DE19903056A1

DE19903056A1 - HPV-Assay

Info

Publication number: DE19903056A1
Application number: DE1999103056
Authority: DE
Inventors: Klaus Bendrat; Axel Niendorf
Original assignee: MEDEEA FORSCHUNGS GmbH
Current assignee: NIENDORF, AXEL, PROF.DR.MED., 22587 HAMBURG, DE
Priority date: 1999-01-26
Filing date: 1999-01-26
Publication date: 2000-08-03
Anticipated expiration: 2019-01-27
Also published as: DE19903056B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur in vitro-Diagnose einer Infektion mit Humanem Papillomavirus (HPV) sowie ein Verfahren zum Amplifizieren von in biologischen Proben vorhandener HPV-DNA. Ferner betrifft die Erfindung unter anderem Kits zur Durchführung dieser Verfahren sowie in diesen Verfahren eingesetzte Oligonukleotidprimer und Oligonukleotidsonden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur in-vitro-Dia gnose einer Infektion mit Humanem Papillomavirus (HPV) sowie ein Verfahren zum Amplifizieren von in biologischen Proben vorhande ner HPV-DNA. Ferner betrifft die Erfindung unter anderem Kits zur Durchführung dieser Verfahren sowie in diesen Verfahren eingesetzte Oligonukleotidprimer und Oligonukleotidsonden.

In der Krebsvorsorge der Frau werden routinemäßig zervikale Zellausstriche auf morphologische Veränderungen (Dysplasien) hin untersucht. Obwohl der überwiegende Anteil dieser Dysplasien reversibel ist und sich spontan wieder zurückbildet, entwickelt sich ein Teil weiter zu einem Karzinom. Das Vorhandensein von dysplastischen Veränderungen eines bestimmten Schweregrades ist die Grundlage für weitergehende Maßnahmen wie z. B. Konisation, bei der die Läsion operativ entfernt wird. Die routinemäßige Anwendung dieses Verfahrens in der Krebsvorsorge hat zu einer erheblichen Reduzierung der Krebsinzidenz geführt.

Es ist bekannt, daß bei der Entstehung bestimmter maligner Tumoren verschiedene virale Erreger eine zentrale Rolle spie len. So sind z. B. mehr als 90% der Karzinome des Gebärmutter halses mit dem Auftreten bestimmter Typen des Humanen Papillo mavirus (HPV) assoziiert. Das Risiko, an einem malignen Tumor (Karzinom) der Zervix uteri zu erkranken, hängt von verschie denen Faktoren ab, wie z. B. der Infektionsdauer mit einem der sog. Hochrisikotypen (HPV 16, 18, 31, 33) und dem Alter der Patientin. [N. Engl. J. Med., 338: 423-8 (1998), Obstet. Gyne col., 67: 665-669 (1986), Br. J. Cancer 64: 559-565 (1991)]. Aus diesen Untersuchungen geht hervor, daß die Beurteilung des individuellen Krebsrisikos verbessert wird, wenn zur Zeit der Diagnose Informationen bezüglich einer zurückliegenden, bzw. persistierenden HPV-Infektion und der beteiligten Typen über einen längeren Zeitraum vorhanden sind.

Ein weiterer Faktor, der den Schweregrad der Läsion be schreibt, liegt im physikalischen Zustand des HPV-Genoms. In der Mehrzahl der Fälle liegt das virale Genom in Form multip ler Episome in der Wirtszelle vor. Es gibt jedoch Hinweise dafür, daß insbesondere in fortgeschrittenen, prämalignen Läsionen das virale Genom in sehr niedriger Kopienzahl in das Wirtsgenom integriert vorliegt, weshalb gerade in diesen Fäl len ein positiver HPV-Nachweis in der Vergangenheit oft miß lang. Um den in diesen Fällen besonders wichtigen HPV-(Typen-) Nachweis erbringen zu können, werden höchste Anforderungen an die Empfindlichkeit des Detektionsverfahrens gestellt [Curr. Top. Microbiol. Immunol. 186: 131-156 (1994), J. Clin. Pathol. 50: 600-604 (1997)].

Zur Erfassung der Persistenz einer vorhandenen HPV-Infektion ist eine regelmäßige Untersuchung des Ausstrichmaterials auf HPV-Befall und die Identifizierung der beteiligten HPV-Typen notwendig. Wenn die cytologische Untersuchung aufgrund des Auftretens bestimmter morphologischer Merkmale den Verdacht auf HPV-Befall begründet, werden bestehende Verfahren zum HPV- Nachweis angewandt. In der Regel ist es hierfür erforderlich, eine zweite Probe zu gewinnen, da cytologische Präparate für Archivzwecke erhalten bleiben müssen. Diese notwendige zweite Probennahme stellt eine erhebliche Mehrbelastung für Patien tinnen, Ärzte und das gesamte Gesundheitssystem dar. Zur Ver meidung einer zweiten Probennahme kann alternativ von jeder Patientin direkt parallel zum ersten PAP-smear eine weitere Probe speziell für die HPV-Testung gewonnen werden. Dieses Vorgehen verursacht allerdings aufgrund der wenigen indizier ten HPV-Untersuchungen (ca. 10% der Fälle) ebenfalls unnötige Mehrkosten, da rund 90% der HPV-Proben nicht benötigt werden.

Die Ergänzung der cytologischen Untersuchung durch HPV-Nach weis/Typisierung kann die Erstellung eines individuellen Fol low-up Programms (z. B. verkürzte Intervalle bei Nachfolgeun tersuchungen) stark erleichtern.

Im folgenden werden die bisher gängigen HPV-Nachweismethoden kurz zusammengefaßt und charakterisiert:
Immunocytochemische Verfahren weisen direkt auf dem speziell vorbehandelten Ausstrich oder histologischen Präparat virale Proteine mithilfe geeigneter Antikörper nach. Die zentrale Frage nach den beteiligten HPV Typen kann hierbei oft nur unzureichend beantwortet werden.

Andere in-situ Methoden benutzen markierte Nukleinsäuren als Sonden, um typenspezifische Sequenzen ebenfalls direkt auf dem Ausstrichpräparat nachzuweisen. Je nach verwendetem Nachweis system lassen sich hiermit auch niedrige Kopienzahlen von HPV (< 10 pro Wirtszelle) nachweisen.

Der labortechnische Aufwand steigt bei diesen in-situ Methoden mit der Menge der Ausstrichproben sowie der Anzahl der zu untersuchenden HPV-Typen stark an, was sie für einen routine mäßigen Einsatz nur eingeschränkt geeignet macht.

Im Rahmen eines weiteren Verfahrens [ViraType™ Plus HPV DNA Assay, Murex Diagnostika GmbH] wird die virale DNA direkt durch Hybridisierung mit entsprechenden RNA-Sonden nachgewie sen. Da hier auf einen Amplifikationsschritt verzichtet wird, liegt die vom Hersteller angegebene Detektionsgrenze von 10 pg/ml (ca. 1.000.000 Kopien HPV-Genom/ml) im Vergleich zu PCR gestützten Tests sehr hoch.

Ein anderer, ebenfalls kommerziell erhältlicher Test [SHARP Signal™ System, Digene] basiert auf einer einstufigen PCR-Am plifikation, wobei der HPV-Nachweis ebenfalls in Form von RNA- DNA-Hybriden erfolgt. Das Detektionslimit liegt laut Herstel lerangabe bei ca. 10-100 Kopien in der Probe.

Bei den beiden letztgenannten Tests wird jedoch oft aus Ko stengründen lediglich zwischen HPV-Gruppen ("Hochrisiko" bzw. "Niedrigrisiko") unterschieden, während eine Identifizierung individueller HPV-Typen nur mit deutlich erhöhtem Aufwand möglich ist.

Im Unterschied zu den bekannten Verfahren im Stand der Technik besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein gegenüber dem Stand der Technik verbessertes Verfahren zur Verfügung zu stellen.

Ein optimiertes Verfahren sollte in der Lage sein, in genau definierten Bedarfsfällen und ohne weiteren Aufwand, d. h. ohne eine zweite Probennahme, eine HPV-Identifizierung und -Typi sierung zu gewährleisten. Das Verfahren müßte empfindlich genug sein, um den auf eine HPV-Infektion suspekten Bereich des ursprünglichen Abstriches als Ausgangsmaterial nutzen zu können, ohne daß das Präparat in seiner Gesamtheit für die Archivierung verloren ginge.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein gegenüber den bisher angewandten Methoden vereinfachtes, leichter zu handhabendes und im Ergebnis sichereres und präziseres Ver fahren zum HPV-Nachweis zur Verfügung zu stellen, das eine hohe Sensitivität aufweist und sich für den routinemäßigen Einsatz in Analytiklabors eignet. Durch dieses Verfahren soll te auf der Grundlage eines einzigen Abstrichs der Cervix uteri nicht nur eine HPV-Infektion diagnostiziert werden können, sondern gleichzeitig sollte auch, der spezifische Nachweis verschiedener HPV-Typen ermöglicht werden.

Zur Lösung der Aufgabe wird erfindungsgemäß ein Verfahren vor geschlagen, bei dem man die in biologischen Proben vorhandene HPV-DNA durch eine zweistufige, verschachtelte (nested PCR) amplifiziert und anschließend nachweist.

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum Nachweis und Identifizierung verschiedener HPV-Typen, insbesondere der Typen 6 und 11, sowie der sog. "Hochrisikost ämme" HPV 16, 18, 31 und 33 des Humanen Papillomavirus, in gynäkologischen Zellausstrichen aus der Krebsvorsorge sowie frischen oder fixierten (auch paraffinierten) Gewebe- und Zellproben.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird vor allem ein Ver fahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, ein Kit nach den Ansprü chen 13 bis 20, Membranstreifen nach den Ansprüchen 21 bis 23 sowie Oligonukleotidprimer nach den Ansprüchen 24 bis 26 und Oligonukleotidsonden nach Anspruch 27 zur Verfügung gestellt.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Amplifizieren von in biologischen Proben vorhandener HPV- DNA, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine Probe gegebenenfalls einem Protease-Verdau un terzieht,
b) die Nukleinsäuren gegebenenfalls von Protease und anderen Bestandteilen abtrennt,
c) eine zweistufige (nested) PCR durchführt, wobei die ver wendeten Oligonukleotidprimer eine Länge von etwa 15 bis 25 Basen haben und deren Sequenzen zu Konsensussequenzen aus dem L1-Genbereich von mindestens 30 HPV-Typen komple mentär sind, und man
d) gegebenenfalls eine Aufreinigung der am Ende von Stufe c) erhaltenen amplifizierten DNA durchführt.

Als biologische Proben kommen insbesondere archivierte oder frische Abstriche der Cervix uteri sowie frische oder fixierte (auch paraffinierte) Gewebeproben auch anderer Lokalisationen (Schnittpräparate von Gewebeproben) in Betracht.

In Einzelfällen kann auf einen Protease-Verdau in Stufe a) des Verfahrens verzichtet werden. In der Regel wird aber ein Pro tease-Verdau notwendig sein, um die Nukleinsäuren freizuset zen. Als Protease wird vorzugsweise Proteinase K oder Pronase® (aus Streptomyces griseus isoliertes Gemisch aus Endo- und Exopeptidasen) verwendet.

Es sollte sich ein Schritt anschließen, bei dem die Protease inaktiviert wird, vorzugsweise durch eine Hitzebehandlung, ge folgt von einem Reinigungsschritt, um die Nukleinsäuren von Substanzen wie Protease und anderen Bestandteilen, die die PCR stören könnten, zu befreien. Die Reinigung wird nach üblichen Methoden durchgeführt, wie z. B. durch Verwendung einer Silica- Matrix (SiO₂, z. B. in Form eines Filters, Perlen, etc.). Al ternativ können die Nukleinsäuren bei schwachsaurem pH-Wert (pH 5) und hoher Ionenstärke auch mit organischen Lösungsmit teln (Ethanol, Isopropanol) ausgefällt werden. Ebenso in Be tracht kommen (Ultra-)Zentrifugationsmethoden für die Nukleinsäureaufreinigung.

Alternativ zu den genannten Reinigungsschritten können poten tielle PCR-Hemmstoffe, die z. B. aus der biologischen Probe stammen, durch die Zugabe geeigneter PCR-Adjuvantien (z. B. Rinderserumalbumin) neutralisiert werden.

Zur erfindungsgemäßen Amplifikation wird eine zweistufige, verschachtelte Polymerasekettenreaktion (nested PCR) durchge führt. Dabei kommt es wesentlich auf die Wahl der in der er sten und zweiten PCR-Stufe verwendeten Oligonukleotidprimer an. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden Primer einer Länge von etwa 15 bis 25 Basen eingesetzt, deren Sequenzen zu Konsensussequenzen aus dem L1-Genbereich von mindestens 30 HPV-Typen komplementär sind, wobei einige wenige (bis zu 3) "mismatches" nicht ausgeschlossen sind. Diese Primer werden nachfolgend auch als Konsensusprimer bezeichnet. Erfindungs gemäß können in der PCR anstelle eines oder mehrerer dieser Oligonukleotidprimer vorzugsweise auch jeweils "Primer mischungen" eingesetzt werden, wobei sich die jeweiligen Se quenzen der Primer in dieser Mischung an ein oder zwei Posi tionen in ihrer Nukleisäuresequenz unterscheiden (d. h. Ver wendung der Sequenzen, die möglich sind, wenn an bis zu zwei Positionen ein Nukleotid A, G, C oder T durch M, K, R, Y oder W ersetzt wird). Dadurch können die "mismatches" stark redu ziert werden.

Wenn genügend Probenmaterial zur Verfügung steht, kann die PCR in Stufe c) unter Verwendung der oben genannten Primer auch einstufig durchgeführt werden, wobei die Vorteile der vorlie genden Erfindung, d. h. insbesondere die Möglichkeit zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer verschiedener HPV-Typen, erhalten bleibt.

Der L1-Genbereich kodiert für ein Protein von ca. 500 Amino säuren Länge (Mr ca. 55 kDa), das den Hauptbestandteil des viralen Kapsids bildet [Review: Icenogle J.; HPV-Compendium 1995; Ch. III, 74-90]. Als Konsensusbereiche werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuresequenzabschnitte einer Länge von 15 bis 25 Basen verstanden, die bei einem Vergleich der DNA-Sequenzen verschiedener HPV-Typen eine Homologie von mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80% und gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung mindestens 90%, auf weisen. Die Wahl der Konsensusbereiche, die sich bei einem Sequenzvergleich von mindestens 30 HPV-Typen ergeben, insbe sondere der Typen 6, 11, 16, 18, 31 und 33, besonders bevor zugt der Hochrisikotypen 16, 18, 31 und 33 hat zur Folge, daß mit hoher Wahrscheinlichkeit auch HPV-Typen erfaßt werden können, die erst zukünftig aufgefunden werden.

Es hat sich erfindungsmäßig gezeigt, daß für die zweistufige PCR folgende ineinandergeschachtelte Oligonukleotidprimer besonders gut geeignet sind:

- Primerpaar für die erste PCR-Stufe:
5'-AGG ATG GKG ATA TGG T-3' (SEQ ID NO: 1) und 5'-GTA TCW ACM ACA GTA ACA AA-3' (SEQ ID NO: 2);
- Primerpaar für die zweite PCR-Stufe:
5'-TGY AAA TAT CCW GAT TAT-3' (SEQ ID NO: 3) und 5'-TGT ARC CAA TAT GGY TTA TT-3' (SEQ ID NO: 4).

Gemäß einer besonderen Ausführungsform des o. g. Verfahrens verwendet man in Stufe c) für die erste PCR-Stufe zunächst die Oligonukleotidprimer mit den SEQ ID: 1 und SEQ ID NO: 2 darge stellten Nukleotidsequenzen und anschließend die Oligonukleo tidprimer mit den in SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 dargestell ten Nukleotidsequenzen. Dabei können entweder die für SEQ ID NO: 1, 2, 3 und 4 jeweils möglichen Einzelsequenzen (d. h.
AGG-ATGGGGATATGGT, AGGATGGTGATATGGT; GTATCAACAACAGTAACAAA,
GTATCT-ACAACAGTAACAAA, GTATCAACCACAGTAACAAA, GTATCTACCACAGTAACAAA;
TGTAAATATCCAGATTAT, TGCAAATATCCAGATTAT, TGTAAATATCCTGATTAT,
TGCAAATATCCTGATTAT; TGTAGCCAATATGGTTTATT,
TGTAACCAA-TATGGTTTATT, TGTAGCCAATATGGCTTATT, TGTAACCAATATGGCTTATT)
oder Mischungen derselben in der PCR eingesetzt werden. Es liegt auf der Hand, daß auch Fragmente dieser Primer (oder Mischun gen derselben) für die PCR eingesetzt werden können, wobei die verkürzten Sequenzen vorzugsweise eine Länge von mindestens 10 Basen aufweisen sollten. Ferner können in ihrer Sequenz oder auch andersartig modifizierte Primer in Frage kommen, solange durch die Modifikation nicht ihre Fähigkeit verlorengeht, als Startpunkte für eine PCR dienen zu können.

Durch dieses erfindungsgemäße Verfahren kann in dem biologi schen Probenmaterial vorhandene HPV-DNA soweit amplifiziert werden, daß nachfolgend ein typenspezifischer HPV-Nachweis möglich ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zum in vitro-Nachweis von HPV (d. h. einer HPV-Infektion), bei dem man zunächst ein oben genanntes Amplifikationsverfahren (PCR) durchführt und die amplifizierte HPV-DNA anschließend durch Hybridisierung mit einer oder mehreren Oligonukleotidsonden nachweist. Neben gewöhnlicher DNA können auch RNA oder artifi zielle Analoga (z. B. Phosphorothioat-Oligonukleotide oder Analoga auf Peptidbasis) als Sonden eingesetzt werden.

Zum Nachweis einer Hybridisierung werden vorzugsweise bei der PCR Primer eingesetzt, von denen wenigstens ein Teil mit Digo xigenin oder Biotin markiert ist, wobei insbesondere der Pri mer der zweiten PCR-Stufe markiert ist, der den zu der gebun denen Sonde komplementären Strang startet. Alternativ können auch Markierungen mit Radioaktivität oder mit Fluoreszensfarb stoffen erfolgen.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung weisen die Oligonukleotidsonden Nukleinsäuresequenzen auf, die zu einem für einen bestimmten HPV-Typ spezifischen Se quenzabschnitt der HPV-DNA oder zu einem konservierten Bereich der HPV-DNA komplementär sind. Als konserviert werden im Rah men der vorliegenden Erfindung DNA-Sequenzabschnitte verstan den, die bei einem Vergleich der DNA-Sequenzen verschiedener HPV-Typen eine Homologie von weniger als 65%, vorzugsweise weniger als 50% und gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung weniger als 35%. Die bevorzugte Länge der Sonden beträgt ca. 10-40 Basen, besonders bevorzugt ca. 15-40 Basen.

Um eine möglichst umfassende Einteilung in die verschiedenen, an einer HPV-Infektion beteiligten HPV-Typen durchzuführen, verwendet man gemäß einer besonderen Ausführungsform der Er findung zur Hybridisierung mehrere Oligonukleotidsonden, deren Nukleinsäuresequenzen jeweils zu einem für einen bestimmten HPV-Typ spezifischen Sequenzabschnitt der HPV-DNA komplementär sind. Es sind somit Sonden bevorzugt, die jede für sich für nur einen HPV-Typ spezifisch ist, d. h. daß unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen eine bestimmte Sonde ausschließlich mit dem entsprechenden HPV-Typ hybridisiert und es zu keiner Kreuzreaktion mit anderen HPV-Typen kommt. Erfindungsgemäß bevorzugte Bedingungen sind im Beispielteil genau beschrieben.

Die Verwendung einer zusätzlichen Oligonukleotidsonde (PAN- Sonde), deren Nukleinsäuresequenz zu einem konservierten Be reich der HPV-DNA komplementär ist (d. h. nicht-typenspezifi sche Sonde), erhöht in diesem Zusammenhang die Sicherheit für einen positiven HPV-Nachweis, auch für den Fall, daß ein ande rer als die erwähnten HPV-Typen 6, 11, 16, 18, 31 und 33 in der Probe enthalten sein sollte. In diesem Fall ist eine Typi sierung zwar nicht möglich, aber das Risiko eines falschnega tiven Resultates wird auf ein Minimum reduziert. Erfindungs gemäß bevorzugt ist die im folgenden genannte Sonde Pan-HPV, und aufgrund der Sequenzabweichungen ist die Verwendung einer Mischung von Pan-HPV mit der für HPV Typ 18 charakteristischen Sonde Pan-HPV18 besonders bevorzugt.

Es hat sich erfindungsgemäß als besonders vorteilhaft erwie sen, Oligonukleotidsonden aus der Gruppe bestehend aus Sonden mit der SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 dargestellten Sequenz und/oder Fragmenten dieser Sequenzen auszuwählen.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung sind die Oligonukleotidsonden an eine Oberfläche (Matrix) gebunden. Auf diese Weise können die amplifizierten Nukleinsäuren durch die Sonden auf der Matrix fixiert werden (gebunden) werden. Dabei wird die Nukleinsäure jedes vorhandenen Typs an die für sie (typen-)spezifische Sonde binden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird zur Durchführung des HPV-Nachweisverfahrens ein flächiger Träger zur Verfügung ge stellt, der optisch in mehrere Felder unterteilt ist, bei dem in jedem Feld eine Oligonukleotidsonde an die Membran gebunden ist, deren Nukleinsäuresequenz zu einem für einen bestimmten HPV-Typ spezifischen Sequenzabschnitt der HPV-DNA komplementär ist. Bei dem flächigen Träger handelt es sich beispielsweise um einen Membranstreifen, z. B. aus Nylon, oder um Glas- bzw. Kunststoffplättchen. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Trägers ist in Fig. 1 dargestellt. Er enthält ein zu sätzliches Feld, das zur Beschriftung und/oder Numerierung (Seriennummer, S-Nummer) dient.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ferner ein Kit zur Durchführung eines Amplifikationsverfahrens zur Verfügung ge stellt, der zusätzlich zu den zu Durchführung einer zweistufi gen PCR erforderlichen Reagenzien auch verschachtelte (nested) Oligonukleotidprimer mit einer Länge von etwa 10 bis 30 Basen enthält, deren Sequenzen zu Konsensussequenzen aus dem L1- Genbereich von mindestens 30 HPV-Typen komplementär sind. Bei den Oligonukleotidprimern handelt es sich für die erste PCR- Stufe um Primer mit den in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 dar gestellten Nukleotidsequenzen, für die zweite Stufe handelt es sich vorzugsweise um Primer mit den in SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 dargestellten Nukleotidsequenzen oder Fragmenten dieser Sequenzen.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform enthält der Kit zusätz lich Reagenzien, die erforderlich sind, um die betreffende biologische Probe für die PCR vorzubereiten. So enthält der Kit vorzugsweise noch eine Protease, insbesondere Proteinase K oder Pronase®.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ferner ein Kit zur Durchführung eines Verfahrens zum in-vitro-Nachweis von HPV zur Verfügung gestellt, der zusätzlich zu den Bestandtei len des Kits zur Durchführung des Amplifikationsverfahrens eine oder mehrere Oligonukloetidsonden enthält, wobei die Sonden ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sonden mit einer für einen bestimmten HPV-Typ spezifischen Sequenz abschnitt der HPV-DNA komplementären Nukleotidsequenz und/oder Sonden mit einer zu einem konservativen Bereich der HPV-DNA komplementären Nukleinsäuresequenz.

Die im Kit vorzugsweise zur Verfügung gestellten Oligonukleo tidsonden sind aus der Gruppe bestehend aus Sonden mit der in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 und/oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Sequenz und/oder Fragmenten dieser Sequenzen ausgewählt.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung sind die Oligonukleotidsonden an eine Oberfläche, vorzugsweise an den oben beschriebenen flächigen Träger, gebunden. Mittels dem Fachmann bekannter Methoden kann eine Hybridisierung mit am plifizierter DNA sichtbar gemacht werden, wenn z. B. markierte Primer (s. o.) in der PCR eingesetzt werden. Der Kit kann daher ferner einen o. g. Träger sowie zur Sichtbarmachung einer Hy bridisierung von Sonde mit DNA erforderliche Reagenzien ent halten.

Für den Fall, daß die verwendeten Primer nicht markiert sind, kann der Kit dNTI's enthalten, die zumindest teilweise mar kiert sind. Solche Markierungen und Nachweisverfahren sind dem Fachmann gut bekannt (z. B. Boehringer Mannheim PCR-Labeling and Detection Kit).

Die vorliegende Erfindung weist den Vorteil auf, daß ein hoch sensitives Nachweisverfahren für das Vorliegen einer HPV-In fektion zur Verfügung gestellt wird, das sich für den routine mäßigen Einsatz in Analytiklabors eignet. Die wichtige Zusatz information über eine mögliche HPV-Infektion und die beteilig ten Typen kann gegebenenfalls auf der Grundlage eines einzigen Abstrichs der Cervix uteri oder anderer biologischer Proben gewonnen werden.

Durch die Zweistufigkeit der PCR ist die Methode empfindlich genug, um auch in kleinsten Probenmengen eine eventuell vor liegende HPV-Infektion identifizieren und typisieren zu kön nen. Dieser Vorteil kann genutzt werden, um bei morphologisch HPV-verdächtigen Pap-smears genügend Material (typisch sind 0,5-5% des Ausstriches) für eine HPV-Typisierung zu isolieren, ohne daß das Präparat für eine weitere Archivierung verloren geht.

Selbstverständlich können die Proben genauso effizient auch aus anderen archivierten Materialien (z. B. histologischen Präparaten) oder auch frischen Proben (Abstrichen) isoliert werden. Eine Beschränkung der Methode auf bestimmte Organe bei der Wahl des Ausgangsmaterials gibt es ebenfalls nicht.

Die Verwendung vorgefertigter, seriennumerierter Trägerstrei fen macht das Verfahren auch bei größeren Probenzahlen in einem einfach ausgestatteten Labor innerhalb eines Tages durchführbar. Lediglich ein Thermocycler sowie eine Temperier einheit (Wasserbad) werden zur Durchführung benötigt. Das Testergebnis kann ohne technische Hilfsmittel direkt auf dem Streifen abgelesen werden.

Ohne den erheblichen Mehraufwand einer erneuten Probenentnahme kann das Krebsrisiko der Patientin bereits frühzeitig abge schätzt werden.

Das hier vorgestellte Nachweisverfahren ermöglicht eine wei tergehende Analyse der aus der Cytologie schon vorhandenen suspekten Probe oder auch von Paraffinmaterial aller denkbaren Organe auf eine eventuell vorliegende HPV-Infektion sowie den beteiligten HPV-Typ. Besonders die Wahl der geeigneten Kon sensusprimer ermöglicht es, mit nur einem Primerpaar nicht nur die relevantesten HPV-Hochrisikotypen, sondern auch eine Viel zahl anderer Typen zu amplifizieren. Die zweistufige HPV-PCR garantiert höchste Empfindlichkeit bei gleichzeitig sehr hoher Spezifität. So konnte in wiederholten Titrationsreihen die theoretische Nachweisgrenze von 1-2 Kopien HPV-Genom in der Probe erreicht werden.

Die mit den Konsensusprimern durch PCR zugänglichen HPV-DNA- Fragmente enthalten ihrerseits so stark typenspezifische Se quenzbereiche, daß mit den verwendeten Sonden eine eindeutige Unterscheidung der auftretenden individuellen HPV-Typen mög lich ist.

Zur Vermeidung falsch-negativer Ergebnisse wird die Effizienz des Materialaufschlusses (d. h. die erfolgreiche Freisetzung vorhandener genomischer DNA aus der Probe) gemäß einer bevor zugten Ausführungsform der Erfindung durch eine parallel ange setzte PCR überprüft, bei der das Beta-Globin Gen amplifiziert wird. Das PCR-Produkt dieser Reaktion wird mittels einer Beta- Globin-Sonde ebenfalls auf dem Membranstreifen (Feld "K") direkt nachgewiesen. Nur wenn Feld "K" positiv ist, kann die Testdurchführung (d. h. sowohl Materialaufschluß als auch PCR) als erfolgreich gelten.

Es ist natürlich möglich, daß eine HPV-Infektion mit einem anderen als den sechs auf dem Membranstreifen enthaltenen Typen vorliegt. Die Konsensusprimer gewährleisten eine Ampli fikation von mindestens 30 verschiedenen Typen. Zusätzliche Detektionssicherheit und Schutz vor falschnegativen Ergebnis sen ergibt sich aus der ergänzenden Verwendung von Pan-HPV Sonden. Diese Sonden, die eine Spezifität für sehr viele bzw. praktisch alle relevanten HPV-Typen aufweisen (mindestens 30 Typen), sind auf dem Feld "+" des Membranstreifens gebunden, und hybridisieren mit einem konservierten Sequenzbereich des HPV-PCR-Fragmentes. Liegt in Feld "+" ein positives Signal vor, kann auf eine HPV-Infektion geschlossen werden, selbst für den Fall, daß keines der "Typenfelder" ein positives Signal aufweist.

Durch die Verwendung vorgefertigter flächiger Träger (Membran streifen) und die Konzeption als "Reverse Dot Blot" ist das Verfahren einfach, schnell und zuverlässig. Das umfassende Testergebnis, nämlich die Beantwortung der Fragen nach:

a) dem Vorhandensein einer HPV-Infektion (Feld "+"),
b) dem vorliegenden HPV-Typ ("Typenfelder 6, 11, 16, 18, 31, 33"), sowie
c) der Verfahrenskontrolle (Feld "K")

sind mit einem Blick und ohne besondere Hilfsmittel auswert bar.

Die Membranstreifen können langfristig mit minimalem Aufwand archiviert werden, wobei die Probenidentität durch die Serien nummern der Streifen garantiert wird.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispie len und einem Sequenzprotokoll näher erläutert.

Verwendete Abkürzungen

A = Adenin
C = Cytosin
G = Guanin
T = Thymin
R = Purin, d. h. G oder A
Y = Pyrimidin, d. h. C oder T
M = Amino, d. h. A oder C
K = Keto, d. h. G oder T
W = A oder T
dNTP's = 2'-Desoxyribonukleosid-5'triphosphate
h = Stunde

BEISPIEL 1 Allgemeines Protokoll

Der Cytoabstrich mit den auf HPV-Infektion zu untersuchenden suspekten Zellen wird nach Markierung des fraglichen Bereiches (sowie eines unauffälligen Bereiches) durch Behandlung mit organischen Lösungsmitteln (z. B. Toluol) entdeckelt und von dem Einbettmedium befreit. Nach dem Entfernen des Toluols mit absolutem Ethanol wird das Präparat mit 96% und 70% Ethanol rehydriert und dann für kurze Zeit getrocknet. Der markierte Bereich wird mit einem geringen Volumen (1-5 µl) eines geeig neten Puffers benetzt (z. B. 0,5% Tween20 in 10 mM Tris-HCl/ImM EDTA, pH 8,0) und nach leichtem Kratzen mit der Pipettenspitze aufgenommen und in ein Reaktionsgefäß übertragen.

Alternativ kann in Analogie auch mit Schnittpräparaten ver fahren werden, bzw. auch das Material direkt in mit dem zum Abstrich benutzten Instrument in das Reaktionsgefäß gegeben werden. Die Zellen/Gewebepartikel werden mit Proteinase K verdaut (2 Stunden bei 55°C) und anschließend für 1 Stunde bei 94°C zur Inaktivierung der Protease inkubiert. Optional schließt sich ein Reinigungsschritt an, bei dem ein kommer zielles Kit (z. B. Qiaex, Qiagen), um die Protease und andere unerwünschte Bestandteile von den Nukleinsäuren zu entfernen. Nach Elution von der Glasmatrix kann die DNA direkt in eine PCR eingesetzt werden.

1. PCR Stufe mit Konsensusprimern aus dem L1 Genbereich

Durch die Verwendung folgender Oligonukleotide als PCR-Primer läßt sich aus der DNA im Falle einer Infektion mit einem der sechs wichtigsten HPV-Typen (6, 11, 16, 18, 31, 33) ein ca. 420 bp langes DNA-Fragment amplifizieren:

L1FW4: 5'-AGGATGGKGA TATGGT-3' (SEQ ID NO: 1)
L1RV3: 5'-GTATCWACMA CAGTAACAAA-3' (SEQ ID NO: 2)

Es ist für den Fachmann selbstverständlich, daß durch Modifi kation der Oligonukleotide, z. B. an deren 5'-Ende, das Ergeb nis der PCR nicht grundlegend beeinflußt wird.

Die Reaktionsbedingungen (z. B. 25 µl Gesamtvolumen) bei Ver wendung von Taq-Polymerase sehen typischerweise wie folgt aus:

30 mM Tris-HCl, pH 8,5
75 mM KCl
2,25 mM MgCl₂
0,2-0,5 mM dNTP's
200-1000 nM Primer L1RV3
200-1000 nM Primer L1FW4
0,1-0,25 U Taq-Polymerase

Als Template dient in der Regel 1 µl der isolierten DNA-Probe. Ein geeignetes Programm kann wie folgt aussehen:

1. 5 min 95°C (initiale Denaturierungsreaktion)
2. 20 sec. 94°C (zyklische Reaktion: Denaturierung)
3. 20 sec 45°C (zyklische Reaktion: Primer annealing)
4. 30 sec 72°C (zyklische Reaktion: Extension)
5. 5 min 72°C (finale Extensionsreaktion)

Von Schritt 4) werden 30 Schleifen zu Schritt 2) durchgeführt. Die PCR kann selbstverständlich auch bei leicht veränderten Bedingungen (Temperatur, Zeit) durchgeführt werden.

2. PCR Stufe mit Ronsensusprimern aus dem L1 Genbereich

Zur Steigerung der Empfindlichkeit bei gleichzeitiger Gewähr leistung einer hohen Spezifität wird der Reaktionsansatz aus der ersten Stufe mit folgenden Konsensusprimern reamplifi ziert, wobei im Falle einer vorliegenden HPV-Infektion ein ca. 258 bp langes PCR-Fragment entsteht:

L1FW3: 5'-TGYAAATATC CWGATTAT-3' (SEQ ID NO: 3)
L1RV4: 5'-TGTARCCAAT ATGGYTTATT-3' (SEQ ID NO: 4)

Die Reaktionsbedingungen können z. B. denen der ersten Stufe gleichen, wobei aber die Primer der zweiten Stufe, L1FW3 (SEQ ID NO: 3) und L1RV4 (SEQ ID NO: 4), diejenigen der ersten Stufe ersetzen. Für die Reaktion kann z. B. dasselbe Programm wie für die erste Stufe verwendet werden. Vorzugsweise kann der Primer L1RV4 (SEQ ID NO: 4) eine Markierung (z. B. Biotin) für die Nachweisreaktion tragen.

Typisierung durch Hybridisierung mit typenspezifischen Oligo nukleotiden

Die in der zweiten PCR Stufe entstandenen spezifischen Produk te werden in einem allgemein üblichen Verfahren durch Hybri disierung weiter charakterisiert, wodurch eine Unterscheidung der sechs Haupttypen von HPV ermöglicht wird. Es wurden vor zugsweise folgenden Sonden eingesetzt:

HPV 6: 5'-TAGTGGAAAT CGCACGTCTG TAGGGAGTAG TAT-3'
HPV 11: 5'-GGGGGTAATA ACAGATCATC TGTAGCTAGT AG-3'
HPV 16: 5'-CTCTGGGTCT ACTGCAAATT TAGCCAGTTC AAA-3'
HPV 18: 5'-CACAGGTATG CCTGCTTCAC CTGGCAGCTG TGT-3'
HPV 31: 5'-CTCCGGTTCA ACAGCTACTT TAGCTAACAG TAC-3'
HPV 33: 5'-TTCAGGAACT ACTGCCTCTA TTCAAAGCAG TGC-3'
PanHPV: 5'-GAACAAATGT TTGYWAGACA TTTTTTTAAY AG-3'
PanHPV(18): 5'-GAGCAGCTTT TTGCTAGGCA TTTTTGGAAT AG-3'

Anstelle der Sonde für HPV 18 (SEQ ID NO: 8) kann bevorzugt auch die am 5'-Ende um 3 Basen und am 3'-Ende um 4 Basen ver kürzte Sequenz eingesetzt werden, um die Schmelztemperatur den anderen Typensonden anzugleichen.

Die Pan-Sonde reagiert mit allen (genauer: ca. 30) Typen, außer Typ 18. Aufgrund des starken Unterschieds von Typ 18 im Sequenzbereich der Pan-Sonde mußte eine Sonde speziell für Typ 18 (Pan18, reagiert nur mit HPV-Typ 18) entwickelt werden.

Auf dem Membranstreifen ist das Feld "+" mit einer 1 : 1 Mischung von Pan Sonde und Pan 18 Sonde belegt, um auf diesem Feld mit den verschiedenen Ziel-DNAs ein positives Signal zu erhalten.

Die Sonden sind im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 5 bis 12 be zeichnet. Es können jedoch auch Fragmente oder Derivate dieser Sequenzen eingesetzt werden, solange dadurch ihre Spezifität nicht verändert wird.

Der Nachweis einer Bindung eines der Oligonukleotide an die HPV-Ziel-DNA ist durch eine der üblichen Markierungs- und Detektionsmethoden (biochemisch mit einer Digoxigenin- oder Biotinmarkierung) leicht durchführbar (Non-radioactive Labe ling and Detection Kits, Boehringer Mannheim).

Typisierung des HPV-Produktes mit einem "Reverse Dot Blot" Verfahren

Die oben angeführten acht Typisierungssonden werden an ihrem 5'-Ende mit einer Markierung versehen (z. B. mit einem Amino linker), über den anschließend leicht eine stabile Bindung an eine feste Phase (z. B. Membran, Glas, Kunststoff) erreicht werden kann.

So kann die amino-modifizierte Sonde kovalent die chemisch (Ethyldimethylaminopropyl-carbodiimid) aktivierten Carboxyl gruppen einer geeigneten Membran (z. B. Biodyne C®, Pall) ge koppelt werden. Glas bzw. Kunststoff können bei geeigneter Vorbehandlung ebenfalls als Unterlage für die HPV-Sonden ein gesetzt werden.

Das über einen Primer (vorzugsweise L1RV4) oder auch durch Einbau markierter Nukleotide während der PCR mit Digoxigenin oder Biotin markierte PCR-Produkt wird nach Denaturierung der beiden Stränge bei ca. 55°C für 30 Minuten mit der Membran hybridisiert. Nach mehreren Waschschritten verbleiben auf dem Membranstreifen ausschließlich solche Ziel-DNA-Moleküle, die spezifisch an die entsprechende Typensonde gebunden haben. Die Markierung (Digoxigenin oder Biotin) dieser Ziel-DNA kann leicht mit gängigen enzymatischen Testverfahren nachgewiesen werden (vgl. z. B. Randall et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 6230-6234; Kawasaki et al. (1993), Methods in Enzy mology 218, 369-381).

Eine schematische Darstellung des "Reverse Dot Blot" Verfah rens findet sich in Fig. 2.

BEISPIEL 2

In Fig. 2 ist ein beispielhafter flächiger Träger zur Durch führung des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt, der kurz als "HPV-Chip" bezeichnet wird.

Im vorliegenden Fall sind auf einer Nylon-Membran (Biodyne C, Pall) der Größe 20 × 2,5 mm z. B. neun Felder aufgedruckt, ein Beschriftungsfeld für die Chip-Seriennummer sowie acht weitere Felder zur Aufnahme (Fixierung) der jeweiligen typenspezifi schen Oligonukleotide.

BEISPIEL 3

Beispielhafte Darstellung der Anwendung des Verfahrens bei mehreren gynäkologischen Cytoabstrichen:
Aus den PAP-smears wurden jeweils die gewünschten Areale mi kroskopisch ausgewählt (jeweils ca. 4 mm² Fläche) und dem Protokoll entsprechend aufgearbeitet.

Die denaturierten Produkte (5 µl) der jeweils zweiten Stufen von HPV- und Beta-Globin-PCR wurden mit 540 µl Hybridisie rungsmix neutralisiert und in einem 0,5 ml Reaktionsgefäß bei 55°C für 30 min mit dem Membranstreifen inkubiert. Unmittel bar nach zwei Waschschritten erfolgte die Nachweisreaktion der gebundenen PCR-Produkte.

Das Ergebnis geht aus der vergrößerten Wiedergabe von fünf Originalmembranstreifen hervor (Fig. 3).

Fig. 3 zeigt die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalte nen Ergebnisse unter Verwendung folgender Proben:

Streifennr.
Probe
515	HPV-unverdächtiges Areal eines teilweise HPVsuspekten Abstriches (I).
516	HPV-suspektes Areal von Abstrich (I).
519, 520	Areale eines HPV-unverdächtigen Abstriches (II) als Negativ-Kontrolle.
511	Abstrichprobe mit bekanntem HPV-Befall (Typ 11) als Positiv-Kontrolle.

Das positive β-Globin-Signal im Kontrollfeld ("K") aller ver wendeten Membranstreifen beweist, daß sowohl Materialaufschluß als auch PCR erfolgreich waren (Kontrolle gegen falschnegati ve Ergebnisse).

Das Feld "+" (Vorliegen einer HPV-Infektion) zeigt ein Signal (neben der Positiv-Kontrolle 511) nur im Fall der Probe 516, die aus HPV-suspekten Zellen von Abstrich (I) gewonnen war. Die Typenfelder identifizieren den beteiligten HPV darüber hinaus eindeutig als Hochrisikotyp 33. Das cytologisch unauf fällige Kontrollareal desselben Abstriches (I) (Streifen 515) zeigt keinerlei HPV-Signal.

Streifen 519 und 520 (Negativ-Kontrolle) zeigen das erwartete Signal für das β-Globin Kontrollgen.

Der Streifen 511 (Positiv-Kontrolle) zeigt das erwartete HPV- Typ 11-Signal.

Beispiel 3 zeigt, wie der vorliegende HPV-Assay z. B. die Mög lichkeit bietet, einen morphologisch begründeten HPV-Verdacht mit einer unabhängigen Methode kurzfristig zu überprüfen und durch Informationen über eventuell beteiligte HPV-Typen zu er gänzen. Da eine zweite Probennahme nicht benötigt wird, lie fert das Verfahren innerhalb von 1,5 Tagen ein verläßliches Ergebnis, das für eine individuelle Beratung/Behandlung der Patientin unmittelbar genutzt werden kann.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zum Amplifizieren von in biologischen Proben vor handener HPV-DNA, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) ein Probe gegebenenfalls einem Protease-Verdau unter zieht,
b) die Nukleinsäuren von Protease und anderen Bestand teilen abtrennt,
c) eine zweistufige (nested) PCR durchführt, wobei die verwendeten Oligonukleotidprimer eine Länge von etwa 15 bis 25 Basen haben und deren Sequenzen zu Konsen sussequenzen aus dem L1-Genbereich von mindestens 30 HPV-Typen komplementär sind, und man
d) gegebenenfalls eine Aufreinigung der am Ende von Stufe
e) erhaltenen amplifizierten DNA durchführt.
f) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe aus der Gruppe bestehend aus Abstrichen der Cervix uteri, frischen, fixierten oder paraffinierten Gewebeproben oder Schnittpräparaten von Gewebeproben ausge wählt ist.
g) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease Proteinase K oder Pronase® ist.
h) Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeich net, daß man in Stufe c) für die erste PCR-Stufe zunächst die Oligonukleotidprimer mit den in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 dargestellten Nukleotidsequenzen verwendet und an schließend die Oligonukleotidprimer mit den in SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 dargestellten Nukleotidsequenzen verwen det.
i) Verfahren zum in vitro-Nachweis von HPV, dadurch gekenn zeichnet, daß man ein Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4 durchführt und die amplifizierte HPV-DNA anschließend durch Hybridisierung mit einer oder mehreren Oligonukleo tidsonden nachweist.
j) Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Teil der verwendeten Primer mit Dioxigenin oder Biotin markiert sind.
k) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der markierte Primer die SEQ ID NO: 4 aufweist.
l) Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeich net, daß die Oligonukleotidsonde eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die zu einem für einen bestimmten HPV-Typ spezi fischen Sequenzabschnitt der HPV-DNA komplementär ist.
m) Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeich net, daß die Oligonukleotidsonde eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die zu einem konservierten Bereich der HPV-DNA komplementär ist.
n) Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeich net, daß man mehrere Oligonukleotidsonden verwendet, deren Nukleinsäuresequenzen jeweils zu einem für einen bestimmten HPV-Typ spezifischen Sequenzabschnitt der HPV-DNA komple mentär sind.
o) Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich eine Oligonukleotidsonde verwendet, deren Nu kleinsäuresequenz zu einem konservierten Bereich der HPV- DNA komplementär ist.
p) Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 11, dadurch gekenn zeichnet, daß die Oligonukleotidsonden aus der Gruppe be stehend aus Sonden mit der in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 und/oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Sequenz und/oder Fragmenten dieser Sequenzen ausgewählt sind.
q) Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 12, dadurch gekenn zeichnet, daß die Oligonukleotidsonde(n) an eine Oberfläche gebunden ist (sind).
r) Verfahren nach des Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekenn zeichnet, daß man einen oder mehrere Primer durch ein Pri mergemisch ersetzt, wobei sich die Nukleinsäuren in diesem Gemisch in bis zu zwei Positionen in ihrer Nukleisäurese quenz unterscheiden.
s) Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich zu den zur Durchführung einer zweistufigen PCR erforderlichen Reagenzien auch verschachtelte (nested) Oligonukleotidpri mer mit einer Länge von etwa 15 bis 25 Basen enthält, deren Sequenzen zu Konsensussequenzen aus dem L1-Genbereich von mindestens 30 HPV-Typen komplementär sind, wobei anstelle eines oder mehrerer dieser Oligonukleotidprimer jeweils eine Primermischung enthalten sein kann, wobei sich die jeweiligen Sequenzen der Primer in dieser Mischung an ein oder zwei Positionen in ihrer Nukleisäuresequenz unter scheiden.
t) Kit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Oli gonukleotidprimer für die erste PCR-Stufe die in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 dargestellten Nukleotidsequenzen auf weisen oder Mischungen der für SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 jeweils möglichen Einzelsequenzen umfassen und die Oligonukleotidprimer für die zweite PCR-Stufe die in SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 dargestellten Nukleotidsequenzen aufweisen oder Mischungen der für SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 jeweils möglichen Einzelsequenzen umfassen.
u) Kit nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Teil der verwendeten Primer mit Digoxigenin oder Biotin markiert ist.
v) Kit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der mar kierte Primer die SEQ ID NO: 4 aufweist.
w) Kit nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten dNTP's teilweise markiert sind.
x) Kit nach den Ansprüchen 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich Reagenzien enthält, die zur Vorbereitung der biologischen Probe für die PCR erforderlich sind.
y) Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach den Ansprüchen 5 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich zu den Bestandteilen des Kits nach den Ansprüchen 15 bis 19 eine oder mehrere Oligonukleotidsonden enthält, die aus der Gruppe bestehend aus Sonden mit einer für einen bestimmten HPV-Typ spezifischen Sequenzabschnitt der HPV-DNA komple mentären Nukleotidsequenz und/oder Sonden mit einer zu einem konservierten Bereich der HPV-DNA komplementären Nukleinsäuresequenz ausgewählt sind.
z) Kit nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Oli gonukleotidsonden aus der Gruppe bestehend aus Sonden mit der in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 und/oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Sequenz und/oder Fragmenten dieser Sequenzen ausgewählt sind.
aa) Kit nach den Ansprüchen 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotidsonden an eine Oberfläche gebunden sind.
ab) Flächiger Träger, der optisch in mehrere Felder unterteilt ist, bei dem in jedem Feld eine Oligonukleotidsonde an die Membran gebunden ist, deren Nukleinsäuresequenz zu einem für einen bestimmten HPV-Typ spezifischen Sequenzabschnitt der HPV-DNA komplementär ist oder deren Nukleinsäuresequenz zu einem konservierten Bereich der HPV-DNA komplementär ist.
ac) Träger nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotidsonden aus der Gruppe bestehend aus Sonden mit der in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 und/oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Sequenz und/oder Fragmenten dieser Sequenzen ausgewählt sind.
ad) Träger nach den Ansprüchen 24 und 25, dadurch gekennzeich net, daß er ein zusätzliches Feld enthält, das zur Be schriftung und/oder Numerierung dient.
ae) Kit nach den Ansprüchen 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner einen Träger nach den Ansprüchen 24 bis 26 enthält sowie zur Sichtbarmachung einer Hybridisierung von Sonde mit DNA erforderliche Reagenzien.
af) Oligonukleotidprimer, dadurch gekennzeichnet, daß er die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellte Nukleotidsequenz oder ein Fragment derselben aufweist.
ag) Oligonukleotidprimer-Paar, dadurch gekennzeichnet, daß es zwei Oligonukleotidprimer umfaßt, die die in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 dargestellten Nukleotidsequenzen oder Fragmente derselben aufweisen.
ah) Oligonukleotidprimer-Paar, dadurch gekennzeichnet, daß es zwei Oligonukleotidprimer umfaßt, die die in SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 dargestellten Nukleotidsequenzen oder Fragmente derselben aufweisen.
ai) Oligonukleotidprimer-Mischung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Mischung der für SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 jeweils möglichen Einzelsequenzen umfaßt.
aj) Oligonukleotidprimer-Mischung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Mischung der für SEQ ID NO: 3 und/oder SEQ ID NO: 4 jeweils möglichen Einzelsequenzen umfaßt.
ak) Oligonukleotidsonde, dadurch gekennzeichnet, daß sie die in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 oder SEQ ID NO: 12 dargestellte Nukleotidsequenz oder ein Fragment derselben aufweist.