DE19923567A1 - Gene des 1-Desoxy-D-xylulose-Biosynthesewegs - Google Patents

Gene des 1-Desoxy-D-xylulose-Biosynthesewegs

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft das 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphatreduktoisomerase-Gen, das 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase-Gen und das gcpE-Gen des 1-Desoxy-D-xylulose-Biosynthesewegs und ihre Verwendung zur Transformation von Vektoren, Wirtsorganismen und Pflanzen und zur Bestimmung von Stoffen, die diesen Biosyntheseweg inhibieren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die bei Inte­ gration in das Genom von Viren, Eukaryonten und Prokaryonten die Isoprenoid-Biosynthese verändern sowie gentechnologische Verfahren zur Herstellung dieser transgenen Viren, Eukaryonten und Prokaryonten. Außerdem betrifft sie Verfahren zur Identifi­ ziereung von Stoffen mit herbizider, antimikrobieller, antipa­ rasitärer, antiviraler, fungizider, bakterizider Wirkung bei Pflanzen und antimikrobieller, antiparasitärer, antimykoti­ scher, antibakterieller und antiviraler Wirkung bei Mensch und Tier.
Der Biosyntheseweg zur Bildung von Isoprenoiden über den klas­ sischen Acetat/ Mevalonat-Weg und einen alternativen, Mevalo­ nat-unabhängigen Biosyntheseweg, den Desoxy-D-xylulose- Phosphat-Weg, ist bereits bekannt (Rohmer, M., Knani, M., Simo­ nin, P., Sutter, B., and Sahm, H. (1993): Biochem. J. 295: 517-­ 524).
Es ist aber nicht bekannt, wie und über welche Wege in Viren, Eukaryonten und Prokaryonten eine Änderung der Isoprenoidkon­ zentration über den Desoxy-D-xylulose-Phoshat-Weg erreicht wer­ den kann. In Fig. 1 ist dieser Biosyntheseweg dargestellt.
Es werden daher DNA-Sequenzen zur Verfügung gestellt, die für die 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase (DOXP-Synthase), : 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphatreduktoisomerase(DOXP- Reduktoisomerase) oder das essentielle gcpß-Protein kodieren. Alle drei Gene und Enzyme sind an der Isoprenoid-Biosynthese beteiligt.
Das gcpE-Protein hat zusätzlich noch eine Kinasefunktion und katalysiert die Phosphorylierung eines Zuckers oder eines Phos­ phorzuckers oder einer Vorstufe der Isoprenoidbiosynthese, ins­ besondere die Phosphorylierung von 2-C-Methyl-D-erythritol, 2- C-Methyl-D-erythritol-phosphat, insbesondere 2-C-Methyl-D- erythritol-4-phosphat, 2-C-Methyl-D-erythrose, 2-C-Methyl-D­ erythrose-phosphat, insbesondere 2-C-Methyl-D-erythrose-4- phosphat. In der Vorstufe der Isoprenoidsynthese katalysiert das gcpE-Protein insbesondere die Phosphorylierung der folgen­ den Substanzen:
CH2(OH)-C(CH3)=C(OH)-CH2-O-PO(OH)2, CH2(OH)-C(CH3)=C(OH)-CH2-OH, CH2(OH)-CH(CH3)-CO-CH2-O-PO(OH)2, CH2(OH)-CH(CH3)-CO-CH2-OH CH2=C(CH3)-CO-CH2-O-PO(OH)2, CH2=C(CH3)-CO-CH2-OH, CH2=C(CH3)-CH(OH)-CH2-O-PO(OH)2, CH2=C(CH3)-CH(OH)-CH2-OH, CH2(OH)-C(=CH2)-C(OH)-CH2-O-PO(OH)2,(OH)-C(=CH2)-C(OH)-CH2-OH CHO-CH(CH3)-CH(OH)-CH2-O-PO(OH)2, CHO-CH(CH3)-CH(OH)-CH2-OH, CH2(OH)-C(OH)(CH3)-CH=CH-O-PO(OH)2, CH2(OH)-C(OH)(CH3)-CH=CH-OH CH(OH)=C(CH3)-CH(OH)-CH2-O-PO(OH)2, CH(OH)=C(CH3)-CH(OH)-CH2-OH.
Die DOXP-Synthase katalysiert die Kondensation von Pyruvat und Glyceraldehyd-3-phosphat zu 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat und die DOXP-Reduktoisomerase katalysiert die Umwandlung von 1- Deoxy-D-xylulose-5-phosphat zu 2-C-Methyl-D-erythritol-4- phosphat. (siehe Fig. 1).
Die Erfindung betrifft die folgenden DNA-Sequenzen:
DNA-Sequenzen, die für ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz codieren oder für ein Analoges oder Derivat des Polypeptids gemäß SEQ ID NO:2, worin eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren substituiert worden sind, ohne die enzymatische Wirkung des Polypeptids wesentlich zu reduzieren,
DNA-Sequenzen, die für ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO:4 dargestellten Aminosäuresequenz codieren oder für ein Analoges oder Derivat des Polypeptids gemäß SEQ ID NO:4, worin eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren substituiert worden sind, ohne die enzymatische Wirkung des Polypeptids wesentlich zu reduzieren,
sowie DNA-Sequenzen, die für ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO:6 dargestellten Aminosäuresequenz codieren oder für ein Ana­ loges oder Derivat des Polypeptids gemäß SEQ ID NO:6, worin ei­ ne oder mehrere Aminosäuren deletiert, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren substituiert worden sind, ohne die enzymati­ sche Wirkung des Polypeptids wesentlich zu reduzieren.
Die Gene und ihre Genprodukte (Polypeptide) sind im Sequenzpro­ tokoll mit ihrer Primärstruktur aufgeführt und haben folgende Zuordnung:
SEQ ID NO:1: 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphatreduktoisomerase-Gen
SEQ ID NO:2: 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphatreduktoisomerase
SEQ ID NO:3: 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase-Gen
SEQ ID NO:4: 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase
SEQ ID NO:5: gcpE-Gen
SEQ ID NO:6: gcpE-Protein.
Die DNA-Sequenzen stammen alle aus Plasmodium falciparum.
Außer den im Sequenzprotokoll genannten DNA-Sequenzen sind auch solche geeignet, die infolge der Degeneration des genetischen Codes eine andere DNA-Sequenz besitzen, jedoch für das gleiche Polypeptid oder für ein Analoges oder Derivat des Polypeptids gemäß, worin eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, hinzuge­ fügt oder durch andere Aminosäuren substituiert worden sind, ohne die enzymatische Wirkung des Polypeptids wesentlich zu re­ duzieren.
Die erfindungsgemäßen Sequenzen eignen sich für die Expression von Genen in Viren, Eukaryonten und Prokaryonten, die für die Isoprenoid-Biosynthese des 1-Desoxy-D-xylulose-Wegs verantwort­ lich sind.
Erfindungsgemäß gehören zu den Eukaryonten oder eukaryontischen Zellen tierischen Zellen, Pflanzenzellen, Algen, Hefen, Pilze und zu den Prokaryonten oder prokaryontischen Bakterien Archae­ bakterien und Eubakterien.
Bei Integration einer DNA-Sequenz in ein Genom, auf der eine der oben angegebenen DNA-Sequenzen lokalisiert ist, wird die Expression der oben beschriebenen Gene in Viren, Eukaryonten und Prokaryonten ermöglicht. Die erfindungsgemäß transformier­ ten Viren, Eukaryonten und Prokaryonten werden in an sich be­ kannter Weise gezüchtet und das währenddessen gebildete Isopre­ noid isoliert und gegebenenfalls gereinigt. Nicht alle Isopre­ noide müssen isoliert werden, da die Isoprenoide in einigen Fällen direkt in die Raumluft abgegeben werden.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Viren, Eukaryonten und Prokaryonten zur Veränderung des Isoprenoid-Gehaltes, das die folgenden Schritte enthält.
  • a) Herstellung einer DNA-Sequenz mit folgenden Teilsequenzen
    • a) Promotor, der in Viren, Eukaryonten und Prokaryonten aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgewebe oder den Zielzellen sicherstellt,
    • b) DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO:2,4 oder 6 dargestellten Aminosäuresequenz codieren oder für ein Analoges oder Derivat des Polypeptids ge­ mäß SEQ ID NO:2,4 oder 6,
    • c) 3'-nichttranslatierte Sequenz, die in Viren, Eukaryon­ ten und Prokaryonten zur Addition von Poly-A Resten an das 3'-Ende der RNA führt,
  • b) Transfer und Einbau der DNA-Sequenz in das Genom von Viren, prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen mit oder ohne Verwendung eines Vektors (z. B. Plasmid, virale DNA).
Aus den transformierten Pflanzenzellen können die intakten gan­ zen Pflanzen regeneriert werden.
Die für die Proteine kodierenden Sequenzen der Proteine mit den Nukleotidabfolgen Seq ID NO:1, Seq ID NO:3 und Seq ID NO: 5 können mit einem die Transkription in bestimmten Organen oder Zellen sicherstelleneden Promotor versehen werden, der in sen­ se-Orientierung (3'-Ende des Promotors zum 5'-Ende der kodie­ renden Sequenz) an die Sequenz, die das zu bildende Protein ko­ diert, gekoppelt ist. An das 3'-Ende der kodierenden Seqeunz wird ein die Termination der mRNA-Synthese bestimmendes Termi­ nationssigrial angehängt. Um das zu exprimierende Protein in be­ stimmte subzelluläre Kompartimente, wie Chloroplasten, Amy­ loplasten, Mitochondrien, Vakuole, Cytosol oder Interzellu­ larräume zu dirigieren, kann zwischen den Promotor und die ko­ dierende Sequenz noch eine für eine sogenannte Signalsequenz oder ein Transitpeptid kodierende Sequenz gesetzt werden. Die Sequenz muß im gleichen Leserahmen wie die kodierende Sequenz des Proteins sein. Zur Vorbereitung der Einführung der erfin­ dungsgemäßen DNA-Sequenzen in höhere Pflanzen sind eine große Anzahl von Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikations­ signal für E.coli und einen Marker beinhalten, der eine Selek­ tion der transformierten Zellen erlaubt. Beispiele für Vektoren sind pBR 322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC 184, EMBL 3 usw. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanze kön­ nen weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden zum Bei­ spiel für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri- Plasmid verwendet, so muß mindestens eine rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich den einzuführenden Genen eingefügt werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transforma­ tion von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120516; Hoekama, in: The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerij Kanters B. V. Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit.Rev.Plant Sci. 4, 1-46 und An et al. (1985) EMBO J. 4, 277-287 beschrieben worden. Ist die eingeführte DNA einmal im Genom integriert, so ist sie in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zellen erhalten. Sie erhält normalerweise einen Selektionsmar­ ker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum, wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell verwendete Marker sollte daher die selektion trans­ formierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingefügte DNA fehlt, gestatten.
Für die Einführung von DNA in eine Pflanze stehen viele Techni­ ken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation mit Hilfe von Agrobakterien, z. B. Agrobacterium tumefaciens, die Fusion von Protoplasten, die Mikroinjektion von DNA, die Elekroporation, sowie ballistische Methoden und die Virusinfek­ tion. Aus dem transformierten Pflanzenmaterial können dann im geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selek­ tion enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.
Bei der Injektion und Elektroporation sind an sich keine spezi­ ellen Anforderungen an die Plasmide gestellt. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert wer­ den, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens not­ wendig. Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflan­ zen in der üblichen Weise (McCormick et al. (1986), Plant Cell Reports 5, 81-84). Die Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen haben, gekreuzt werden. Die daraus entstehen­ den Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigen­ schaften.
Weiterhin sind Gegenstand der Erfindung Expressionsvektoren, die eine oder mehrere der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen ent­ halten. Solche Expressionsvektoren erhält man, indem man die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen mit geeigneten funktionellen Regulationssignalen versieht. Solche Regulationssignale sind DNA-Sequenzen, die für die Expression verantwortlich sind, bei­ spielsweise Promotoren, Operatoren, Enhancer, ribosomale Bin­ dungsstellen, uhd die vom Wirtsorganismus erkannt werden.
Gegebenenfalls können noch weitere Regulationssignale, die bei­ spielsweise Replikation oder Rekombination der rekombinanten DNA im Wirtsorganismus steuern, Bestandteil des Expressionsvek­ tors sein.
Ebenso gehören die mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Expressionsvektoren transformierten Wirtsorganismen zum Gegen­ stand der Erfindung.
Für die Expression der erfindungsgemäßen Enzyme eignen sich be­ sonders solche Wirtszellen und Organismen, die keine intrinsi­ schen Enzyme mit der Funktion der DOXP-Synthase, der DOXP- Reduktoisomerase oder des gcpE-Proteins aufweisen. Dies trifft für Archaebacterien, Tiere, Pilze, Schleimpilze und einige Eu­ bakterien zu. Durch das Fehlen dieser intrinsischen Enzymakti­ vitäten wird die Detektion und Aufreinigung der rekombinanten Enzyme wesentlich erleichtert. Auch wird es erst dadurch mög­ lich, mit geringem Aufwand die Aktivität und insbesondere die Hemmung der Aktivität der erfindungsgemäßen rekombinanten Enzy­ me durch verschiedenen Chemikalien und Pharmaka in Rohextrakten aus den Wirtszellen zu messen.
Die Expression der erfindungsgemäßen Enzyme erfolgt vorteilhaf­ terweise dann in eukaryontischen Zellen, wenn posttranslatori­ sche Modifikationen und eine native Faltung der Polypeptidkette erreicht werden soll. Außerdem wird in Abhängigkeit vom Expres­ sionssystem bei der Expression genomischer DNA-Sequenzen er­ reicht, daß Introns durch Spleißen der DNA beseitigt und die Enzyme in der für die Parasiten charakteristischen Polypep­ tidsequenz produziert werden. Für Introns codierende Sequenzen können auch durch rekombinante DNA-Technologie aus den zu ex­ primierenden DNA-Sequenzen beseitigt oder experimentell einge­ fügt werden.
Die Isolierung des Proteins kann aus der Wirtszelle oder dem Kulturüberstand der Wirtszelle nach dem Fachmann bekannten Ver­ fahren erfolgen. Es kann auch eine in vitro Reaktivierung der Enzyme erforderlich sein.
Zur Erleichterung der Aufreinigung können die erfindungsgemäßen Enzyme oder Teilsequenzen der Enzyme als Fusionsprotein mit verschiedenen Peptidketten exprimiert werden. Dazu eigenen sich besonders Oligo-Histidin-Sequenzen und Sequenzen, die von der Glutathion-S-Transferase, Thioredoxin oder Calmodulin-bindenden Peptiden abgeleitet sind. Fusionen mit Thioredoxin-abgeleiteten Sequenzen eignen sich besonders für prokaryontische Expression, da dadurch die Löslichkeit der rekombinanten Enzyme erhöht wird.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Enzyme oder Teilsequen­ zen der Enzyme als Fusionsprotein mit solchen, dem Fachmann be­ kannten, Peptidketten exprimiert werden, daß die rekombinanten Enzyme in das extrazelluläre Millieu oder in bestimmte Kompar­ timente der Wirtszellen transportiert werden. Dadurch kann so­ wohl die Aufreinigung, als auch die Untersuchung der biologi­ schen Aktivität der Enzyme erleichtert werden.
Bei der Expression der erfindungsgemäßen Enzyme kann es sich als zweckmäßig erweisen, einzelne Codone zu verändern. Dabei ist der gezielte Austausch von Basen in der kodierenden Region auch sinnvoll, wenn die genutzten Codone in den Parasiten ab­ weichend sind von der Codonnutzung im heterologen Expressions­ system, um eine optimale Synthese des Proteins zu gewährlei­ sten. Zudem sind oft Deletionen von nicht-translatierten 5' bzw. 3'-Abschnitten sinnvoll, beispielsweise wenn mehrere destabili­ sierende Sequenzmotive ATTTA im 3'-Bereich der DNA vorliegen. Dann sollten diese bei der bevorzugen Expression in Eukaryonten deletiert werden. Veränderungen dieser Art sind Deletionen, Ad­ ditionen oder Austausch von Basen und ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Enzyme unter standardi­ sierten Bedingungen durch dem Fachmann bekannte Techniken durch in vitro-Translation gewonnen werden. Dafür geeignete Systeme sind Kaninchen-Reticulozyten- und Weizenkeimextrakte und Bakte­ rienlysate. Auch kann in vitro transskribierte mRNA in Xenopus- Oocyten translatiert werden.
Durch chemische Synthese können Oligo- und Polypeptide herge­ stellt werden, der Sequenzen aus der Peptidsequenz der erfin­ dungsgemäßen Enzyme abgeleitet sind. Bei geeigneter Wahl der Sequenzen besitzen derartige Peptide Eigenschaften, die für die vollständigen erfindungsgemäßen Enzyme charakteristisch sind. Derartige Peptide können in großen Mengen hergestellt werden und eignen sich besonders für Studien über die Kinetik der En­ zymaktivität, die Regulation der Enzymaktivität, die dreidimen­ sionale Struktur der Enzyme, die Hemmung der Enzymaktivität durch verschiedenen Chemikalien und Pharmaka und die Bindungs­ geometrie und Bindungsaffinität verschiedener Liganden.
Vorzugsweise wird zur rekombinanten Herstellung der erfindungs­ gemäßen Enzyme eine DNA mit den Nukleotiden aus den Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3 und 5 verwendet.
Wie in dem dieser Anmeldung zugrundeliegenden Prioritätsdoku­ ment beschrieben, hat sich herausgestellt, daß in vielen Para­ siten, Bakterien, Viren und Pilzen dieser der Desoxy-D- xylulose-Phosphat-Stoffwechselweg ebenfalls vorliegt.
Die Erfindung umfaßt daher außerdem ein Verfahren zum Screening einer Verbindung. Gemäß diesem Verfahren wird ein Wirtsorganis­ mus, der einen rekombinanten Expressionsvektor enthält, wobei der Vektor zumindest einen Teil der Olignukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 oder Varianten oder Homologe dieser aufweist, und außerdem eine Verbindung, von der vermutet wird, daß sie eine antimikrobielle, antiparasitäre, antibakterielle, antivirale und antimykotische Wirkung bei Mensch und Tier oder eine antimikrobielle, antivirale, bakteri­ zide, herbizide oder fungizide Wirkung bei Pflanzen hat, be­ reitgestellt. Anschließend wird der Wirtsorganismus mit der Verbindung in Kontakt gebracht und die Wirksamkeit der Verbin­ dung bestimmt.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung sind Methoden zur Be­ stimmung der enzymatische Aktivität des gcpE-Proteins. Diese kann nach den bekannten Anleitungen bestimmt werden. Hierbei wird die Phosphorylierung eines Zuckers oder eines Phosphorzuc­ kers oder einer Vorstufe der Isoprenoidbiosynthese, insbeson­ dere die Phosphorylierung von 2-C-Methyl-D-erythritol, 2-C- Methyl-D-erythritol-phosphat, insbesondere 2-C-Methyl-D- erythritol-4-phosphat, 2-C-Methyl-D-erythrose, 2-C-Methyl-D- erythrose-phosphat, insbesondere 2-C-Methyl-D-erythrose-4- phosphat, detektiert. Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist die Verwendung dieser Meßverfahren zur Ermittlung von Stof­ fen, die die Aktivität der jeweiligen Enzyme inhibieren.
Analog erfolgt die Bestimmung der Aktivitäten von DOXP-Synthase und DOXP-Reduktoisomerase. Für die Bestimmung der DOXP- Synthase-Aktivität eignen sich auch fluorimetrische Verfahren, wie von Querol et al. beschrieben (Querol et al. Abstracts 4tn european symposium on plant isoprenoids, Barcelona 21-23 April 1999).
Sequenzprotokoll

Claims (15)

1. DNA-Sequenzen, die für ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO:­ 2 dargestellten Aminosäuresequenz codieren oder für ein Analoges oder Derivat des Polypeptids gemäß SEQ ID NO:2, worin eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren substittuiert worden sind, oh­ ne die enzymatische Wirkung des Polypeptids wesentlich zu reduzieren.
2. DNA-Sequenzen, die für ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO:­ 4 dargestellten Aminosäuresequenz codieren oder für ein Analoges oder Derivat des Polypeptids gemäß SEQ ID NO:4, worin eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren substituiert worden sind, oh­ ne die enzymatische Wirkung des Polypeptids wesentlich zu reduzieren.
3. DNA-Sequenzen, die für ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO:­ 6 dargestellten Aminosäuresequenz codieren oder für ein Analoges oder Derivat des Polypeptids gemäß SEQ ID NO:6, worin eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren substituiert worden sind, oh­ ne die enzymatische Wirkung des Polypeptids wesentlich zu reduzieren.
4. DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß sie außerdem funktionelle Regulations­ signale, insbesondere Promotoren, Operatoren, Enhancer, ri­ bosomale Bindungsstellen, aufweist.
5. DNA-Sequenz mit folgenden Teilsequenzen
  • a) Promotor, der in Viren, Eukaryonten und Prokaryonten aktiv ist und die Bildung einer RNA im vorgesehenen Zielgewebe oder den Zielzellen sicherstellt,
  • b) DNA-Sequenzen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3,
  • c) 3'-nichttranslatierte Sequenz, die in Viren, Eukaryon­ ten und Prokaryonten zur Addition von Poly-A Resten an das 3'-Ende der RNA führt.
6. Verfahren zur Herstellung von transgenen Viren, Eukaryonten und Prokaryonten zur Veränderung des Isoprenoid-Gehaltes, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 4 oder 5 in das Genom von Viren, eukaryontischen und proka­ ryontischen Zellen mit oder ohne Verwendung eines Plasmids transferiert und eingebaut wird.
7. Expressionsvektor, enthaltend eine oder mehrere DNA- Sequenzen gemäß Anspruch 1 bis 3.
8. Protein, welches am 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat- Stoffwechselweges beteiligt ist und a) codiert wird von der in DNA-Sequenz SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder b) codiert wird von DNA-Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder Fragmenten dieser DNA-Sequenzen im DNA-Bereich, der für das reife Protein codiert, hybridisieren.
9. Protein nach den Anspruch 8, erhältlich aus den Kulturüber­ ständen von Parasiten oder aus den aufgeschlossenen Parasi­ ten und Aufreinigung über chromatographische und elektro­ phoretische Techniken.
10. Protein nach einem der Ansprüche 8 und 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es a) das Produkt einer viralen, prokaryonti­ schen oder eukaryontischen Expression einer exogenen DNA ist, b) codiert wird von den Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 oder codiert wird von DNA-Sequenzen, die mit den in den DNA-Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 oder Fragmenten dieser DNA-Sequenzen im DNA-Bereich, der für das reife Protein ko­ diert, hybridisieren, oder c) codiert wird von DNA- Sequenzen, die ohne Degeneration des genetischen Codes mit den in b) definierten Sequenzen hybridisieren würden und für ein Polypeptid mit entsprechender Aminosäure-Sequenz kodieren.
11. Protein gemäß einem der vorangehenden Ansprüchen, welches aus den Aminosäuren von Sequenz SEQ ID NO: 2, 4 und 6 be­ steht.
12. Verfahren zur Bestimmung der enzymatische Aktivität des gcpE-Proteins, dadurch gekennzeichnet., daß Phosphorylierung eines Zuckers oder eines Phosphorzuckers oder einer Vdrstu­ fe der Isoprenoidbiosynthese, insbesondere die Phosphory­ lierung von 2-C-Methyl-D-erythritol, 2-C-Methyl-D- erythritol-phosphat, insbesondere 2-C-Methyl-D-erythritol- 4-phosphat, 2-C-Methyl-D-erythrose, 2-C-Methyl-D-erythrose­ phosphat, insbesondere 2-C-Methyl-D-erythrose-4-phosphat, und der Phosphat- und Alkoholvorstufen, detektiert wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Phosphorylierung der folgenden Phosphate oder Alkohole de­ tektiert wird:
CH2(OH)-C(CH3)=C(OH)-CH2-O-PO(OH)2, CH2(OH)-C(CH3)=C(OH)-CH2-OH, CH2(OH)-CH(CH3)-CO-CH2-O-PO(OH)2, CH2(OH)-CH(CH3)-CO-CH2-OH CH2=C(CH3)CO-CH2-O-PO(OH)2, CH2=C(CH3)-CO-CH2-OH, OH2=C(CH3)-CH(OH)-CH2-O-PO(OH)2, CH2=C(CH3)-CH(OH)-CH2-OH, CH2(OH)-C(=CH2)-C(OH)-CH2-O-PO(OH)2, CH2(OH)-C(=CH2)-C(OH)-CH2-OH CHO-CH(CH3)-CH(OH)-CH2-O-PO(OH)2, CHO-OH(CH3)-CH(OH)-CH2-OH, CH(OH)-C(OH)(CH3)-CH=CH-O-PO(OH)2, CH2(OH)-C(OH)(CH3)-CH=CH-OH CH(OH)=C(CH3)-CH(OH)-CH2-O-PO(OH)2, CH(OH)=C(CH3)-CH(OH)-CH2-OH
14. Verfahren zum Screening einer Verbindung, wobei das Verfah­ ren umfaßt:
  • a) Bereitstellen einer Wirtszelle, die einen rekombinanten Expresslonsvektor enthält, wobei der Vektor zumindest einen Teil der Olignukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:5 oder Varianten oder Ana­ loga dieser aufweist, und außerdem. eine Verbindung, von der vermutet wird, daß sie eine antimykotische, antibio­ tische, antiparasitäre oder antivirale Wirkung bei Mensch und Tier hat,
  • b) In-Kontakt-Bringen der Wirtszelle mit der Verbindung und
  • c) Bestimmung der antimikrobiellen, antimykotischen, anti­ biotischen, antiparasitären oder antiviralen Wirksamkeit der Verbindung.
15. Verfahren zum Screening einer Verbindung, wobei das Verfah­ ren umfaßt:
  • a) Bereitstellen einer Wirtszelle, die einen rekombinanten Expressionsvektor enthält, wobei der Vektor zumindest einen Teil der Olignukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:5 oder Varianten oder Ana­ loga dieser aufweist, und außerdem eine Verbindung, von der vermutet wird, daß sie eine antimikrobielle, antivi­ rale, antiparasitäre, bakterizide, fungizide oder herbi­ zide Wirkung bei Pflanzen hat,
  • b) In-Kontakt-Bringen der Wirtszelle mit der Verbindung und
  • c) Bestimmung der antimikrobiellen, antiviralen, antipara­ sitären, bakteriziden, fungiziden oder herbiziden Wirk­ samkeit der Verbindung.
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