DE19909891C1 - Wischanalysator für den immunchemischen Stoffnachweis - Google Patents

Wischanalysator für den immunchemischen Stoffnachweis

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Rainer Polzius
Da Costa Maria Cerqueira
Jessica Mahn
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Abstract

Die Erfindung betrifft einen hinsichtlich der Handhabung und Nachweisempfindlichkeit verbesserten Wischanalysator für den immun-chemischen Stoffnachweis mit einem Gehäuse (1), einer Elutionsmittelaufgabezone (Wischstift 2) und einer Reaktionszone (6). DOLLAR A Der Erfindungsgegenstand ist durch folgende zusätzliche, im Vergleich zum Stand der Technik neue Merkmale gekennzeichnet: DOLLAR A - Das Gehäuse (1) weist eine lokale Erhebung mit einer zentralen Öffnung auf, aus der eine als poröser Wischstift (2) ausgebildete Probenahme- und Elutionsmittelaufgabezone hervorsteht, DOLLAR A - die lokale Erhebung ist mit einer zumindest teilweise umlaufenden Auffangrinne (3) zur Aufnahme überschüssigen Elutationsmittels versehen, DOLLAR A - im Abstand von der lokalen Erhebung ist ein Fenster (10) im Gehäuse (1) zur Auswertung der unterlegten Reaktionszone (6) vorhanden und DOLLAR A - Probeaufnahme- und Elutionsmittelaufgabezone sowie Reaktionszone (6) mit Signalzonen (7) stehen in kapillarer Fluidverbindung miteinander.

Description

Die Erfindung betrifft einen Wischanalysator für den immunchemischen Stoffnachweis gemäß Oberbegriff von Anspruch 1.
Aus der DE 44 39 429 C2 ist ein Verfahren zum Nachweis der Kontami­ nation einer Oberfläche mit einem Analyten durch Abwischen des Ana­ lyten von der Oberfläche mit einer zu einem Teststreifen separaten Wisch­ fläche, Kontaktierung von Wischfläche und Teststreifen und anschließende Elutionsmittelaufgabe mit einer nachfolgenden immunologischen Bindungs­ reaktion bekanntgeworden. Ein Nachteil dieses bekannten Verfahrens und der zugehörigen Anordnung besteht darin, daß einerseits eine separate Wischfläche zur Probenahme vorhanden sein muß und daß andererseits zur Kontaktierung von Wischfläche und Teststreifen mit Hilfe eines speziellen Gehäuses zur Aufnahme des Teststreifens und der Wischfläche die Wischfläche mit einem Mindestdruck mit dem Teststreifen kontaktiert werden muß, ohne jedoch den kapillaren Flüssigkeitsstrom im Teststreifen zu unterbinden oder zu behindern.
In der US 5,500,187 wird eine Prüfvorrichtung zum Nachweis von Analyten in einer mittels speziellem Tupfer, Spritze oder Pipette eingeführten Probe beschrieben. Die Prüfvorrichtung umfaßt Behältnisse für ein Reagens, die in Fluidverbindung mit einer die Probe aufweisenden Zone stehen. Mittels Steilmechanismus wird das Reagens aus den Behältnissen geführt und mit der Probe vermischt, so daß eine Reaktion stattfindet, mit der bestimmt werden kann, ob der gesuchte Analyt vorhanden ist. Auch hier erweist sich als Nachteil, dass eine separate Einrichtung, wie etwa ein Tupfer, zur Probenahme vorhanden sein muß. Ferner erfordert die Herbeiführung der Reaktion von Probe und Reagens technisch aufwendige Maßnahmen sowohl an der Prüfvorrichtung als auch am Tupfer.
Somit ist es die Aufgabe der Erfindung, einen Wischanalysator der eingangs genannten Art bereitzustellen, welcher einfach aufgebaut ist, eine verbesserte Handhabung mit guter Nachweisempfindlichkeit ermöglicht und keine separate Wischfläche zur Kontaktierung mit einem Teststreifen gemäß Stand der Technik aufweist.
Die Lösung der Aufgabe erhält man mit dem kennzeichnenden Merkmal von Anspruch 1 für einen Wischanalysator der eingangs genannten Art.
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Wischanalysators nach Anspruch 1 besteht in der sicheren, im Durchführungsaufwand erleichterten Handhabbarkeit und in der selektiven Nachweisempfindlichkeit durch die gewählte Porosität und das Material der als Wischstift ausgebildeten, kombinierten Probenahme- und Elutionsmittelaufgabezone. Hierbei ist die kombinierte Probenahme- und Elutionsmittelaufgabezone (Wischstift) mit dem Analyse­ system in einem Gehäuse integriert.
Die Unteransprüche geben vorteilhafte Weiterbildungen des Wisch­ analysators nach Anspruch 1 an.
Mit Hilfe der Erfindung können Substanzen, die sich auf Oberflächen befinden, durch manuelles Wischen mit der als poröser Wischstift ausge­ bildeten Probenahme- und Elutionsmittelaufgabezone gesammelt und analysiert werden. Die tropfenweise Zugabe eines spezifischen Elutions­ mittels auf die Probenahme- und Elutionsmittelaufgabezone eluiert den sich in oder auf der gesammelten Substanz befindenden Analyten über Kapillar­ transport in die Reaktionszone.
Die Notwendigkeit, sich auf Oberflächen befindende Substanzen zu ana­ lysieren, ist sowohl in der forensischen Chemie, der Umweltanalytik als auch bei der medizinischen Diagnostik von Sekreten, wie Schweiß und Speichel, gegeben.
Bekanntermaßen verursachen an feinste Staubpartikel adsorbierte Proteine (Allergene) unerwünschte allergische Reaktionen bei sensibilisierten Personen. Die krankmachende Wirkung der Allergene ist konzentrationsabhängig. Konkrete Grenzwerte werden beispielsweise für Milben- und Katzenallergene im Haus­ staub genannt. Diese Grenzwerte der Konzentration im Rahmen der Sondierung des Expositionspotentials zu überprüfen, erfordert eine Sammlung des Feinstaubs auf unterschiedlichsten Oberflächen, wie Matratzen, Teppichen, Polstermöbeln etc.
Darüber hinaus ist die Probenahme aus Körpersekreten wie Schweiß und Speichel in der Kriminalistik beispielsweise zur Erstellung des genetischen Abdrucks ("Fingerprint") bekannt. Außerdem werden beispielsweise Tests aus immunologischen Komponenten (wie sekretorische Antikörper) oder pharma­ kologischen Wirkstoffen auf Speichel oder Schweiß vorgenommen. In diesen Fällen ist es gängige Praxis, Wischproben von der Haut oder aus dem Rachenraum zu entnehmen, die in der Regel in einer separaten Analytik ausgewertet werden.
Somit wird die erfindungsgemäße Vorrichtung für solche Nachweisver­ fahren verwendet, bei welchen die Probenahme mittels Wischen auf Oberflächen integraler bzw. zugehöriger Bestandteil einer nachfolgenden Analytik mit optisch wahrnehmbarer Anzeige für eine gemessene Konzen­ tration eines bestimmten Analyten ist.
Die Erfindung wird mit Hilfe der Figuren an Ausführungsbeispielen er­ läutert.
Es zeigen
Fig. 1 Eine Ansicht auf ein Gehäuse eines Aus­ führungsbeispiels
Fig. 2 Einen Längsschnitt durch das Gehäuse nach Fig. 1.
Das Gehäuse 1 nimmt alle Bauelemente des erfindungsgemäßen Wisch­ analysators auf und besteht vorzugsweise aus einem Kunststoff, beispielsweise aus Polypropylen. Das Gehäuse 1 ist öffenbar und besitzt ein Fenster 10, so daß sowohl die in Form eines porösen Wischstifts 2 ausgebildete Probenahme- und Elutionsmittelaufgabezone als auch die hiermit in Fluidverbindung stehenden weiteren Analyseelemente einschließlich der von außen sichtbaren Reaktionszone 6 mit zwei beispielhaft eingezeichneten Signalzonen 7 bei Bedarf ausgewechselt werden können. Die Auswertung der Signalzonen 7 erfolgt durch das Fenster 10 im Gehäuse 1. Die als poröser Wischstift 2 ausgebildete Probenahme- und Elutionsmittelaufgabezone ist in der Fig. 2 zentral hervorstehend in einem kegelförmig sich abhebenden Bereich des Gehäuses 1 dargestellt und am Fußpunkt der Erhebung mit einer umlaufenden Auffangrinne 3 für Elutionsflüssigkeit versehen.
Die geometrische Anordnung des Wischstifts 2 im Bereich zwischen 45 Grad und 90 Grad, bezogen auf den Winkel zum Gehäuse 1, ermöglicht die gezielte und effiziente Beprobung eines Probenahmeortes.
Der verwendete zylindrische Wischstift 2 ist an seiner Wischseite vorzugs­ weise abgerundet, um gleichzeitig den Abrieb des Probensubstrats als auch den Abrieb des Wischstiftes 2 selbst zu minimieren. Auf der dem Gehäuse 1 zugewandten Unterseite ist der Wischstift 2 abgeflacht und steht so in direktem Kontakt mit der Transferzone 4. Die favorisierte Ausführung des Wischstiftes 2 als poröser Kunststoff kombiniert die vorteilhaften Materialeigenschaften Elastizität und Rigidität zugunsten eines abriebarmen Wischprozesses auch auf rauhen Oberflächen. Als Materialien kommen vorzugsweise gesinterte oder geschäumte Kunststoffe aller Art in Frage, beispielsweise Polyethylen. Darüber hinaus sind auch poröse Glas- oder Metallkörper für spezielle Wischanforderungen auf weichen Oberflächen geeignet. Die Porengröße des Materials kann zwischen 10 und 100 Mikrometer variieren.
Die durch einen Sinterprozess oder einen Schäumungsprozess gebildeten Poren ermöglichen die Aufnahme sowohl flüssiger als auch partikelförmiger Substanzen. Diese dringen während des Wischvorganges in die Poren ein; Zusätze von oberflächenaktiven Chemikalien (Detergentien) ermöglichen eine an die Polarität der Probe adaptierte Einstellung der Hydrophilie bzw. Lipophilie des porösen Wischstiftes 2. Im günstigsten Falle kann über die chemische Einstellung des Wischstiftes 2 das Penetrationsverhalten einer flüssigen Substanz zugunsten einer schnelleren Aufnahme eines gesuchten Analyten gezielt beeinflußt werden. Die gewählte Porosität des Wischstiftes 2 entscheidet letztlich auch über die Selektion einer bestimmten Partikelfraktion.
Die Menge der Substanzaufnahme richtet sich im allgemeinen nach der gewählten Porosität des Wischstiftes 2, dem Integral aus verfügbarer Substanzmenge und der pro Zeiteinheit gewischten Fläche sowie dem Anpressdruck auf die zu wischende Oberfläche. Die Substanzaufnahme bei flüssigen Substraten kann primär über die Kontaktzeit zum Substrat und das Porenvolumen reguliert werden, wobei der Anpressdruck nicht von Bedeutung ist. Im Anschluß an die Probenahme mit dem integrierten Wischstift 2 des Wisch­ analysators erfolgt die Elution des Analyten, der sich infolge der Probenahme auf der Oberfläche des Wischstiftes 2 befindet oder aber in die Poren einge­ drungen ist. Dazu muß der flache Wischanalysator (Abmessungen des Gehäuses 1 im Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 1 etwa: Länge 9 cm, maximale Breite 2 cm und maximale Höhe 1 cm) auf eine Unterlage gelegt werden. Der Wischstift 2 ist nun vertikal ausgerichtet. Der Vorgang der Elution findet innerhalb der Poren des Wischstiftes 2 statt, nachdem ein Elutionsmittel auf die Oberfläche des Wischstiftes 2 getropft wurde. Dieser Vorgang kann vorzugsweise manuell durchgeführt werden, indem Tropfen aus einer Tropf­ flasche aufgegeben werden. Der gesuchte Analyt löst sich in dem Elutions­ mittel und gelangt schließlich in verdünnter und hinreichend mobiler Form auf die Analyseelemente. Im Falle der Aufnahme von partikulären Substanzen fungiert der Wischstift 2 zusätzlich als Filter, indem die akkumulierten Partikel im wesentlichen auf der Oberfläche des Wischstiftes 2 zurückgehalten werden. Durch die exponierte Position des Wischstiftes 2 winklig zum Gehäuse 1 baut sich entsprechend der Höhe des Wischstiftes 2 ein hydrostatischer Druck auf, der den Kapillartransport zu den angrenzenden Analyseelementen erleichtert. Der Transport des Analyten erfolgt vorzugsweise über Kapillarkräfte der kleinen Poren sämtlicher Komponenten des Analysesystems (4, 5, 6, 7, 9). Die Höhe des Wischstiftes 2 folgt dem Kompromiß, eine gezielte Beprobung durchführen zu können, und dem Bestreben, die Verdünnung des gesuchten Analyten so gering wie möglich zu halten, um die Empfindlichkeit des analytischen Verfahrens nicht zu beeinträchtigen.
Die Einfassung des Wischstiftes 2 in das Gehäuse 1 sieht außerdem eine Auffangrinne 3 vor. Hiermit wird sichergestellt, daß Tropfen des Elutionsmittels, die nicht sofort vom Wischstift 2 aufgesogen werden, über einen Ablaufkegel des Gehäuses 1 in der Auffangrinne 3 festgehalten werden, um nicht auf die Analyseelemente selbst oder auf die beprobte Fläche zu gelangen.
Für den Fall einer versehentlichen Überdosierung von Elutionsmittel ist an der Schnittstelle zwischen Wischstift 2 und poröser Transferzone 4 ein Über­ laufschutz in Form einer in den Figuren nicht dargestellten Aussparung für überschüssige Flüssigkeit in das Innere des Gehäuses 1 integriert.
Das kapillarporöse Analysesystem (4, 5, 6, 7, 9) als integraler Bestand­ teil eines Wischanalysators zeichnet sich durch die Eigenschaft aus, eine Analyseflüssigkeit autonom zu transportieren. Die Analyseflüssig­ keit wird direkt vom Wischkompartiment über die Schnittstelle in Form sich berührender Flächen des Wischstiftes 2 und der porösen Transferzone 4 übernommen. Der flüssige Analyt gelangt mit Hilfe der Saugwirkung sämtlicher Komponenten des Analysesystems über die Konjugatzone 5, Reaktionszone 6 und die Signalzonen 7 in eine ebenfalls poröse Auffangzone 9. Bei dem Durchfluß des Analyten durch die verschiedenen Zonen des Analysesystems werden in der Konjugatzone 5 Hilfsstoffe zur Visualisierung eines analytspezifischen Nachweises solubilisiert, die schon durch den Fluid­ transport in die Reaktionszone 6 und in die Signalzonen 7 sowie in diesen Zonen selbst analytspezifische chemische oder biochemische Wechsel­ wirkungen mit weiteren, stationären Hilfsstoffen und dem Analyten ermög­ lichen. In den Signalzonen 7 sind weitere Hilfsstoffe immo­ bilisiert, die eine Visualisierung eines analytspezifischen Nachweises er­ möglichen. Als Hilfsstoffe zur Analyse kommen biochemische Erkennungs­ strukturen aller Art, wie beispielsweise Antikörper, Rezeptoren, DNA- oder RNA-Strukturen in Frage. Weitere analytische Hilfsstoffe sind signalindu­ zierende Komponenten, beispielsweise Farbstoffe, gefärbte Partikel, Enzyme, Redox- und pH-Indikatoren.
Eine besonders bevorzugte Ausführung des erfindungsgemäßen Wisch­ analysators ist die Kombination des oben beschriebenen Wischkomparti­ ments mit einem immunchromatographischen Teststreifen. Die Verbindung beider Einheiten zu einem eigenständigen Instrument geschieht über deren paßgenaue Einbettung in ein auseinandernehmbares Gehäuse 1 aus Polypropylen. Aus dem Gehäuse 1 ragt der Wischstift 2, bestehend aus gesintertem Kunststoff, heraus, der wiederum in das Wischkompartiment samt Aussparung für überschüssiges Elutionsmittel integriert ist. Das Gehäuse 1 weist außerdem ein Fenster 10 als Signalfenster über den Signalzonen 7 des Teststreifens auf. Das Analysenergebnis, in Form von farblich sichtbaren Banden, kann durch dieses Signalfenster visuell abge­ lesen werden. Der Ablauf einer Wischanalyse gestaltet sich vorzugsweise wie folgt:
Die Wischprobe wird mit Hilfe einer zeitlich begrenzten manuellen Wischbe­ wegung auf dem zu analysierenden Objekt entnommen. Die Elution des Analyten folgt durch gezielte Zugabe einiger Tropfen eines Elutionsmittels auf den Wischstift 2. An dem Wischstift 2 abperlende Tropfen laufen an­ schließend in die Auffangrinne 3. Ein für die Analyse essentieller Anteil des Elutionsmittels wird von dem Wischstift 2 aufgenommen. Das Elutions­ mittel passiert den Wischstift 2 und extrahiert gleichzeitig einen Anteil des an die aufgenommene Probe gebundenen Analyten. Der gelöste Analyt gelangt nun über den Kapillartransport auf den Teststreifen, wo eine analytspezifische Erkennungsreaktion stattfindet.
Beispiel 1 Nachweis des Katzenallergens Fel d1 aus Hausstaub mit einem erfindungsgemäßen Wischanalysator a) Herstellung des Goldmarkers
Es wurden 0,5 l destilliertes und filtriertes (0,2 µm) Wasser in einem silikonisierten Becherglas unter Rühren zum Sieden erhitzt und 5 ml 1%ige Goldsäure hinzugefügt. Die Lösung wurde weitere 5 Minuten gekocht und dann 20 ml 1%ige Natriumcitrat-Lösung rasch hinzuge­ geben. Nach weiteren 10 Minuten zeigte ein Farbumschlag von blau nach rot das Ende der Reaktion an. Das Kolloid wurde im Eisbad auf Raumtemperatur abgekühlt und durch Zugabe von 5 ml 2%iger NaN3-Lösung und von 0,5 ml 1%igem PEG (Polyethylenglykol) 20000 stabilisiert.
b) Herstellung des Goldmarker-Konjugats
Der pH-Wert der Goldkolloid-Lösung wurde durch Zugabe von 0,2 M K2CO3 auf pH 9 eingestellt. 10 mg eines ersten für Fel d1 spezifischen monoklonalen Antikörpers wurde zur Lösung zugegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Zugabe von 200 mg Rinderserumalbumin zur Lösung und einer Inkubation für weitere 30 Minuten wurden die Konjugate aus Antikörpern und Goldmarkern durch 15minütige Zentrifugation bei 40000 × g erhalten, indem das Pellet in 0,1 M HEPES (Hydroxyethyl-Piperazin-Ethansulfon­ säure)-Puffer, pH 7,0, mit den Zusätzen 0,1% Rinderserumalbumin und 0,05% PEG 20000 aufgenommen wurde.
c) Präparation des Konjugatvlieses (Konjugatzone 5)
F075-14 Glasfaservliesmaterial (Firma Whatman, Großbritannien) wurde in Streifen mit 0,5 cm Breite und 2,5 cm Länge geschnitten, in der Goldmarker-Konjugat-Lösung (optische Dichte bei 520 nm auf 3 eingestellt) getränkt und bei 40°C für 20 Minuten im Umluftofen getrocknet.
d) Aufbau der Reaktionszone 6
Als Reaktionszone 6 wurde eine Nitrocellulose-Membran mit der Porengröße 5 µm (Firma Schleicher & Schüll, Deutschland), die eine Breite von 0,5 cm und eine Länge von 2,5 cm aufwies, mit Hilfe eines doppelseitigen Klebebands auf einem Kunststofflaminat 8 mit einer Stärke von 1 mm fixiert. Mit Hilfe eines Camag Linomaten IV (Firma Camag, Schweiz) wurden 1 cm vom vorderen Rand der Nitrocellulose entfernt sowohl ein zweiter für Fel d1 spezifischer monoklonaler Anti­ körper in einer Konzentration von 1 mg/ml als linienförmige Signalzone 7 (1 µl/cm) als auch in 1,5 cm Abstand vom Rand ein für Mausantikörper spezifischer Antikörper linienförmig aufgesprüht. Anschließend wurde die Membran für 30 Minuten bei 40°C im Umluftofen getrocknet, mit 0,1%iger Rinderserumalbuminlösung für 10 Minuten blockiert und erneut für 30 Minuten bei 40°C getrocknet.
e) Zusammenbau des Wischanalysators
Das mit Goldmarker-Konjugat getränkte Konjugatvlies (Konjugatzone 5) wurde derart mit doppelseitigem Klebeband auf dem Kunststofflaminat 8 fixiert, daß es die Reaktionszone 6 um 2 mm an ihrem vorderen Ende überlappte. Ebenfalls mit 2 mm Überlappung wurde am hinteren Ende der Reaktionszone 6 ein 2 cm langes und 0,5 cm breites Glasfaservlies GF/F (Firma Whatman, Großbritannien) fixiert, das als Absorptionsvlies (Auffangzone 9) diente. Somit erhielt man einen Teststreifen mit einer Breite von 0,5 cm, bestehend aus einem 2,5 cm langen Absorptions­ vlies (Auffangzone 9) und angrenzend einer 2,5 cm langen Reaktions­ zone 6 und einer 2 cm langen Transferzone 5, deren einzelne Kompo­ nenten im Kapillartransport zueinander standen. Der 7 mm hohe zylindrische Wischstift 2 (Durchmesser 4 mm), bestehend aus gesintertem Polyethylen mit einer Porengröße von 70 µm, kontaktierte den Teststreifen an der Stelle der Transferzone 4. Das geschlossene Gehäuse 1 des Wischanalysators hält die beiden Komponenten, Wischstift 2 und Teststreifen, im Preßsitz.
f) Präparation einer Modelloberfläche und Probenahme des Hausstaubs
Auf der Oberfläche von fünf Lagen (Simulation einer weichen Textil­ oberfläche) staubfreier Reinstraum-Papiertücher der Firma Clear-Clean wurden mit dem Laborspatel ca. 10 mg Feinstaub einer 110 µm partikel­ gesiebten Hausstaubprobe verteilt. Die Konzentration der Hausstaubprobe an Katzenallergen beträgt gemäß Mikrotiterplatten-ELISA < 10 µg Fel d1/g Hausstaub.
Der Wischanalysator wurde in die Hand genommen und mit dem Wisch­ stift 2 nach unten gerichtet 1 Minute über den verteilten Staub gewischt. Der Staub drang oberflächlich in die Poren des Wischstiftes 2 ein. Nach der Beprobung verfärbte sich der Wischstift 2 infolge der Partikelanrei­ cherung grau.
g) Elution des Katzenallergens Fel d1 und Analyse
Mit Hilfe einer 5 ml-Tropfflasche wurden 5 Tropfen einer Elutionsflüssig­ keit innerhalb von 30 Sekunden zielgenau auf den Wischstift 2 dosiert. Die Elutionsflüssigkeit bestand aus 0,01 molarem Natriumphosphatpuffer pH 7,6 mit 1% Rinderserumalbumin und 0,2% Tween 20.
h) Auswertung des Wischanalysators
Nach ca. 5 Minuten wurden zwei rote Linien (Signalzone 7) sichtbar. Bei unbelasteten Kontrollproben ergab sich lediglich eine Verfärbung der Kontrollbande.
Beispiel 2 Nachweis von Amfetaminsulfat aus menschlichem Speichel mit einem erfindungsgemäßen Wischanalysator a) Herstellung des Goldmarkers
Es wurden 0,5 l destilliertes und filtriertes (0,2 µm) Wasser in einem silikonisierten Becherglas unter Rühren zum Sieden erhitzt und 5 ml 1%ige Goldsäure hinzugefügt. Die Lösung wurde weitere 5 Minuten gekocht und dann 20 ml 1%ige Natriumcitrat-Lösung rasch hinzugegeben. Nach weiteren 10 Minuten zeigte ein Farbumschlag von blau nach rot das Ende der Reaktion an. Das Kolloid wurde im Eisbad auf Raumtem­ peratur abgekühlt und durch Zugabe von 5 ml 2%iger NaN3-Lösung und von 0,5 ml 1%igem PEG (Polyethylenglykol) 20000 stabilisiert.
b) Herstellung des Goldmarker-Konjugats
Der pH-Wert der Goldkolloid-Lösung wurde durch Zugabe von 0,2 M K2CO3 auf pH 9 eingestellt. 10 mg eines ersten für Amfetamin spezifi­ schen monoklonalen Antikörpers wurde zur Lösung zugegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Zugabe von 200 mg Rinderserumalbumin zur Lösung und einer Inkubation für weitere 30 Minu­ ten wurden die Konjugate aus Antikörpern und Goldmarkern durch 15- minütige Zentrifugation bei 40000 × g erhalten, indem das Pellet in 0,1 M HEPES (Hydroxyethyl-Piperazin-Ethansulfonsäure)-Puffer, pH 7,0, mit den Zusätzen 0,1% Rinderserumalbumin und 0,05% PEG 20000 aufgenommen wurde.
c) Präparation des Konjugatvlieses (Konjugatzone 5)
F075-14 Glasfaservliesmaterial (Firma Whatman, Großbritannien) wurde in Streifen mit 0,5 cm Breite und 2,5 cm Länge geschnitten, in der Goldmarker-Konjugat-Lösung (optische Dichte bei 520 nm auf 3 eingestellt) getränkt und bei 40°C für 20 Minuten im Umluftofen getrocknet.
d) Aufbau der Reaktionszone 6
Als Reaktionszone 6 wurde eine Nitrocellulose-Membran mit der Porengröße 5 µm (Firma Schleicher & Schüll, Deutschland), die eine Breite von 0,5 cm und eine Länge von 2,5 cm aufwies, mit Hilfe eines doppelseitigen Klebebands auf einem Kunststofflaminat 8 mit einer Stärke von 1 mm fixiert. Mit Hilfe eines Camag Linomaten IV (Firma Camag, Schweiz) wurden 1 cm vom vorderen Rand der Nitrocellulose entfernt sowohl ein Amfetamin-Polyhapten in einer Konzentration von 1 mg/ml als linienförmige Signalzone 7 (1 µl/cm) als auch in 1,5 cm Abstand vom Rand ein für Mausantikörper spezifischer Antikörper linienförmig aufgesprüht. Anschließend wurde die Membran für 30 Minuten bei 40°C im Umluftofen getrocknet, mit 0,1%iger Rinderserumalbuminlösung für 10 Minuten blockiert und erneut für 30 Minuten bei 40°C getrocknet.
e) Zusammenbau des Wischanalysators
Das mit Goldmarker-Konjugat getränkte Konjugatvlies (Konjugatzone 5) wurde derart mit doppelseitigem Klebeband auf dem Kunststofflaminat 8 fixiert, daß es die Reaktionszone 6 um 2 mm an ihrem vorderen Ende überlappte. Ebenfalls mit 2 mm Überlappung wurde am hinteren Ende der Reaktionszone 6 ein 2 cm langes und 0,5 cm breites Glasfaservlies GF/F (Firma Whatman, Großbritannien) fixiert, das als Absorptionsvlies (Auffangzone 9) diente. Somit erhielt man einen Teststreifen mit einer Breite von 0,5 cm, bestehend aus einem 2,5 cm langen Absorptions­ vlies (Auffangzone 9) und angrenzend einer 2,5 cm langen Reaktions­ zone 6 und einer 2 cm langen Transferzone 4, deren einzelne Kompo­ nenten im Kapillartransport zueinander standen. Der 7 mm hohe zylindrische Wischstift 2 (Durchmesser 4 mm), bestehend aus gesintertem Polyethylen mit einer Porengröße von 70 µm, kontaktierte den Teststreifen an der Stelle der Transferzone 4. Das geschlossene Gehäuse 1 des Wischanalysators hält die beiden Komponenten, Wischstift 2 und Teststreifen, im Preßsitz.
f) Speichelprobenahme
1 ml menschlicher Speichel wurde entnommen und mit 100 Nanogramm Amfetamin versetzt. Die so erhaltene Positivprobe wurde mit Hilfe eines Pinsels auf eine Rinderzunge aufgetragen. Der Wischanalysator wurde in die Hand genommen und mit dem Wischstift 2 nach unten gerichtet einmal über die Zunge gestrichen.
g) Elution des Amfetamins und Analyse
Mit Hilfe einer 5 ml-Tropfflasche wurden 5 Tropfen einer Elutionsflüssig­ keit innerhalb von 30 Sekunden zielgenau auf den Wischstift 2 dosiert. Die Elutionsflüssigkeit bestand aus 0,01 molarem Natriumphosphatpuffer pH 7,6 mit 1% Rinderserumalbumin und 0,2% Tween 20.
h) Auswertung des Wischanalysators
Nach ca. 5 Minuten wurde eine rote Linie (Signalzone 7) sichtbar. Bei unbelasteten Kontrollproben ergaben sich zwei rote Linien.

Claims (7)

1. Wischanalysator für den immunchemischen Stoffnachweis mit
  • - einem Gehäuse,
  • - einer Elutionsmittelaufgabezone und
  • - einer Reaktionszone mit Signalzone,
dadurch gekennzeichnet, daß
  • - das Gehäuse (1) eine lokale Erhebung mit einer zentralen Öffnung aufweist, aus der eine als poröser Wischstift (2) aus­ gebildete Probenahme- und Elutionsmittelaufgabezone hervor­ steht,
  • - die lokale Erhebung mit einer zumindest teilweise umlaufenden Auffangrinne (3) zur Aufnahme überschüssigen Elutionsmittels versehen ist,
  • - im Abstand von der lokalen Erhebung ein Fenster (10) im Gehäuse (1) zur Auswertung der unterlegten Reaktions­ zone (6) vorhanden ist und
  • - Probenahme- und Elutionsmittelaufgabezone sowie Reaktions­ zone (6) mit Signalzonen (7) in kapillarer Fluidverbindung mitein­ ander stehen.
2. Wischanalysator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die lokale Erhebung kegelförmig ausgebildet ist.
3. Wischanalysator nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die um die lokale Erhebung umlaufende Auffangrinne (3) konzentrisch ausgebildet ist.
4. Wischanalysator nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die vom Gehäuse (1) nach außen hervor­ stehende poröse Fläche des Wischstiftes (2) abgerundet ist.
5. Wischanalysator nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Porengröße des Wischstiftes (2) 10 Mikrometer bis 100 Mikrometer beträgt.
6. Wischanalysator nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Wischstift (2) aus einem gesin­ terten oder geschäumten Kunststoff besteht, insbesondere aus ge­ sintertem Polyethylen.
7. Wischanalysator nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gehäuse (1) öffenbar ist und aus einem Kunststoff besteht, insbesondere aus Polypropylen.
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