DE19915867A1 - Nucleosid-Derivate mit photolabilen Schutzgruppen - Google Patents

Nucleosid-Derivate mit photolabilen Schutzgruppen

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Markus Beier
Joerg Hoheisel
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Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleosid-Derivate mit photolabilen Schutzgruppen der allgemeinen Formel (I) DOLLAR F1 mit DOLLAR A R·1· = H, NO¶2¶, CN, OCH¶3¶, Halogen, Alkyl-, Alkoxy- oder Alkoxyalkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen DOLLAR A R·2· = H, OCH¶3¶, NO¶2¶, CN, Halogen, Alkoxy-, Alkoxyalkyl- oder Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen oder ein Arylrest DOLLAR A R·3· = H, Halogen, NO¶2¶, CN, Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen oder Arylrest oder aliphatischer Arylrest mit 2 bis 5 C-Atomen DOLLAR A R·4· = H, Halogen, OCH¶3¶, CN, NO¶2¶, Alkoxy-, Alkoxyalkyl- oder Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen oder Arylrest DOLLAR A R·5· = H oder eine bei der Herstellung von Oligonukleotiden übliche Schutzgruppe DOLLAR A R·6· = H, OH, Halogen, Alkoxy- oder Alkoxyalkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen oder XR·8·, wobei X = O oder S und R·8· = eine in der Nukleotidchemie übliche Schutzgruppe DOLLAR A R·7· = H, NO¶2¶, CN, OCH¶3¶, Halogen, Alkyl- oder Alkoxyalkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen oder ein Arylrest DOLLAR A X = SO¶2¶, OCO, OCS DOLLAR A B = H, Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil, 2,6-Diaminopurin-9-yl, Hypoxanthin-9-yl, 5-Methylcytosin-1-yl, 5-Amino-4-Imidazolcarbonsäure-1-yl oder 5-Amino-4-Imidazolcarbonsäureamid-3-yl, wobei im Falle von B = Adenin, Cytosin oder Guanin die primäre Aminofunktion ggf. eine permanente Schutzgruppe aufweist bzw. Thymin oder Uracil an der O4-Position ggf. eine permanente Schutzgruppe aufweist. DOLLAR A Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieser Nucleoside, deren Verwendung und daraus aufgebaute Nucleinsäure-Chips.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Nucleosid-Derivate mit photolabilen Schutzgruppen, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung sowie daraus aufgebaute Nucleinsäure-Chips.
Photolabile Schutzgruppen für die Hydroxy- und Phosphatfunktionen in Nucleosi­ den bzw. Nucleotiden sind von Bedeutung, da sie sich für die lichtgesteuerte Parallel-Synthese von Oligonukleotiden auf einer soliden Trägeroberfläche eignen (Fodor et al., Science 1991, 251, S. 767 ff.). Hiermit können Oligonukleotide oder Nukleinsäure-Chips aufgebaut werden, die für eine effiziente Sequenzierung von Nukleinsäuren eingesetzt werden können.
Bislang sind einzig photolithografische Herstellungsverfahren von DNA-Chips unter Verwendung von 3'-O-Phosphitamiden, die entsprechend die temporäre photolabile Schutzgruppe an der 5'-O-Position aufweisen, bekannt (WO-A- 96/18634). Unter Verwendung dieser Nucleinsäurebausteine lassen sich DNA- Chips herstellen, wobei der Aufbau des Oligomers vom 3'- zum 5'-Ende erfolgt. Das fertiggestellte Oligomer ist somit über das 3'-O-Ende an der festen Phase verankert, das 5'-OH-Ende ist frei zugänglich. DNA-Chips, die mit dieser Metho­ de erzeugt wurden, lassen sich für Hybridisierungsexperimente verwenden, aber nicht für bestimmte Enzymreaktionen (z. B. mit der der DNA-Polymerase oder Ligase), die ein freies 3'-OH erfordern.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, 3'-photolabile Nucleoside und deren Derivate bereitzustellen und mit den daraus gewonnenen 3'-photolabilen Nucleosiden Nukleinsäure-Chips zu generieren, bei denen die über die lichtgesteuerte Synthese aufgebauten Oligomeren über das 5'-Ende an die feste Phase gekoppelt sind und somit Enzymreaktionen am 3'-Ende möglich machen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Nucleosid-Derivate der allgemei­ nen Formel (I) entsprechend Patentanspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltun­ gen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Erfindungsgemäße Nucleosid-Derivate haben folgende Formel:
mit
R1 = H, NO2, CN, OCH3, Halogen, Alkyl-, Alkoxy- oder Alkoxyalkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen
R2 = H, OCH3, NO2, CN, Halogen, Allkoxy-, Alkoxyalkyl- oder Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen oder ein Arylrest
R3 = H, Halogen, NO2, CN, Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen oder Arylrest oder aliphatischer Acylrest mit 2 bis 5 C-Atomen
R4 = H, Halogen, OCH3, CN, NO2, Alkoxy-, Alkoxyalkyl- oder Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen oder Arylrest
R5 = H oder eine bei der Herstellung von Oligonukleotiden übliche Sch­ utzgruppe
R6 = H, OH, Halogen, Alkoxy- oder Alkoxyalkylrest mit 1 bis 4 C-Ato­ men oder XR8, wobei X = O oder S und R8 = eine in der Nukleo­ tidchemie übliche Schutzgruppe
R7 = H, NO2, CN, OCH3, Halogen, Alkyl- oder Alkoxyalkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen oder ein Arylrest
X = SO2, OCO, OCS
B = H, Adenin, Cytosin, Guanin, Thyimin, Uracil, 2,6-Diaminopurin-9-yl, Hypoxanthin-9-yl, 5-Methylcytosin-1-yl, 5-Amino-4-Imidazolcarbon­ säure-1-yl oder 5-Amino-4-Imidazolcarbonsäureamid-3-yl, wobei im Falle von B = Adenin, Cytosin oder Guanin die primäre Aminofunk­ tion ggf. eine permanente Schutzgruppe aufweist bzw. Thymin oder Uracil an der O4-Position ggf. eine permanente Schutzgruppe aufweist.
Die Alkyl-, Alkoxy- oder Alkoxyalkylgruppe der Reste R1, R2, R3, R4 und R7 kann linear oder verzweigt sein, substituiert (insbesondere mit einem oder mehreren Halogenatomen) oder unsubstituiert sowie gesättigt oder ungesättigt sein. Analoges gilt für die Arylgruppe der Reste R2, R3, R4 oder R7 bzw. den Acylrest des Rests R3.
Vorzugsweise stellt R4 H oder einen Methylrest dar. Im Falle von R4 ≠ H sind die Substituenten R1-R3 am Phenylring vorzugsweise Wasserstoffreste. Außerdem stellt im Falle von R2 = OCH3 R3 vorzugsweise einen Wasserstoffrest dar.
In der Position R5 bedeutet "eine bei der Herstellung von Oligonukleotiden übliche Schutzgruppe" beispielsweise eine Phosphitamid-Gruppe, wie p-NC-CH2- CH2-O-P-N(Q)2, p-NC-C6H4-CH2-CH2-O-P-N(Q)2, p-NO2-C6H4-CH2-CH2-O-P-N(Q)2 oder CH2 = CH-CH2-O-P-N(Q)2, wobei die Q-Gruppen gleich oder verschieden sein können und lineare oder verzweigte Alkylreste mit 1 bis 4 C-Atomen, vorzugs­ weise Ethyl- oder Isopropylreste, bedeuten.
In der Position R6 bedeutet "eine in der Nukleotidchemie übliche Schutzgruppe" (= R8) insbesondere H sowie die üblichen Alkyl-, Alkenyl-, Acetal- oder Silylet­ her-Schutzgruppen. Bevorzugte Schutzgruppen sind Methyl- oder Ethylreste, Allylreste, Tetrahydropyranyl- bzw. Methoxytetrahydropyranyl-Reste sowie t- Butyldimethylsilyl-Reste.
Die an den Basen B ggf. permanent vorkommenden Schutzgruppen basieren vorzugsweise auf Acyl-Schutzgruppen. Bevorzugt sind vor allem Phenoxyacetyl-, tert-Butylphenoxyacetyl-, Isobutyryl-, Acetyl-, Benzoyl-, Allyl-, Phthaloyl-, Dansylethyloxycarbonyl-, 2-(4-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl-oder Dimethylforma­ midino-Reste. Im Falle von Adenin, Cytosin und Guanin handelt es sich vorzugs­ weise um Phenoxyacetyl-, tert-Butylphenoxyacetyl, Acetyl- oder 2-(4-Nitrophe­ nyl)ethoxycarbonyl-Gruppen zum Schutz der exocyclischen Aminofunktionen. Die O6-Position von Guanin kann ggf. durch eine Schutzgruppe wie 2-(4-Nitro­ phenylsulfonyl)ethyl- oder 2-(4-Nitrophenyl)ethyl- geschützt sein. Ebenso kann die O4-Position von Thymin oder Uracil eine Schutzgruppe wie 2-(4-Nitrophenyl­ sulfonyl)ethyl- oder 2-(4-Nitrophenyl)ethyl- aufweisen.
Halogen bedeutet erfindungsgemäß F, Cl, Br, I, wobei die drei erstgenannten bevorzugt sind.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Nucleosid-Derivate ist beispielhaft in Fig. 2 gezeigt, worauf nachfolgend Bezug genommen wird. Die Erwähnung von be­ stimmten Halogen- und Alkylsubstitutionen schließt immer gleichwirkende Äquivalente ein, z. B. "Chlor-" schließt nicht aus, daß auch die entsprechenden Fluor- oder Bromverbindungen einsetzbar sind. Ebensolches gilt für "Methyl-", das auch die entsprechenden anderen Niederalkylverbindungen, wie Ethyl-, Propyl- oder Butyl mit einschließt. Die Reste R1, R2, R3, R4, R6, R7 und X haben die oben genannten Bedeutungen.
Die Herstellung beginnt mit der Präparation eines Acylierungsreagenzes. Hierzu wird auf Fig. 1 verwiesen. Ausgegangen wird hierfür bevorzugt von einem Chlorkohlensäureester (II, mit X = OCO), der sich beispielsweise gemäß der Vorschrift in WO-A-96/18634 oder gemäß nachfolgendem Beispiel 1 erhalten läßt. Analog ist ein gewünschter Chlorthiokohlensäureester (II, mit X = OCS) über die analoge Umsetzung mit Thiophosgen zugänglich. Das Acylierungs­ reagenz (IV) wird dann durch Umsetzung des Chlorkohlensäureesters (II, mit X = OCO) oder des Chlorthiokohlensäureesters (II, mit X = OCS) oder ein entsprechendes Sulfonylchlorid-Derivat (II, X = SO2) mit einer Verbindung (III), vorzugsweise N-Methylimidazol, generiert. Diese Reaktionen werden in einem polaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Dichlormethan, bei Temperatu­ ren zwischen -10°C und +10°C, vorzugsweise bei 0°C, durchgeführt. Vor­ zugsweise wird der Reaktion Molekularsieb zugesetzt und mit einem Überschuß an Verbindung (III), bevorzugt N-Methylimidazol, in bezug auf die eingesetzte Verbindung (II) gearbeitet: 1-10 Äquivalente, bevorzugt 2-5 Äquivalente. Alter­ nativ zu N-Methylimidazol kann die Generation des Acylierungsreagenzes auch mittels anderer heterocyclischer Verbindungen (III), wie Pyridin, 4-N,N-Dimethyl­ aminopyridin (DMAP), Triazol, Tetrazol oder Imidazol verlaufen.
Alternativ ist das Acylierungsreagenz (IV, Z = triflat) ausgehend von N,N-Carbo­ nyldiimidazol (V, Y = CO) oder N,N-Thiocarbonyldiimidazol (V, Y = CS) nach Methylierung mit einem Methylierungsreagenz (VI), vorzugsweise Trifluorme­ thansulfonsäuremethylester, und Umsetzung mit dem entsprechenden Alkohol (VIII) zugänglich. Hierbei wird die Reaktion bevorzugt in einem polaren organi­ schen Lösungsmittel, vorzugsweise in Nitromethan oder einem Gemisch von Nitromethan und Dichlormethan, bei Temperaturen zwischen -10 und +10°C, vorzugsweise 0°C, durchgeführt. Die Methylierung von (V) erfolgt beispiels­ weise gemäß Rapoport et al., J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, S. 4856-4859. Nach erfolgter Methylierung wird der entsprechende Alkohol (VIII) zugesetzt und somit das Acylierungsmittel vom Imidazoliumtyp (IV, Z = triflat) in Form eines Triflatsalzes generiert. Werden bei der Methylierung von (V) als Methylierungs­ reagenz (VI) Methyljodid oder Meerweinsalze eingesetzt, können die Acylierungs­ reagenzien (IV) entsprechend in Form ihrer Iodid oder Tetrafluoroborat-Salze erzeugt werden. Die Umsetzung von Verbindung (V) mit dem entsprechenden Methylierungsmittel erfolgt vorzugsweise im Verhältnis 1 : 1 bis 1 : 10, bevorzugt im Verhältnis 1 : 2. Die Umsetzung der methylierten Form (VI) mit dem entspre­ chenden Alkohol (VIII) erfolgt vorzugsweise im Verhältnis 1 : 1 bis 1 : 10, ganz bevorzugt im Verhältnis 1 : 1 bis 1 : 2.
Das Acylierungsreagenz (IV) wird weiter mit einem ggf. geschützten Nucleosid (IX) umgesetzt. 5'-DMTr-geschützte Nucleoside der allgemeinen Formel (IX) sind beispielsweise käuflich erhältlich von den Firmen Proligo, Fluka, Sigma oder Aldrich.
Die Umsetzung des Acylierungsreagenz (IV) mit den geschützen Nukleosiden (IX) erfolgt vorzugsweise in Dichlormethan oder einem Lösungsmittelgemisch aus Dichlormethan und einem polaren organischen Lösungsmittel ggf. in Gegenwart einer Base, wie Pyridin, N-Methylimidazol, 4,N,N-Dimethylaminopyridin, Ethyldii­ sopropylamin (EtN(i-pr)2) oder Triethylamin, bei Temperaturen zwischen -60 und +25°C, bevorzugt 0°C. Als polares organisches Lösungsmittel wird vorzugs­ weise Dichlorethan, Nitromethan, DMF oder Pyridin eingesetzt. Das Mischungs­ verhältnis von Dichlormethan zu dem polaren organischen Lösungsmittel unter­ liegt keiner Beschränkung. Vorzugsweise werden jedoch 1 bis 3 Vol.-Teile Dichlormethan pro Vol.-Teil polarem organischem Lösungsmittel eingesetzt. Bevorzugt wird eine Lösung des Acylierungsreagenz (IV) in Dichlormethan vor­ gelegt und das Nucleosid (IX), welches ebenso in Dichlormethan gelöst wurde, zugetropft. Das Molverhältnis von Acylierungsreagenz zu Nucleosid kann vor­ zugsweise zwischen 1 : 1 bis 5 : 1, bevorzugt bei 3 : 1, ganz bevorzugt bei 2 : 1 liegen, d. h. das Acylierungsreagenz wird bevorzugt im Überschuß verwendet. Die Konzentration des Nucleosids im Lösungsmittelgemisch unterliegt keiner Be­ schränkung. Sie liegt jedoch bevorzugt im Bereich von 0,1 bis 3,0 mmol pro 10 ml Lösungsmittel.
Nach erfolgter Umsetzung (bevorzugte Reaktionszeit: 1-12 Std.) kann das erhaltene Nucleosid-Derivat (X) isoliert werden. Danach erfolgt das Abspalten der 5'-Schutzgruppe am Nucleosidbestandteil durch Umsetzen mit bevorzugt Trichloressigsäure oder Toluolsulfonsäure, ggf. mit Camphersulfonsäure oder Dichloressigsäure in Dichlormethan. Es wird das Nucleosid-Derivat (XI) erhalten, das Formel (I) gehorcht.
Falls es gewünscht ist, kann an der 5'-Position des Nucleosid-Derivats (XI) eine Phosphitamid-Gruppe eingeführt werden. Dies geschieht beispielsweise durch die Umsetzung des Nucleosid-Derivats (XI) mit Bis(diisopropylamino)(β-cyanoethoxy)­ phosphin unter Zusatz eines leicht aciden Katalysators (beispielsweise Tetrazol, Pyridin-Hydrochlorid) oder durch Umsetzung des Nucleosidderivats mit Chlor- Diisopropylamino-2-cyanoethoxylphosphin unter Zusatz einer Base (z. B. Dii­ sopropylethylamin, N-Methylmorphin, Lutidin oder Collidin) und einem Lösungs­ mittel (z. B. THF). Dabei entsteht Verbindung (XII).
Der Vorteil die Umsetzung des geschützten Nucleosids mit einem milden Acylie­ rungsreagenz durchzuführen, liegt in der Selektivität der Reaktion. Es werden quantitative Acylierungen der 3'-O-Position des Nucleosidbausteins ohne nach­ teilige Nebenproduktformation erhalten. Werden hierzu reaktivere Acylierungs­ reagenzien, wie z. B. der Chlorkohlensäureester selbst, verwendet, tritt eine unkontrollierte Reaktion ein. Es werden eine große Anzahl von Nebenprodukten gebildet, d. h. es besteht hierbei keinerlei Selektivität für das gewünschte 3- monoacylierte Produkt. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform wird das geschützte Nucleosid mit dem Acylierungsreagenz unter Zusatz von Molekularsieb durchgeführt. Mit Molekularsieb ist eine Steigerung der Selektivi­ tät für das gewünschte 3'-monoacylierte Produkt zu beobachten.
Die erfindungsgemäßen 3'-photolabilen Nucleoside können bei der photolithogra­ fischen Nukleinsäurechip-Synthese eingesetzt werden. Verfahren hierzu sind dem Fachmann ausreichend bekannt (z. B. Fodor et al., s. o.). Ein geeignetes Verfahren hierzu ist beispielsweise auch in der deutschen Anmeldung DE 198 58 440.7 gezeigt. Dort wird zwar ein Verfahren gezeigt, das von 5'-photolabilen Nucleosiden ausgeht, aber die dort gezeigte Methodik läßt sich auf die Ver­ wendung von 3'-photolabilen 5'-Phosphitamiden analog übertragen. Bei diesem Verfahren wird der bei der Chip-Synthese übliche Bestrahlungsschritt in Anwe­ senheit einer Base durchgeführt wird. Dieses Verfahren zur photolithographischen Biochip-Synthese bietet den Vorteil, daß eine effiziente Abspaltung von photola­ bilen Schutzgruppen stattfindet.
Unter einem Nucleinsäurechip sollen erfindungsgemäß auf einem Träger aufge­ baute Biomoleküle, wie DNA oder RNA, sowie Nucleinsäureanaloga, wie PNA, LNA oder Chimären von diesen mit DNA, RNA oder untereinander verstanden werden.
Erfindungsgemäß ist jegliche(r) auf diesem Gebiet übliche Träger bzw. Matrix bei der Nucleinsäurechip-Herstellung einsetzbar. Dies sind insbesondere Glas, Folien bzw. Membranen aus Polypropylen, Nylon, Cellulose, Cellulosederivate (z. B. Celluloseacetat, Cellulose-Mischester), Polyethersulfonen, Polyamiden, Polyvinyl­ chlorid, Polyvinylidenfluorid, Polyester, Teflon oder Polyethylen. Die Trägerober­ flächen können auch mit freien oder geschützten funktionellen Gruppen versehen sein, z. B. eine Amino-Gruppe, Hydroxyl-Gruppe, Carboxyl-Gruppe, Carbonyl- Gruppe, Thiol-, Amid- oder Phosphat-Gruppe tragen. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Trägeroberflächen eine Derivatisierung gemäß der deutschen Patentanmeldung 198 53 242.3 auf.
Bei dem oben genannten bevorzugten Verfahren zur photolithographischen Bio­ chip-Synthese gemäß der deutschen Anmeldung DE 198 58 440.7 werden die Schritte Kondensation, Oxidation und Capping wie üblich (Fodor et al., Science 1991, 251, S. 767 ff.) durchgeführt. Allerdings findet der erste Schritt der Syn­ these, nämlich die Bestrahlung, unter Zusatz von Basen, bevorzugt starken Basen, insbesondere nicht-nukleophilen Basen, statt, was in Zusammenwirken mit dem bei der Bestrahlung angewendeten Licht zu einer überraschend effekti­ ven Abspaltung der Schutzgruppen führt. Als Basen eignen sich die dem Fach­ mann bekannten Basen, wie z. B. DBU (1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en, DBN (1,5-Diazabicyclo[4.3.0]non-5-en, Diiisopropylethylamin, Pyridin, Piperidin, Triethyl­ amin, Diisopropylamin, N-Methylmorpholin, 2,6-Lutidin, Collidin, N-Methylimi­ dazol, Dabco, N,N,-Dimethylaminopyridin. Die Bestrahlung kann unter den üblichen Bedingungen stattfinden. Die Wellenlänge der Bestrahlung ist von der verwendeten Schutzgruppe abhängig. Die geeigneten Wellenlängen sind dem Fachmann bekannt. Die Menge an während der Bestrahlung anwesender Base variiert zwischen 0,01 M und 1,0 M und ist natürlich von der Basenstärke abhängig. So hat sich es sich bewährt 0,03 bis 1 M (bevorzugt 0,05 bis 0,5 M) DBU in Acetonitril, 0,03 bis 0,8 M (bevorzugt 0,05 M) Diisoproylethylamin in Acetronitril oder 0,03 bis 1 M (bevorzugt 0,05 M) Piperidin in Acetonitril zu verwenden.
Nucleinsäure-Chips, die unter Verwendung erfindungsgemäßer Nucleoside herge­ stellt worden sind, sind dadurch gekennzeichnet, daß das fertiggestellte Oligo­ mer mit der 5'-Position mit der festen Phase verbunden ist, das 3'-OH aber frei zugänglich ist (vgl. Fig. 3). DNA-Chips, die mit dieser Methode erzeugt wurden, lassen sich sowohl für Hybridisierungsexperimente als auch für bestimmte Enzymreaktionen (z. B. DNA-Polymerase), die ein freies 3'-OH erfordern, ver­ wenden. Somit haben Nucleinsäure-Chips (bevorzugt DNA-Chips), die mit dieser Strategie erzeugt wurden, einen weit größeren Anwendungsbereich, da mit diesen sowohl alle Experimente durchgeführt werden können wie mit den "üblichen" DNA-Chips, aber darüberhinaus noch hochparallel festphasengestütz­ te Enzymreaktionen (z. B. cDNA-Synthese, Ligase-Reaktionen, reverse Trans­ kription, PCR, multiplex-PCR) durchgeführt werden können. Damit erschließen sich neue Anwendungsgebiete (z. B. DNA-Computing, festphasengestützte Sequenzierung).
Die Erfindung wird weiter anhand der nachfolgenden Figuren beschrieben.
Fig. 1 Herstellung eines Acylierungsreagenzes (allgemein)
(a) Herstellung des Acylierungsreagenzes für X = OCO
(b) Herstellung des Acylierungsreagenzes für X = OCS
(c) Herstellung des Acylierungsreagenzes für X = SO2
Fig. 2 Allgemeiner Syntheseplan erfindungsgemäßer 3'-photolabiler Nu­ cleosid-Derivate
Fig. 3-6 Synthesepläne der Verbindungen gemäß der Beispiele 1-6
Fig. 7 Aufbau eines Oligonukleotids unter Verwendung 3'-photolabiler 5'- Phosphitamide
Fig. 8 Bio-Chip mit d(T9), hergestellt unter Verwendung von 3'-O-[2-(2- Nitrophenyl)-propoxycarbonyl]thymidin-5'-O-[2-cyanoethyl]-N,N- diisopropylphosphoramidit]
Fig. 9 DNA-Chip-Syntheseprinzip
Die Erfindung wird weiter anhand der nachfolgenden Beispiele beschrieben. Die Reaktionsschemata zur Herstellung der nachfolgenden Verbindungen sind in den Fig. 3-6 gezeigt, worauf nachfolgend Bezug genommen wird.
Beispiel 1 2-(2-Nitrophenyl)propoxycarbonylchlorid (2)
Zu 5 ml Diphosgen (41,4 mmol) in 10 ml absolutem THF werden unter Stick­ stoffatmosphäre bei 0°C über eine Kanüle eine Lösung bestehend aus 7,2 g 2- (2-Nitrophenyl)propanol (39,9 mmol) und 4,4 ml N-Methylmorpholin (39,7 mmol) in 15 ml absolutem THF langsam zugegeben. Nach 1 Std. Rühren bei 0°C wird vom gebildeten Niederschlag abgesaugt und das Filtrat am Hochvakuum abgezogen. Man erhält 6,91 g von (2) in Form eines braunes Öls (71%).
Beispiel 2 1-Methyl-3[2-(2-nitrophenyl)propoxycarbonyl]imidazolium­ chlorid (3)
Unter Stickstoff und unter Ausschluß von Licht werden bei 0°C zu 0,8 ml N- Methylimidazol (12,66 mol) und Molekularsieb 4 Å in 20 ml absolutem Dichlor­ methan 0,55 ml 2-(2-Nitrophenyl)propoxycarbonylchlorid (2) (5 mmol) zugege­ ben. Die Reaktionslösung wird 15 Minuten bei 0°C gerührt. Diese Reaktions­ lösung wird direkt für Acylierungen eingesetzt.
Beispiel 3 1-Methyl-3-[2(2-nitrophenyl)propoxycarbonyl]imidazolium­ triflat (4)
Unter Stickstoffatmosphäre werden 2,19 g N,N-Carbonyldiimidazol (13,5 mmol) in 40 ml absolutem Dichlormethan und 10 ml absolutem Nitromethan gelöst und auf 0°C gekühlt. Es werden 3 ml Trifluormethansulfonsäuremethylester (27 mmol) zugegeben und bei 0°C gerührt. Nach 30 Min. wird eine Lösung, beste­ hend aus 1,22 g 2-(2-Nitrophenyl)propanol (6,75 mmol) in 10 ml absolutem Dichlormethan zugegeben. Die Reaktionslösung kann nach 1 Std. Reaktionszeit direkt für Acylierungen eingesetzt werden.
Beispiel 4 3'-O-[2-(2-Nitrophenyl)propoxycarbonyl]thymidin (7)
1,088 g 5'-O-Dimethoxytrityl-thymidin ((5), 2 mmol; Fa. Proligo, Hamburg) werden unter Stickstoffatmosphäre und unter Ausschluß von Licht zu einer 1- Methyl-3-[2-(2-nitrophenyl)propoxycarbonyl]imidazoliumchlorid-Acylierungs­ reaktion (3) (hergestellt aus 0,55 ml 2-[2-Nitrophenyl)propoxycarbonylchlorid (4,9 mmol), 0,8 ml N-Methylimidazol (10 mmol) und Molekularsieb 4 Å) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wird abgedunkelt über Nacht bei 4°C gelagert. Das Molekularsieb wird abgetrennt und die organische Phase gegen 50 ml gesättigte Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Nach Trocknen der organischen Phase über Natriumsulfat wird 100 ml einer 3% Trichloressigsäurelösung in Dichlorethan zugefügt. Die stark rot gefärbte Lösung wird mit 100 ml gesättigter Natriumbi­ carbonatlösung extrahiert, die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und evaporiert. Die Reinigung erfolgt über Säulenchromatografie [30 g SiO2; Elution mit Toluol/Ethylacetat (5 : 4, 250 ml), dann Toluol/Ethylacetat/Methanol (5 : 4 : 0,5, 300 ml)]. Die Ausbeute an Verbindung (7) beträgt 781 mg in Form eines weißen Schaumes (87% Ausbeute).
Beispiel 5 3'-O-[2-(2-Nitrophenyl)propoxycarbonyl]thymidin-5'-O-[2- cyanoethyl)-(N,N-diisopropylamino)phosphoramidit] (9)
Unter Stickstoffatmosphäre werden 449 mg 3'-O-[2-(2-Nitrophenyl)propoxy­ carbonyl]thymidin (7) (1 mmol) in 20 ml absolutem Dichlormethan gelöst. Es werden unter Stickstoffatmosphäre und unter Ausschluß von Licht 0,22 ml N- Methylmorpholin (2 mmol) und 0,24 ml (2-Cyanoethyl)-N,N-diisopropylphos­ phorimidochloridit (8) (1,1 mmol) zugefügt und 30 Minuten gerührt. Es wird gegen 50 ml gesättigte Natriumbicarbonatlösung extrahiert, die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und evaporiert. Die Reinigung erfolgt über Säulenchromatografie [10 g SiO2; Elution mit Toluol (50 ml), Toluol/Ethylacetat (4 : 1; 50 ml), Toluol/Ethylacetat (3 : 1, 40 ml), Toluol/Ethylacetat (2 : 1, 120 ml)]. Die Ausbeute beträgt 300 mg Verbindung (9) in Form eines weißen Schaumes (46% Ausbeute).
Beispiel 6 3'-O-[2-(2-Nitrophenyl)propoxycarbonyl]-N6-[(4-(tertbutyl)phe­ noxy)-acetyl]-2'-desoxyadenosin (12)
1,0 g 5'-O-Dimethoxytrityl-N6-[(4-(tertbutyl)phenoxy)acetyl]-2'-desoxyadenosin (1,34 mmol) in 20 ml absolutem Dichlormethan werden durch eine Kanüle unter Stickstoffatmosphäre und unter Ausschluß von Licht zu einer 1-Methyl-3-[2-(2- nitrophenyl)propoxycarbonyl]imidazoliumchlorid-Acylierungsreaktion (3) (her­ gestellt aus 0,30 ml 2-[2-Nitrophenyl)propoxycarbonylchlorid (2,68 mmol), 0,534 ml N-Methylimidazol (6,7 mmol) und Molekularsieb 4 Å) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wird abgedunkelt über Nacht bei 4°C gelagert. Das Moleku­ larsieb wird abgetrennt und die organische Phase gegen 50 ml gesättigte Natri­ umbicarbonatlösung extrahiert. Nach Trocknen der organischen Phase über Natriumsulfat wird diese 30 Min. in einer 1% Toluolsulfonsäurelösung in Di­ chlormethan/Methanol (4 : 1) gerührt. Die stark rot gefärbte Lösung wird mit 100 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung extrahiert, die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und evaporiert. Die Reinigung erfolgt über Säulen­ chromatografie [30 g SiO2; Elution mit Toluol, dann Toluol/Ethylacetat (4 : 1, 100 ml), (7 : 3, 100 ml), (3.2, 100 ml), (1 : 1, 200 ml), (2 : 3, 200 ml), (3 : 7, 200 ml). Die Ausbeute an Verbindung (12) beträgt 324 mg in Form eines weißen Schau­ mes (37% Ausbeute).
Beispiel 7 Herstellung von DNA-Chips mit Hilfe von Phosphoramiditen vom Typ 3'-O-Photoschutzgruppe-5'-Phosphoramidit mittels photolithographischer Techniken
Die DNA-Chip-Synthese wurde analog dem bekannten Verfahren von Fodor et al. (Science 1991, 251, S. 767 ff) auf einer Glasoberfläche als Träger durchgeführt. Hinsichtlich des Bestrahlungsschritts wurde jedoch gemäß der deutschen Paten­ tanmeldung DE 198 58 440.7 verfahren. Der Reaktionsablauf ist schematisch in Fig. 9 gezeigt. Als Nucleosid wurde die erfindungsgemäße Verbindung (9) (3'- O-[2-(2-Nitrophenyl)-propoxycarbonyl]thymidin-5'-O-[2-cyanoethyl]-(N,N-di­ isopropylamino)phosphoramidit]; s. Beispiel 5) eingesetzt.
Der angewendete Zyklus und die speziellen Synthesebedingungen sind in der deutschen Patentanmeldung DE 198 58 440.7 gezeigt, worauf hier Bezug genommen wird. Das allgemeine Syntheseprinzip ist auch in Fig. 7 gezeigt.
In Fig. 8 ist eine Fluoreszenzanalyse des hergestellten Chips mit d(T9) zu sehen. Das Muster entspricht der angewendeten Maske II, d. h. es war eine erfolgreiche DNA-Chip-Synthese möglich.
Dieser Chip hat den Vorteil, daß die Ankopplung des Nucleotidstrangs über das 5'-Ende erfolgt und somit das 3'-Ende frei verfügbar ist. Dadurch können Enzym­ reaktionen, die ein freies 3'-Ende verlangen (z. B. PCR, cDNA-Synthese, Ligase- Reaktionen, reverse Transkription, Sequenzierungen, multiplex-PCR usw.) an diesem Bio-Chip durchgeführt werden.

Claims (19)

1. Nucleosid-Derivate mit photolabilen Schutzgruppen der allgemeinen For­ mel (I)
mit
R1 = H, NO2, CN, OCH3, Halogen, Alkyl-, Alkoxy- oder Alkoxyalkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen
R2 = H, OCH3, NO2, CN, Halogen, Alkoxy-, Alkoxyalkyl- oder Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen oder ein Arylrest
R3 = H, Halogen, NO2, CN, Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen oder Arylrest oder aliphatischer Acylrest mit 2 bis 5 C-Atomen
R4 = H, Halogen, OCH3, CN, NO2, Alkoxy-, Alkoxyalkyl- oder Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen oder Arylrest
R5 = H oder eine bei der Herstellung von Oligonukleotiden übliche Schutzgruppe
R6 = H, OH, Halogen, Alkoxy- oder Alkoxyalkylrest mit 1 bis 4 C-Ato­ men oder XR8, wobei X = O oder S und R8 = eine in der Nukleo­ tidchemie übliche Schutzgruppe
R7 = H, NO2, CN, OCH3, Halogen, Alkyl- oder Alkoxyalkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen oder ein Arylrest
X = SO2, OCO, OCS
B = H, Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil, 2,6-Diaminopurin-9-yl, Hypoxanthin-9-yl, 5-Methylcytosin-1-yl, 5-Amino-4-Imidazolcarbon­ säure-1-yl oder 5-Amino-4-Imidazolcarbonsäureamid-3-yl, wobei im Falle von B = Adenin, Cytosin oder Guanin die primäre Aminofunk­ tion ggf. eine permanente Schutzgruppe aufweist bzw. Thymin oder Uracil an der O4-Position ggf. eine permanente Schutzgruppe aufweist.
2. Nucleosid-Derivat nach Anspruch 1, wobei im Falle von R4 ≠ H R1, R2 und R3 jeweils H sind.
3. Nucleosid-Derivat nach Anspruch 1, wobei im Fall von R2 = OCH3 R3 = H ist.
4. Nucleosid-Derivat nach einem der Ansprüche 1-3, wobei R4 = CH3 ist.
5. Nucleosid-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die übliche funktionelle Gruppe zur Herstellung von Oligonukleotiden an der Position R5 eine Phosphitamidgruppe der Formel
p-NC-CH2-CH2-O-P-N(Q)2, p-NC-C6H4-CH2-CH2-O-P-N(Q)2, p-NO2- C6H4-CH2-CH2-O-P-N(Q)2 oder OH2=CH-CH2-O-P-N(Q)2 ist,
wobei die Q-Gruppen gleich oder verschieden sein können und lineare oder verzweigte Alkylreste mit 1 bis 4 C-Atomen bedeuten.
6. Nucleosid-Derivat nach Anspruch 5, wobei die Y-Gruppe Ethyl- oder Iso­ propyl- ist.
7. Nucleosid-Derivat nach einem der Ansprüche 1-6, wobei der Rest R8 in der Gruppe XR8 an der Position R6 im Falle von X = O eine Alkyl-, Alke­ nyl-, Acetal- oder Silylether-Gruppe oder im Fall von X = S eine Alkyl- Gruppe ist.
8. Nucleosid-Derivat nach Anspruch 7, wobei Halogen F, Cl oder Br bedeu­ tet.
9. Verfahren zur Herstellung von Nucleosid-Derivaten nach einem der An­ sprüche 1-8, wobei man
  • 1. eine Verbindung der allgemeinen Formel (II)
in der R1, R2, R3, R4, R7 und X die oben genannte Bedeutung ha­ ben,
mit N-Methylimidazol, Pyridin, N,N-Dimethylaminopyridin, Triazol oder Tetrazol umsetzt, oder
(a2) eine Verbindung der allgemeinen Formel (V)
Y = C = O oder C = S
mit einem Methylierungsmittel umsetzt sowie das erhaltene Pro­ dukt mit einem Alkohol reagieren läßt und anschließend
(b) das in Stufe (a1) oder (a2) gebildete Acylierungsreagenz (IV)
Y = C = O oder C = S
mit einem Nucleosid der allgemeinen Formel (IX)
in der R5, R6 und B die oben angegebene Bedeutung haben, reagieren läßt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei man in der 5'-Stellung der entstande­ nen Nucleosid-Derivate eine Phosphitamid-Gruppe der Formel
p-NC-CH2-CH2-O-P-N(Q)2, p-NC-C6H4-CH2-CH2-O-P-N(Q)2, p-NO2- C6H4-CH2-CH2-O-P-N(Q)2 oder CH2=CH-CH2-O-P-N(Q)2 ist,
wobei die Q-Gruppen gleich oder verschieden sein können und lineare oder verzweigte Alkylreste mit 1 bis 4 C-Atomen bedeuten, einführt.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei man Stufe (a) in einem pola­ ren organischen Lösungsmittel bei Temperaturen zwischen -10 und +10°C durchführt.
12. Verfahren nach Anspruch 1 l, wobei das polare Lösungsmittel Dichlorme­ than ist.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Temperatur ca. 0°C beträgt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei man Stufe (b) in Dichlormethan oder einem Dichlormethan enthaltenden Lösungsmittelge­ misch bei Temperaturen von ca. 0°C durchführt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei man in Stufe (b) das in Stufe (a) gebildete Acylierungsmittel in Dichlormethan vorlegt und das Nucleosid zutropft.
17. Verwendung der Nucleosid-Derivate nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zum Aufbau von Oligonukleotiden oder Nukleinsäure-Chips.
18. Nukleinsäure-Chip, bei dem die über eine lichtgesteuerte Synthese aufge­ bauten Oligomeren über das 5'-Ende an die feste Phase gekoppelt sind.
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