektion des Fluoreszenzlichts erfolgte mittels vier übereinander gestapelten Detektorarrays (Hamamatsu Photonics, Japan), auf die durch ein jeweiliges Gradientenindexlinsenarray das Fluoreszenzlicht abgebildet wurde (vgl. die obigen Ausführungen zum Ausführungsbeispiel der Elektrophorese-Einrichtung).

1.3 Gelelektrophorese

Die Auftrennung der Produkte der Sequenzierreaktionen erfolgte auf 5,0% oder 4,3% Hydrolink Long R 16894 00070 552 001000280000000200012000285911678300040 0002019948391 00004 16775anger denaturierenden Gels (AT Biochem, Malvern, PA, USA) mit 42% Harnstoff. Lauf- und Gelpuffer waren 1,2 × TBE. 100 ml Gellösung wurden durch Zugabe von 84,5 µl N,N,N',N'- Tetramethylethylendiamin (TEMED) und 650 µl 10% Ammoniumperoxodisulfat (APS) Lösung in Wasser polymerisiert. Die Gels waren 0,30 mm dick. Die Temperatur war 45°C. Die Auftrennung erfolgte über eine Strecke von etwa 50 cm unter Verwendung von 60 cm langen und 34 cm breiten Glasplatten. Die Elektrophorese wurde mit einer Leistung von 60 W und einer Anfangsspannung von etwa 1500 V durchgeführt.

Die Sequenzen aller vier unterschiedlich markierten Reaktionsprodukte mit einer einzigen Gelbahn wurden online detektiert und in einem Computer aufgezeichnet. Die Auswertung erfolgte automatisch nach Ende des Laufs unter Verwendung der Software-Pakete Lanetracker und Geneskipper (EMBL, Schwager et al.).

1.4 Gelbeladung

Zur Handhabung der großen Anzahl von Proben und der gleichzeitigen Beladung der 120 Spuren eines Gels wurden Kämme aus porösem Filtermaterial und ein Robotsystem (Beckman Biomek 2000) eingesetzt. Dieses Verfahren ist im einzelnen bei Erfle et al. (Nucleic Acids Res. 25 (1997), 2229-2230) beschrieben und beinhaltet das Beladen der Vertiefungen eines Polyacryl (Plexiglas)-Blocks mit der Probensuspension durch einen Pipettierroboter. Durch Eintauchen der Zähne des Kamms in die Taschen des Plexiglasblocks absorbiert das poröse Material die Probenflüssigkeit durch Kapillarwirkung. Der die Proben enthaltende Kamm wird dann zwischen den Glasplatten direkt oberhalb des geraden Rands des polymerisierten Gels eingesetzt. Bei Anlegen des elektrischen Felds werden die Proben aus dem Kamm und in das Gel gezogen.

Jeweils 0,6 µl der Sequenzierproben wurden mit dieser Technik auf den Kamm geladen. Zusätzlich wurden als Kontrolle vier Standard- Sequenzierungsreaktionen (4-4-4) und zwei Duplex- Sequenzierungsreaktionen (4-2-2) in separaten Reaktionsgefäßen durchgeführt, vorgemischt und auf den Kamm geladen oder ohne Vormischen aller vier Reaktionen separat auf dieselben Zähne des Kamms geladen. Dabei wurden identische Ergebnisse wie bei den zuvor beschriebenen Protokollen erhalten.

1.5 Ergebnisse

Das Fluoreszenz-Quadruplex-Sequenzierverfahren erlaubt die Anwendung unterschiedlicher Strategien. So wurden vier verschiedenen Matrizen in einem Reaktionsgefäß unter Verwendung vier unterschiedlich markierter Primer (4-4-1), zwei verschiedene Matrizen mit einer Tandem-Duplex- Sequenzreaktion in zwei Richtungen und vier verschieden markierten Primern in einem Gefäß (4-2-1) sowie Sequenzlücken-Auffüllungsreaktionen unter Verwendung von vier "Walking-Primern" zum gleichzeitigen Schließen von vier Lücken auf derselben Matrize in einem Gefäß (4-1-1) erfolgreich durchgeführt.

Bei einer Auflösung von 1000 Basen pro Strang konnten durch die beschriebenen Techniken etwa 4000 Basen pro Sequenzierungsreaktion bestimmt werden. Dies bedeutet, daß 120 Sequenzierungsreaktionen auf einem einzigen Gel aufgetrennt werden können, wodurch 120 kb Information pro Gel erhalten werden.

Die Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe und das Sammeln von Emissionslicht erfolgte dabei kontinuierlich über die Breite des Gels und kontinuierlich über die gesamte Laufdauer. Jeder Farbstoff konnte selektiv angeregt und detektiert werden. Die Genauigkeit und die lesbare Sequenzlänge zeigten keinen Unterschied gegenüber Standard- Sequenzierungsreaktionen.

Das mittels der erfindungsgemäßen Elektrophorese-Einrichtung durchführbare Fluoreszenz-Quadruplex-Sequenzierverfahren ist auch für innere Markierungen oder Farbstoff-markierte Terminatoren geeignet.

Beispiel 2

Mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll wurden gleichzeitig 192 Sequenzierungsreaktionen (d. h. 48 Sequenzierungsreaktionen an jeweils unabhängigen Klonen) auf einem einzigen Gel aufgetrennt. Dabei konnten 155 kb oder mehr Informationen pro Gel erhalten werden.

Beispiel 3

Der in Beispiel 1 verwendete Farbstoff FITC wurde durch 5-Carboxy- Rhodamin 6 G ersetzt. Statt des Argon-Lasers wurde ein Neodym-YAG-Laser mit einer Emissionswellenlänge von 532 nm und einer Leistung von 5 bis 10 mW eingesetzt. Auch hier war eine selektive Anregung und selektive Detektion von vier Farbstoffen auf einer Gelbahn möglich.

Beispiel 4

Zusätzlich zu der in Beispiel 3 beschriebenen Farbstoffkombination wurde der Farbstoff CY 2 verwendet. Als Anregungslichtquelle diente ein Neodym- YAG-Laser mit einer Wellenlänge von 473 nm und einer Leistung von 5 bis 10 mW.

Es wurde gefunden, daß eine selektive Anregung und selektive Detektion auch bei gleichzeitiger Verwendung von fünf Fluoreszenzfarbstoffen auf einer Gelbahn möglich ist.

Im folgenden wird die Erfindung hinsichtlich weiterer Aspekte auf Grundlage von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Zum Temperieren des Gels kann eine erfindungsgemäße Elektrophorese- Einrichtung eine thermostatisierbare Platte von der Art aufweisen, wie sie als Beispiel in Fig. 6 gezeigt ist. Die Fig. 6 entspricht der Fig. 1 der schon in Bezug genommenen DE 30 46 729 C2. Die thermostatisierbare Platte 16b besteht aus einer unteren Glasplatte 112 und einer oberen Glasplatte 214, die parallel übereinander angeordet sind und von einem mehrteiligen Abstandsstreifen 216 in definiertem Abstand voneinander gehalten werden. Die beiden Glasplatten 212 und 214 haben vorzugsweise den gleichen Umriß, können jedoch unterschiedliche Dicken aufweisen, beispielsweise 3 mm für die untere Glasplatte 212 und 1,5 mm für die obere Glasplatte 214, die mit der Gelschicht in Berührung steht. Die außenliegende Oberseite der oberen Glasplatte 214 kann vorbehandelt sein, um gelabstoßend ausgebildet zu sein und so das Ablösen der an der Oberseite zur Anlage kommende Gelschicht zu erleichtern. Die beiden Glasplatten bestehen ebenso wie der mehrteilige Abstandsstreifen 216 aus Spiegel-Glas oder Floated-Glas, um eine hohe Planizität zu gewährleisten.

Der Abstandsstreifen 216 läuft entlang des rechteckigen Umrisses der Glasplatten 212 und 214. Er besteht aus zwei in Fig. 1 von oben nach unten verlaufenden sechs Abschnitten, von denen der linke mit 220 und der rechte mit 222 bezeichnet ist, sowie aus zwei deren Enden verbindenden Querabschnitten 224 und 226.

Der Abstandsstreifen 216 ist in sich geschlossen und schließt daher einen Innenraum 228 zwischen den Glasplatten 212 und 214 ein. Um durch den Innenraum 218 Wärmeaustauschermittel, z. B. über eine gesonderte Thermostatheizung erwärmtes Wasser bzw. von der Wärmebad- und Pumpenanordnung 28, 30 (Fig. 1) stammendes Wasser, leiten zu können, sind zwei Anschlüsse vorgesehen, ein Zulaufanschluß 230 und ein Ablaufanschluß 232. Die Zulaufanschlüsse sind mittels des zum Einkleben verwendeten Klebstoffs dicht in den Abstandsstreifen 216 integriert.

Im Innenraum 228 sind mehrere Leitstreifen 240 eingesetzt, um einen mäanderförmigen (zickzackförmigen oder schlangenförmigen) Durchflußweg 238 für das Wärmeaustauschermedium zu erreichen. Zwischen den Leitstreifen 240 verläuft die Strömungsrichtung C des Wärmeaustauschermittels bevorzugt senkrecht zur Molekülausbreitungsrichtung M, die in der Darstellung der Fig. 6 in Abweichung von der Darstellung in Fig. 1 von unten nach oben verläuft. Die thermostatisierbare Platte kann für den Einsatz bei der Elektrophorese für eine Auftrennung in vertikaler Richtung von oben nach unten nach Wunsch ausgerichtet angeordnet werden. Die Leitstreifen 240 können aus Glas oder - alternativ - aus gut wärmeleitendem Material, z. B. Kupfer, bestehen. Durch letzteres kann die Temperaturkonstanz in Querrichtung zur Molekülausbreitungsrichtung M verbessert werden.

Eine modifizierte Ausführungsform der thermostatisierbaren Platte ist in Fig. 18 gezeigt. Die hier gezeigte thermostatisierbare Platte 16c weist in Querrichtung durchgehende Leitstreifen 240' auf, die den Innenraum 228' in sieben voneinander getrennte Durchflußbereiche 239' unterteilen. Zusätzlich zu den Anschlüssen 230' und 232' sind weitere Anschlüsse 234' vorgesehen, so daß jeder Durchflußbereich 239' einen Zulaufanschluß und einen Ablaufanschluß aufweist. Entlang der Molekülausbreitungsrichtung M unmittelbar aufeinanderfolgende Anschlüsse können paarweise miteinander verbunden werden, um einen mäanderförmigen Durchlauf des Wärmeaustauschermittels durch die Platte wie beim Ausführungsbeispiel der Fig. 6 zu erreichen. Alternativ kann man jedem Durchflußbereich 239' Wärmeaustauschermedium mit unterschiedlich eingestellter Temperatur zuführen, um einen Temperaturgradienten in der Thermostatisierplatte 16c entlang der Molekülausbreitungsrichtung M einzustellen. So kann beispielsweise ein rechts der Platte 16c schematisch angedeutetes Temperaturprofil T eingestellt werden, nach dem die Temperatur der Platte und damit der angrenzenden Gelschicht in Molekülausbreitungsrichtung M ansteigt, während in Querrichtung im wesentlichen konstante Temperatur herrscht. Es kann sich um ein linear oder auch parabelförmig ansteigendes Temperaturprofil handeln. Bei 60 cm langen Platten hat sich ein Temperaturanstieg über einige Grad, beispielsweise 2 bis 10°, längs der Platte in Molekülausbreitungsrichtung als vorteilhaft herausgestellt, um über eine Beeinflussung der Viskosität des Gels eine Art Fokussierungseffekt für die sich in Molekülausbreitungsrichtung M bewegenden Banden zu erreichen. Dieser Fokussierungseffekt basiert darauf, daß sich die vorderen Flanken der Banden von einem Bereich höherer Mobilität in einen Bereich niedrigerer Mobilität bewegen. Durch diese Fokussierung wird zumindest in einem gewissen Ausmaß die naturgemäß bei der Elektrophorese auftretende Bandendiffussion kompensiert, und es lassen sich höhere Auflösungen und längere Sequenzleselängen erreichen.

Die thermostatisierbare Platte ermöglicht die Einstellung verschiedenster Temperaturprofile, beispielsweise auch ein Temperaturprofil mit in Molekülausbreitungsrichtung zunehmender Temperatur. Ferner kann es vorteilhaft sein, in einem Anfangsbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen eine lokal erhöhte Temperatur vorzusehen, um damit stärker denaturierende Bedingungen für die DNA zu schaffen.

Die Detektion der Banden mittels wenigstens eines Laserstrahls kann dadurch unterstützt werden, daß im vom Laserstrahl geschnittenen Bereich des Gels eine Temperaturüberhöhung, also eine lokal höhere Temperatur, eingestellt wird. Dies führt zu einer gezielten Verbreiterung der Banden und Erhöhung des Bandenabstands, was eine bessere Detektierbarkeit der Banden ergibt.

Es wurde gefunden, daß sich ein die Fokussierung bewirkender Temperaturgradient in Molekülausbreitungsrichtung auch auf andere Weise unter Einsatz einer thermostatisierbaren Platte wie in Fig. 6 gezeigt, erreichen läßt auf Grundlage einer speziellen Betriebsweise für die thermostatisierbare Platte. Nach dieser Betriebsweise wird die vertikal in einem Gehäuse angeordnete thermostatisierbare Platte zuerst mittels des Wärmeaustauschermittelkreislaufs auf eine vorgegebene Temperatur, beispielsweise 45°C erwärmt, um denaturierende Bedingungen im Gel zu schaffen und das Gel gleichmäßig zu erwärmen, um die Voraussetzungen für einen gleichmäßige und parallele Migration der zu analysierenden Moleküle im Gel zu schaffen. Anschließend wird der Wärmetauschermittelkreislauf durch die thermostatisierbare Platte unterbrochen, beispielsweise durch Abkopplung der Platte vom Wasserbad. Hierdurch wird zum einen erreicht, daß durch Druckschwankungen des Wärmeaustauschermittels induzierte Vibrationen der Thermostatisierplatte eliminiert werden, die zu Nichtplanaritäten der Thermostatisierplatte führen und damit über eine Modifikation der Laserstrahlführung im Gel, insbesondere zusätzliche Reflexionen des jeweiligen Laserstrahls an dem Glas der Thermostatisierplatte, eine Erhöhung des Hintergrund- Strahlungsuntergrunds (zusätzliches Streulicht oder/und zusätzliches Fluoreszenzlicht aufgrund einer Eigenfluoreszenz des Glases) bewirkt, wodurch das Signal-zu-Rausch-Verhältnis verschlechtert wird und damit die Sequenzleselänge begrenzt wird. Ferner stellt sich aufgrund eines Wärmeaustausches mit der Umgebung der thermostatisierbaren Platte im umgebenden Gehäuse der Elektrophorese-Einrichtung (in Fig. 1 nicht dargestellt), speziell der Umgebungsatmosphäre, sowie ggf. aufgrund einer Konvektion der umgebenden Atmosphäre oder/und des Wärmeaustauschermediums in der Platte ein Temperaturgradient in Molekülausbreitungsrichtung M ein, wobei sich eine höhere Temperatur am oberen Ende des Gels, also am Anfang der Gel-Elektrophorese-Bahnen und eine niedrigere Temperatur am unteren Ende des Gels, also am Ende der Gel-Elektrophorese-Bahnen, sich einstellt. Trotz der Unterbrechung des Wärmeaustauschermediumkreislaufs wird das allgemeine Temperaturniveau, vom Temperaturgradienten abgesehen, zumindest in einem gewissen Ausmaß aufrechterhalten aufgrund der während der Elektrophorese im Gel sich entwickelten Joule'schen Wärme, so daß die denaturierenden Bedingungen im Gel aufrechterhalten bleiben. Auf diese Weise kann auch unter Einsatz einer thermostatisierbaren Platte wie in Fig. 6 gezeigt, ein um einige Grad in Molekülausbreitungsrichtung abfallendes Temperaturprofil erreicht werden, um den erläuterten Fokussierungseffekt zu erreichen.

Durch entsprechende Anordnung der Thermostatisierplatte und ggf. zusätzliche Abschirmungsmaßnahmen können auch andere Temperaturprofile, ggf. mit einer lokalen Temperaturüberhöhung in wenigstens einem Gel-Querbereich, erreicht werden.

Eine Art Fokussierungseffekt kann auch auf Grundlage eines Temperaturprofils mit einem Temperaturgradienten in einer einer Dicke der Gelschicht entsprechenden Richtung erhalten werden. Auf Grundlage der im Gel bei der Elektrophorese entstehenden Joule'schen Wärme sowie beispielsweise zweier thermostatisierbaren Platten 16d1 und 16d2, zwischen denen die Gelschicht 12d angeordnet ist (vgl. Fig. 19a), kann ein Temperaturgradient in der genannten Richtung eingestellt werden entsprechend einem Temperaturprofil, bei dem die Temperatur in der Mitte des Gels maximal ist und zu den thermostatisierbaren Platten hin abnimmt. Ein entsprechendes Temperaturprofil ist als Beispiel in Fig. 19b gezeigt. Da die migrierenden Moleküle sich in einem Bereich höherer Mobilität, also geringerer Viskosität konzentrieren, kommt es zu einer Ansammlung der Moleküle gleichen Molekulargewichts (gleicher Fragmentlänge) in einem mittleren Bereich der Gelschicht, wodurch störende Effekte an der Grenzschicht zwischen benachbarten Glasplatten und dem Gel vermindert werden. Hierdurch wird ebenfalls ein Fokussierungseffekt im Bezug auf die migrierenden Banden erreicht. Man kann einen Temperaturgradient sowohl in Molekülausbreitungsrichtung M als auch in der der Geldicke zugeordneten Richtung vorsehen. Alternativ kann man einen Temperaturgradienten nur in Molekülausbreitungsrichtung M oder nur in der der Geldicke zugeordneten Richtung vorsehen.

Die Erfindung betrifft eine Elektrophorese-Einrichtung zum Analysieren von Fluoreszenzmarker-markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, die nach einem Aspekt der Erfindung dafür geeignet ist, mindestens vier verschiedene Fluoreszenzmarker unabhängig voneinander mittels eines jeweils zugeordneten Detektorfeldes nach der jeweiligen Gel- Elektrophorese-Bahn und dem jeweiligen Fluoreszenzmarker aufgelöst zu detektieren. Hierzu sind Spektralfilter hinsichtlich ihrer spektralen Selektivität, die Fluoreszenzmarker hinsichtlich ihrer spektralen Absorptions- und Emissionsselektivität und die Wellenlängen der zur Anregung der Fluoreszenzmarker eingesetzten Laserstrahlen in entsprechender Weise aufeinander abgestimmt.

Claims (98)

1. Elektrophorese-Einrichtung (10) zum Analysieren von Fluoreszenzmarker-markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, umfassend:

• - eine Mehrzahl von im wesentlichen parallel zueinander und längs einer Molekülausbreitungsrichtung (M) verlaufenden Gel- Elektrophorese-Bahnen (12),
• - eine Energiequelle (20) zum Anlegen eines elektrischen Potentials an einem Anfangsbereich und einem Endbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen (12),
• - eine Laseranordnung (50, 52, 54, 56) zum Anregen einer Mehrzahl von verschiedenen, den Molekülen zugeordneten Fluoreszenzmarkern, von denen wenigstens einige voneinander verschiedene Absorptions-Wellenlängenbereiche (A) oder/und voneinander verschiedene Emissions-Wellenlängenbereiche (E) aufweisen,
  wobei die Laseranordnung im Elektrophoresebetrieb Laserstrahlung erzeugt, die als im wesentlichen quer zu der Molekülausbreitungsrichtung und im wesentlichen parallel zueinander verlaufende und in Molekülausbreitungsrichtung gegeneinander versetzte Laserstrahlen (60, 62, 64, 66) wenigstens mehrere der Gel-Elektrophorese-Bahnen (12) schneidet, um in einem Detektionsbereich der jeweiligen Gel- Elektrophorese-Bahn zugeordnete Fluoreszenzmarker der dort vorhandenen Moleküle anzuregen,
• - eine Erfassungsanordnung (90) zur Gel-Elektrophorese-Bahn- aufgelösten und Fluoreszenzmarker-aufgelösten Erfassen von von den angeregten Fluoreszenzmarkern ausgehender Emissionsstrahlung,

wobei die Erfassungsanordung eine Mehrzahl von in Molekülausbreitungsrichtung gegeneinander versetzten und sich vorzugsweise im wesentlichen parallel zu den Laserstrahlen erstreckenden Detektorfeldern (102; 102a) aufweist, die jeweils einem bestimmten der Laserstrahlen zugeordnet sind und dafür ausgebildet sind, längs einer dem jeweiligen Laserstrahl zugeordneten, vorzugsweise zu diesem im wesentlichen parallelen Detektionsstrecke wenigstens einen Teil der in den Detektionsbereichen aufgrund der Anregung durch den jeweiligen Laserstrahl entstehenden, über eine jeweils zugeordnete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung (106, 108; 112a) zum Detektorfeld geführten Emissionsstrahlung ortsaufgelöst zu erfassen,
wobei die Spektralfilteranordnung (106; 106a, 107) hinsichtlich ihrer spektralen Selektivität, die Fluoreszenzmarker hinsichtlich ihrer spektralen Absorptions- und Emissionsselektivität, und die Wellenlängen der Laserstrahlen derart aufeinander abgestimmt sind, daß unter Einsatz von wenigstens vier Laserstrahlen und von wenigstens vier Detektorfeldern wenigstens vier verschiedene Fluoreszenzmarker unabhängig voneinander mittels eines jeweils zugeordneten Detektorfeldes nach der jeweiligen Gel- Elektrophorese-Bahn und dem jeweiligen Fluoreszenzmarker aufgelöst detektierbar sind.

2. Elektrophorese-Einrichtung (10) zum Analysieren von Fluoreszenzmarker-markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, umfassend:

• - eine Mehrzahl von im wesentlichen parallel zueinander und längs einer Molekülausbreitungsrichtung (M) verlaufenden Gel- Elektrophorese-Bahnen (12),
• - eine Energiequelle (20) zum Anlegen eines elektrischen Potentials an einem Anfangsbereich und einem Endbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen (12),
• - eine Laseranordnung (50, 52, 54, 56) zum Anregen einer Mehrzahl von verschiedenen, den Molekülen zugeordneten Fluoreszenzmarkern, von denen wenigstens einige voneinander verschiedene Absorptions-Wellenlängenbereiche (A) oder/und voneinander verschiedene Emissions-Wellenlängenbereiche (E) aufweisen,
  wobei die Laseranordnung im Elektrophoresebetrieb Laserstrahlung erzeugt, die als im wesentlichen quer zu der Molekülausbreitungsrichtung verlaufende Laserstrahlen (60, 62, 64, 66) wenigstens mehrere der Gel-Elektrophorese- Bahnen (12) schneidet, um in einem Detektionsbereich der jeweiligen Gel-Elektrophorese-Bahn zugeordnete Fluoreszenzmarker der dort vorhandenen Moleküle anzuregen, wobei wenigstens einige der Laserstrahlen (60, 62, 64, 66) räumlich gegeneinander versetzt sind oder/und in gegeneinander versetzten Zeitfenstern auftreten oder/und wobei wenigstens ein Laserstrahl zur Ermöglichung einer phasenempfindlichen Detektion moduliert ist oder/und wobei wenigstens einige der Laserstrahlen voneinander verschiedene Wellenlängen aufweisen,
• - eine Erfassungsanordnung (90) zum Gel-Elektrophorese-Bahn- aufgelösten und Fluoreszenzmarker-aufgelösten Erfassen von von den angeregten Fluoreszenzmarkern ausgehender Emissionsstrahlung,
  wobei die Erfassungsanordung wenigstens ein sich vorzugsweise im wesentlichen parallel zu den Laserstrahlen erstreckendes Detektorfeld (102; 102a) aufweist, das dafür ausgebildet ist, längs einer dem Laserstrahl zugeordneten, vorzugsweise zu diesem im wesentlichen parallelen Detektionsstrecke wenigstens einen Teil der in den Detektionsbereichen aufgrund der Anregung durch den jeweiligen Laserstrahl entstehenden, über eine zugeordnete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung (106, 108; 112a) zum Detektorfeld geführten Emissionsstrahlung ortsaufgelöst zu erfassen,
  wobei die Spektralfilteranordnung (106; 106a, 107) hinsichtlich ihrer spektralen Selektivität, die Fluoreszenzmarker hinsichtlich ihrer spektralen Absorptions- und Emissionsselektivität, und die Wellenlängen der Laserstrahlen derart aufeinander abgestimmt sind, daß unter Einsatz von wenigstens vier Laserstrahlen wenigstens vier verschiedene Fluoreszenzmarker unabhängig voneinander nach der jeweiligen Gel-Elektrophorese-Bahn und dem jeweiligen Fluoreszenzmarker aufgelöst detektierbar sind.

3. Einrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Laserstrahlung selektiv anregbare Fluoreszenzmarker mit sich überlappenden Emissionsspektren (E) voneinander unterscheidbar sind aufgrund einer räumlich oder/und zeitlich getrennten Laserstrahlanregung oder/und aufgrund unterschiedlicher Wellenlängen der Laserstrahlen (60, 62, 64, 66) oder/und aufgrund einer phasenempfindlichen Detektion bei Anregung mit modulierter Laserstrahlung oder/und daß durch die Laserstrahlung selektiv oder nicht-selektiv anregbare Fluoreszenzmarker mit zumindest teilweise sich nicht-überlappenden Emissionsspektren (E) unterscheidbar sind aufgrund spektral selektiver Detektion der Emissionsstrahlung und ggf. räumlich getrennter Laserstrahlanregung.

4. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlängen der Laserstrahlen (60, 62, 64, 66) oder/und Spektralfilter (106; 106a, 107a) der Spektralfilteranordnungen auf wenigstens vier verschiedene Fluoreszenzmarker abgestimmt sind, deren Absorptionsmaxima unter Elektrophorese-Betriebsbedingungen wenigstens jeweils 30 nm, vorzugsweise jeweils wenigstens 50 nm voneinander entfernt sind oder/und deren Emissionsmaxima unter Elektrophorese- Betriebsbedingungen wenigstens jeweils 30 nm, vorzugsweise jeweils wenigstens 50 nm voneinander entfernt sind.

5. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Spektralfilter (106; 106a, 107a) eine spektrale Charakteristik derart aufweist, daß aufgrund der Anregung des jeweils zugeordneten Laserstrahls entstehende Fluoreszenzstrahlung des jeweils zugeordneten Fluoreszenzmarkers für einen Durchlaß-Wellenlängenbereich um ein Emissionsmaximum des Fluoreszenzspektrums dieses Fluoreszenzmarkers oder für einen zu diesem Fluoreszenzmaximum benachbarten Durchlaß- Wellenlängenbereich zum zugeordneten Detektorfeld (102; 102a) geführt wird.

6. Einrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß in Bezug auf wenigstens einen der anderen Fluoreszenzmarker wenigstens eine der folgenden Bedingungen a) und b) erfüllt ist, um die nach den Fluoreszenzmarkern aufgelöste Detektion zu ermöglichen:

• a) die Laserstrahl-Wellenlänge liegt auf einer spektralen Seite eines Absorptionsspektrums (A) des anderen Fluoreszenzmarkers jenseits einer von einem Absorptionsmaximum zur Laserstrahl-Wellenlänge hin bis wenigstens auf eine Restabsorptionsamplitude, die einer höchstens geringen Restabsorption entspricht, abfallenden Flanke des Absorptionsspektrums,
• b) der Durchlaß-Wellenlängenbereich liegt auf einer spektralen Seite eines Emissionsspektrums (E) des anderen Fluoreszenzmarkers jenseits einer von einem Emissionsmaximum zum Durchlaß-Wellenlängenbereich hin bis auf wenigstens eine Restemissionsamplitude, die einer höchstens geringen Restemission entspricht, abfallenden Flanke des Emissionsspektrums.

7. Einrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Laserstrahl-Wellenlänge abfallende Flanke eine zu längeren Wellenlängen hin abfallende Flanke ist und die zum Durchlaß- Wellenlängenbereich hin abfallende Flanke eine zu kürzeren Wellenlängen hin abfallende Flanke ist.

8. Einrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Laserstrahl-Wellenlänge abfallende Flanke eine zu kürzeren Wellenlängen hin abfallende Flanke ist und die zum Durchlaß- Wellenlängenbereich hin abfallende Flanke eine zu längeren Wellenlängen hin abfallende Flanke ist.

9. Einrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Flanke zur Laserstrahl-Wellenlänge bzw. zum Durchlaß-Wellenlängenbereich hin steiler abfällt als eine auf der anderen Seite des Maximums des Spektrums (A bzw. E) liegende, mit dem Abstand vom Maximum abfallende Flanke des Spektrums.

10. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung als Strahlungsführungsanordnung eine Linsenanordnung, vorzugsweise ein Gradientenindexlinsenfeld (108; 108a), umfaßt.

11. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet durch wenigstens einen auf einer den Gel-Elektrophorese-Bahnen zugeordneten Gegenstandseite der Strahlungsführungsanordnung angeordneten gegenstandsseitigen Spektralfilter (107a) oder/und wenigstens einen auf einer dem Detektorfeld zugeordneten Bildseite der Strahlungsführungsanordnung angeordneten bildseitigen Spektralfilter (106; 106a).

12. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Spektralfilteranordnung (106a, 107a) als Interferenzfilter ausgebildet ist oder einen Interferenzfilter (107a) umfaßt.

13. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Spektralfilteranordnung (106a, 107a) als Kombination aus einer Absorptionsfilteranordnung (106a) und einer Interferenzfilteranordnung (107a) ausgebildet ist.

14. Einrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Spektralfilter (107a) einen Absorptionsfilter, ggf. Farbglasfilter, umfaßt, der als Trägersubstrat für Dünnschichtfilme eines zugeordneten Interferenzfilters dient.

15. Einrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Interferenzfilter (107a), ggf. in Verbindung mit der Strahlungsführungsanordnung (108a), als Durchlaß- Wellenlängenbereich einen Wellenlängenbereich definiert, der einer Überlagerung von Durchlaßbereichen eines/des Interferenzfilters für verschiedene Licht-Einfallswinkel in den Interferenzfilter entspricht.

16. Einrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß als Durchlaß-Wellenlängenbereich ein Wellenlängenbereich definiert ist, der alle Durchlaßbereiche des Interferenzfilters (107a) für alle gemäß einer Akzeptanzwinkelcharakteristik der Strahlungsführungsanordnung (108a) auftretenden Lichteinfallswinkel umfaßt.

17. Einrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß als Durchlaß-Wellenlängenbereich ein Wellenlängenbereich definiert ist, der einen Durchlaßbereich des Interferenzfilters (107a) für einen einem Lichteinfallswinkel von α = 0° und einen Durchlaßbereich des Interferenzfilters für einen einem maximalen Akzeptanzwinkel der Strahlungsführungsanordnung (108a) entsprechenden Lichteinfallswinkel umfaßt.

18. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß von den folgenden Fluoreszenzmarkern wenigstens sieben Marker detektierbar sind: Indodicarbocyanin CY 2, Alexa 488, Fluoreszein-Iso-Thio-Cyanat (FITC), 5-Carboxy- Rhodamin 6G, Alexa 532, Tetramethyl-Rhodamin-Iso-Thio-Cyanat (TRITC), Indodicarbocyanin CY 3, Sulforhodamin 101 (TexasRed™), Indodicarbocyanin CY 5, Indodicarbocyanin CY 5.5, IRD 700, Indodicarbocyanin CY 7, IRD 40 und IRD 800.

19. Einrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens die Marker Indodicarbocyanin CY 2, Fluoreszein-Iso-Thio- Cyanat (FITC), 5-Carboxy-Rhodamin 6G, Sulforhodamin 101 (TexasRed™), Indodicarbocyanin CY 5, Indodicarbocyanin CY 5.5 und IRD 800 detektierbar sind.

20. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß von den folgenden Fluoreszenzmarkern wenigstens drei, vorzugsweise wenigstens vier, höchstvorzugsweise wenigstens fünf Marker gleichzeitig Fluoreszenzmarker aufgelöst und Gel-Elektrophorese-Bahn-aufgelöst detektierbar sind:
Indodicarbocyanin CY 2, Alexa 488, Fluoreszein-Iso-Thio-Cyanat (FITC), 5-Carboxy-Rhodamin 6G, Alexa 532, Tetramethyl-Rhodamin- Iso-Thio-Cyanat (TRITC), Indodicarbocyanin CY 3, Sulforhodamin 101 (TexasRed™), Indodicarbocyanin CY 5, Indodicarbocyanin CY 5.5, IRD 700, Indodicarbocyanin CY 7, IRD 40 und IRD 800.

21. Einrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens die fünf Marker
Indodicarbocyanin CY 2, 5-Carboxy-Rhodamin 6G, Sulforhodamin 101 (TexasRed™), Indodicarbocyanin CY 5.5 und IRD 800
oder wenigstens die vier Marker
Fluoreszein-Iso-Thio-Cyanat (FITC), Sulforhodamin 101 (TexasRed™), Indodicarbocyanin CY 5.5 und IRD 800
oder wenigstens die vier Marker
Indodicarbocyanin CY 2, 5-Carboxy-Rhodamin 6G, Indodicarbocyanin CY 5 und IRD 800
oder wenigstens die drei Marker
Fluoreszein-Iso-Thio-Cyanat (FITC), Indodicarbocyanin CY 5 und IRD 800
gleichzeitig Fluoreszmarker-aufgelöst und Gel-Elektrophorese-Bahn­ aufgelöst detektierbar sind.

22. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß für die Detektion des Fluoreszenzmarkers Indodicarbocyanin CY 2 ein frequenzverdoppelter, ggf. diodengepumpter Neodym: YAG-Laser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 473 nm vorgesehen ist.

23. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß dem Fluoreszenzmarker Indodicarbocyanin CY 2 eine Spektralfilteranordnung mit einem Durchlaßbereich von etwa 494 nm bis etwa 524 nm, ggf. mit unterschiedlichen Licht- Einfallwinkeln α zugeordneten Durchlaßbereichen von etwa 494 nm bis etwa 524 nm für α = 0° und etwa 492 nm bis etwa 514 nm für einen einem maximalen Akzeptanzwinkel der Strahlungsführungsanordnung entsprechenden Lichteinfallwinkel, beispielsweise von etwa 20°, zugeordnet ist.

24. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß eine/die dem Fluoreszenzmarker Indodicarbocyanin CY 2 zugeordnete Spektralfilteranordung einen Absorptions-Kurzpaßfilter, einen Absorptions-Langpaßfilter und einen Interferenz-Bandpaßfilter umfaßt.

25. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß für die Detektion des Fluoreszenzmarkers Fluoreszein-Iso-Thio-Cyanat (FITC) ein Argon-Ionen-Laser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 488 nm oder ein frequenzverdoppelter, ggf. diodengepumpter Neodym:YAG-Laser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 473 nm vorgesehen ist.

26. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß dem Fluoreszenzmarker Fluoreszein-Iso-Thio- Cyanat (FITC) eine Spektralfilteranordnung mit einem Durchlaßbereich von etwa 505 nm bis etwa 555 nm, ggf. mit unterschiedlichen Licht- Einfallwinkeln α zugeordneten Durchlaßbereichen von etwa 505 nm bis etwa 555 nm für α = 0° und etwa 500 nm bis etwa 545 nm für einen einem maximalen Akzeptanzwinkel der Strahlungsführungsanordnung entsprechenden Lichteinfallwinkel, beispielsweise von etwa 20°, zugeordnet ist.

27. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß eine/die dem Fluoreszenzmarker Fluoreszein-Iso- Thio-Cyanat (FITC) zugeordnete Spektralfilteranordung einen Absorptions-Kurzpaßfilter, einen Absorptions-Langpaßfilter und einen Interferenz-Bandpaßfilter umfaßt.

28. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß für die Detektion des Fluoreszenzmarkers 5- Carboxy-Rhodamin 6 G ein frequenzverdoppelter, ggf. diodengepumpter Neodym:YAG-Laser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 532 nm vorgesehen ist.

29. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß dem Fluoreszenzmarker 5-Carboxy-Rhodamin 6G eine Spektralfilteranordnung mit einem Durchlaßbereich von etwa 555 nm bis etwa 578 nm, ggf. mit unterschiedlichen Licht- Einfallwinkeln α zugeordneten Durchlaßbereichen von etwa 555 nm bis etwa 578 nm für α = 0° und etwa 553 nm bis etwa 569 nm für einen einem maximalen Akzeptanzwinkel der Strahlungsführungsanordnung entsprechenden Lichteinfallwinkel, beispielsweise von etwa 20°, zugeordnet ist.

30. Einrichtung nach einem der Anspruch 18 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß eine/die dem Fluoreszenzmarker 5-Carboxy- Rhodamin 6G zugeordnete Spektralfilteranordung einen Absorptions- Kurzpaßfilter und einen Interferenz-Bandpaßfilter umfaßt.

31. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß für die Detektion des Fluoreszenzmarkers Sulforhodamin 101 (TexasRed™) ein Helium-Neon-Laser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 594 nm vorgesehen ist.

32. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß dem Fluoreszenzmarker Sulforhodamin 101 (TexasRed™) eine Spektralfilteranordnung mit einem Durchlaßbereich von etwa 613 nm bis etwa 651 nm, ggf. mit unterschiedlichen Licht- Einfallwinkeln α zugeordneten Durchlaßbereichen von etwa 613 nm bis etwa 651 nm für α = 0° und etwa 613 nm bis etwa 636 nm für einen einem maximalen Akzeptanzwinkel der Strahlungsführungsanordnung entsprechenden Lichteinfallwinkel, beispielsweise von etwa 20°, zugeordnet ist.

33. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß eine/die dem Fluoreszenzmarker Sulforhodamin 101 (TexasRed™) zugeordnete Spektralfilteranordung einen Absorptions-Langpaßfilter und einen Interferenz-Bandpaßfilter umfaßt.

34. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß für die Detektion des Fluoreszenzmarkers Indodicarbocyanin CY 5 ein Helium-Neon-Laser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 633 nm oder ein Halbleiterlaser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 640 nm vorgesehen ist.

35. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß dem Fluoreszenzmarker Indodicarbocyanin CY 5 eine Spektralfilteranordnung mit einem Durchlaßbereich von etwa 655 nm bis etwa 690 nm, ggf. mit unterschiedlichen Licht- Einfallwinkeln α zugeordneten Durchlaßbereichen von etwa 655 nm bis etwa 690 nm für α = 0° und etwa 650 nm bis etwa 683 nm für einen einem maximalen Akzeptanzwinkel der Strahlungsführungsanordnung entsprechenden Lichteinfallwinkel, beispielsweise von etwa 20°, zugeordnet ist.

36. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß eine/die dem Fluoreszenzmarker Indodicarbocyanin CY 5 zugeordnete Spektralfilteranordung einen Absorptions-Langpaßfilter und einen Interferenz-Bandpaßfilter umfaßt.

37. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß für die Detektion des Fluoreszenzmarkers Indodicarbocyanin CY 5.5 oder/und des Fluoreszenzmarkers IRD 700 ein Halbleiterlaser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 660 nm oder etwa 670 nm oder etwa 675 nm vorgesehen ist.

38. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß dem Fluoreszenzmarker Indodicarbocyanin CY 5.5 oder/und dem Fluoreszenzmarker IRD 700 eine Spektralfilteranordnung mit einem Durchlaßbereich von etwa 655 nm bis etwa 690 nm, ggf. mit unterschiedlichen Licht-Einfallwinkeln α zugeordneten Durchlaßbereichen von etwa 695 nm bis etwa 745 nm für α = 0° und etwa 695 nm bis etwa 730 nm für einen einem maximalen Akzeptanzwinkel der Strahlungsführungsanordnung entsprechenden Lichteinfallwinkel, beispielsweise von etwa 20°, zugeordnet ist.

39. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß eine/die dem Fluoreszenzmarker Indodicarbocyanin CY 5.5 oder/und dem Fluoreszenzmarker IRD 700 zugeordnete Spektralfilteranordung einen Absorptions-Langpaßfilter und einen Interferenz-Bandpaßfilter umfaßt.

40. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß für die Detektion des Fluoreszenzmarkers IRD 800 ein Halbleiterlaser mit einer Emissionswellenlänge von etwa 775 nm oder von etwa 780 nm vorgesehen ist.

41. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß dem Fluoreszenzmarker IRD 800 eine Spektralfilteranordnung mit einem Durchlaßbereich von etwa 795 nm bis etwa 790 nm, ggf. mit unterschiedlichen Licht-Einfallwinkeln α zugeordneten Durchlaßbereichen von etwa 795 nm bis etwa 835 nm für α = 0° und etwa 790 nm bis etwa 830 nm für einen einem maximalen Akzeptanzwinkel der Strahlungsführungsanordnung entsprechenden Lichteinfallwinkel, beispielsweise von etwa 20°, zugeordnet ist.

42. Einrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß eine/die dem Fluoreszenzmarker IRD 800 zugeordnete Spektralfilteranordung einen Absorptions-Langpaßfilter und einen Interferenz-Bandpaßfilter umfaßt.

43. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 42, gekennzeichnet durch Maßnahmen zur Verringerung von das Auflösungsvermögen der Detektion in Bezug auf die Gel-Elektrophorese-Bahn oder/und in Bezug auf die Fluoreszenzmarker oder/und das Signal-zu- Rauschverhältnis beeinträchtigender Störstrahlung, ggf. Fluoreszenzlicht-Hintergrundstrahlung oder/und gestreuter Laserstrahlung.

44. Einrichtung nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens einer der Laserstrahlen linear polarisiert ist mit einem Polarisationsvektor, der nach einer eingangseitigen Lichtführungsrichtung der Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung ausgerichtet ist, ggf. zu dieser zumindest näherungsweise parallel ist.

45. Einrichtung nach Anspruch 43 oder 44, dadurch gekennzeichnet, daß die Gel-Elektrophorese-Bahnen in einer vorzugsweise plattenförmigen Gelmatrix (12) verlaufen, die zwischen Glasplatten (14, 16) aus gefloatetem Borosilikatglas angeordnet ist.

46. Einrichtung nach einem der Ansprüche 43 bis 45, dadurch gekennzeichnet, daß die Gel-Elektrophorese-Bahnen in einer vorzugsweise plattenförmigen Gelmatrix (12) verlaufen, wobei die Laserstrahlen (60, 62, 64, 66) über wenigstens eine zur Laserstrahl- Ausbreitungsrichtung in der Gelmatrix (12) im wesentlichen parallele Koppelplatte in die Gelmatrix eingekoppelt werden, wobei die Koppelplatte eine polierte, zum jeweiligen Laserstrahl im wesentlichen orthogonale Eintrittsfläche oder/und eine polierte, zum jeweiligen Laserstrahl im wesentlichen orthogonale Austrittsfläche oder/und einen an die Gelmatrix angepaßten, dem Brechungsindix der Gelmatrix ggf. zumindest näherungsweise entsprechenden Brechungsindex aufweist.

47. Einrichtung nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß für alle Laserstrahlen (60, 62, 64, 66) eine gemeinsame Koppelplatte vorgesehen ist.

48. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 47, dadurch gekennzeichnet, daß die räumlich gegeneinander versetzten, unterschiedliche Wellenlängen aufweisenden Laserstrahlen (60, 62, 64, 66) derart gegeneinander versetzt sind, daß die Laserstrahlungswellenlänge in Molekülausbreitungsrichtung (M) von Laserstrahl zu Laserstrahl abnimmt.

49. Elektrophorese-Einrichtung (10) zum Analysieren von Fluoreszenzmarker-markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, umfassend:

• - eine Mehrzahl von im wesentlichen parallel zueinander und längs einer Molekülausbreitungsrichtung (M) verlaufenden Gel- Elektrophorese-Bahnen (12),
• - eine Energiequelle (20) zum Anlegen eines elektrischen Potentials an einem Anfangsbereich und einem Endbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen (12),
• - eine Laseranordnung (50, 52, 54, 56) zum Anregen von den Molekülen zugeordneten Fluoreszenzmarkern,
  wobei die Laseranordnung im Elektrophoresebetrieb Laserstrahlung erzeugt, die als wenigstens einer im wesentlichen quer zu der Molekülausbreitungsrichtung verlaufender Laserstrahl (60, 62, 64, 66) wenigstens mehrere der Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidet, um in einem Detektionsbereich der jeweiligen Gel-Elektrophorese-Bahn zugeordnete Fluoreszenzmarker der dort vorhandenen Moleküle anzuregen,
• - eine Erfassungsanordnung (90) zum Erfassen von von den angeregten Fluoreszenzmarkern ausgehender Emissionsstrahlung,
  wobei die Erfassungsanordung wenigstens ein sich vorzugsweise im wesentlichen parallel zu dem wenigstens einen Laserstrahl erstreckendes Detektorfeld (102; 102a) aufweist, das dafür ausgebildet ist, längs einer dem Laserstrahl zugeordneten, vorzugsweise zu diesem im wesentlichen parallelen Detektionsstrecke wenigstens einen Teil der in den Detektionsbereichen aufgrund der Laserstrahlanregung entstehenden, über eine zugeordnete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung (106, 108; 112a) zum Detektorfeld geführten Emissionsstrahlung ortsaufgelöst zu erfassen,
  wobei die Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung die von den angeregten Fluoreszenzmarkern ausgehende Emissionsstrahlung auf Empfangsoberflächen oder Empfangsoberflächenabschnitte (104a) des Detektorfeldes (102a) umlenkt, die zur Molekülausbreitungsrichtung (M) zumindest näherungsweise orthogonal angeordnet sind.

50. Einrichtung nach Anpruch 49, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektorfeld (102a) auf einer Trägerplatine (114a) angeordnet ist, die zur Molekülausbreitungsrichtung (M) zumindest näherungsweise orthogonal angeordnet ist.

51. Einrichtung nach Anspruch 49 oder 50, dadurch gekennzeichnet, daß in Molekülausbreitungsrichtung hintereinander mehrere einer Mehrzahl von Laserstrahlen vorzugsweise unterschiedlicher Wellenlänge zugeordnete Detektorfelder (102a) jeweils mit zur Molekülausbreitungsrichtung (M) zumindest näherungsweise orthogonal angeordneten Empfangsoberflächen bzw. Empfangsoberflächenabschnitten (104a) vorgesehen sind, die vorzugsweise jeweils auf einer eigenen Trägerplatine (114a) angeordnet sind.

52. Einrichtung nach einem der Ansprüche 49 bis 51, dadurch gekennzeichnet, daß die Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung (112a) wenigstens eine einem jeweiligen Detektorfeld (102a) zugeordnete und sich im wesentlichen parallel zu diesem Detektorfeld erstreckende Umlenkprismaanordnung, ggf. ein durchgehendes Umlenkprisma (110a), umfaßt.

53. Einrichtung nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß die Umlenkprismaanordnung (110a) auf einer Ausgangsseite einer Linsenanordnung, ggf. einem Gradientenindexlinsenfeld (108a), der Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung angeordnet ist.

54. Einrichtung nach einem der Ansprüche 49 bis 53, dadurch gekennzeichnet, daß die Umlenkprismaanordnung (110a) aus einem hochbrechenden optischen Material gebildet ist zur Anpassung eines bildseitigen optischen Weges zwischen einer/der Linsenanordnung, ggf. einem/dem Gradientenindexlinsenfeld (108a), der Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung einerseits und den Empfangsoberflächen (104a) andererseits an eine bildseitige Fokuslänge der Linsenanordnung.

55. Einrichtung nach einem der Ansprüche 52 bis 54, dadurch gekennzeichnet, daß die Umlenkprismaanordnung (110a) Teil eines integralen optischen Moduls (112a) ist, welches eine/die Linsenanordnung (108A) und wenigstens einen Spektralfilter (106a, 107a) umfaßt.

56. Einrichtung nach Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, daß die Umlenkprismaanordnung (110a), die als Gradientenindexlinsenfeld ausgebildete Linsenanordnung (108a), der wenigstens eine Spektralfilter (106a, 107a) und gewünschtenfalls eine Trägerschiene zur Herstellung des integralen optischen Moduls (112a) miteinander verklebt sind.

57. Einrichtung nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, daß auf einer optischen Eingangsseite des Gradientenindexlinsenfelds (108a) oder/und auf einer optischen Ausgangsseite des Gradientenindexfelds (108a), ggf. zwischen dem Gradientenindexlinsenfeld und der Umlenkprismaanordnung (110a), wenigstens ein Spektralfilter (106a) aufgeklebt ist.

58. Einrichtung nach Anspruch 56 oder 57, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Spektralfilter (107a) des optischen Moduls (112a) als Interferenzfilter ausgebildet ist oder einen Interferenzfilter umfaßt.

59. Einrichtung nach einem der Ansprüche 56 bis 58, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Spektralfilter (107a) als Kombination aus einem Absorptionsfilter und einem Interferenzfilter ausgebildet ist.

60. Einrichtung nach Anspruch 59, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Spektralfilter (107a) des optischen Moduls einen Absorptionsfilter, ggf. Farbglasfilter, umfaßt, der als Trägersubstrat für Dünnschichtfilme eines zugeordneten Interferenzfilters dient.

61. Einrichtung nach einem der Ansprüche 56 bis 60, dadurch gekennzeichnet, das das optische Modul (112a) zur Justage eines optischen Weges in einem Modulträger in einer zu den die Gel- Elektrophorese-Bahnen (12) schneidenden Laserstrahlabschnitten und zu der Molekülausbreitungsrichtung im wesentlichen orthogonalen Richtung verschiebbar angeordnet ist.

62. Einrichtung nach einem der Ansprüche 55 bis 61, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mehrzahl von Detektorfeldern (102a), eine Mehrzahl von jeweils einem der Detektorfelder zugeordneten optischen Modulen (112a) sowie den Detektorfeldern zugeordnete Detektionselektronik (116a) in ein Detektormodul (90) mit einem gemeinsamen Gehäuse integriert sind, wobei das Detektormodul als eine Einheit handhabbar ist und vorzugsweise durch Verlagerung in einer zu die Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidenden Laserstrahlabschnitten und zu der Molekülausbreitungsrichtung (M) im wesentlichen orthogonalen Richtung eine gemeinsame Justage zugeordneter objektseitiger optischer Weglängen für alle optischen Module (112a) des Detektormoduls ermöglicht.

63. Einrichtung nach einem der Ansprüche 49 bis 62, gekennzeichnet durch die übrigen Merkmale wenigstens eines der vorangehenden Ansprüche 1 bis 48.

64. Elektrophorese-Einrichtung (10) zum Analysieren von Fluoreszenzmarker-markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, umfassend:

• - eine Mehrzahl von im wesentlichen parallel zueinander und längs einer Molekülausbreitungsrichtung (M) verlaufenden Gel- Elektrophorese-Bahnen (12),
• - eine Energiequelle (20) zum Anlegen eines elektrischen Potentials an einem Anfangsbereich und einem Endbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen,
• - eine Laseranordnung (50, 52, 54, 56) zum Anregen einer Mehrzahl von verschiedenen, den Molekülen zugeordneten Fluoreszenzmarkern,
  wobei die Laseranordnung im Elektrophoresebetrieb Laserstrahlung erzeugt, die als im wesentlichen quer zu der Molekülausbreitungsrichtung und im wesentlichen parallel zueinander verlaufende und in Molekülausbreitungsrichtung gegeneinander versetzte Laserstrahlen (60, 62, 64, 66) unterschiedlicher Wellenlänge wenigstens mehrere der Gel- Elektrophorese-Bahnen (12) schneidet, um in einem Detektionsbereich der jeweiligen Gel-Elektrophorese-Bahn zugeordnete Fluoreszenzmarker der dort vorhandenen Moleküle anzuregen,
• - eine Erfassungsanordnung (90) zum Gel-Elektrophorese-Bahn­ aufgelösten und Fluoreszenzmarker-aufgelösten Erfassen von von den angeregten Fluoreszenzmarkern ausgehender Emissionsstrahlung,
  wobei die Erfassungsanordung eine Mehrzahl von in Molekülausbreitungsrichtung gegeneinander versetzten und sich vorzugsweise im wesentlichen parallel zu den Laserstrahlen erstreckenden Detektorfeldern (102; 10a) aufweist, die jeweils einem bestimmten der Laserstrahlen zugeordnet sind und dafür ausgebildet sind, längs einer dem jeweiligen Laserstrahl zugeordneten, vorzugsweise zu diesem im wesentlichen parallelen Detektionsstrecke wenigstens einen Teil der in den Detektionsbereichen aufgrund der Anregung durch den jeweiligen Laserstrahl entstehenden, über eine jeweils zugeordnete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung (106, 108; 112a) zum Detektorfeld geführten Emissionsstrahlung ortsaufgelöst zu erfassen,

wobei die Laseranordnung wenigstens einen Laser (50, 52) mit einem optischen Laserresonator aufweist, der bezogen auf eine den Strahlverlauf des aus dem Resonator austretenden Laserstrahls (60 bzw. 62) kennzeichnende Resonatorachse zumindest näherungsweise parallel zu den Detektorfeldern (102; 102a) angeordnet ist, wobei der aus dem Laserresonator austretende Laserstrahl (60 bzw. 62) mittels einer Strahlführungsanordnung (70, 72) umgelenkt wird, damit ein quer zu der Molekülausbreitungsrichtung verlaufender Laserstrahlabschnitt die Gel-Elektrophorese-Bahnen (12) schneidet.

65. Einrichtung nach Anspruch 64, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Laser (50, 52) mit bezogen auf eine jeweilige Resonatorachse zu den Detektorfeldern zumindest näherungsweise parallelen Resonatoren vorgesehen sind, wobei die Laserresonatoren bezogen auf die Resonatorachsen zumindest näherungsweise entsprechend dem Versatz der die Gel-Elektrophorese-Bahnen (12) schneidenden Laserstrahlabschnitte in Molekülausbreitungsrichtung (M) gegeneinander versetzt sind.

66. Elektrophorese-Einrichtung (10), gegebenenfalls nach Anspruch 64 oder 65, zum Analysieren von Fluoreszenzmarker-markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, umfassend:

• - eine Mehrzahl von im wesentlichen parallel zueinander und längs einer Molekülausbreitungsrichtung (M) verlaufenden Gel- Elektrophorese-Bahnen (12),
• - eine Energiequelle (20) zum Anlegen eines elektrischen Potentials an einem Anfangsbereich und einem Endbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen (12),
• - eine Laseranordnung (50, 52, 54, 56) zum Anregen einer Mehrzahl von verschiedenen, den Molekülen zugeordneten Fluoreszenzmarkern,
  wobei die Laseranordnung im Elektrophoresebetrieb Laserstrahlung erzeugt, die als im wesentlichen quer zu der Molekülausbreitungsrichtung und im wesentlichen parallel zueinander verlaufende und in Molekülausbreitungsrichtung gegeneinander versetzte Laserstrahlen (60, 62, 64, 66) unterschiedlicher Wellenlänge wenigstens mehrere der Gel- Elektrophorese-Bahnen (12) schneidet, um in einem Detektionsbereich der jeweiligen Gel-Elektrophorese-Bahn zugeordnete Fluoreszenzmarker der dort vorhandenen Moleküle anzuregen,
• - eine Erfassungsanordnung (90) zum Gel-Elektrophorese-Bahn­ aufgelösten und Fluoreszenzmarker-aufgelösten Erfassen von von den angeregten Fluoreszenzmarkern ausgehender Emissionsstrahlung,
  wobei die Erfassungsanordung eine Mehrzahl von in Molekülausbreitungsrichtung gegeneinander versetzten und sich vorzugsweise im wesentlichen parallel zu den Laserstrahlen erstreckenden Detektorfeldern (102; 102a) aufweist, die jeweils einem bestimmten der Laserstrahlen zugeordnet sind und dafür ausgebildet sind, längs einer dem jeweiligen Laserstrahl zugeordneten, vorzugsweise zu diesem im wesentlichen parallelen Detektionsstrecke wenigstens einen Teil der in den Detektionsbereichen aufgrund der Anregung durch den jeweiligen Laserstrahl entstehenden, über eine jeweils zugeordnete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung (106, 108; 112a) zum Detektorfeld geführten Emissionsstrahlung ortsaufgelöst zu erfassen,

wobei die Laseranordnung wenigstens zwei Laser (54, 56) mit einem jeweiligen Laserresonator aufweist, die jeweils bezogen auf eine den Strahlverlauf des aus dem jeweiligen Resonator austretenden Laserstrahls (64 bzw. 66) kennzeichnende Resonatorachse unter einem Winkel zu den Detektorfeldern (102; 102a) angeordnet sind, vorzugsweise zumindest näherungsweise orthogonal zu den Detektorfeldern (102; 102a) angeordnet sind, wobei der aus dem jeweiligen Laserresonator austretende Laserstrahl (64 bzw. 66) mittels einer Strahlführungsanordnung (72) umgelenkt wird, damit ein quer zu der Molekülausbreitungsrichtung verlaufender Laserstrahlabschnitt die Gel-Elektrophorese-Bahnen (12) schneidet und wobei die Laserresonatoren bezogen auf die Resonatorachsen zumindest näherungsweise entsprechend dem Versatz der die Gel- Elektrophorese-Bahnen schneidenden Laserstrahlabschnitte in Molekülausbreitungsrichtung (M) gegeneinander versetzt sind sowie unterschiedlichen Seitenabstand von den Gel-Elektrophorese-Bahnen (12) haben.

67. Einrichtung nach Anspruch 66, dadurch gekennzeichnet, daß die Resonatorachsen zumindest näherungsweise in einer jeweiligen, zur Molekülausbreitungsrichtung (M) orthogonalen Ebene liegen.

68. Einrichtung nach einem der Ansprüche 64 bis 67, gekennzeichnet durch eine seitlich der Gel-Elektrophorese-Bahnen (12) angeordnete gestufte optische Bank (80) mit unter einem/dem Winkel zur Molekülausbreitungsrichtung (M) angeordneten, vorzugsweise zumindest näherungsweise orthogonal zur Molekülausbreitungsrichtung (M) verlaufenden Stufen (82), die mit zunehmendem Seitenabstand von den Gel-Elektrophorese-Bahnen (12) entgegengesetzt zur Molekülausbreitungsrichtung (M) zumindest näherungsweise entsprechend dem Versatz der die Gel- Elektrophorese-Bahnen (12) schneidenden Laserstrahlabschnitte ansteigen und einem jeweiligen der Laser zugeordnet sind zur Halterung einer dem Laser zugeordneten jeweiligen Strahlführungsanordnung (70, 72 bzw. 72) oder/und des mit seiner Resonatorachse zumindest näherungsweise sich längs der Stufe erstreckenden Laserresonators (54, 56).

69. Einrichtung nach Anspruch 68, dadurch gekennzeichnet, daß die jeweilige Strahlführungsanordnung eine optische Faser, vorzugsweise Monomodefaser, oder/und wenigstens einen Umlenkspiegel (72) oder/und wenigstens ein optisches Element zur Fokussierung des Laserstrahls oder/und Einstellung einer Laserstrahltaille in Bezug auf die Gel-Elektrophorese-Bahnen, ggf. eine optische Linse (74), ein optisches Objektiv oder ein optisches Teleskop, oder/und eine optisches Element zur Konditionierung, ggf. räumlichen Filterung, des Laserstrahls, aufweist.

70. Einrichtung nach Anpruch 69, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Umlenkspiegel (72) oder/und das optische Element (74) zur Justierung des Strahlverlaufs des jeweiligen Laserstrahls verstellbar, vorzugsweise motorisch verstellbar ist.

71. Einrichtung nach Anspruch 70, dadurch gekennzeichnet, daß ein Umlenkspiegel (72), von dem der die Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidende Laserstrahlabschnitt ausgeht, zumindest näherungsweise in einer zu der Molekülausbreitungsrichtung (M) und dem Laserstrahlabschnitt orthogonalen Richtung, vorzugsweise zumindest näherungsweise längs der jeweiligen Stufe (82) der optischen Bank (80), verschiebbar ist zur Justage des die Gel- Elektrophorese-Bahnen (12) schneidenden Laserstrahlabschnitts.

72. Einrichtung nach Anspruch 70 oder 71, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein optisches Element (74) zumindest näherungsweise in der Molekülausbreitungsrichtung (M) verschiebbar ist zur Justage des die Gel-Elektrophorese-Bahnen (12) schneidenden Laserstrahlabschnitts.

73. Elektrophorese-Einrichtung (10), gegebenenfalls nach einem der Ansprüche 64 bis 72, zum Analysieren von Fluoreszenzmarker- markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, umfassend:

• - eine Mehrzahl von im wesentlichen parallel zueinander und längs einer Molekülausbreitungsrichtung (M) verlaufenden Gel- Elektrophorese-Bahnen (12),
• - eine Energiequelle (20) zum Anlegen eines elektrischen Potentials an einem Anfangsbereich und einem Endbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen (12),
• - eine Laseranordnung (50, 52, 54, 56) zum Anregen einer Mehrzahl von den Molekülen zugeordneten Fluoreszenzmarkern,
  wobei die Laseranordnung im Elektrophoresebetrieb Laserstrahlung erzeugt, die als wenigstens einer im wesentlichen quer zu der Molekülausbreitungsrichtung verlaufender Laserstrahl (60, 62, 64, 66) wenigstens mehrere der Gel-Elektrophorese-Bahnen (12) schneidet, um in einem Detektionsbereich der jeweiligen Gel-Elektrophorese-Bahn zugeordnete Fluoreszenzmarker der dort vorhandenen Moleküle anzuregen,
• - eine Erfassungsanordnung (90) zum Gel-Elektrophorese-Bahn­ aufgelösten und Fluoreszenzmarker-aufgelösten Erfassen von von den angeregten Fluoreszenzmarkern ausgehender Emissionsstrahlung,

wobei die Erfassungsanordung wenigstens ein sich vorzugsweise im wesentlichen parallel zu den Laserstrahlen erstreckendes Detektorfeld (102; 102a) aufweist, das dafür ausgebildet ist, längs einer dem Laserstrahl zugeordneten, vorzugsweise zu diesem im wesentlichen parallelen Detektionsstrecke wenigstens einen Teil der in den Detektionsbereichen aufgrund der Anregung durch den zugeordneten Laserstrahl entstehenden, über eine zugeordnete Spektralfilter- und Strahlungsführungsanordnung (106, 108; 112a) zum Detektorfeld geführten Emissionsstrahlung ortsaufgelöst zu erfassen,
wobei die Laseranordnung wenigstens einen Laser aufweist, dessen Laserstrahl in eine optische Faser, vorzugsweise Monomodefaser, eingekoppelt wird, um den Laserstrahl zu den Gel-Elektrophorese- Bahnen zu führen oder/und den Laserstrahl zu konditionieren, oder/und
wobei die Laseranordnung wenigstens einen Laser aufweist, dessen Laserstrahl durch wenigstens ein optisches Element zur Konditionierung, ggf. räumlichen Filterung, des Laserstrahls geführt wird.

74. Einrichtung nach einem der Ansprüche 69 bis 73, dadurch gekennzeichnet, daß der ggf. vornherein ein nicht-Gauß'sches Profil aufweisende Laserstrahl derart konditioniert wird, daß er zumindest näherungsweise ein Gauß-Profil oder/und eine reduzierte Divergenz oder/und einen reduzierten Strahltaille-Durchmesser oder/und einen reduzierten, mit dem Produkt aus einem die Divergenz beschreibenden Divergenzwinkel und dem Strahltaille-Durchmesser ansteigenden Kollimationsfaktor, ggf. sogenannter M²-Faktor, aufweist.

75. Einrichtung nach einem der Ansprüche 64 bis 74, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens einer der Laserstrahlen (60, 62, 64, 66) derart geführt und ggf. fokussiert wird, daß ein Laserstrahlbereich minimalen Laserstrahldurchmessers, ggf. eine/die Strahltaille, längs des zugeordneten Detektorfeldes (102; 102a) etwa im Bereich einer mittleren der vom Laserstrahl geschnittenen Gel- Elektrophorese-Bahnen (12) angeordnet ist.

76. Einrichtung nach einem der Ansprüche 64 bis 75, gekennzeichnet durch die übrigen Merkmale wenigstens eines der vorangehenden Ansprüche 1 bis 63.

77. Justageverfahren zum Justieren des Verlaufs wenigstens eines Laserstrahls (60, 62, 64, 66) in Bezug auf zugeordnete Gel- Elektrophorese-Bahnen einer Elektrophorese-Einrichtung, die wenigstens einen Anregungslaser zum Erzeugen des Laserstrahls und wenigstens ein Detektorfeld (102; 102a) zum Aufnehmen von angeregten Fluoreszenzmarkern ausgehender Emissionsstrahlung aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die Justage auf Grundlage von mittels eines dem Laserstrahl zugeordneten Detektorfeldes (102; 102a) aufgenommenen Detektionssignalen erfolgt, die eine durch den Laserstrahl induzierte Hintergrundstrahlung, ggf. Hintergrundfluoreszenz oder/und Streulicht, repräsentieren.

78. Justageverfahren nach Anspruch 77, dadurch gekennzeichnet, daß im Zuge des Justierens wenigstens ein dem Laserstrahl zugeordnetes optisches Element (72, 74), ggf. eine Linse (74), ein Objektiv, ein Teleskop oder ein Umlenkspiegel (72), zur Aufnahme eines Hintergrundstrahlungsprofils verstellt wird, und das optische Element dann derart eingestellt wird, daß in Folge eine Hintergrundstrahlung zumindest näherungsweise entsprechend einem Maximum oder/und einer Mitte des Profils detektiert wird.

79. Justageverfahren nach Anspruch 77 oder 78, dadurch gekennzeichnet, daß zuerst ein die Gel-Elektrophorese-Bahnen (12) schneidender Laserstrahlverlauf und dann ein zu den Gel- Elektrophorese-Bahnen (12) zumindest näherungsweise orthogonaler Laserstrahlverlauf oder/und ein zum zugeordneten Detektorfeld (102; 102a) zumindest näherungsweise paralleler Laserstrahlverlauf eingestellt wird.

80. Justageverfahren nach einem der Ansprüche 77 bis 79, dadurch gekennzeichnet, daß ein die Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidender Laserstrahlverlauf primär auf Grundlage von durch wenigstens einen Detektorfeldabschnitt an einem Ende, vorzugsweise an dem einer Laserstrahleinkoppelstelle in eine/die die Gel-Elektrophorese-Bahnen aufweisende Gelmatrix nächsten Ende des Detektorfelds (102; 102a) aufgenommenen Detektionssignalen eingestellt wird und ein zu den Gel-Elektrophorese-Bahnen zumindest näherungsweise orthogonaler Laserstrahlverlauf oder/und ein zum Detektorfeld zumindest näherungsweise paralleler Laserstrahlverlauf primär auf Grundlage von durch wenigstens einen Detektorfeldabschnitt am anderen Ende des Detektorfelds aufgenommenen Detektionssignalen eingestellt wird.

81. Justageverfahren nach einem der Ansprüche 77 bis 80, dadurch gekennzeichnet, daß die Justage motorisch und vorzugsweise automatisiert erfolgt.

82. Justageverfahren nach einem der Ansprüche 77 bis 81, das auf eine Einrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 76 angewendet wird.

83. Elektrophorese-Einrichtung (10) zum Analysieren von markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, umfassend:

• - eine Mehrzahl von im wesentlichen parallel zueinander und längs einer Molekülausbreitungsrichtung (M) verlaufenden Gel- Elektrophorese-Bahnen (12), die in einer Gelmatrix (12), ggf. einem Plattengel (12), verlaufen,
• - wenigstens eine mit einer Gelmatrixoberfläche in Wärmeaustauschverbindung stehende Thermostatisierplatte (16; 16a; 16c; 16d),
• - eine Energiequelle (20) zum Anlegen eines elektrischen Potentials an einem Anfangsbereich und einem Endbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen (12),

wobei die Thermostatisierplatte (16; 16a; 16c; 16d) dazu geeignet ist, eine gleichmäßige Temperaturverteilung in der Gelmatrix in die Gel-Elektrophorese-Bahnen schneidender Querrichtung zur Molekülausbreitungsrichtung herzustellen oder/und aufrechtzuerhalten,
wobei die wenigstens eine Thermostatisierplatte (16c) ferner dazu geeignet ist, in der Gelmatrix (12) einen Temperaturgradienten in Molekülausbreitungsrichtung (M) oder/und in einer einer Dicke der Gelmatrix (12) zugeordneten, zur Thermostatisierplatte (16d) im wesentlichen orthogonalen Richtung einzustellen, oder/und dazu geeignet ist, ein Temperaturprofil mit einer lokalen Temperaturüberhöhung oder einer lokalen Temperaturabsenkung in wenigstens einem Querbereich der Gelmatrix einzustellen,
wobei im Falle einer von einem Wärmeaustauschermittel durchströmten Thermostatisierplatte (16c) diese dazu geeignet ist, den betreffenden Temperaturgradient bzw. das Temperaturprofil im Zustand fortwährender Durchströmung der Thermostatisierplatte (16c) mit dem Wärmeaustauschermittel einzustellen.

84. Einrichtung nach Anspruch 83, dadurch gekennzeichnet, daß zwei Thermostatisierplatten (16d1, 16d2) vorgesehen sind, zwischen denen die Gelmatrix (12d) angeordnet ist.

85. Einrichtung nach Anspruch 83 oder 84, dadurch gekennzeichnet, daß ein Temperaturprofil (T) mit in Molekülausbreitungsrichtung (M) abnehmender oder zunehmender Temperatur einstellbar ist.

86. Einrichtung nach einem der Ansprüche 83 bis 85, dadurch gekennzeichnet, daß, bezogen auf die der Dicke der Gelmatrix (12d) zugeordnete Richtung ein Temperaturprofil (T) mit einem in einem mittleren Bereich der Gelmatrix (12d) liegenden Temperaturmaximum einstellbar ist.

87. Einrichtung nach einem der Ansprüche 83 bis 86, dadurch gekennzeichnet, daß eine lokale Temperaturüberhöhung in einem einem Anfangsbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen entsprechenden Querbereichen der Gelmatrix einstellbar ist.

88. Einrichtung nach einem der Ansprüche 83 bis 87, dadurch gekennzeichnet, daß eine Laseranordnung (50, 52, 54, 56) zum Anregen einer Mehrzahl von den Molekülen zugeordneten Fluoreszenzmarkern vorgesehen ist,
wobei die Laseranordnung im Elektrophoresebetrieb Laserstrahlung erzeugt, die als wenigstens einer im wesentlichen quer zu der Molekülausbreitungsrichtung verlaufender Laserstrahl (60, 62, 64, 66) wenigstens mehrere der Gel-Elektrophorese-Bahnen (12) schneidet, um in einem Detektionsbereich der jeweiligen Gel- Elektrophorese-Bahn zugeordnete Fluoreszenzmarker der dort vorhandenen Moleküle anzuregen,
wobei in einem den jeweiligen Detektionsbereich einschließenden Querbereich der Gelmatrix eine lokale Temperaturüberhöhung einstellbar ist.

89. Einrichtung nach einem der Ansprüche 83 bis 88, gekennzeichnet durch die übrigen Merkmale wenigstens eines der vorangehenden Ansprüche 1 bis 76.

90. Verfahren zum Betreiben einer Elektrophorese-Einrichtung (10) zum Analysieren von markierten Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen, die umfaßt:

• - eine Mehrzahl von im wesentlichen parallel zueinander und längs einer Molekülausbreitungsrichtung (M) verlaufenden Gel- Elektrophorese-Bahnen (12), die in einer Gelmatrix (12), ggf. einem Plattengel (12), verlaufen,
• - wenigstens eine mit einer Gelmatrixoberfläche in Wärmeaustauschverbindung stehende, von einem Wärmeaustauschermittel durchströmbare Thermostatisierplatte (16b), die dafür geeignet ist, eine gleichmäßige Temperaturverteilung in der Gelmatrix (12) in die Gel- Elektrophorese-Bahnen schneidender Querrichtung zur Molekülausbreitungsrichtung (M) herzustellen oder/und aufrechtzuerhalten,
• - eine Energiequelle (20) zum Anlegen eines elektrischen Potentials an einem Anfangsbereich und einem Endbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen (12),

gekennzeichnet durch den Schritt des Unterbrechens der Strömung des Wärmeaustauschermittels durch die durch das Wärmeaustauschermittel vorgeheizte Thermostatisierplatte (16b) nach Erreichen einer vorgegebenen/vorgebbaren Geltemperatur oder/und einer vorgegebenen/vorgebbaren Geltemperaturverteilung.

91. Verfahren nach Anspruch 90, dadurch gekennzeichnet, daß sich nach Unterbrechen der Strömung in der Gelmatrix (12) ein Temperaturgradient in Molekülausbreitungsrichtung (M) oder/und in einer einer Dicke der Gelmatrix zugeordneten, zur Thermostatisierplatte (16b) im wesentlichen orthogonalen Richtung einstellt oder/und daß sich ein Temperaturprofil mit einer lokalen Temperaturüberhöhung oder einer lokalen Temperaturabsenkung in wenigstens einem Querbereich der Gelmatrix einstellt.

92. Verfahren nach Anspruch 90 oder 91, dadurch gekennzeichnet, daß zwei Thermostatisierplatten (16d1, 16d2) vorgesehen sind, zwischen denen die Gelmatrix (12d) angeordnet ist.

93. Verfahren nach Anspruch 89 oder 90, dadurch gekennzeichnet, daß ein Temperaturprofil (T) mit in Molekülausbreitungsrichtung (M) abnehmender oder zunehmender Temperatur eingestellt wird.

94. Verfahren nach einem der Ansprüche 91 bis 93, dadurch gekennzeichnet, daß, bezogen auf die der Dicke der Gelmatrix (12d) zugeordnete Richtung ein Temperaturprofil (T) mit einem in einem mittleren Bereich der Gelmatrix (12d) liegenden Temperaturmaximum eingestellt wird.

95. Verfahren nach einem der Ansprüche 91 bis 94, dadurch gekennzeichnet, daß eine lokale Temperaturüberhöhung in einem einem Anfangsbereich der Gel-Elektrophorese-Bahnen entsprechenden Querbereich der Gelmatrix eingestellt wird.

96. Verfahren nach einem der Ansprüche 91 bis 95, dadurch gekennzeichnet, daß eine Laseranordnung (50, 52, 54, 56) zum Anregen einer Mehrzahl von den Molekülen zugeordneten Fluoreszenzmarkern verwendet wird,
wobei die Laseranordnung im Elektrophoresebetrieb Laserstrahlung erzeugt, die als wenigstens einer im wesentlichen quer zu der Molekülausbreitungsrichtung verlaufender Laserstrahl (60, 62, 64, 66) wenigstens mehrere der Gel-Elektrophorese-Bahnen (12) schneidet, um in einem Detektionsbereich der jeweiligen Gel- Elektrophorese-Bahn zugeordnete Fluoreszenzmarker der dort vorhandenen Moleküle anzuregen,
wobei in einem den jeweiligen Detektionsbereich einschließenden Querbereich der Gelmatrix eine lokale Temperaturüberhöhung eingestellt wird.

97. Verfahren nach einem der Ansprüche 90 bis 96, daß auf eine Einrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 76 mit einer von einem Wärmeaustauschermittel durchströmbaren Thermostatisierplatte (16b) angewendet wird.

98. Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß mit mindestens vier unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern markierte Produkte von Nukleinsäure-Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung eine Einrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 76 und 83 bis 89 zusammen in einer Bahn nach ihrer Größe aufgetrennt und voneinander unabhängig analysiert werden, gewünschtenfalls unter Einbeziehung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 77 bis 82 oder/und des Verfahrens nach einem der Ansprüche 90 bis 97.