DE19940131A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen - Google Patents
Verfahren und Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven SubstanzenInfo
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Abstract
Es werden Verfahren und eine Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen aus Mikroorganismen vorgeschlagen, wobei ein Extraktor (1) zum Filtrieren des wässrigen Nährmediums sowie zum Freisetzen der Metabolite aus den Mikroorganismen und eine Chromatographieeinheit (2) zum Trennen der produzierten Naturstoffe aus dem wässrigen Kulturfiltrat als auch der aus den Mikroorganismen freigesetzten Metabolite von den übrigen Bestandteilen vorgesehen ist.
Description
Die Erfindung geht aus von einem Verfahren und einer
Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen
nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und des Anspruchs 10.
In vielen Indikationsgebieten besteht ein großer Bedarf an
biologisch aktiven Substanzen und Wirkstoffen, die durch
chemische Modifikation zu Therapeutika umgewandelt werden
können. Dies gilt beispielsweise in den Bereichen
Enzyminhibitorische und Rezeptorbinde-Modelle, spezifisch
antitumorale antiparasitäre und immunomodulatorisch
wirkende Substanzen. Es ist bekannt, zur Gewinnung derartiger
Substanzen Mikroorganismen zu verwenden. Die Vertreter der
Ordnung Actinomycetales insbesondere der Gattung
Streptomyces, werden aufgrund ihres ausgeprägten
Sekundärstoffwechsels hierzu herangezogen. Die biologisch
aktiven Substanzen treten als Metabolite im Stoffwechsel der
Mikroorganismen auf und müssen zur weiteren Verwendung aus
der zur Gewinnung der Metabolite notwendigen Kulturbrühe aus
Mikroorganismen und Nährmedium isoliert werden.
Darüberhinaus müssen sie in qualitativ hochwertiger Form und
ausreichender Menge zur Verfügung gestellt werden, um eine
Weiterverarbeitung beispielsweise zu Therapeutika zu
ermöglichen. Aus dem Stand der Technik sind bisher keine
Verfahren bekannt, die dies auf einfache und schnelle Weise
ermöglichen.
Demgegenüber werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 und der
erfindungsgemäßen Vorrichtung mit den kennzeichnenden
Merkmalen des Anspruchs 10 die Mikroorganismen mit einem
Nährmedium zu einer Kulturbrühe vermischt und damit zur
Bildung von Metaboliten veranlaßt. Durch Zugabe von
Lösungsmittel werden die Metabolite aus den Mikroorganismen
freigesetzt. Um die Metabolite von den übrigen Bestandteilen
der Kulturbrühe zu trennen, wird das Gemisch zunächst über ein
Filter und anschließend durch eine Chromatographieeinheit
geleitet. Durch die Kombination aus Extraktions-Filtrations-
Einheit und Chromatographieeinheit können die von den
Mikroorganismen gebildeten Metabolite auf schnelle und
einfache Weise als Rohprodukte gewonnen werden. Außerdem
kann mit dem Verfahren und der Vorrichtung das gesamte von
den Mikroorganismen produzierte Metaboliten-Spektrum erfaßt
werden. Hierzu sind nur geringe Mengen an umweltschädlichem
Verbrauchsmaterial, wie beispielsweise Lösungsmittel
notwendig. Als Lösungsmittel werden Wasser oder organische
Lösungsmittel verwendet.
Zur Durchführung des Verfahreiis werden die Mikroorganismen
als Reinkulturen verwendet. Diese erhält man durch Isolierung
von Mikroorganismen aus Proben, denen eine Nährlösung
zugegeben wird. Die in der Probe enthaltenen Mikroorganismen
verteilen sich in der Lösung, der nach kurzer Inkubationszeit
geringe Volumina entnommen werden. Diese werden auf festen
Nährmedien, welche selektive Bestandteile wie spezifisch
wirkende Antibiotika enthalten, ausplattiert und kultiviert. In
einer solchen Anreicherungskultur setzt sich der am besten
angepaßte Typ durch und überwächst alle Begleitorganismen.
Durch Übertragung und Verteilen auf andere Medien läßt sich
der angereicherte Stamm leicht isolieren und liegt als
Reinkultur, d. h. als Nachkommenschaft einer einzelnen Zelle vor.
Zur Gewinnung der biologisch aktiven Substanzen werden die
Reinkulturen gattungsspezifisch unter optimalen modifizierten
Kultivierungsbedingungen in einem Nährmedium angezogen. Die
Mikroorganismen wachsen so lange bis ein Faktor ins Minimum
gerät und das Wachstum begrenzt. Zu diesem Zeitpunkt
beginnen die Mikroorganismen Sekundärmetabolite zu
produzieren. Diese Stoffwechselprodukte zeichnen sich durch
eine strukturelle Vielfalt aus und können somit als Wirkstoffe,
wie Therapeutika, Stimulanzien oder Futtermittelzusätze
verwendet werden. Nach ausreichender Kultivierungsdauer,
welche die Organismen für die Produktion der Metabolite
benötigen, werden die Ansätze geerntet und komplett der
Extraktion zugeführt. Die produzierten Metabolite liegen sowohl
in der Kulturbrühe als auch in den Mikroorganismen vor. Um die
Gesamtheit des Metabolitenspektrums zu erhalten werden die
Zellen chemisch durch organische Lösungsmittel aufgeschlossen.
Durch die Klärung über ein Filter werden die gelösten Metabolite
mittels eine Chromatographieeinheit von den übrigen
Bestandteilen des Gemisches getrennt. Abschließend liegen die
Metabolite als Rohprodukte vor. Zur Lagerung oder
Weiterverarbeitung werden sie häufig in einem Vakuum-
Zentrifugalverdampfungssystem aufkonzentriert, in
Lochtiterplatten überführt und schließlich eingedampft. Damit
stellen sie das Endprodukt, die Naturstoffextrakte dar. Zur
Lagerung werden die Lochtiterplatten bei -20°C eingefroren und
in Gefrierschränken gelagert.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann die
Mikroorganismenkultur komplett ohne Vorbehandlung dem
Extraktor zugeführt werden. Die Behälter des Extraktors dienen
gleichzeitig als Bevorratungsbehältnisse der Kulturen bis zur
Bearbeitung.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung wird die Kultur
filtriert und in demselben Behältnis kann der zurückbleibende
Filterkuchen durch Zugabe von Lösungsmitteln in folgenden
Schritten weiter bearbeitet werden, d. h. Zellen können
aufgeschlossen und in den Zellen sich befindende Substanzen
können extrahiert werden. Diese Aufarbeitungsschritte lassen
sich mehrmals im gleichen Behältnis ohne Filterwechsel
wiederholen.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann das Filtrat
für eine Nachklärung in ein weiteres, gleichgestaltetes Behältnis
geleitet werden und unter Druck filtriert werden.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung ist das Material
so gewählt, daß es zu keiner Interaktion mit den freigesetzten
Substanzen kommt. Es werden inerte Materialien wie Glas und
PTFE verwendet, so dass die Substanzen sich durch das Material
chemisch nicht verändern können.
Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird das Filtrat nach dem durch die
Chromographieeinheit erfolgten Auftrennen in einer
Fraktionierungseinheit separiert. Dadurch können
Nährmedienbestandteile, die nicht durch den Stoffwechsel
umgesetzt wurden und damit nicht zum produzierten
Metabolitenspektrum gehören, größtenteils eliminiert werden.
Dies führt zu einer Qualitätsverbesserung der durch das
Verfahren gewonnenen biologisch aktiven Substanzen. Die
eliminierten Substanzen können eine anschließende
pharmakologische Testierung der gewonnenen Metaboliten nicht
mehr beeinflußen, so daß falsche Ergebnisse durch diese
Begleitsubstanzen ausgeschlossen werden können.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des
erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Kulturbrühe vor dem
Einbringen in die Extraktions-Filtrations-Einheit mit einem
inerten porösen Material, insbesondere mit Celiten, versetzt.
Dadurch kann eine Druckfiltration gewährleistet werden.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des
erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Gemisch aus
Mikroorganismen, Zellen der Mikroorganismen und den
unlöslichen Nährmediumbestandteilen mit Hilfe von über Düsen
einströmende Luft oder Flüssigkeit mit dem Lösungsmittel
vermischt. Dies führt auf einfache und schnelle Weise zu einer
Homogenisierung des Gemisches.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung
werden die Kulturbrühe und das Gemisch aus Mikroorganismen,
Zellen der Mikroorganismen, unlöslichen
Nährmediumbestandteilen und Lösungsmittel mit Preßluft durch
das Filter gedrückt. Dadurch können besonders schnell und
einfach feste Partikel abgetrennt und so die Kulturbrühe und
das Gemisch zum Filtrat geklärt werden.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung
wird als Chromatographieeinheit eine
Säulenchromatograhieeinheit, insbesondere mit einer
Chromatographiesäule aus Glas, verwendet. Hierbei durchsickert
eine mobile Phase (Filtrate) eine stationäre Phase
(Säulenpackung). Die Trennung beruht dabei auf Unterschieden
in der Wanderungsgeschwindigkeit der Probenbestandteile. Bei
der elutions-chromatograhischen Trennung von Substanzen in
einer Trennsäule erreichen die Stoffe je nach Verzögerungen,
welche durch das Säulenmaterial bedingt werden, zeitlich
nacheinander das Säulenende. Durch die unterschiedliche
Verweildauer in der Trennsäule können die Metabolite
fraktioniert aufgefangen werden. Die mittels der
Säulenchromatographie durchgeführte Fest-Flüssig-Extraktion
hat gegenüber einer Flüssig-Flüssig-Extraktion den Vorteil, daß
das gesamte Metabolitenspektrum erfaßt werden kann und nur
sehr geringe Mengen an umweltschädlichen
Verbrauchsmaterialien benötigt werden.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des
erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Säulenmaterial ein
Adsorberharz verwendet. Durch hydrophobe Wechselwirkungen
binden die durch die Chromatographieeinheit zu trennenden
Substanzen an die hydrophoben Oberflächen des
Adsorberharzes. Durch Erhöhung der organischen
Lösungsmittelkonzentration in Wasser kann die Elutionskraft
der mobilen Phase erhöht werden, was dazu führt, daß die
Substanzen nacheinander entsprechend ihrer lipophilen
Eigenschaften eluiert werden.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des
erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Mikroorganismen
der natürlich vorkommenden Flora und Fauna entnommen.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des
erfindungsgemäßen Verfahrens werden die einzelnen
Verfahrensschritte durch ein speicherprogrammierbares
Steuerungssystem und/ oder einen mit Software ausgestatteten
Rechner gesteuert. Sie laufen damit automatisch ab.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung mit den kennzeichnenden
Merkmalen des Anspruchs 10 zeichnet sich dadurch aus, daß
eine Kombination aus einer Extraktions-Filtrations-Einheit und
einer Chromatographieeinheit vorgesehen ist. Damit können die
als Metabolite in Mikroorganismen auftretende biologisch
aktiven Substanzen auf schnelle und einfache Weise aus den
Mikroorganismen gewonnen werden. Hierzu sind lediglich die
Kulturansätze bestehend aus Mikroorganismen und einer
Nährlösung in die erfindungsgemäße Vorrichtung einzuleiten. Die
von den Mikroorganismen produzierten Metabolite sind
einerseits in der Nährlösung als auch in den Mikroorganismen
selbst vorhanden. Zum Trennen wird die Kulturbrühe einer
Chromatographieeinheit zugeführt. Als Endprodukt erhält der
Benutzer eine das gesamte Metabolitenspektrum des jeweiligen
Mikroorganismus enthaltende Lösung. Zusätzlich kann eine
Steuerung vorgesehen sein, welche dafür sorgt, daß die in der
Vorrichtung ablaufenden Verfahrensschritte kontrolliert
werden.
Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen
Vorrichtung ist an die Chromatographieeinheit eine
Fraktionierungseinheit angeschlossen. Durch diese können
Substanzen eliminiert werden, die durch die
Chromatographieeinheit nicht abgetrennt wurden und damit in
der als Endprodukt gewonnenen Lösung noch enthalten sind,
und die sich störend auf anschließende pharmakologische
Testierungen auswirken können.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der
erfindungsgemäßen Vorrichtung ist als Chromatographieeinheit
eine Säulenchromatographieeinheit vorgesehen. Diese hat
gegenüber anderen bekannten Trennmethoden wie
beispielsweise Flüssig-Flüssig-Extraktion den Vorteil, daß das
gesamte Metabolitenspektrum erfaßt werden kann und nur sehr
geringe Mengen an umweltschädlichen Verbrauchsmaterial
notwendig sind.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der
erfindungsgemäßen Vorrichtung ist ein
speicherprogrammierbares Steuerungssystem und/oder ein
Rechner zur Steuerung der Extraktions-Filtrations-Einheit, der
Chromatographieeinheit und/oder der Fraktionierungseinheit
vorgesehen.
Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausgestaltungen der
Erfindung sind der nachfolgenden Beschreibung, der Zeichnung
und den Ansprüchen entnehmbar.
In der Zeichnung ist ein Ausführungsbeispiel der
erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt und im folgenden
näher beschrieben. Es zeigen:
Fig. 1 Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven
Substanzen aus Mikroorganismen,
Fig. 2 Extraktions-Filtrations-Einheit der Vorrichtung aus Fig.
1,
Fig. 3 Lochfilter und Filterhalter einer Extraktions-Filtrations-
Einheit gemäß Fig. 2.
In Fig. 1 ist eine Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch
aktiven Substanzen aus Mikroorganismen mit einer Extraktions-
Filtrations-Einheit 1, einer Chromatographieeinheit 2 und einer
Fraktionierungseinheit 3 dargestellt. Die die Mikroorganismen
enthaltende Kulturbrühe wird in den zylindrischen Behälter 4
des Extraktors 1 eingefüllt. Über Rohre 5 wird in den Behälter 4
Druckluft eingeleitet. Durch das Filter 6 gelangt das wässrige
Kulturfiltrat in die Chromatographieeinheit 2. Der
zurückbleibende Filterkuchen wird durch Zugabe von
organischem Lösungsmittel über die die Rohre 5 und durch
rühren wieder in Lösung gebracht. Dabei werden die Zellen
aufgeschlossen. Durch weitere Zugabe von Wässriger Lösung
über die Rohre 5 wird die Endkonzentration des organischen
Lösungsmittels herabgesetzt. Es folgt eine weitere Filtration
durch Druckbeaufschlagung über die Rohre 5 über den gleichen
Filter 6. Dieses Filtrat gelangt in die Chromatographieeinheit 2.
Der zurückbleibende Filterkuchen kann in weiteren Schritten
wie oben beschrieben nochmals bearbeitet werden. Bei der
Chromatographieeinheit 2 dient ein Adsorberharz 7 als
Säulenmaterial. Die durch ihre Wanderungsgeschwindigkeit im
Adsorberharz von den übrigen Bestandteilen ab getrennten
Metabolite werden über eine Pumpe 8 der
Fraktionierungseinheit 3 zugeführt. Diese besteht aus mehreren
Fraktionssammelgläsern 9.
In Fig. 2 ist die Extraktions-Filtrations-Einheit 1 mit Filter 6 in
Explosionsdarstellung gezeigt. Der Behälter 4 ist mit einem
Deckel 10 verschlossen. Zur Positionierung des Filters 6 ist ein
Filterhalter 11 mit einem Lochfilter vorgesehen, an welchen sich
ein Trichter 12 anschließt, der das Gemisch aus der Extraktions-
Filtrations-Einheit in die Chromatographieeinheit einleitet.
Fig. 3 zeigt den Deckel und den Filterhalter mit Lochfilter aus
Fig. 2. In dieser Darstellung sind die Rohre 5 erkennbar, über die
in das in dem Behälter 4 enthaltene Gemisch Druckluft, Wasser
oder organische Lösungsmittel eingeleitet werden können.
Alle in der Beschreibung, den nachfolgenden Ansprüchen und
der Zeichnung dargestellten Merkmale können sowohl einzeln
als auch in beliebiger Kombination miteinander
erfindungswesentlich sein.
1
Extraktions-Filtrations-Einheit
2
Chromatographieeinheit
3
Fraktionierungseinheit
4
Behälter
5
Rohr
6
Filter
7
Adsorberharz
8
Pumpe
9
Fraktionssammelglas
10
Deckel
11
Filterhalter mit Lochfilter
12
Trichter
Claims (16)
1. Verfahren zur Gewinnung von biologisch aktiven
Substanzen, welche als Metabolite bei Mikroorganismen
auftreten,
gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
daß die Mikroorganismen mit einem Nährmedium zu einer Kulturbrühe vermischt und damit zur Bildung von Metaboliten veranlaßt werden,
daß zum Freisetzen der Metabolite aus den Mikroorganismen die Kulturbrühe in einer Extraktions-Filtrations-Einheit (1) gefiltert, das am Filter (6) zurückgehaltetene Gemisch aus Mikroorganismen und unlöslichen Nährmediumbestandteilen mit einem organischen Lösungsmittel vermischt und das Gemisch durch ein Filter (6) geleitet wird,
daß zum Trennen der Metabolite von den übrigen Bestandteilen das Filtrat durch eine Chromatographieeinheit (2) geleitet wird.
daß die Mikroorganismen mit einem Nährmedium zu einer Kulturbrühe vermischt und damit zur Bildung von Metaboliten veranlaßt werden,
daß zum Freisetzen der Metabolite aus den Mikroorganismen die Kulturbrühe in einer Extraktions-Filtrations-Einheit (1) gefiltert, das am Filter (6) zurückgehaltetene Gemisch aus Mikroorganismen und unlöslichen Nährmediumbestandteilen mit einem organischen Lösungsmittel vermischt und das Gemisch durch ein Filter (6) geleitet wird,
daß zum Trennen der Metabolite von den übrigen Bestandteilen das Filtrat durch eine Chromatographieeinheit (2) geleitet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Filtrat nach dem durch die Chromatographieeinheit (2)
erfolgten Auftrennen in einer Fraktionierungseinheit (3)
fraktioniert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der zurückbleibende Filterkuchen im Extraktor (1) durch
Zugabe von Lösungsmitteln und mit Hilfe von Rührsystemen
resuspendiert, weiterverarbeitet und abfiltriert werden
kann. Diese Abfolge der Verfahrensschritte läßt sich
wiederholen.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Kulturbrühe vor dem Einbringen in die Extraktions-
Filtrations-Einheit (1) mit einem inerten porösen Material,
insbesondere mit Celiten, versetzt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch aus
Mikroorganismen, Zellen der Mikroorganismen und den
unlöslichen Nährmediumbestandteilen mit Hilfe von über
Düsen einströmende Luft oder Flüssigkeit mit dem
Lösungsmittel vermischt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturbrühe und das
Gemisch aus Mikroorganismen, Zellen der Mikroorganismen,
unlöslichen Nährmediumbestandteilen und Lösungsmittel
mit Preßluft durch das Filter (6) gedrückt werden.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß als Chromatographieeinheit (2)
eine Säulenchromatographieeinheit verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
als Säulenmaterial ein Adsorberharz (7) verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen der
natürlich vorkommenden Flora und Fauna entnommen
werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen
Verfahrensschritte durch ein speicherprogrammierbares
Steuerungssystem und/ oder einen mit Software
ausgestatteten Rechner gesteuert werden.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Materialien
inert gegenüber den produzierten Substanzen sind. Dafür
wird vorrangig Glas und PTFE verwendet.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass eine nachfolgende Klärung des
Filtrats nach gleichem Verfahren nach geschaltet werden
kann.
13. Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven
Substanzen, welche als Metabolite bei Mikroorganismen
auftreten, insbesondere zur Durchführung des Verfahrens
nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß eine Kombination aus einer Extraktions-Filtrations-
Einheit (1) und einer Chromatographieeinheit (2) vorgesehen
ist.
14. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß
an die Chromatographieeinheit (2) eine
Fraktionierungseinheit (3) angeschlossen ist.
15. Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch
gekennzeichnet, daß als Chromatographieeinheit (2) eine
Säulenchromatographieeinheit vorgesehen ist.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch
gekennzeichnet, daß ein speicherprogrammierbares
Steuerungssystem und/oder ein Rechner zur Steuerung der
Extraktions-Filtrations-Einheit, der Chromatographieeinheit
und/oder der Fraktionierungseinheit vorgesehen ist.
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE19838197 | 1998-08-24 | ||
DE19838197.2 | 1998-08-24 | ||
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Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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DE19940131A Expired - Fee Related DE19940131B4 (de) | 1998-08-24 | 1999-08-24 | Verfahren und Vorrichtung zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen |
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