DE10105077A1 - Hybrid-Schutzgruppe - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft fotolabile Hybrid-Schutzgruppen und deren Verwendung zur Herstellung von geschützten Synthonen für die lichtgesteuerte Synthese von Biopolymeren, insbesondere Nukleinsäuren.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft fotolabile Hybrid-Schutzgruppen und
deren Verwendung zur Herstellung von geschützten Synthonen für die
lichtgesteuerte Synthese von Biopolymeren, insbesondere Nukleinsäuren.
In den letzten Jahren wurden Arrays aus Biopolymeren auf einem festen
Träger, z. B. DNA-Chips, durch schrittweisen Aufbau aus
Synthonbausteinen in situ erzeugt. Biopolymer-Arrays haben in der
Forschung und Diagnostik eine sehr hohe Bedeutung, da sie eine schnelle
und hochparallele Bearbeitung komplexer biologischer Fragestellungen
erlauben.
Bei der lichtgesteuerten Synthese von Nukleinsäure-Chips finden fotolabile
Nukleosid-Derivate Verwendung. Hierbei findet der Kettenaufbau der
Nukleinsäure-Fragmente üblicherweise mittels Phosphoramidit-Synthonen
statt. Die Bausteine tragen jeweils eine temporäre Fotoschutzgruppe, die
durch Lichteinstrahlung entfernt werden kann. Das Syntheseprinzip sieht
eine zyklische Abfolge von v. a. Kondensations- und Deprotektions-
Schritten (durch Licht) vor. Die Effizienz, mit der eine solche lichtgesteuerte
Synthese erfolgen kann, wird im Wesentlichen durch die verwendeten
fotolabilen Schutzgruppen, insbesondere durch die Effizienz, mit der diese
im Bestrahlungsschritt entfernt werden können, bestimmt. Bei den bislang
zur lichtgesteuerten Synthese verwendeten Fotoschutzgruppen handelt es
sich um die NVOC (S. P. A. Fodor et al., Science 251 (1991), 767 ff.),
MeNPOC (A. C. Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91 (1994), 5022 ff.),
DMBOC (M. C. Pirrung, J. Org. Chem. 60 (1995), 1116 ff.) und die
NPPOC-Schutzgruppen (A. Hassan et al., Tetrahedron 53 (1997), 4247
ff.).
Weitere Beispiele für fotolabile Schutzgruppen in der Nukleosid- bzw.
Nukleotidchemie sind die o-Nitrobenzyl-Gruppe und ihre Derivate (vgl. z. B.
Pillai, Org. Photochem. 9 (1987), 225; Walker et al., J. Am. Chem. Soc.
110 (1988), 7170). Weiterhin ist auch die 2-(o-Nitrophenyl)ethyl-Gruppe
als fotolabile Schutzgruppe für Nukleoside bekannt (vgl. Pfleiderer et al., In:
"Biophosphates and their Analogues - Synthesis, Structure, Metabolism
and Activity", ELSEVIER Science Publishers B. V. Amsterdam (1987), 133
ff.; WO 97/44345 und WO 96/18634).
Die gegenwärtig für die lichtgesteuerte Synthese von Nukleinsäuren
verwendeten fotolabilen Schutzgruppen (z. B. NVOC, MeNPOC, NPPOC)
zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass ihre Abstraktion in einem
einzigen Schritt erfolgt.
Des Weiteren handelt es sich bei den bislang verwendeten Schutzgruppen
um durchweg farblose bzw. nicht-fluoreszierende Moleküle. Dies hat u. a.
neben einer nur sehr geringen Absorption des eingestrahlten Lichtes zur
Folge, dass der Abstraktionsprozess dieser Schutzgruppen nicht
verfolgt/detektiert werden kann.
Aufgabe der Erfindung war es somit, Fotoschutzgruppen bereitzustellen,
die einen zweistufigen Abstraktionsprozess ermöglichen. Des Weiteren war
die Bereitstellung von neuartigen fotolabilen Nukleosid-Derivaten für die
lichtgesteuerte Synthese von Nukleinsäure-Arrays eine Aufgabe der
Erfindung.
In einer Ausführungsform wird der zweistufige Abspaltungsprozess dafür
genutzt, eine zusätzliche quasi-Pause-Funktion einzuführen, d. h. es kann
entschieden werden, wann und wo aus einer vormals nicht-fotoaktiven
Schutzgruppe durch eine chemische Transformation eine fotolabile
Schutzgruppe generiert wird.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit eine Verbindung der allgemeinen
Formel (I)
worin
R H oder ein organischer Rest, z. B. ein gegebenenfalls substituierter C1-C10-Alkylrest, ein gegebenenfalls substitutierter Arylrest oder eine abspaltbare Gruppe ist,
R' jeweils unabhängig Halogen, CN, OCH3, OC2H5, NO2, -N=N-R" oder ein gegebenenfalls substituierter C1-C4-Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder Alkoxyrest ist, wobei gegebenenfalls mehrere benachbarte R'- Gruppen ein Ringsystem bilden können,
R" ein gegebenenfalls substituierter Arylrest ist,
m eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist,
n eine ganze Zahl von 0 bis 4, vorzugsweise von 0 bis 2 ist,
p 0 oder 1 ist,
X eine Gruppe ausgewählt aus
R H oder ein organischer Rest, z. B. ein gegebenenfalls substituierter C1-C10-Alkylrest, ein gegebenenfalls substitutierter Arylrest oder eine abspaltbare Gruppe ist,
R' jeweils unabhängig Halogen, CN, OCH3, OC2H5, NO2, -N=N-R" oder ein gegebenenfalls substituierter C1-C4-Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder Alkoxyrest ist, wobei gegebenenfalls mehrere benachbarte R'- Gruppen ein Ringsystem bilden können,
R" ein gegebenenfalls substituierter Arylrest ist,
m eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist,
n eine ganze Zahl von 0 bis 4, vorzugsweise von 0 bis 2 ist,
p 0 oder 1 ist,
X eine Gruppe ausgewählt aus
und
Y eine Abgangsgruppe ist.
Y eine Abgangsgruppe ist.
Substituenten von Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl bzw. Arylgruppen sind
vorzugsweise ausgewählt aus Halogen, z. B. F, Cl, Br oder J, OH, SH, -O-,
-S-, -S(O)2-, NO2 und CN. Die Substituenten können an dem betreffenden
Rest einfach oder mehrfach vorliegen. Arylgruppen können auch
Ringsysteme mit Heteroatomen wie O, N oder/und S umfassen.
In der Verbindung (I) kann R Wasserstoff oder ein organischer Rest,
vorzugsweise eine abspaltbare Gruppe, z. B. eine Schutzgruppe oder/und
eine optisch nachweisbare Gruppe, z. B. eine Farbstoff- oder
Fluoreszenzgruppe, sein, wobei R in diesem Fall vorzugsweise eine
fotostabile Gruppe ist, d. h. eine Gruppe, die nicht durch Bestrahlung,
sondern auf andere Art und Weise, z. B. durch Behandlung mit Base oder
Säure, durch Reduktion oder Oxidation, oder enzymatisch abspaltbar ist.
Das Symbol m ist vorzugsweise eine ganze Zahl von 0 bis 2, besonders
bevorzugt 0 oder 1. Das Symbol n ist vorzugsweise eine ganze Zahl von 0
bis 2 und besonders bevorzugt 0 oder 1.
Die Abgangsgruppe Y ist eine Gruppe, die bei Reaktion der Verbindung (I)
mit einer anderen Verbindung abgespalten werden kann. Vorzugsweise ist
Y eine durch Reaktion mit einem Nukleophil gegebenenfalls in Gegenwart
einer Hilfsbase wie Pyridin abspaltbare Abgangsgruppe. Bevorzugte
Beispiele für Y sind:
Cl, Br, J, Aryl, z. B. Phenyl, Tosylat, Mesylat, Trifluorsulfonat,
Cl, Br, J, Aryl, z. B. Phenyl, Tosylat, Mesylat, Trifluorsulfonat,
Überraschenderweise wird durch Blockierung/Maskierung des
Wasserstoffatoms in Position R durch geeignete funktionelle Gruppen
erreicht, dass die Abstraktion der Fotoschutzgruppe teilweise oder ganz
blockiert wird. Dadurch kann der üblicherweise einstufige
Abstraktionsvorgang auf einen zweistufigen Prozess erweitert werden.
Durch die Maskierung der Fotoschutzgruppe (R ≠ H) wird erreicht, dass in
einem ersten Schritt durch Abspaltung der funktionellen Gruppe das zur
Nitro-Funktion orthoständige Amido- oder Aminoproton (R = H) freigesetzt
wird. Erst mit diesem vorgeschalteten Schritt wird eine fotolabile
Funktion/Schutzgruppe erzeugt. Im folgenden zweiten Schritt erfolgt dann
die Abstraktion der Fotoschutzgruppe durch Lichteinwirkung.
In einer weiteren Ausführungsform wird zur Derivatisierung der Amido-
oder Aminofunktion z. B. eine farbgebende Funktion (UV- oder
Fluoreszenzfarbstoff) eingesetzt. Dadurch wird eine besonders leichte
Detektion der Fotoschutzgruppen möglich.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird zur Derivatisierung der
Aminofunktion z. B. eine dem Fachmann bekannte Schutzgruppe eingesetzt.
Wird hierfür z. B. eine basenlabile Schutzgruppe verwendet, kann diese
Fotoschutzgruppe durch Lichteintrag erst abgespalten werden, wenn ein
basenlabiler Entschützungsschritt vorgeschalten ist.
Dies ermöglicht eine zusätzliche Dimension hinsichtlich der Adressierung
von Stellplätzen auf einem Bio-Chip. Zusätzlich zur Adressierung durch
einstufige Bestrahlung kommt eine solche mit zweistufiger Bestrahlung
(d. h. zuerst Schutzgruppen-Abspaltung, dann Bestrahlung) hinzu. D. h. an
bestimmten Stellplätzen kann das Kettenwachstum durch Lichteintrag allein
weitergeführt werden, während an anderen Stellplätzen für die Fortführung
des Kettenwachstums zuerst eine Abspaltung der Aminschutzgruppe
erforderlich ist. Somit wird quasi eine Licht-Pause-Funktion für das
Kettenwachstum erwirkt, die, wenn gewünscht, wieder aufgehoben
werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer
Verbindung (I) zur Herstellung von geschützten Synthonen für die
lichtgesteuerte Synthese von Biopolymeren, wie etwa Nukleinsäuren, z. B.
DNA oder RNA. Es ist jedoch anzumerken, dass die Verbindungen auch zur
Synthese von anderen Biopolymeren, wie etwa Peptiden,
Peptidnukleinsäuren (PNA) oder Sacchariden, geeignet sind. Das Synthon
kann ein monomerer Baustein, z. B. ein Nukleosidderivat, aber auch ein
oligomerer Baustein, z. B. ein Dimer oder Trimer, d. h. beispielsweise ein Di-
oder Trinukleosidderivat, sein. Besonders bevorzugt ist das Synthon ein
Phosphoramidit-Baustein. Es können jedoch auch andere
Nulkeotidsynthese-Bausteine, z. B. Phosphat-, oder Phosphonat-Bausteine,
verwendet werden. Weiterhin können als Synthone auch Linker- bzw.
Spacerbausteine, z. B. als Phosphoramidite, eingesetzt werden.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein geschütztes Synthon
für die lichtgesteuerte Synthese von Biopolymeren, das mindestens eine
fotolabile oder (wenn R von H verschieden ist) durch Aktivierung
(Abstraktion von R) fotolabilisierbare Schutzgruppe Z trägt, die durch
Reaktion (des Synthons) mit Verbindung (I) durch Substitution von Y
hervorgegangen ist.
Bevorzugte Beispiele für Synthone zum Aufbau von Nukleinsäurepolymeren
sind Verbindungen der allgemeinen Formeln (IIa), (IIb), (IIc) oder (IId):
worin B Wasserstoff oder ein organischer Rest, z. B. ein gegebenenfalls
substituierter C1-C10 Alkylrest wie CH3, und vorzugsweise eine
heterocyclische Base, insbesondere eine Nukleobase, beispielsweise eine
Pyrimidinbase, ausgewählt aus natürlichen Pyrimidinbasen wie Cytosin,
Thymin oder Uracil, und nicht natürlichen Pyrimidinbasen, wie 5-
Methylcytosin, oder eine Purinbase, ausgewählt aus natürlichen
Purinbasen, wie Adenin oder Guanin, oder nicht natürlichen Purinbasen,
wie 2,6-Diaminopurin, Hypoxanthin oder Xanthin ist, und wobei die
Nukleobase gegebenenfalls eine oder mehrere Schutzgruppen tragen kann,
Z aus der Verbindung (I) durch Substitution von Y gebildet ist,
R1 H, OH, R4 oder OR4 ist, wobei R4 jeweils unabhängig Halogen, CN oder ein gegebenenfalls substituierter C1-C4-Alkyl-, Alkenyl- oder Alkoxyrest ist, der ebenfalls - sofern erforderlich - eine Schutzgruppe tragen kann,
einer von R2 und R3 eine gegebenenfalls geschützte Phosphat-, Phosphonat- oder Phosphoramiditgruppe ist und der andere H oder eine Schutzgruppe ist, wobei als Schutzgruppen auf dem Gebiet der Festphasen-Nukleinsäuresynthese übliche Schutzgruppen verwendet werden können, sofern sie nicht mit der Schutzgruppe Z oder anderen in der Verbindung vorhandenen Schutzgruppen interferieren.
Z aus der Verbindung (I) durch Substitution von Y gebildet ist,
R1 H, OH, R4 oder OR4 ist, wobei R4 jeweils unabhängig Halogen, CN oder ein gegebenenfalls substituierter C1-C4-Alkyl-, Alkenyl- oder Alkoxyrest ist, der ebenfalls - sofern erforderlich - eine Schutzgruppe tragen kann,
einer von R2 und R3 eine gegebenenfalls geschützte Phosphat-, Phosphonat- oder Phosphoramiditgruppe ist und der andere H oder eine Schutzgruppe ist, wobei als Schutzgruppen auf dem Gebiet der Festphasen-Nukleinsäuresynthese übliche Schutzgruppen verwendet werden können, sofern sie nicht mit der Schutzgruppe Z oder anderen in der Verbindung vorhandenen Schutzgruppen interferieren.
Die erfindungsgemäßen geschützten Synthone können zur lichtgesteuerten
Synthese von Biopolymeren, insbesondere von Nukleinsäuren eingesetzt
werden. Dabei kann zur Verbesserung der Syntheseeffizienz eine
zweistufige Abspaltung der Schutzgruppe Z bzw. eine optische
Überwachung der Aktivierung (Fotolabilisierung) oder/und der Abspaltung
der Schutzgruppe Z erfolgen.
Die Synthese der Verbindungen (I) und diese Verbindungen enthaltender
Synthone erfolgt im Wesentlichen nach den in WO 96/18634 und
WO 97/44345 beschriebenen Verfahren.
Die schematische Darstellung einer Verbindung (I) ist in Fig. 1 gezeigt. o-
Nitroanilin wird mit Diphosgen umgesetzt, wobei eine Verbindung (I) mit R
= H und n = 0 entsteht. Alternativ kann o-Nitroanilin mit Formaldehyd in
Kalium-t.-butoxylat und anschließend mit Diphosgen zu einer Verbindung
mit R = H und n = 1 reagiert werden. Eine weitere Möglichkeit zur
Darstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht darin, o-
Nitroanilin mit Fmoc-Cl und anschließend mit Diphosgen umzusetzen,
wobei eine Verbindung (I) mit R = Fmoc und n = 0 erhalten wird.
Dementsprechend entsteht aus Umsetzung von o-Nitroanilin mit
Formaldehyd und Kalium-t.-butoxylat, anschließende Reaktion mit Fmoc-Cl
und nachfolgende Umsetzung mit Diphosgen eine Verbindung (I) mit R =
Fmoc und n = 1.
Die Reaktion einer Verbindung (I) mit R = H zu einem geschützten Synthon
ist in Fig. 2 schematisch dargestellt. Die Verbindung (I) wird in Gegenwart
von Base an die 5'-OH-Gruppe eines Nukleosids gekoppelt und
anschließend mit Phosphan zu einem geschützten Phosphoramiditderivat
umgesetzt. Eine entsprechende Reaktion kann auch mit einer maskierten
Verbindung (I) mit R ≠ H, z. B. Fmoc oder Farbstoff, durchgeführt werden.
Zwei Ausführungsformen der trägergestützten Oligonukleotid-Synthese
unter Verwendung der erfindungsgemäßen geschützten Synthone sind in
Fig. 3 gezeigt. In Abschnitt A erfolgt eine einstufige Abspaltung der
Schutzgruppe Z (mit R = H) durch Bestrahlung. In Abschnitt B ist der
Wasserstoff an der Anilingruppe durch Fmoc blockiert, sodass bei
Lichteinstrahlung ohne vorherige Aktivierung kein Kettenwachstum erfolgt.
Erst nach Abspaltung der Fmoc-Gruppe durch Base erfolgt eine Aktivierung
zur fotolabilen Schutzgruppe, die durch anschließende Bestrahlung
abgespalten werden kann.
Claims (17)
1. Verbindung der allgemeinen Formel (I)
worin
R H oder ein organischer Rest ist,
R' jeweils unabhängig Halogen, CN, OCH3, NO2, -N=N-R", OC2H5 oder ein gegebenenfalls substituierter C1-C4-Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder Alkoxyrest ist, wobei gegebenenfalls mehrere benachbarte R'-Gruppen ein Ringsystem bilden können,
R" ein gegebenenfalls substituierter Arylrest ist,
m eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist,
n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist,
p 0 oder 1 ist,
X eine Gruppe ausgewählt aus
und
Y eine Abgangsgruppe ist.
worin
R H oder ein organischer Rest ist,
R' jeweils unabhängig Halogen, CN, OCH3, NO2, -N=N-R", OC2H5 oder ein gegebenenfalls substituierter C1-C4-Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder Alkoxyrest ist, wobei gegebenenfalls mehrere benachbarte R'-Gruppen ein Ringsystem bilden können,
R" ein gegebenenfalls substituierter Arylrest ist,
m eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist,
n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist,
p 0 oder 1 ist,
X eine Gruppe ausgewählt aus
und
Y eine Abgangsgruppe ist.
2. Verbindung nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
dass n 0 oder 1 ist.
3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass R H bedeutet.
4. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass R eine Schutzgruppe ist.
5. Verbindung nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,
dass R eine optisch nachweisbare Gruppe, z. B. eine Farbstoff- oder
Fluoreszenzgruppe ist.
6. Verbindung nach Anspruch 4 oder 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass R eine fotostabile Gruppe ist.
7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass Y eine durch Reaktion mit einem Nukleophil gegebenenfalls in
Gegenwart einer Hilfsbase abspaltbare Abgangsgruppe ist.
8. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass Y ausgewählt ist aus:
Cl, Br, J, Aryl, Tosylat, Mesylat, Trifluorsulfonat
Cl, Br, J, Aryl, Tosylat, Mesylat, Trifluorsulfonat
9. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur
Herstellung von geschützten Synthonen für die lichtgesteuerte
Synthese von Biopolymeren.
10. Verwendung nach Anspruch 9 für die Synthese von Nukleinsäuren,
z. B. DNA oder RNA.
11. Verwendung nach Anspruch 10,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Synthon ein Phosphoramidit ist.
12. Geschütztes Synthon für die lichtgesteuerte Synthese von
Biopolymeren,
dadurch gekennzeichnet,
dass es mindestens eine fotolabile oder durch Aktivierung
fotolabilisierbare Schutzgruppe Z trägt, die durch Reaktion des
Synthons mit einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8
durch Substitution von Y hervorgegangen ist.
13. Synthon nach Anspruch 11 oder 12 mit der allgemeinen Formel (IIa),
(IIb), (IIc) oder (IId):
wobei
B Wasserstoff oder ein organischer Rest, insbesondere eine heterocyclische Base ist,
Z aus der Verbindung (I) durch Substitution von Y gebildet ist,
R' H, OH, R4 oder OR4 ist, wobei R4 jeweils unabhängig Halogen, CN oder ein gegebenenfalls substituierter C1-C4- Alkyl-, Alkenyl- oder Alkoxyrest ist,
einer von R2 und R3 eine gegebenenfalls geschützte Phosphat-, Phosphonat- oder Phosphoramiditgruppe ist und der andere H oder eine Schutzgruppe ist.
wobei
B Wasserstoff oder ein organischer Rest, insbesondere eine heterocyclische Base ist,
Z aus der Verbindung (I) durch Substitution von Y gebildet ist,
R' H, OH, R4 oder OR4 ist, wobei R4 jeweils unabhängig Halogen, CN oder ein gegebenenfalls substituierter C1-C4- Alkyl-, Alkenyl- oder Alkoxyrest ist,
einer von R2 und R3 eine gegebenenfalls geschützte Phosphat-, Phosphonat- oder Phosphoramiditgruppe ist und der andere H oder eine Schutzgruppe ist.
14. Synthon nach Anspruch 12 oder 13,
dadurch gekennzeichnet,
dass B eine natürliche oder nicht natürliche Nukleobase ist.
15. Verwendung eines geschützten Synthons nach einem der Ansprüche
12 bis 14 zur lichtgesteuerten Synthese von Biopolymeren.
16. Verwendung nach Anspruch 15,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine zweistufige Abspaltung der Schutzgruppe Z erfolgt.
17. Verwendung nach Anspruch 15 oder 16,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine optische Überwachung der Aktivierung oder/und der
Abspaltung der Schutzgruppe Z erfolgt.
Priority Applications (3)
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- 2001-02-05 DE DE10105077A patent/DE10105077A1/de not_active Withdrawn
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