DE19825395C1

DE19825395C1 - Antiviral wirksame RNA-Moleküle und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE19825395C1
Application number: DE1998125395
Authority: DE
Inventors: Ann De Beuckelaer; Jens-Peter Fuerste; Volker A Erdmann; Maria Gruszecka; Brigitte Wittmann-Liebold; Heinz Zeichhardt; Peter Grunert; Nora Zare; Reinhard Lohmann; Michael Warstat; Paul Wrede; Gisbert Schneider; Johannes Schuchhardt
Original assignee: Wita Wittmann Inst Of Tec GmbH
Current assignee: WITA PROTEOMICS AG, 14513 TELTOW, DE
Priority date: 1998-05-27
Filing date: 1998-05-27
Publication date: 1999-09-23
Anticipated expiration: 2018-05-28

Abstract

Die Erfindung betrifft antiviral wirksame RNA-Moleküle, ihre Verwendung zur Wachstumshemmung der Picornavirus-Familie, insbesondere zur Wachstumshemmung von Humanen Rhinoviren (HRV), wie z. B. HRV 1, HRV 14 oder HRV 16. Außerdem betrifft die Erfindung neue Peptide und deren Anwendung als Targetmoleküle für in vitro Selektionsexperimente.

Description

Die Erfindung betrifft antiviral wirksame RNA-Moleküle, ihre Verwendung zur Wachstumshemmung der Picorna virus-Familie, insbesondere zur Wachstumshemmung von Humanen Rhinoviren (HRV), wie z. B. HRV 1, HRV 14 oder HRV 16. Außerdem betrifft die Erfindung neue Peptide und deren Anwendung als Targetmoleküle für in vitro Selektionsexperimente.

Grundsätzlich ist eine Prophylaxe von Viruserkrankungen einer therapeutischen Behandlung der Symptome vorzuziehen. Im Vergleich zu der großen Anzahl antibakterieller Arzneistoffe gibt es gegenwärtig nur wenig wirksame antivirale Arzneistoffe. Bisher wurden Arzneistoffe in der Regel durch empirisches Screening verschiedener Klassen synthetischer oder natürlicher Verbindungen für eine mögliche Verwendung als Virustatika entwickelt. Diese Verfahren sind allerdings sehr zeitaufwendig. Methoden, wie z. B. Computer Aided Drug Design (CADD), die eine schnelle Identifikation der essentiellen funktionellen Elemente eines Wirkstoffs ermöglichen, beruhen auf der Kenntnis der dreidimensionalen Strukturen der Zielmoleküle. Das Design eines universellen Inhibitors der Humanen Rhinoviren, den Erregern des gemeinen Schnupfens, ist auf diese Weise nicht möglich. Die Gruppe der Humanen Rhinoviren umfaßt mehr als 115 verschiedene Serotypen von denen bisher nur wenige Kristallstrukturen vorliegen.

Humane Rhinoviren gehören zur Familie der Picornaviren. Sie besitzen eine ikosaedrische Proteinhülle und sind aus 60 identischen Untereinheiten, den sogenannten Protomeren aufgebaut (Abb. 1). Jedes Protomer ist aus vier viralen Proteinen (VP) zusammengesetzt: VP1, VP2, VP3 und VP4. Letzteres ist von außen nicht zugänglich. Bei allen Picornaviren ist VP1 das immundominante Protein. Ein charakteristisches Merkmal der Humanen Rhinoviren ist eine 2,5 nm tiefe Mulde, oder Canyon, die jede fünfzählige Symmetrieachse der Virusoberfläche umgibt. An der Ausbildung dieser Vertiefung sind hauptsächlich Aminosäuren des VP1 beteiligt. Aminosäuren die sich am Boden der Canyon-Region befinden, sind eher konserviert als Aminosäuren der Virusoberfläche (Rossmann, M.G. et al. 1985; Nature 317, 145-153).

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, antiviral wirksame Verbindungen zu isolieren, die zur Inhibition des Wachstums von Picornaviren geeignet sind. Insbesondere sollen die antiviralen Verbindungen für die Inhibition des Wachstums der verschiedenen Serotypen der Humanen Rhinoviren einsetzbar sein.

Gemäß der Erfindung werden RNA-Moleküle bereitgestellt, die ein Peptid der Canyon-Region der Picornaviren binden, hochaffin sind und inhibitorische Eigenschaften aufweisen. Die Bindung der erfindungsgemäßen RNA-Moleküle an ein solches Viruspeptid blockiert die Canyon-Region und schützt somit vor einer viralen Infektion.

Erfindungsgemäß bevorzugt werden RNA-Moleküle bereitgestellt, die an ein Peptidfragment (als Peptid A bezeichnet) des VP1 der Canyon-Region des Humanen Rhinovirus (HRV) spezifisch binden.

Die erfindungsgemäßen RNAs weisen Dissoziations konstanten zwischen 1 und 20 µM, vorzugsweise von 6 bis 16 µM, auf. Bevorzugt umfassen die RNA-Moleküle mindestens 45 Nukleotide, besonders bevorzugt 45-82. Die erfindungsgemäßen RNA-Moleküle sind in 5 Gruppen eingeteilt, wobei sie insbesondere die Sequenzen SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 16 aufweisen (Abb. 2, wobei homologe Nukleotide fett markiert sind).

Bevorzugt handelt es sich-um RNA-Moleküle der Gruppe 1 mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sowie deren Analoga, die in mindestens 45 Nukleotiden homolog sind, besonders um SEQ ID No. 2 bis SEQ ID No. 6. Desweiteren um RNA-Moleküle der Gruppe 2 mit der SEQ ID No. 7 sowie deren Analoga, die mindestens in 44 Nukleotiden homolog sind, insbesondere um SEQ ID No. 8 und 9. Außerdem um RNA-Moleküle der Gruppe 3 mit der SEQ ID No. 10 sowie deren Analoga, die mindestens in 58 Nukleotiden homolog sind, insbesondere um SEQ ID No. 11 und 12, um RNA-Moleküle der Gruppe 4 mit der SEQ ID No. 13 sowie deren Analoga, die mindestens in 57 Nukleotiden homolog sind, insbesondere um SEQ ID No. 14 und um RNA-Moleküle der Gruppe 5 mit der SEQ ID No. 15 sowie deren Analoga, die mindestens in 57 Nukleotiden homolog sind, insbesondere um SEQ ID No. 16.

Die bevorzugten erfindungsgemäßen RNA-Aptamere, die spezifisch für Peptid A des HRV 14 sind, wurden aus einer kombinatorischen Bibliothek von RNA-Molekülen mit 60 randomisierten Nukleotiden isoliert. Der Pool umfaßte annähernd 7×10¹⁴ verschiedene Moleküle.

Die Selektion hochaffiner Moleküle aus der randomisierten RNA-Bibliothek wurde mit Hilfe der Affinitätschromatographie durchgeführt. Die Anreicherung von RNA-Molekülen, die eine Affinität zum Säulenmaterial oder zur Sepharosematrix besitzen, wurde durch Verwendung einer Vorsäule unterdrückt. Zur Herstellung eines Säulenmaterials für die Affinitätschromatographie wurde das Peptid PepA an Thiopropyl-Sepharose 6B immobilisiert. Das Zielmolekül für die Selektion wurde durch Ausbildung einer Disulfidbrücke zwischen der Thiolgruppe des Peptids und der Thiolgruppe des Linkers der modifizierten Sepharose kovalent an das Säulenmaterial gebunden.

Für jede Selektion wurde jeweils eine Vor- und eine Hauptsäule verwendet. Die Hauptsäule enthielt Thiopropyl-Sepharose 6B, an welche das Peptid über Disulfidbrücken immobilisiert war. Die Vorsäule enthielt vorbehandelte Thiopropyl-Sepharose 6B ohne Peptid. Beide Säulen wurden mit jeweils 50 Säulenvolumina 1×Bindungspuffer äquilibriert.

Die mit ³²P markierten Ribonukleinsäuren wurden in demineralisiertem Wasser gelöst und mit 15 µl zweifach Bindungspuffer verdünnt. Diese Lösung wurde 5 min im Heizblock bei 65°C inkubiert, in 10 min auf Raumtemperatur abgekühlt und auf die Vorsäule gegeben. Anschließend wurde mit 2 ml Bindungspuffer gewaschen. Die Elution erfolgte nach Entfernung der Vorsäule mit 1 ml Elutionspuffer. Die Elutionsfraktionen wurden für die Aufreinigung vereinigt, mit Phenol- und Chloroform extrahiert und mit Ethanol unter Zusatz von Glykogen gefällt.

Für den ersten Selektionszyklus wurden 2 nmol RNA (ca. 2 Kopien jeder Sequenz) verwendet. In den folgenden Selektionszyklen wurde die Menge der RNA-Moleküle, die auf die Säulen aufgetragen wurden, reduziert. Ab dem 4. Zyklus wurden nur noch 500 pmol RNA für die Affinitätschromatographie verwendet. Insgesamt wurden 11 Selektionszyklen durchgeführt. Dabei stieg der Anteil der eluierten RNA-Moleküle in Zyklus 7 signifikant von 2,08% auf 11,87%. In 4 weiteren Zyklen der in vitro Selektion wurde der Anteil der eluierten RNA-Moleküle auf 16,49% erhöht.

Die in der 11. Selektionsrunde eluierte RNA-Fraktion wurde revers transkribiert und in mehreren PCR-Ansätzen amplifiziert. Die doppelsträngigen DNAs wurden mit den Restriktionsenzymen EcoR I und Pst I gespalten und in die multiple cloning site des Vektors pT7/T3α-18 ligiert. Nach der Transformation wurden individuelle Klone von einer Ampicillin-Selektionsplatte isoliert. Plasmid-DNAs wurden enzymatisch nach der Didesoxymethode (Sanger, F. et al. 1977 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) unter Verwendung eines Universalprimers und eines reversen Sequenzierungsprimers sequenziert.

Es wurden 16 Sequenzen identifiziert, die in 5 Gruppen eingeteilt wurden (Abb. 2). Diese RNA-Sequenzen sind hochaffin und binden spezifisch an ein Peptid A des HRV 14 (SEQ ID No. 17), so daß Inhibitionen des Wachstums von HRV 14 von bis zu 50% auftreten.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin die Peptide, die sich in der Hülle von Viren der Picorna virus-Familie befinden und Fragmente an sich bekannter Hüllproteine dieser Viren darstellen.

Die Peptide werden erfindungsgemäß erstmalig zur Verfü gung gestellt und haben sich als ausgezeichnete Target moleküle zum Screening antiviraler Substanzen erwiesen. So konnten die erfindungsgemäß beschriebenen, hochaffinen RNA-Moleküle gegen diese Peptide isoliert werden.

Die erfindungsgemäßen Peptide sind durch die Sequenz der allgemeinen Formel I (SEQ ID No 17) PPGAPNPKEWDDYTWQSASC gekennzeichnet, die an mindestens einer Stelle oder durch Deletion am N- und/oder C-terminalen Ende der Sequenz verändert sein kann und die antiviral wirksame RNA-Moloküle spezifisch binden.

Insbesondere betrifft die Erfindung Peptid A des Huma nen Rhinovirus (HRV) 14 mit der Sequenz der allgemeinen Formel I. Als Teil von VP1 bildet dieses Peptid A eine Helix-Schleifen-Konformation (helix-loop conformation), die in die Canyon-Region hineinragt und kaum für An tikörper zugänglich ist. Dieses Peptidfragment kommt in Variationen auch in weiteren Viren der Picorna virus-Familie vor.

Die Erfindung betrifft deshalb in bevorzugten Ausfüh rungsformen auch ein Peptid A mit der Sequenz PPGAP-P-- -DDY-WQS-+, das z. B. im HRV 16 vorkommt, ein Peptid A mit der Sequenz PPGAP-P-+-+D++WQS-+, das z. B. im HRV 1 vorliegt, ein Peptid A mit der Sequenz PPGAP-PK- WDDYTWQ++S, das z. B. im Poliovirus 3 vorkommt, und ein Peptid A mit der Sequenz PPG-P-P-+-D-Y-WQ+++, das z. B. im Coxsackievirus 3 vorliegt, wobei mit + gekennzeich nete Stellen Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften und mit - gekennzeichnete Stellen Aminosäuren mit unterschiedlichen Eigenschaften darstellen.

Die Erfindung betrifft darüber hinaus die Verwendung der RNAs zur Inhibition einer Virus-Rezeptor-Inter aktion von Viren der Picornavirus-Familie, insbesondere zur Inhibition der Humanen Rhinoviren (HRV) 1, 14 und 16, zur Inhibition des Wachstums von Polioviren und von Coxsackieviren, besonders bevorzugt zur Inhibition des Humanen Rhinovirus (HRV) 14.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Arzneimittel, die die erfindungsgemäßen RNAs sowie an sich übliche pharmazeutische Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthalten. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Peptidfragmente (Peptide A) der Viren der Picorna virus-Familie als Targetmoleküle in Screening-Verfahren nach antiviralen Mitteln, z. B. für die Inhibition der Virus-Rezeptor-Interaktion.

Anschließend wird die Erfindung an Ausführungsbeispie len näher erläutert.

Beispiel 1 Peptidsynthese und Reinigung

Die Sequenz des Canyon-Peptids A ist PPGAPNPKEWDDYTWQSASC. Die Aminosäuren 1 bis 19 entsprechen den Aminosäuren 154 bis 172 des viralen Proteins VP1 aus Humanem Rhinovirus 14. Die Aminosäure Cystein am C-Terminus wurde hinzugefügt, um die Ausbildung von Disulfidbrücken bei der Immobilisierung an Sepharose zu ermöglichen. Das Peptid wurde mittels Fmoc Chemie (Carpino, L.A. & Han, G.Y. 1972 J. Org.

Chem. 37, 3404-3409) im 0,05 mM Maßstab unter Verwendung von 278 mg Tentagel-S Trt Cys(Trt)Fmoc (Rapp Chemie) synthetisiert. Für die Synthese wurden zehnfache Mengen der jeweiligen Fmoc-Aminosäuren eingesetzt (0,5 mM). Die folgenden Schutzgruppen wurden verwendet: Fmoc-Ser(tBu)GH, Fmoc-Thr(tBu)OH, Fmoc-Gln(Trt)OH, Pmoc-Asn(Trt)OH, Fmoc-Glu(OtBu)OH, Fmoc-Asp(OtBu)OH, Fmoc-Tyr(tBu)OH, Fmoc-Lys(Boc)OH, Fmoc-Trp(Boc)OH. Die Kopplung wurde mit 0,45 M HBTU/HOBt (Dourtoglou, V. et al., 1984 Synthesis 572-574; Knorr, R. et al., 1989 Tetrahedron Lett. 30: 1927-1930) in DMF/N-Methylpyrrolidon durchgeführt. Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppen erfolgte nach jedem Zyklus in 20% Piperidin analog dem Standard Applied Biosystems Protokoll (Fast Fmoc Programm). Für die Aminosäuren Ser, Tyr, Asp, Lys und Gly wurden Einfachkopplungen durchgeführt; für die Aminosäuren Ala, Gln, Trp, Thr, Pro und Asn wurden Doppelkopplungen verwendet. Die Abspaltung des Produktes vom Säulenmaterial erfolgte für 20 min bei 0°C in 8,25 ml Trifluoressigsäure (TFA), 500 mg Phenol, 0,5 ml Thioanisol, 0,25 ml Ethandithiol und 0,5 ml Wasser. Anschließend wurde die Reaktion für zwei Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das Säulenmaterial wurde abfiltriert, zweimal mit 2,5 ml TFA und zweimal mit 2 ml DCM gewaschen. Das Filtrat wurde in einer Vakuumzentrifuge auf 3 ml eingeengt. Dem Ansatz wurden 200 ml gekühlter Diethylether zugefügt und 30 min bei 5°C inkubiert. Der Reaktionsansatz wurde zentrifugiert und der Niederschlag dreimal mit Ether gewaschen und über Kaliumhydroxid getrocknet. Die Ausbeute des Rohpeptids betrug 108,9 mg (87%). Die Reinigung des Rohpeptids erfolgte durch präparative reversed phase-Hoch druckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) mit einer RP18-HPLC Säule mit Encapharm®-Säulenmaterial (7,2 nm Porengröße, Abmessungen 250 mm×32 mm). Bei einer Flußrate von 10 ml/min wurde folgender Gradient verwendet: 10-50% Puffer B in 60 min. Durch analytische HPLC und Massenspektroskopie wurde die Reinheit des Endproduktes überprüft.

Beispiel 2 Immobilisierung von Peptid A an Thiopropyl-Sepharose 6B

Zur Herstellung des Säulenmaterials für die Affinitätschromatographie wurde das Peptid A an Thiopropyl-Sepharose 6B (Pharmacia) immobilisiert. Durch Ausbildung einer Disulfidbrücke zwischen der Thiolgruppe des Peptids und der Thiolgruppe des Linkers der modifizierten Sepharose wurde das Zielmolekül kovalent an das Säulenmaterial gebunden.

10,5 ml gequollene Thiopropyl-Sepharose 6B wurden auf einen Glassinterfilter überführt und mit 600 ml Wasser gewaschen. Die Sepharosemasse wurde mit 9 ml einer Lösung aus 2,6 µmol Peptid in 0,5 M NaCl, 0,1 M Tris/HCl, pH 8,4, 1 mM EDTA im Brutschrank unter Rotieren bei 45°C 16 h inkubiert. Nach der Kopplung wurde die Sepharosemasse abfiltriert und mit 60 ml 0,1 M Natriumacetatlösung, pH 6,0 gewaschen. Um die nicht mit Peptid gekoppelten reaktiven Gruppen zu blockieren, wurde die Sepharosematrix 1 h mit 9 ml 2-Mercaptoethanol (5 mM in 0,1 M Natriumacetat, pH 4,5) geschwenkt. Das Material wurde erneut auf einem Glassinterfilter mit 600 ml demineralisiertem Wasser gewaschen. Auf die gleiche Weise wurde Säulenmaterial ohne Zusatz von Peptid hergestellt. Alle reaktiven Gruppen wurden dabei ausschließlich mit 2-Mercaptoethanol gekoppelt.

Beispiel 3 Synthese des RNA-Pools

Für die chemische Festphasensynthese einer kombinatorischen einzelsträngigen DNA-Bibliothek wurde ein Konstrukt aus 100 Nukleotiden mit 60 randomisierten Positionen gewählt (Abb. 3). Am 3'- und 5'-Ende dieser Sequenz befanden sich konstante Primerregionen aus jeweils 20 Nukleotiden, die für die Amplifikation und Transkription während der in vitro Selektion notwendig waren. Ebenso enthielten die konstanten Regionen die Schnittstellen der Restriktionsenzyme EcoR I und Pst I. Sämtliche DNA-Synthesen wurden nach der Phosphoramidit-Methode (Beaucage, SL & Caruthers, MH, 1981 Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862) mit Syntheseautomaten der Firma Applied Biosystems durchgeführt. Die Synthese der randomisierten DNA wurde im 0,2 mmol-Maßstab mit Säulenmaterial der Porengröße 1000 durchgeführt. Die Phosphoramidite wurden zu 0,15 M in Acetonitril gelöst. Für die Kopplungen im randomisierten Bereich (N)₆₀ der Sequenz wurde ein Gemisch der vier Phosphoramidite unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Kopplungsraten im Verhältnis dA : dC : dG : dT von 3 : 2,5 : 2,5 : 2 in Acetonitril hergestellt. Im Standardsyntheseprotokoll (Anleitung Applied Biosystems) wurde die Kopplungszeit der Phosphoramidite von 15 s auf 35 s verlängert und die Abspaltung der Tritylschutzgruppen zu Beginn jedes Zyklus, um 20% verkürzt. Die Entschützung des Endproduktes erfolgte unter Zusatz von 1 ml 32%-igem Ammoniak im Wasserbad bei 55°C für 24 h. Nach Entfernung des Lösungsmittels in einer Vakuumzentrifuge wurde die DNA mehrmals mit demineralisiertem Wasser gewaschen. Mittels präparativer denaturierender Polyacrylamidgel elektrophorese wurden kürzere DNA-Sequenzen abgetrennt. Das gewünschte Produkt wurde durch UV-Shadowing identifiziert, anschließend aus dem Gel eluiert und durch Gelfiltration entsalzt. Die Herstellung der Primer wurde im 1 µmol-Maßstab nach dem Standardsyntheseprotokoll durchgeführt. Die Entschützung und Aufreinigung der Endprodukte erfolgte analog der Aufreinigung der randomisierten DNA.

Der randomisierte DNA-Pool wurde dann in einer präparativen Polymerasekettenreaktion amplifiziert. 9,2 nmol der synthetischen DNA wurde in 13 ml 10 mM Tris/HCl, pH 8,8, 50 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 5 µM Primer A, 5 µM Primer B, 0,2 mM je dNTP gelöst und mit 660 Einheiten Taq DNA Polymerase (Stratagnene, USA) amplifiziert. Das Gemisch wurde 4 min bei 94°C präinkubiert und anschließend einem Zyklus von Reaktionen bei unterschiedlichen Temperaturen (1,30 min bei 94°C, 1,30 min bei 55°C und 12 min bei 75°C) unterworfen. Diese Zyklen wurden solange durchgeführt, bis eine hinreichende Menge an DNA durch analytische Polyacrylamidgelelektrophorese detektiert werden konnte. Mittels Phenol- und Chloroformextraktion wurden die amplifizierten DNA-Produkte aufgearbeitet und anschließend durch Ethanolfällung entsalzt. Anschließend wurde durch präparative T7-Transkription der DNA-Sequenzen eine randomisierte RNA-Bibliothek erzeugt. 1,5 nmol der doppelsträngigen DNA (ca. 1,2- fache Komplexität des Pools) wurden 4 h in 80 mM Hepes, pH 7,5, 22 mM MgCl₂, 1 mM Spermidin, 5 mM DTT, 2 mg/ml BSA, 3,75 mM NTPs und 50 Einheiten T7 RNA-Polymerase bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde dem Ansatz DNase I (RNase frei) zugefügt und die DNA-Matrize in einer 30-minütigen Reaktion bei 37°C abgebaut. Die resultierenden RNA-Moleküle wurden mit Phenol und Chloroform extrahiert und mittels Ethanolfällung entsalzt. Durch denaturierende Polyacrylamidgel elektrophorese wurden die Abbruchprodukte der Transkription abgetrennt. Die RNA-Moleküle wurden mit demineralisiertem Wasser aus dem Gel eluiert und mit Ethanol ausgefällt.

Beispiel 4 In Vitro Selektion

Die Selektion hochaffiner Moleküle aus der randomisierten RNA-Bibliothek wurde mit Hilfe der Affinitätschromatographie durchgeführt. Die Anreicherung von RNA-Molekülen, die eine Affinität zum Säulenmaterial oder zur Sepharosematrix besitzen, wurde durch Verwendung einer Vorsäule unterdrückt. Für den ersten Selektionszyklus wurden Säulenvolumina von 100 µl Thiopropyl Sepharose 6B (Vorsäule) bzw. 200 µl Thiopropyl Sepharose 6B beladen mit Peptid A (Hauptsäule) verwendet. In den folgenden Zyklen wurden die Säulenvolumina jeweils auf die Hälfte reduziert. Die Säulen wurden mit Bindungspuffer (150 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl, pH 7,6, 5 mM MgCl₂) gewaschen.

Die RNA-Moleküle wurden in 15 µl demineralisiertem Wasser gelöst und 15 µl zweifach Bindungspuffer hinzugefügt. Nach Erhitzen auf 65°C für 5 min wurden die RNA-Moleküle für 10 min auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Lösung wurde auf die Säule aufgetragen und anschließend mit 10×200 µl Bindungspuffer gewaschen. Für den ersten Selektionszyklus wurde 2 nmol RNA (ca. 2 Kopien jeder Sequenz) verwendet. In den folgenden Selektionszyklen wurde die Menge der RNA-Moleküle, die auf die Säulen aufgetragen wurden, reduziert (Tab. 1). Ab dem 4. Zyklus wurden nur noch 500 pmol RNA für die Affinitätschromatographie verwendet. Peptid-gebundene RNA-Moleküle wurden mit 5×200 µl Elutionspuffer (Bindungspuffer mit 100 mM DTT) eluiert, mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Ethanol unter Verwendung von 2 µg Glycogen als Tracer ausgefällt. Durch Kombination von Reverser Transkription, Polymerasekettenreaktion und T7-Transkription wurden die RNA-Moleküle für die nächste Selektionsrunde gewonnen. Die gesamte RNA-Menge, die nach jeder Selektion von der Hauptsäule eluiert wurde, wurde in 20 µl 50 mM Tris/HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 0,5 mM dNTPs, 10 µM Primer B unter Verwendung von 200 Einheiten MMLV Reverse Transkriptase (GibcoBRL) bei 37°C für 1 h revers transkribiert. Die Polymerasekettenreaktion der cDNA erfolgte in 100 µl unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben, abgesehen von der Verwendung von 2 µM jedes Primers und 5 Einheiten Taq DNA-Polymerase.

Tabelle 1

Beispiel 5 Bestimmung der Dissoziationskonstanten

Die Dissoziationskonstanten der Aptamere wurden ebenfalls durch Affinitätschromatographie bestimmt. Das Volumen der Vorsäule wurde auf 100 µl und das der Hauptsäule auf 400 µl erhöht. Die Äquilibrierung der Säulen sowie die Präinkubation der RNA-Lösung wurde analog der in vitro Selektion von RNA-Molekülen durchgeführt. Die RNA-Lösung wurde auf die Vorsäule gegeben. Der Waschvorgang umfaßte 4 ml Bindungspuffer. Nach Entfernen der Vorsäule wurde auf eine spezifische Elution mit DTT-haltigem Puffer verzichtet. Statt dessen wurde der Waschvorgang mit Bindungspuffer solange fortgesetzt, bis auf der Säule keine Radioaktivität mehr detektiert werden konnte. Durch Addition der Volumina der Fraktionen, die benötigt wurden, um die RNA von der Säule zu waschen, erhält man das Elutionsvolumen V_el. Das Totvolumen V₀ der Säule wurde mit einer Lösung aus Dextran 2000 bestimmt. Anhand der folgenden Gleichung wurde die apparente Dissoziationskonstante K_d berechnet:

K_d=L (V_c-V₀)/(V_el-V₀)

L gibt die Konzentration des immobilisierten Liganden auf der Säule an, Vc das Säulenvolumen.

Das Ergebnis ist in Tabelle 2 dargestellt.

Sequenz/Klon Nr.
K_d (µM)
2/ 370	16,07
6/ 388	16,07
3/ 391	8,71
4/ 454	7,54
5/ 486	7,76
1/ 494	6,37

Der offensichtlich beste K_d war 6,37 µM für RNA 494 (SEQ ID No. 1).

Claims

1. Antiviral wirksame RNA-Moleküle, die an Peptid A der Aminosäuresequenz der allgemeinen Formel I
PPGAPNPKEWDDYTWQSASC I
und seine durch Deletion, Substitution oder Addition an einer oder mehreren Stellen erhaltenen Varianten spezifisch binden.

2. RNA-Moleküle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Dissoziationskonstante bezüglich Peptid A zwischen 1 und 20 mM, vorzugsweise zwischen 6 und 16 µM, aufweisen.

3. RNA-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie Sequenzen aufweisen, die mindestens 45 Nukleotide umfassen, vorzugsweise 45 bis 82 Nucleotide.

4. RNA-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz SEQ ID No. 1 sowie Analoga aufweisen, die mindestens in 45 Nukleotiden homolog sind.

5. RNA-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz SEQ ID No. 7 sowie Analoga aufweisen, die mindestens in 44 Nukleotiden homolog sind.

6. RNA-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz SEQ ID No. 10 sowie Analoga aufweisen, die mindestens in 58 Nukleotiden homolog sind.

7. RNA-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz SEQ ID No. 13 sowie Analoga aufweisen, die mindestens in 57 Nukleotiden homolog sind.

8. RNA-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz SEQ ID No. 15 sowie Analoga aufweisen, die mindestens in 57 Nukleotiden homolog sind.

9. RNA-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nukleotidsequenzen SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 16 besitzen.

10. Peptid A der Aminosäuresequenz SEQ ID No. 17 der allgemeinen Formel I
PPGAPNPKEWDDYTWQSASC I
und seine durch Deletion, Substitution oder Addition an einer oder mehreren Stellen erhaltenen Varianten; die antiviral wirksame RNA-Moleküle spezifisch binden.

11. Peptid A nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnete daß es die Sequenz PPGAP-P---DDY-WQS-+ oder PPGAP-P-+-+D++WQS-+ oder PPGAP-PK-WDDYTWQ++S oder PPG-P-P-+-D-Y-WQ+++ aufweist, wobei mit + gekennzeichnete Stellen Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften und mit - gekennzeichnete Stellen Aminosäuren mit unterschiedlichen Eigenschaften darstellen.

12. Verwendung von RNA-Molekülen nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Inhibition von Viren der Picornavirus-Familie.

13. Verwendung nach Anspruch 12 zur Inhibition von Humanen Rhinoviren 1, 14, 16, zur Inhibition des Wachstums von Polioviren und von Coxsackieviren, insbesondere zur Inhibition des HRV 14.

14. Verwendung der Peptide nach Anspruch 10 oder 11 als Target-Moleküle in Screening Verfahren zur Gewinnung antiviraler Arzneimittel.