DE19825395C1 - Antiviral wirksame RNA-Moleküle und ihre Verwendung - Google Patents
Antiviral wirksame RNA-Moleküle und ihre VerwendungInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft antiviral wirksame RNA-Moleküle, ihre Verwendung zur Wachstumshemmung der Picornavirus-Familie, insbesondere zur Wachstumshemmung von Humanen Rhinoviren (HRV), wie z. B. HRV 1, HRV 14 oder HRV 16. Außerdem betrifft die Erfindung neue Peptide und deren Anwendung als Targetmoleküle für in vitro Selektionsexperimente.
Description
Die Erfindung betrifft antiviral wirksame RNA-Moleküle,
ihre Verwendung zur Wachstumshemmung der Picorna
virus-Familie, insbesondere zur Wachstumshemmung von Humanen
Rhinoviren (HRV), wie z. B. HRV 1, HRV 14 oder HRV 16.
Außerdem betrifft die Erfindung neue Peptide und deren
Anwendung als Targetmoleküle für in vitro
Selektionsexperimente.
Grundsätzlich ist eine Prophylaxe von Viruserkrankungen
einer therapeutischen Behandlung der Symptome
vorzuziehen. Im Vergleich zu der großen Anzahl
antibakterieller Arzneistoffe gibt es gegenwärtig nur
wenig wirksame antivirale Arzneistoffe. Bisher wurden
Arzneistoffe in der Regel durch empirisches Screening
verschiedener Klassen synthetischer oder natürlicher
Verbindungen für eine mögliche Verwendung als
Virustatika entwickelt. Diese Verfahren sind allerdings
sehr zeitaufwendig. Methoden, wie z. B. Computer Aided
Drug Design (CADD), die eine schnelle Identifikation
der essentiellen funktionellen Elemente eines
Wirkstoffs ermöglichen, beruhen auf der Kenntnis der
dreidimensionalen Strukturen der Zielmoleküle. Das
Design eines universellen Inhibitors der Humanen
Rhinoviren, den Erregern des gemeinen Schnupfens, ist
auf diese Weise nicht möglich. Die Gruppe der Humanen
Rhinoviren umfaßt mehr als 115 verschiedene Serotypen
von denen bisher nur wenige Kristallstrukturen
vorliegen.
Humane Rhinoviren gehören zur Familie der Picornaviren.
Sie besitzen eine ikosaedrische Proteinhülle und sind
aus 60 identischen Untereinheiten, den sogenannten
Protomeren aufgebaut (Abb. 1). Jedes Protomer ist aus
vier viralen Proteinen (VP) zusammengesetzt: VP1, VP2,
VP3 und VP4. Letzteres ist von außen nicht zugänglich.
Bei allen Picornaviren ist VP1 das immundominante
Protein. Ein charakteristisches Merkmal der Humanen
Rhinoviren ist eine 2,5 nm tiefe Mulde, oder Canyon,
die jede fünfzählige Symmetrieachse der Virusoberfläche
umgibt. An der Ausbildung dieser Vertiefung sind
hauptsächlich Aminosäuren des VP1 beteiligt.
Aminosäuren die sich am Boden der Canyon-Region
befinden, sind eher konserviert als Aminosäuren der
Virusoberfläche (Rossmann, M.G. et al. 1985; Nature
317, 145-153).
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde,
antiviral wirksame Verbindungen zu isolieren, die zur
Inhibition des Wachstums von Picornaviren geeignet
sind. Insbesondere sollen die antiviralen Verbindungen
für die Inhibition des Wachstums der verschiedenen
Serotypen der Humanen Rhinoviren einsetzbar sein.
Gemäß der Erfindung werden RNA-Moleküle bereitgestellt,
die ein Peptid der Canyon-Region der Picornaviren
binden, hochaffin sind und inhibitorische Eigenschaften
aufweisen. Die Bindung der erfindungsgemäßen
RNA-Moleküle an ein solches Viruspeptid blockiert die
Canyon-Region und schützt somit vor einer viralen
Infektion.
Erfindungsgemäß bevorzugt werden RNA-Moleküle
bereitgestellt, die an ein Peptidfragment (als Peptid A
bezeichnet) des VP1 der Canyon-Region des Humanen
Rhinovirus (HRV) spezifisch binden.
Die erfindungsgemäßen RNAs weisen Dissoziations
konstanten zwischen 1 und 20 µM, vorzugsweise von 6 bis
16 µM, auf. Bevorzugt umfassen die RNA-Moleküle
mindestens 45 Nukleotide, besonders bevorzugt 45-82.
Die erfindungsgemäßen RNA-Moleküle sind in 5 Gruppen
eingeteilt, wobei sie insbesondere die Sequenzen SEQ ID
No. 1 bis SEQ ID No. 16 aufweisen (Abb. 2, wobei
homologe Nukleotide fett markiert sind).
Bevorzugt handelt es sich-um RNA-Moleküle der Gruppe 1
mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sowie deren Analoga, die in
mindestens 45 Nukleotiden homolog sind, besonders um
SEQ ID No. 2 bis SEQ ID No. 6. Desweiteren um
RNA-Moleküle der Gruppe 2 mit der SEQ ID No. 7 sowie deren
Analoga, die mindestens in 44 Nukleotiden homolog sind,
insbesondere um SEQ ID No. 8 und 9. Außerdem um
RNA-Moleküle der Gruppe 3 mit der SEQ ID No. 10 sowie deren
Analoga, die mindestens in 58 Nukleotiden homolog sind,
insbesondere um SEQ ID No. 11 und 12, um RNA-Moleküle
der Gruppe 4 mit der SEQ ID No. 13 sowie deren Analoga,
die mindestens in 57 Nukleotiden homolog sind,
insbesondere um SEQ ID No. 14 und um RNA-Moleküle der
Gruppe 5 mit der SEQ ID No. 15 sowie deren Analoga, die
mindestens in 57 Nukleotiden homolog sind, insbesondere
um SEQ ID No. 16.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen RNA-Aptamere, die
spezifisch für Peptid A des HRV 14 sind, wurden aus
einer kombinatorischen Bibliothek von RNA-Molekülen mit
60 randomisierten Nukleotiden isoliert. Der Pool
umfaßte annähernd 7×1014 verschiedene Moleküle.
Die Selektion hochaffiner Moleküle aus der
randomisierten RNA-Bibliothek wurde mit Hilfe der
Affinitätschromatographie durchgeführt. Die
Anreicherung von RNA-Molekülen, die eine Affinität zum
Säulenmaterial oder zur Sepharosematrix besitzen, wurde
durch Verwendung einer Vorsäule unterdrückt. Zur
Herstellung eines Säulenmaterials für die
Affinitätschromatographie wurde das Peptid PepA an
Thiopropyl-Sepharose 6B immobilisiert. Das Zielmolekül
für die Selektion wurde durch Ausbildung einer
Disulfidbrücke zwischen der Thiolgruppe des Peptids und
der Thiolgruppe des Linkers der modifizierten Sepharose
kovalent an das Säulenmaterial gebunden.
Für jede Selektion wurde jeweils eine Vor- und eine
Hauptsäule verwendet. Die Hauptsäule enthielt
Thiopropyl-Sepharose 6B, an welche das Peptid über
Disulfidbrücken immobilisiert war. Die Vorsäule
enthielt vorbehandelte Thiopropyl-Sepharose 6B ohne
Peptid. Beide Säulen wurden mit jeweils 50
Säulenvolumina 1×Bindungspuffer äquilibriert.
Die mit 32P markierten Ribonukleinsäuren wurden in
demineralisiertem Wasser gelöst und mit 15 µl zweifach
Bindungspuffer verdünnt. Diese Lösung wurde 5 min im
Heizblock bei 65°C inkubiert, in 10 min auf
Raumtemperatur abgekühlt und auf die Vorsäule gegeben.
Anschließend wurde mit 2 ml Bindungspuffer gewaschen.
Die Elution erfolgte nach Entfernung der Vorsäule mit 1
ml Elutionspuffer. Die Elutionsfraktionen wurden für
die Aufreinigung vereinigt, mit Phenol- und Chloroform
extrahiert und mit Ethanol unter Zusatz von Glykogen
gefällt.
Für den ersten Selektionszyklus wurden 2 nmol RNA (ca.
2 Kopien jeder Sequenz) verwendet. In den folgenden
Selektionszyklen wurde die Menge der RNA-Moleküle, die
auf die Säulen aufgetragen wurden, reduziert. Ab dem 4.
Zyklus wurden nur noch 500 pmol RNA für die
Affinitätschromatographie verwendet. Insgesamt wurden
11 Selektionszyklen durchgeführt. Dabei stieg der
Anteil der eluierten RNA-Moleküle in Zyklus 7
signifikant von 2,08% auf 11,87%. In 4 weiteren Zyklen
der in vitro Selektion wurde der Anteil der eluierten
RNA-Moleküle auf 16,49% erhöht.
Die in der 11. Selektionsrunde eluierte RNA-Fraktion
wurde revers transkribiert und in mehreren PCR-Ansätzen
amplifiziert. Die doppelsträngigen DNAs wurden mit den
Restriktionsenzymen EcoR I und Pst I gespalten und in
die multiple cloning site des Vektors pT7/T3α-18
ligiert. Nach der Transformation wurden individuelle
Klone von einer Ampicillin-Selektionsplatte isoliert.
Plasmid-DNAs wurden enzymatisch nach der
Didesoxymethode (Sanger, F. et al. 1977 Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) unter Verwendung eines
Universalprimers und eines reversen
Sequenzierungsprimers sequenziert.
Es wurden 16 Sequenzen identifiziert, die in 5 Gruppen
eingeteilt wurden (Abb. 2). Diese RNA-Sequenzen sind
hochaffin und binden spezifisch an ein Peptid A des HRV
14 (SEQ ID No. 17), so daß Inhibitionen des Wachstums
von HRV 14 von bis zu 50% auftreten.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin die Peptide,
die sich in der Hülle von Viren der Picorna
virus-Familie befinden und Fragmente an sich bekannter
Hüllproteine dieser Viren darstellen.
Die Peptide werden erfindungsgemäß erstmalig zur Verfü
gung gestellt und haben sich als ausgezeichnete Target
moleküle zum Screening antiviraler Substanzen erwiesen.
So konnten die erfindungsgemäß beschriebenen,
hochaffinen RNA-Moleküle gegen diese Peptide isoliert
werden.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind durch die Sequenz
der allgemeinen Formel I (SEQ ID No 17)
PPGAPNPKEWDDYTWQSASC gekennzeichnet,
die an mindestens einer Stelle oder durch Deletion am
N- und/oder C-terminalen Ende der Sequenz verändert
sein kann und die antiviral wirksame RNA-Moloküle spezifisch binden.
Insbesondere betrifft die Erfindung Peptid A des Huma
nen Rhinovirus (HRV) 14 mit der Sequenz der allgemeinen
Formel I. Als Teil von VP1 bildet dieses Peptid A eine
Helix-Schleifen-Konformation (helix-loop conformation),
die in die Canyon-Region hineinragt und kaum für An
tikörper zugänglich ist. Dieses Peptidfragment kommt in
Variationen auch in weiteren Viren der Picorna
virus-Familie vor.
Die Erfindung betrifft deshalb in bevorzugten Ausfüh
rungsformen auch ein Peptid A mit der Sequenz PPGAP-P--
-DDY-WQS-+, das z. B. im HRV 16 vorkommt, ein Peptid A
mit der Sequenz PPGAP-P-+-+D++WQS-+, das z. B. im HRV 1
vorliegt, ein Peptid A mit der Sequenz PPGAP-PK-
WDDYTWQ++S, das z. B. im Poliovirus 3 vorkommt, und ein
Peptid A mit der Sequenz PPG-P-P-+-D-Y-WQ+++, das z. B.
im Coxsackievirus 3 vorliegt, wobei mit + gekennzeich
nete Stellen Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften
und mit - gekennzeichnete Stellen Aminosäuren mit
unterschiedlichen Eigenschaften darstellen.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus die Verwendung
der RNAs zur Inhibition einer Virus-Rezeptor-Inter
aktion von Viren der Picornavirus-Familie,
insbesondere zur Inhibition der Humanen Rhinoviren
(HRV) 1, 14 und 16, zur Inhibition des Wachstums von
Polioviren und von Coxsackieviren, besonders bevorzugt
zur Inhibition des Humanen Rhinovirus (HRV) 14.
Gegenstand der Erfindung sind ferner Arzneimittel, die
die erfindungsgemäßen RNAs sowie an sich übliche
pharmazeutische Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthalten.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der
Peptidfragmente (Peptide A) der Viren der Picorna
virus-Familie als Targetmoleküle in Screening-Verfahren nach
antiviralen Mitteln, z. B. für die Inhibition der
Virus-Rezeptor-Interaktion.
Anschließend wird die Erfindung an Ausführungsbeispie
len näher erläutert.
Die Sequenz des Canyon-Peptids A ist
PPGAPNPKEWDDYTWQSASC. Die Aminosäuren 1 bis 19
entsprechen den Aminosäuren 154 bis 172 des viralen
Proteins VP1 aus Humanem Rhinovirus 14. Die Aminosäure
Cystein am C-Terminus wurde hinzugefügt, um die
Ausbildung von Disulfidbrücken bei der Immobilisierung
an Sepharose zu ermöglichen. Das Peptid wurde mittels
Fmoc Chemie (Carpino, L.A. & Han, G.Y. 1972 J. Org.
Chem. 37, 3404-3409) im 0,05 mM Maßstab unter
Verwendung von 278 mg Tentagel-S Trt Cys(Trt)Fmoc (Rapp
Chemie) synthetisiert. Für die Synthese wurden
zehnfache Mengen der jeweiligen Fmoc-Aminosäuren
eingesetzt (0,5 mM). Die folgenden Schutzgruppen wurden
verwendet: Fmoc-Ser(tBu)GH, Fmoc-Thr(tBu)OH,
Fmoc-Gln(Trt)OH, Pmoc-Asn(Trt)OH, Fmoc-Glu(OtBu)OH,
Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Tyr(tBu)OH, Fmoc-Lys(Boc)OH,
Fmoc-Trp(Boc)OH. Die Kopplung wurde mit 0,45 M HBTU/HOBt
(Dourtoglou, V. et al., 1984 Synthesis 572-574; Knorr,
R. et al., 1989 Tetrahedron Lett. 30: 1927-1930) in
DMF/N-Methylpyrrolidon durchgeführt. Die Abspaltung der
Fmoc-Schutzgruppen erfolgte nach jedem Zyklus in 20%
Piperidin analog dem Standard Applied Biosystems
Protokoll (Fast Fmoc Programm). Für die Aminosäuren
Ser, Tyr, Asp, Lys und Gly wurden Einfachkopplungen
durchgeführt; für die Aminosäuren Ala, Gln, Trp, Thr,
Pro und Asn wurden Doppelkopplungen verwendet. Die
Abspaltung des Produktes vom Säulenmaterial erfolgte
für 20 min bei 0°C in 8,25 ml Trifluoressigsäure
(TFA), 500 mg Phenol, 0,5 ml Thioanisol, 0,25 ml
Ethandithiol und 0,5 ml Wasser. Anschließend wurde die
Reaktion für zwei Stunden bei Raumtemperatur
fortgesetzt. Das Säulenmaterial wurde abfiltriert,
zweimal mit 2,5 ml TFA und zweimal mit 2 ml DCM
gewaschen. Das Filtrat wurde in einer Vakuumzentrifuge
auf 3 ml eingeengt. Dem Ansatz wurden 200 ml gekühlter
Diethylether zugefügt und 30 min bei 5°C inkubiert.
Der Reaktionsansatz wurde zentrifugiert und der
Niederschlag dreimal mit Ether gewaschen und über
Kaliumhydroxid getrocknet. Die Ausbeute des Rohpeptids
betrug 108,9 mg (87%). Die Reinigung des Rohpeptids
erfolgte durch präparative reversed phase-Hoch
druckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) mit
einer RP18-HPLC Säule mit Encapharm®-Säulenmaterial
(7,2 nm Porengröße, Abmessungen 250 mm×32 mm). Bei
einer Flußrate von 10 ml/min wurde folgender Gradient
verwendet: 10-50% Puffer B in 60 min. Durch analytische
HPLC und Massenspektroskopie wurde die Reinheit des
Endproduktes überprüft.
Zur Herstellung des Säulenmaterials für die
Affinitätschromatographie wurde das Peptid A an
Thiopropyl-Sepharose 6B (Pharmacia) immobilisiert.
Durch Ausbildung einer Disulfidbrücke zwischen der
Thiolgruppe des Peptids und der Thiolgruppe des Linkers
der modifizierten Sepharose wurde das Zielmolekül
kovalent an das Säulenmaterial gebunden.
10,5 ml gequollene Thiopropyl-Sepharose 6B wurden auf
einen Glassinterfilter überführt und mit 600 ml Wasser
gewaschen. Die Sepharosemasse wurde mit 9 ml einer
Lösung aus 2,6 µmol Peptid in 0,5 M NaCl, 0,1 M
Tris/HCl, pH 8,4, 1 mM EDTA im Brutschrank unter
Rotieren bei 45°C 16 h inkubiert. Nach der Kopplung
wurde die Sepharosemasse abfiltriert und mit 60 ml 0,1
M Natriumacetatlösung, pH 6,0 gewaschen. Um die nicht
mit Peptid gekoppelten reaktiven Gruppen zu blockieren,
wurde die Sepharosematrix 1 h mit 9 ml
2-Mercaptoethanol (5 mM in 0,1 M Natriumacetat, pH 4,5)
geschwenkt. Das Material wurde erneut auf einem
Glassinterfilter mit 600 ml demineralisiertem Wasser
gewaschen. Auf die gleiche Weise wurde Säulenmaterial
ohne Zusatz von Peptid hergestellt. Alle reaktiven
Gruppen wurden dabei ausschließlich mit
2-Mercaptoethanol gekoppelt.
Für die chemische Festphasensynthese einer
kombinatorischen einzelsträngigen DNA-Bibliothek wurde
ein Konstrukt aus 100 Nukleotiden mit 60 randomisierten
Positionen gewählt (Abb. 3). Am 3'- und 5'-Ende dieser
Sequenz befanden sich konstante Primerregionen aus
jeweils 20 Nukleotiden, die für die Amplifikation und
Transkription während der in vitro Selektion notwendig
waren. Ebenso enthielten die konstanten Regionen die
Schnittstellen der Restriktionsenzyme EcoR I und Pst I.
Sämtliche DNA-Synthesen wurden nach der Phosphoramidit-Methode
(Beaucage, SL & Caruthers, MH, 1981 Tetrahedron
Lett. 22: 1859-1862) mit Syntheseautomaten der Firma
Applied Biosystems durchgeführt. Die Synthese der
randomisierten DNA wurde im 0,2 mmol-Maßstab mit
Säulenmaterial der Porengröße 1000 durchgeführt. Die
Phosphoramidite wurden zu 0,15 M in Acetonitril gelöst.
Für die Kopplungen im randomisierten Bereich (N)60 der
Sequenz wurde ein Gemisch der vier Phosphoramidite
unter Berücksichtigung der unterschiedlichen
Kopplungsraten im Verhältnis dA : dC : dG : dT von
3 : 2,5 : 2,5 : 2 in Acetonitril hergestellt. Im
Standardsyntheseprotokoll (Anleitung Applied
Biosystems) wurde die Kopplungszeit der Phosphoramidite
von 15 s auf 35 s verlängert und die Abspaltung der
Tritylschutzgruppen zu Beginn jedes Zyklus, um 20%
verkürzt. Die Entschützung des Endproduktes erfolgte
unter Zusatz von 1 ml 32%-igem Ammoniak im Wasserbad
bei 55°C für 24 h. Nach Entfernung des Lösungsmittels
in einer Vakuumzentrifuge wurde die DNA mehrmals mit
demineralisiertem Wasser gewaschen. Mittels
präparativer denaturierender Polyacrylamidgel
elektrophorese wurden kürzere DNA-Sequenzen abgetrennt.
Das gewünschte Produkt wurde durch UV-Shadowing
identifiziert, anschließend aus dem Gel eluiert und
durch Gelfiltration entsalzt. Die Herstellung der
Primer wurde im 1 µmol-Maßstab nach dem
Standardsyntheseprotokoll durchgeführt. Die
Entschützung und Aufreinigung der Endprodukte erfolgte
analog der Aufreinigung der randomisierten DNA.
Der randomisierte DNA-Pool wurde dann in einer
präparativen Polymerasekettenreaktion amplifiziert. 9,2
nmol der synthetischen DNA wurde in 13 ml 10 mM
Tris/HCl, pH 8,8, 50 mM KCl, 15 mM MgCl2, 5 µM Primer
A, 5 µM Primer B, 0,2 mM je dNTP gelöst und mit 660
Einheiten Taq DNA Polymerase (Stratagnene, USA)
amplifiziert. Das Gemisch wurde 4 min bei 94°C
präinkubiert und anschließend einem Zyklus von
Reaktionen bei unterschiedlichen Temperaturen (1,30 min
bei 94°C, 1,30 min bei 55°C und 12 min bei 75°C)
unterworfen. Diese Zyklen wurden solange durchgeführt,
bis eine hinreichende Menge an DNA durch analytische
Polyacrylamidgelelektrophorese detektiert werden
konnte. Mittels Phenol- und Chloroformextraktion wurden
die amplifizierten DNA-Produkte aufgearbeitet und
anschließend durch Ethanolfällung entsalzt.
Anschließend wurde durch präparative T7-Transkription
der DNA-Sequenzen eine randomisierte RNA-Bibliothek
erzeugt. 1,5 nmol der doppelsträngigen DNA (ca. 1,2-
fache Komplexität des Pools) wurden 4 h in 80 mM Hepes,
pH 7,5, 22 mM MgCl2, 1 mM Spermidin, 5 mM DTT, 2 mg/ml
BSA, 3,75 mM NTPs und 50 Einheiten T7 RNA-Polymerase
bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde dem Ansatz
DNase I (RNase frei) zugefügt und die DNA-Matrize in
einer 30-minütigen Reaktion bei 37°C abgebaut. Die
resultierenden RNA-Moleküle wurden mit Phenol und
Chloroform extrahiert und mittels Ethanolfällung
entsalzt. Durch denaturierende Polyacrylamidgel
elektrophorese wurden die Abbruchprodukte der
Transkription abgetrennt. Die RNA-Moleküle wurden mit
demineralisiertem Wasser aus dem Gel eluiert und mit
Ethanol ausgefällt.
Die Selektion hochaffiner Moleküle aus der
randomisierten RNA-Bibliothek wurde mit Hilfe der
Affinitätschromatographie durchgeführt. Die
Anreicherung von RNA-Molekülen, die eine Affinität zum
Säulenmaterial oder zur Sepharosematrix besitzen, wurde
durch Verwendung einer Vorsäule unterdrückt. Für den
ersten Selektionszyklus wurden Säulenvolumina von 100
µl Thiopropyl Sepharose 6B (Vorsäule) bzw. 200 µl
Thiopropyl Sepharose 6B beladen mit Peptid A
(Hauptsäule) verwendet. In den folgenden Zyklen wurden
die Säulenvolumina jeweils auf die Hälfte reduziert.
Die Säulen wurden mit Bindungspuffer (150 mM NaCl, 20
mM Tris/HCl, pH 7,6, 5 mM MgCl2) gewaschen.
Die RNA-Moleküle wurden in 15 µl demineralisiertem
Wasser gelöst und 15 µl zweifach Bindungspuffer
hinzugefügt. Nach Erhitzen auf 65°C für 5 min wurden
die RNA-Moleküle für 10 min auf Raumtemperatur
abgekühlt. Die Lösung wurde auf die Säule aufgetragen
und anschließend mit 10×200 µl Bindungspuffer
gewaschen. Für den ersten Selektionszyklus wurde 2 nmol
RNA (ca. 2 Kopien jeder Sequenz) verwendet. In den
folgenden Selektionszyklen wurde die Menge der
RNA-Moleküle, die auf die Säulen aufgetragen wurden,
reduziert (Tab. 1). Ab dem 4. Zyklus wurden nur noch
500 pmol RNA für die Affinitätschromatographie
verwendet. Peptid-gebundene RNA-Moleküle wurden mit
5×200 µl Elutionspuffer (Bindungspuffer mit 100 mM DTT)
eluiert, mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit
Ethanol unter Verwendung von 2 µg Glycogen als Tracer
ausgefällt. Durch Kombination von Reverser
Transkription, Polymerasekettenreaktion und
T7-Transkription wurden die RNA-Moleküle für die nächste
Selektionsrunde gewonnen. Die gesamte RNA-Menge, die
nach jeder Selektion von der Hauptsäule eluiert wurde,
wurde in 20 µl 50 mM Tris/HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM
MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM dNTPs, 10 µM Primer B unter
Verwendung von 200 Einheiten MMLV Reverse Transkriptase
(GibcoBRL) bei 37°C für 1 h revers transkribiert. Die
Polymerasekettenreaktion der cDNA erfolgte in 100 µl
unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben,
abgesehen von der Verwendung von 2 µM jedes Primers und
5 Einheiten Taq DNA-Polymerase.
Die Dissoziationskonstanten der Aptamere wurden
ebenfalls durch Affinitätschromatographie bestimmt. Das
Volumen der Vorsäule wurde auf 100 µl und das der
Hauptsäule auf 400 µl erhöht. Die Äquilibrierung der
Säulen sowie die Präinkubation der RNA-Lösung wurde
analog der in vitro Selektion von RNA-Molekülen
durchgeführt. Die RNA-Lösung wurde auf die Vorsäule
gegeben. Der Waschvorgang umfaßte 4 ml Bindungspuffer.
Nach Entfernen der Vorsäule wurde auf eine spezifische
Elution mit DTT-haltigem Puffer verzichtet. Statt dessen
wurde der Waschvorgang mit Bindungspuffer solange
fortgesetzt, bis auf der Säule keine Radioaktivität
mehr detektiert werden konnte. Durch Addition der
Volumina der Fraktionen, die benötigt wurden, um die
RNA von der Säule zu waschen, erhält man das
Elutionsvolumen Vel. Das Totvolumen V0 der Säule wurde
mit einer Lösung aus Dextran 2000 bestimmt. Anhand der
folgenden Gleichung wurde die apparente
Dissoziationskonstante Kd berechnet:
Kd=L (Vc-V0)/(Vel-V0)
L gibt die Konzentration des immobilisierten Liganden
auf der Säule an, Vc das Säulenvolumen.
Das Ergebnis ist in Tabelle 2 dargestellt.
Sequenz/Klon Nr. | |
Kd (µM) | |
2/ 370 | 16,07 |
6/ 388 | 16,07 |
3/ 391 | 8,71 |
4/ 454 | 7,54 |
5/ 486 | 7,76 |
1/ 494 | 6,37 |
Der offensichtlich beste Kd war 6,37 µM für RNA 494
(SEQ ID No. 1).
Claims (14)
1. Antiviral wirksame RNA-Moleküle, die an Peptid A
der Aminosäuresequenz der allgemeinen Formel I
PPGAPNPKEWDDYTWQSASC I
und seine durch Deletion, Substitution oder Addition an einer oder mehreren Stellen erhaltenen Varianten spezifisch binden.
PPGAPNPKEWDDYTWQSASC I
und seine durch Deletion, Substitution oder Addition an einer oder mehreren Stellen erhaltenen Varianten spezifisch binden.
2. RNA-Moleküle nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß sie eine
Dissoziationskonstante bezüglich Peptid A
zwischen 1 und 20 mM, vorzugsweise zwischen 6 und
16 µM, aufweisen.
3. RNA-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß sie Sequenzen
aufweisen, die mindestens 45 Nukleotide umfassen,
vorzugsweise 45 bis 82 Nucleotide.
4. RNA-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz SEQ
ID No. 1 sowie Analoga aufweisen, die mindestens
in 45 Nukleotiden homolog sind.
5. RNA-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz SEQ
ID No. 7 sowie Analoga aufweisen, die mindestens
in 44 Nukleotiden homolog sind.
6. RNA-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz SEQ
ID No. 10 sowie Analoga aufweisen, die mindestens
in 58 Nukleotiden homolog sind.
7. RNA-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz SEQ
ID No. 13 sowie Analoga aufweisen, die mindestens
in 57 Nukleotiden homolog sind.
8. RNA-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz SEQ
ID No. 15 sowie Analoga aufweisen, die mindestens
in 57 Nukleotiden homolog sind.
9. RNA-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß sie die
Nukleotidsequenzen SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 16
besitzen.
10. Peptid A der Aminosäuresequenz SEQ ID No. 17 der
allgemeinen Formel I
PPGAPNPKEWDDYTWQSASC I
und seine durch Deletion, Substitution oder Addition an einer oder mehreren Stellen erhaltenen Varianten; die antiviral wirksame RNA-Moleküle spezifisch binden.
PPGAPNPKEWDDYTWQSASC I
und seine durch Deletion, Substitution oder Addition an einer oder mehreren Stellen erhaltenen Varianten; die antiviral wirksame RNA-Moleküle spezifisch binden.
11. Peptid A nach Anspruch 10,
dadurch gekennzeichnete daß es die Sequenz
PPGAP-P---DDY-WQS-+ oder PPGAP-P-+-+D++WQS-+
oder PPGAP-PK-WDDYTWQ++S oder PPG-P-P-+-D-Y-WQ+++
aufweist, wobei mit + gekennzeichnete Stellen
Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften und mit -
gekennzeichnete Stellen Aminosäuren mit
unterschiedlichen Eigenschaften darstellen.
12. Verwendung von RNA-Molekülen nach einem der
Ansprüche 1 bis 9 zur Inhibition von Viren der
Picornavirus-Familie.
13. Verwendung nach Anspruch 12 zur Inhibition von
Humanen Rhinoviren 1, 14, 16, zur Inhibition des
Wachstums von Polioviren und von Coxsackieviren,
insbesondere zur Inhibition des HRV 14.
14. Verwendung der Peptide nach Anspruch 10 oder 11
als Target-Moleküle in Screening Verfahren zur
Gewinnung antiviraler Arzneimittel.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1998125395 DE19825395C1 (de) | 1998-05-27 | 1998-05-27 | Antiviral wirksame RNA-Moleküle und ihre Verwendung |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1998125395 DE19825395C1 (de) | 1998-05-27 | 1998-05-27 | Antiviral wirksame RNA-Moleküle und ihre Verwendung |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19825395C1 true DE19825395C1 (de) | 1999-09-23 |
Family
ID=7870176
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1998125395 Expired - Fee Related DE19825395C1 (de) | 1998-05-27 | 1998-05-27 | Antiviral wirksame RNA-Moleküle und ihre Verwendung |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19825395C1 (de) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001038341A1 (en) * | 1999-11-24 | 2001-05-31 | The Regents Of The University Of California | Polynucleotide ligands as anti-viral agents |
DE102004002351A1 (de) * | 2004-01-15 | 2005-08-11 | TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH | Erfindung betreffend Wundheilung |
US8282969B2 (en) | 2006-12-05 | 2012-10-09 | Marinomed Biotechnologie Gmbh | Antiviral composition and method of use |
-
1998
- 1998-05-27 DE DE1998125395 patent/DE19825395C1/de not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Nature 317, 1985, S.145-153 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2001038341A1 (en) * | 1999-11-24 | 2001-05-31 | The Regents Of The University Of California | Polynucleotide ligands as anti-viral agents |
DE102004002351A1 (de) * | 2004-01-15 | 2005-08-11 | TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH | Erfindung betreffend Wundheilung |
US8282969B2 (en) | 2006-12-05 | 2012-10-09 | Marinomed Biotechnologie Gmbh | Antiviral composition and method of use |
US10376537B2 (en) | 2006-12-05 | 2019-08-13 | Marinomed Biotech Ag | Antiviral composition and method of use |
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