DE10105077A1 - Hybrid-Schutzgruppe - Google Patents

Hybrid-Schutzgruppe

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DE10105077A1
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft fotolabile Hybrid-Schutzgruppen und deren Verwendung zur Herstellung von geschützten Synthonen für die lichtgesteuerte Synthese von Biopolymeren, insbesondere Nukleinsäuren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft fotolabile Hybrid-Schutzgruppen und deren Verwendung zur Herstellung von geschützten Synthonen für die lichtgesteuerte Synthese von Biopolymeren, insbesondere Nukleinsäuren.
In den letzten Jahren wurden Arrays aus Biopolymeren auf einem festen Träger, z. B. DNA-Chips, durch schrittweisen Aufbau aus Synthonbausteinen in situ erzeugt. Biopolymer-Arrays haben in der Forschung und Diagnostik eine sehr hohe Bedeutung, da sie eine schnelle und hochparallele Bearbeitung komplexer biologischer Fragestellungen erlauben.
Bei der lichtgesteuerten Synthese von Nukleinsäure-Chips finden fotolabile Nukleosid-Derivate Verwendung. Hierbei findet der Kettenaufbau der Nukleinsäure-Fragmente üblicherweise mittels Phosphoramidit-Synthonen statt. Die Bausteine tragen jeweils eine temporäre Fotoschutzgruppe, die durch Lichteinstrahlung entfernt werden kann. Das Syntheseprinzip sieht eine zyklische Abfolge von v. a. Kondensations- und Deprotektions- Schritten (durch Licht) vor. Die Effizienz, mit der eine solche lichtgesteuerte Synthese erfolgen kann, wird im Wesentlichen durch die verwendeten fotolabilen Schutzgruppen, insbesondere durch die Effizienz, mit der diese im Bestrahlungsschritt entfernt werden können, bestimmt. Bei den bislang zur lichtgesteuerten Synthese verwendeten Fotoschutzgruppen handelt es sich um die NVOC (S. P. A. Fodor et al., Science 251 (1991), 767 ff.), MeNPOC (A. C. Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91 (1994), 5022 ff.), DMBOC (M. C. Pirrung, J. Org. Chem. 60 (1995), 1116 ff.) und die NPPOC-Schutzgruppen (A. Hassan et al., Tetrahedron 53 (1997), 4247 ff.).
Weitere Beispiele für fotolabile Schutzgruppen in der Nukleosid- bzw. Nukleotidchemie sind die o-Nitrobenzyl-Gruppe und ihre Derivate (vgl. z. B. Pillai, Org. Photochem. 9 (1987), 225; Walker et al., J. Am. Chem. Soc. 110 (1988), 7170). Weiterhin ist auch die 2-(o-Nitrophenyl)ethyl-Gruppe als fotolabile Schutzgruppe für Nukleoside bekannt (vgl. Pfleiderer et al., In: "Biophosphates and their Analogues - Synthesis, Structure, Metabolism and Activity", ELSEVIER Science Publishers B. V. Amsterdam (1987), 133 ff.; WO 97/44345 und WO 96/18634).
Die gegenwärtig für die lichtgesteuerte Synthese von Nukleinsäuren verwendeten fotolabilen Schutzgruppen (z. B. NVOC, MeNPOC, NPPOC) zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass ihre Abstraktion in einem einzigen Schritt erfolgt.
Des Weiteren handelt es sich bei den bislang verwendeten Schutzgruppen um durchweg farblose bzw. nicht-fluoreszierende Moleküle. Dies hat u. a. neben einer nur sehr geringen Absorption des eingestrahlten Lichtes zur Folge, dass der Abstraktionsprozess dieser Schutzgruppen nicht verfolgt/detektiert werden kann.
Aufgabe der Erfindung war es somit, Fotoschutzgruppen bereitzustellen, die einen zweistufigen Abstraktionsprozess ermöglichen. Des Weiteren war die Bereitstellung von neuartigen fotolabilen Nukleosid-Derivaten für die lichtgesteuerte Synthese von Nukleinsäure-Arrays eine Aufgabe der Erfindung.
In einer Ausführungsform wird der zweistufige Abspaltungsprozess dafür genutzt, eine zusätzliche quasi-Pause-Funktion einzuführen, d. h. es kann entschieden werden, wann und wo aus einer vormals nicht-fotoaktiven Schutzgruppe durch eine chemische Transformation eine fotolabile Schutzgruppe generiert wird.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit eine Verbindung der allgemeinen Formel (I)
worin
R H oder ein organischer Rest, z. B. ein gegebenenfalls substituierter C1-C10-Alkylrest, ein gegebenenfalls substitutierter Arylrest oder eine abspaltbare Gruppe ist,
R' jeweils unabhängig Halogen, CN, OCH3, OC2H5, NO2, -N=N-R" oder ein gegebenenfalls substituierter C1-C4-Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder Alkoxyrest ist, wobei gegebenenfalls mehrere benachbarte R'- Gruppen ein Ringsystem bilden können,
R" ein gegebenenfalls substituierter Arylrest ist,
m eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist,
n eine ganze Zahl von 0 bis 4, vorzugsweise von 0 bis 2 ist,
p 0 oder 1 ist,
X eine Gruppe ausgewählt aus
und
Y eine Abgangsgruppe ist.
Substituenten von Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl bzw. Arylgruppen sind vorzugsweise ausgewählt aus Halogen, z. B. F, Cl, Br oder J, OH, SH, -O-, -S-, -S(O)2-, NO2 und CN. Die Substituenten können an dem betreffenden Rest einfach oder mehrfach vorliegen. Arylgruppen können auch Ringsysteme mit Heteroatomen wie O, N oder/und S umfassen.
In der Verbindung (I) kann R Wasserstoff oder ein organischer Rest, vorzugsweise eine abspaltbare Gruppe, z. B. eine Schutzgruppe oder/und eine optisch nachweisbare Gruppe, z. B. eine Farbstoff- oder Fluoreszenzgruppe, sein, wobei R in diesem Fall vorzugsweise eine fotostabile Gruppe ist, d. h. eine Gruppe, die nicht durch Bestrahlung, sondern auf andere Art und Weise, z. B. durch Behandlung mit Base oder Säure, durch Reduktion oder Oxidation, oder enzymatisch abspaltbar ist.
Das Symbol m ist vorzugsweise eine ganze Zahl von 0 bis 2, besonders bevorzugt 0 oder 1. Das Symbol n ist vorzugsweise eine ganze Zahl von 0 bis 2 und besonders bevorzugt 0 oder 1.
Die Abgangsgruppe Y ist eine Gruppe, die bei Reaktion der Verbindung (I) mit einer anderen Verbindung abgespalten werden kann. Vorzugsweise ist Y eine durch Reaktion mit einem Nukleophil gegebenenfalls in Gegenwart einer Hilfsbase wie Pyridin abspaltbare Abgangsgruppe. Bevorzugte Beispiele für Y sind:
Cl, Br, J, Aryl, z. B. Phenyl, Tosylat, Mesylat, Trifluorsulfonat,
Überraschenderweise wird durch Blockierung/Maskierung des Wasserstoffatoms in Position R durch geeignete funktionelle Gruppen erreicht, dass die Abstraktion der Fotoschutzgruppe teilweise oder ganz blockiert wird. Dadurch kann der üblicherweise einstufige Abstraktionsvorgang auf einen zweistufigen Prozess erweitert werden. Durch die Maskierung der Fotoschutzgruppe (R ≠ H) wird erreicht, dass in einem ersten Schritt durch Abspaltung der funktionellen Gruppe das zur Nitro-Funktion orthoständige Amido- oder Aminoproton (R = H) freigesetzt wird. Erst mit diesem vorgeschalteten Schritt wird eine fotolabile Funktion/Schutzgruppe erzeugt. Im folgenden zweiten Schritt erfolgt dann die Abstraktion der Fotoschutzgruppe durch Lichteinwirkung.
In einer weiteren Ausführungsform wird zur Derivatisierung der Amido- oder Aminofunktion z. B. eine farbgebende Funktion (UV- oder Fluoreszenzfarbstoff) eingesetzt. Dadurch wird eine besonders leichte Detektion der Fotoschutzgruppen möglich.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird zur Derivatisierung der Aminofunktion z. B. eine dem Fachmann bekannte Schutzgruppe eingesetzt. Wird hierfür z. B. eine basenlabile Schutzgruppe verwendet, kann diese Fotoschutzgruppe durch Lichteintrag erst abgespalten werden, wenn ein basenlabiler Entschützungsschritt vorgeschalten ist.
Dies ermöglicht eine zusätzliche Dimension hinsichtlich der Adressierung von Stellplätzen auf einem Bio-Chip. Zusätzlich zur Adressierung durch einstufige Bestrahlung kommt eine solche mit zweistufiger Bestrahlung (d. h. zuerst Schutzgruppen-Abspaltung, dann Bestrahlung) hinzu. D. h. an bestimmten Stellplätzen kann das Kettenwachstum durch Lichteintrag allein weitergeführt werden, während an anderen Stellplätzen für die Fortführung des Kettenwachstums zuerst eine Abspaltung der Aminschutzgruppe erforderlich ist. Somit wird quasi eine Licht-Pause-Funktion für das Kettenwachstum erwirkt, die, wenn gewünscht, wieder aufgehoben werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer Verbindung (I) zur Herstellung von geschützten Synthonen für die lichtgesteuerte Synthese von Biopolymeren, wie etwa Nukleinsäuren, z. B. DNA oder RNA. Es ist jedoch anzumerken, dass die Verbindungen auch zur Synthese von anderen Biopolymeren, wie etwa Peptiden, Peptidnukleinsäuren (PNA) oder Sacchariden, geeignet sind. Das Synthon kann ein monomerer Baustein, z. B. ein Nukleosidderivat, aber auch ein oligomerer Baustein, z. B. ein Dimer oder Trimer, d. h. beispielsweise ein Di- oder Trinukleosidderivat, sein. Besonders bevorzugt ist das Synthon ein Phosphoramidit-Baustein. Es können jedoch auch andere Nulkeotidsynthese-Bausteine, z. B. Phosphat-, oder Phosphonat-Bausteine, verwendet werden. Weiterhin können als Synthone auch Linker- bzw. Spacerbausteine, z. B. als Phosphoramidite, eingesetzt werden.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein geschütztes Synthon für die lichtgesteuerte Synthese von Biopolymeren, das mindestens eine fotolabile oder (wenn R von H verschieden ist) durch Aktivierung (Abstraktion von R) fotolabilisierbare Schutzgruppe Z trägt, die durch Reaktion (des Synthons) mit Verbindung (I) durch Substitution von Y hervorgegangen ist.
Bevorzugte Beispiele für Synthone zum Aufbau von Nukleinsäurepolymeren sind Verbindungen der allgemeinen Formeln (IIa), (IIb), (IIc) oder (IId):
worin B Wasserstoff oder ein organischer Rest, z. B. ein gegebenenfalls substituierter C1-C10 Alkylrest wie CH3, und vorzugsweise eine heterocyclische Base, insbesondere eine Nukleobase, beispielsweise eine Pyrimidinbase, ausgewählt aus natürlichen Pyrimidinbasen wie Cytosin, Thymin oder Uracil, und nicht natürlichen Pyrimidinbasen, wie 5- Methylcytosin, oder eine Purinbase, ausgewählt aus natürlichen Purinbasen, wie Adenin oder Guanin, oder nicht natürlichen Purinbasen, wie 2,6-Diaminopurin, Hypoxanthin oder Xanthin ist, und wobei die Nukleobase gegebenenfalls eine oder mehrere Schutzgruppen tragen kann,
Z aus der Verbindung (I) durch Substitution von Y gebildet ist,
R1 H, OH, R4 oder OR4 ist, wobei R4 jeweils unabhängig Halogen, CN oder ein gegebenenfalls substituierter C1-C4-Alkyl-, Alkenyl- oder Alkoxyrest ist, der ebenfalls - sofern erforderlich - eine Schutzgruppe tragen kann,
einer von R2 und R3 eine gegebenenfalls geschützte Phosphat-, Phosphonat- oder Phosphoramiditgruppe ist und der andere H oder eine Schutzgruppe ist, wobei als Schutzgruppen auf dem Gebiet der Festphasen-Nukleinsäuresynthese übliche Schutzgruppen verwendet werden können, sofern sie nicht mit der Schutzgruppe Z oder anderen in der Verbindung vorhandenen Schutzgruppen interferieren.
Die erfindungsgemäßen geschützten Synthone können zur lichtgesteuerten Synthese von Biopolymeren, insbesondere von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Dabei kann zur Verbesserung der Syntheseeffizienz eine zweistufige Abspaltung der Schutzgruppe Z bzw. eine optische Überwachung der Aktivierung (Fotolabilisierung) oder/und der Abspaltung der Schutzgruppe Z erfolgen.
Die Synthese der Verbindungen (I) und diese Verbindungen enthaltender Synthone erfolgt im Wesentlichen nach den in WO 96/18634 und WO 97/44345 beschriebenen Verfahren.
Die schematische Darstellung einer Verbindung (I) ist in Fig. 1 gezeigt. o- Nitroanilin wird mit Diphosgen umgesetzt, wobei eine Verbindung (I) mit R = H und n = 0 entsteht. Alternativ kann o-Nitroanilin mit Formaldehyd in Kalium-t.-butoxylat und anschließend mit Diphosgen zu einer Verbindung mit R = H und n = 1 reagiert werden. Eine weitere Möglichkeit zur Darstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht darin, o- Nitroanilin mit Fmoc-Cl und anschließend mit Diphosgen umzusetzen, wobei eine Verbindung (I) mit R = Fmoc und n = 0 erhalten wird. Dementsprechend entsteht aus Umsetzung von o-Nitroanilin mit Formaldehyd und Kalium-t.-butoxylat, anschließende Reaktion mit Fmoc-Cl und nachfolgende Umsetzung mit Diphosgen eine Verbindung (I) mit R = Fmoc und n = 1.
Die Reaktion einer Verbindung (I) mit R = H zu einem geschützten Synthon ist in Fig. 2 schematisch dargestellt. Die Verbindung (I) wird in Gegenwart von Base an die 5'-OH-Gruppe eines Nukleosids gekoppelt und anschließend mit Phosphan zu einem geschützten Phosphoramiditderivat umgesetzt. Eine entsprechende Reaktion kann auch mit einer maskierten Verbindung (I) mit R ≠ H, z. B. Fmoc oder Farbstoff, durchgeführt werden.
Zwei Ausführungsformen der trägergestützten Oligonukleotid-Synthese unter Verwendung der erfindungsgemäßen geschützten Synthone sind in Fig. 3 gezeigt. In Abschnitt A erfolgt eine einstufige Abspaltung der Schutzgruppe Z (mit R = H) durch Bestrahlung. In Abschnitt B ist der Wasserstoff an der Anilingruppe durch Fmoc blockiert, sodass bei Lichteinstrahlung ohne vorherige Aktivierung kein Kettenwachstum erfolgt. Erst nach Abspaltung der Fmoc-Gruppe durch Base erfolgt eine Aktivierung zur fotolabilen Schutzgruppe, die durch anschließende Bestrahlung abgespalten werden kann.

Claims (17)

1. Verbindung der allgemeinen Formel (I)
worin
R H oder ein organischer Rest ist,
R' jeweils unabhängig Halogen, CN, OCH3, NO2, -N=N-R", OC2H5 oder ein gegebenenfalls substituierter C1-C4-Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder Alkoxyrest ist, wobei gegebenenfalls mehrere benachbarte R'-Gruppen ein Ringsystem bilden können,
R" ein gegebenenfalls substituierter Arylrest ist,
m eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist,
n eine ganze Zahl von 0 bis 4 ist,
p 0 oder 1 ist,
X eine Gruppe ausgewählt aus
und
Y eine Abgangsgruppe ist.
2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass n 0 oder 1 ist.
3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R H bedeutet.
4. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R eine Schutzgruppe ist.
5. Verbindung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass R eine optisch nachweisbare Gruppe, z. B. eine Farbstoff- oder Fluoreszenzgruppe ist.
6. Verbindung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass R eine fotostabile Gruppe ist.
7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Y eine durch Reaktion mit einem Nukleophil gegebenenfalls in Gegenwart einer Hilfsbase abspaltbare Abgangsgruppe ist.
8. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass Y ausgewählt ist aus:
Cl, Br, J, Aryl, Tosylat, Mesylat, Trifluorsulfonat
9. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung von geschützten Synthonen für die lichtgesteuerte Synthese von Biopolymeren.
10. Verwendung nach Anspruch 9 für die Synthese von Nukleinsäuren, z. B. DNA oder RNA.
11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Synthon ein Phosphoramidit ist.
12. Geschütztes Synthon für die lichtgesteuerte Synthese von Biopolymeren, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine fotolabile oder durch Aktivierung fotolabilisierbare Schutzgruppe Z trägt, die durch Reaktion des Synthons mit einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 durch Substitution von Y hervorgegangen ist.
13. Synthon nach Anspruch 11 oder 12 mit der allgemeinen Formel (IIa), (IIb), (IIc) oder (IId):
wobei
B Wasserstoff oder ein organischer Rest, insbesondere eine heterocyclische Base ist,
Z aus der Verbindung (I) durch Substitution von Y gebildet ist,
R' H, OH, R4 oder OR4 ist, wobei R4 jeweils unabhängig Halogen, CN oder ein gegebenenfalls substituierter C1-C4- Alkyl-, Alkenyl- oder Alkoxyrest ist,
einer von R2 und R3 eine gegebenenfalls geschützte Phosphat-, Phosphonat- oder Phosphoramiditgruppe ist und der andere H oder eine Schutzgruppe ist.
14. Synthon nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass B eine natürliche oder nicht natürliche Nukleobase ist.
15. Verwendung eines geschützten Synthons nach einem der Ansprüche 12 bis 14 zur lichtgesteuerten Synthese von Biopolymeren.
16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine zweistufige Abspaltung der Schutzgruppe Z erfolgt.
17. Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine optische Überwachung der Aktivierung oder/und der Abspaltung der Schutzgruppe Z erfolgt.
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