DE19819857A1 - Vorrichtung zur Bestimmung von Biomolekülen und gelösten Stoffen in Flüssigkeiten - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Bestimmung von Biomolekülen und gelösten Stoffen in Flüssigkeiten, umfassend ein mit der zu analysierenden Flüssigkeit innerhalb eines Gefäß­ es, insbesondere innerhalb eines Bioreaktors, in unmittelbaren Kontakt bringbares Probenahmesystem und eine Analyseneinheit. Speziell betrifft die Erfindung eine neuartige Vorrichtung, mit der Biomoleküle und gelöste Stoffe in Flüssigkeiten von Steril­ prozessen qualitativ und quantitativ bestimmt werden können und die eine kompakte Kombination eines Probenahmesystems und einer Analyseneinheit darstellt, die eine unmittelbar im Anschluß an die Probenahme stattfindende und somit quasi zeitgleiche Messung und gleichzeitig eine Reduzierung des Infektionsrisikos auf ein Minimum ermöglicht. Die Vorrichtung eignet sich zum Einsatz in allen Bereichen, in denen Bioprozesse, insbesondere biotechno­ logische und enzymtechnologische Produktionsverfahren, involviert und hohe Anforderungen an sterile Prozeßbedingungen zu stellen sind. Die Vorteile der Erfindung lassen sich daher inbesondere in der Nahrungsmittelherstellung, der Gewinnung von Pharmaka, Carbon­ säuren, Lösungsmitteln, Enzymen und Aminosäuren, in Verfahren der Umweltbiotechnologie und der Wirkstoffproduktion mit rekombinanten Zellen bzw. Enzymen nutzen.

Die in biotechnologischen Produktionsprozessen stattfindenden Stoffumwandlungen mit Biokatalysatoren, d. h. Enzymen, Mikroorga­ nismen oder tierischen und pflanzlichen Zellen, müssen durch off­ line- und on-line-Überwachung genau verfolgt werden, um hohe Produktivität und Produktqualität zu erreichen. Nur durch die Messung der den Prozeß kennzeichnenden Größen und deren zeitlichen Verlaufs lassen sich jederzeit die für das Prozeßziel günstigsten Maßnahmen treffen.

Das Fehlen geeigneter Überwachungsinstrumente, insbesondere von in-situ-Instrumenten, die sich für den Einsatz bei Fermentations­ prozessen eignen, stellt ein besonderes Problem für biotechno­ logische Produktionsprozesse mit hohen Anforderungen an eine sterile Prozeßführung dar. Aus diesem Grund werden die meisten physikalisch-chemischen oder biologischen Analysen, die in der Regel aus der sterilen Probenentnahme, der Probenaufbereitung, der Analyse selbst und der Signalauswertung bestehen, außerhalb des Bioreaktors durchgeführt. Da jeder dieser Vorgänge eine Quelle fehlerhafter Ergebnisse sein kann, ist ihre strenge Kontrolle enorm wichtig. Nur wenn die Zeit zwischen Probenahme und dem Vorliegen des Analysenergebnisses ausreichend kurz ist, kann die Analyse eine geeignete Prozeßkontrolle gewährleisten.

In den meisten herkömmlichen Systemen zur Sterilprozeßkontrolle und -steuerung liegen sowohl das Probenahmesystem als auch die eigentliche Meßeinheit außerhalb des Reaktors vor. Die Probenahme und -aufbereitung findet dabei in der Regel durch Trennverfahren, wie Mikrofiltration, Dialyse, Elektrolyse und Gasdiffusion statt; alternativ kann die Probelösung auch durch die Einwirkung abbau­ ender Enzyme, wie Proteasen, von Mikroorganismen und ungelösten Teilen befreit werden. Anschließend wird die aufbereitete und ggf. an die entsprechende Analysemethode angepaßte Probe der eigent­ lichen Analyseneinheit zugeführt.

Aber selbst für den Fall, daß ein sterilisierbares, in den Reaktor integriertes Probenahmesystem, beispielsweise ein sterilisierbares Membranmodul, eingesetzt wird, finden in herkömmlichen Systemen Probenahme und -messung räumlich getrennt voneinander statt. Die Überführung der Probe von dem Reaktor zu einer Meßeinheit resul­ tiert nicht nur in einem erheblichen Infektionsrisiko, sondern auch in einer unerwünschten zeitlichen Verzögerung. Während des Transports der Probelösung zu der Meßstation können zum Teil drastische Veränderungen der zu messenden Probe auftreten, die zu fehlerhaften Analyseergebnissen führen und eine aussagekräftige Kontrolle der Kulturflüssigkeit in dem Reaktor daher nicht erlauben.

Ein Beispiel für ein sterilisierbares Probenahmesystem ist in der deutschen Patentschrift 26 50 730 offenbart. Der dort beschriebene Tauchdialysator umfaßt einen abnehmbaren Dialysationskopf mit Membranhalterung und sich durch den Dialysationskopf erstreckende Zulauf- und Rücklaufkanäle sowie ein mit dem Dialysationskopf lösbar verbundenes Halterungsrohr, durch das der Tauchdialysator an dem Fermenter oder einem Bypass befestigt werden kann. Im Anschluß an die Dialyse kann eine zuvor über die Zulaufleitungen der Membran zugeführte Pufferlösung, die jetzt die dialysierbaren Materialien aus der Kulturflüssigkeit enthält, über eine Rücklauf­ leitung abgezogen und anschließend über Schläuche, die den Tauch­ dialysator mit einer Analysenvorrichtung verbinden, einer Analy­ seneinheit, beispielsweise einem automatischen Analyzer, zugeführt werden. Die Möglichkeit, einen Tauchdialysator mit einer Detek­ tionseinheit in kompakter Form zu kombinieren, wird im Stand der Technik nicht erwähnt.

Die deutsche Offenlegungsschrift 195 33 510 offenbart eine Sonde zur Entnahme gelöster Gase oder flüchtiger Komponenten aus Flüssigkeiten zur Bestimmung ihrer Konzentration in diesen Flüssigkeiten. Zwar verkörpert die in dieser Entgegenhaltung offenbarte Vorrichtung eine Kombination einer Sonde und eines Sensors, doch werden, abgesehen davon, daß der eingesetzte Sensor ausschließlich für die Quantifizierung von Gasen, wie bspw. Zinndioxid, ausgerichtet ist und hierfür entsprechend speziellen Erfordernissen genügen muß, Sterilprozesse und deren besondere Probleme und Anforderungen an keiner Stelle erwähnt.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, eine für die Sterilprozeßkontrolle geeignete Sonde bereitzustellen, die die Nachteile herkömmlicher Kontrollinstrumente überwindet, insbesondere die Zeit zwischen Probenahme und Vorliegen des Analysenergebnisses verkürzt und das Infektionsrisiko auf ein Minimum vermindert bzw. vollkommen ausschließt.

Diese Aufgabe wird durch die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Be­ stimmung von Biomolekülen und gelösten Stoffen in Flüssigkeiten von Sterilprozessen gelöst, bei der es sich um eine Kombinations­ sonde handelt, in der ein mit der zu analysierenden Flüssigkeit innerhalb eines Bioreaktors in direktem Kontakt stehendes Probe­ nahmesystem und eine Analyseneinheit als kompakte Einheit vor­ liegen und als solche mit dem Bioreaktor verbunden werden. Die Vorrichtung kann auch für die Kontrolle von Prozessen in anderen Gefäßen bzw. Behältnissen, z. B. Whirlpools in Brauprozessen u. a., eingesetzt werden, d. h. der Begriff "Bioreaktor" ist im Rahmen dieser Erfindung nicht auf klassische Fermenter beschränkt, son­ dern umfaßt allgemein Gefäße, in denen in Flüssigkeiten statt­ findende Stoffumwandlungen gemessen und überwacht werden können.

Nach dem Verbinden der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit dem Bioreaktor, das in herkömmlicher Weise, z. B. mittels eines Gewindes, erfolgen kann, kann die Vorrichtung zusammen mit dem Bioreaktor einer Sterilisationsbehandlung unterzogen werden. Dabei kann die Vorrichtung sowohl in einer Flüssigkeit als auch mit Dampf bei üblichen Temperaturen, in der Regel bei mindestens 120°C, sterilisiert werden.

Im Anschluß an die Sterilisationsbehandlung und ggf. eine sich daran anschließende Abkühlungsphase kann die Vorrichtung, genauer gesagt die außerhalb des Bioreaktors angeordnete Analyseneinheit, mit einem oder mehreren Biosensoren bestückt werden. Nach erfolgter Kalibrierung des Sensors ist die Vorrichtung sofort betriebsbereit.

Biosensoren sind im Rahmen dieser Erfindung im üblichen Sinn zu verstehen, d. h. als Kombination von bioaktiven Komponenten, z. B. immobilisierten Biokatalysatoren, und einem physikalischen bzw. physikochemischen Sensor (Transduktor), der in Gegenwart von Substrat ein Signal als Maß für den Substratgehalt liefert. Das biologisch erzeugte und vom Transduktor in eine meßbare Größe umgewandelte Signal kann anschließend durch eine elektronische Komponente verstärkt und mittels einer Rechnereinheit ausgewertet werden.

Bei den bioaktiven Komponenten handelt es sich um Analyten, die in der Lage sind, die zu analysierende Substanz zu "erkennen". Zur spezifischen Erkennung eignen sich beispielsweise Rezeptoren, Antikörper, Enzyme, Organellen, Gewebeschnitte oder ganze prokary­ ontische oder eukaryontische Zellen. Kommerziell erhältlich sind gegenwärtig vor allem Enzymsensoren, Immunosensoren und mikro­ bielle Sensoren.

Für den Einsatz in der erfindungsgemäßen Kombinationssonde ist jeder beliebige Biosensor geeignet. Die bioaktive Komponente muß lediglich in einer Form vorliegen, die den Einsatz in die Analy­ seneinheit der Vorrichtung ermöglicht. Hier bieten sich beispiels­ weise konventionelle Biosensoren in Form von Chips, Meßbausteinen, Biokapseln o.a. an.

Sollen beispielsweise Enzyme, Glykoproteine, Antigene oder Hormone in der zu analysierenden Flüssigkeit detektiert werden, bietet sich der Einsatz von Bioaffinitätssensoren an, die in der Regel Farbstoffe, Lektine, Antikörper oder Hormonrezeptoren für die spezifische Erkennung nutzen. Die durch die Bindung bzw. Komplex­ bildung hervorgerufenen Veränderungen (Lichtabsorption, Brechungs­ index, elektrische Ladung etc.) werden als meßbare Größen ange­ zeigt. Als besonders geeignet sind auch sog. Metabolismus-Sensoren zu nennen, die auf der spezifischen Erkennung von Substraten und ihrer chemischen Umsetzung zu entsprechenden Produkten beruhen. Hierzu zählen u. a. Enzymelektroden, Organellen-Sensoren, mikro­ bielle Sensoren und allgemein Sensoren auf der Basis biokatalyisch aktiver Materialien. Häufig ist auch ein gekoppeltes Analysever­ fahren mit mehreren Enzymen angezeigt, das u. U. zusätzlich den Nachweis von Cofaktoren umfaßt. Des weiteren können auch Biosen­ soren des biomimetischen Typs eingesetzt werden, die Funktion von Sinnesorganen simulieren und physikalische Signale, wie Dehnung oder Licht in chemische Signale umkodieren. Es ist darüber hinaus auch möglich, bestimmte Substanzen mittels Nachweisreaktionen zu detektieren, deren Ablauf ein unmittelbar mit bloßem Auge erkenn­ bares optisches Signal, beispielsweise in Form einer Farbreaktion, Fluoreszenz, Biolumineszenz oder Trübung der Probe, liefert. Des weiteren können enzymatische und immunologische Verfahren mit einander gekoppelt werden, insbesondere wenn besonders niedrige Konzentrationen einer Substanz zu bestimmen sind. Zu nennen ist hier der sog. ELISA-Nachweis (Enyzme-linked-immuno-sorbent-assay).

Häufig liegt die bioaktive Substanz, insbesondere ein Rezeptor, Antikörper oder Enzym, zwischen Membranen eingeschlossen oder an Membranen immobilisert vor. Des weiteren kann der Analyt unmittel­ bar auf der Transduktoroberfläche gebunden oder direkt auf das elektronische Element aufgebracht sein, das die Signale umwandelt oder verstärkt.

Gegenwärtig sind bereits zahlreiche, für den Nachweis verschieden­ ster Substanzen aufgerichteter Biosensoren erhältlich, die für den Einsatz in der erfindungsgemäßen Vorrichtung geeignet sind. Eine aktuelle Übersicht, insbesondere hinsichtlich Affinitätsbiosen­ soren, liefern beispielsweise Buchholz K. und Kasche V. in "Biokatalysatoren und Enzymtechnologie", VCH, Weinheim, 1997.

Damit die erfindungsgemäße Vorrichtung zusammen mit dem Bioreaktor sterilisiert werden kann, können für deren Herstellung nur solche Materialien eingesetzt werden, die einer Sterilisationsbehandlung unterzogen werden können und vorzugsweise Temperaturen von mindes­ tens 120°C und besonders bevorzugt von bis zu 150°C aushalten. Darüber hinaus sollten die verwendeten Materialien gegen Oxidation bzw. Korrosion beständig sein. Des weiteren müssen sämtliche Teile der Vorrichtung, die einer Sterilisationsbehandlung zu unterziehen sind, den dabei entstehenden Sterilisationsdruck aushalten, der bis zu 1,5 bar betragen kann. Weitere Anforderungen an die zur Herstellung eingesetzten Materialien ergeben sich daraus, daß die Probenahmeeinheit in direktem Kontakt mit der zu analysierenden Flüssigkeit in dem Bioreaktor steht. Zumindest die Probenahme­ einheit sollte daher eine inerte Oberfläche aufweisen. Als geeignete, d. h. sterilisierbare und inerte Materialien sind rostfreier Stahl und Kunststoffe, insbesondere Polytetrafluor­ ethylen, zu nennen.

Die Probenahmeeinheit kann einen herkömmlichen Aufbau aufweisen und beispielsweise in Form des in der deutschen Patentschrift 26 50 730 beschriebenen Tauchdialysators vorliegen. In diesem Fall umfaßt die erfindungsgemäße Vorrichtung mindestens zwei Kanäle, einen Zuführ- und einen Rückführkanal, die sich von dem mit der zu analysierenden Flüssigkeit in dem Bioreaktor in Kontakt stehenden Ende der Probenahmeeinheit durch die gesamte Vorrichtung erstrec­ ken, d. h. in jedem Fall über die Probenahmeeinheit hinaus in die Analyseneinheit. In der Analyseneinheit wird die aufgenommenen Probe vorzugsweise zu dem Biosensor geführt. Es besteht aber auch die Möglichkeit, die Probe - ohne Zuführen zur Biosensoreinheit - zu einer unabhängigen, außerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorliegenden Analyseneinheit zu leiten.

Die Probenahme kann über eine Dialysemembran erfolgen, die an dem in den Reaktor hineinragenden Ende der Einheit angebracht ist. Vorzugsweise ist die Dialysemembran Teil eines Dialysekopfes, der abnehmbar mit dem mit der Wand des Bioreaktors in Verbindung stehenden Teils der Vorrichtung verbunden ist. In diesem Fall ver­ fügt der Dialysekopf ebenfalls über mindestens zwei darin einge­ arbeitete Kanäle (Zuführ- und Rückführkanal), die mit den Kanälen bzw. Leitungen der Vorrichtung lösbar verbunden sind. Eine dichte und festsitzende Verbindung des Dialysekopfes mit der restlichen Vorrichtung kann beispielsweise durch Ringnuten am unteren Ende des Dialysekopfes erreicht werden, in die O-Ringe aus Gummi oder Kunststoff eingelegt werden können. Die Kanäle bzw. Leitungen der Vorrichtung können mit den Kanälen des Dialysekopfes beispiels­ weise über Steck- oder Gewindeverbindungen verbunden werden.

Das Vorderende der Probenahmeeinheit - bei Verwendung eines ab­ nehmbaren Dialysekopfes die Vorderseite des Dialysekopfes - kann planar und ggf. mit einem erhöhten Randbereich versehen sein, weist jedoch vorzugsweise eine konisch geformte und noch bevor­ zugter eine abgerundete Spitze auf. Die Spitze kann zur besseren Verteilung der mit der Membran in Kontakt stehenden Pufferlösung mit Längs- und Querrillen aufweisen.

Das Vorderende der Probenahmeeinheit - bei Verwendung eines abnehmbaren Dialysekopfes das vordere Ende des Dialysekopfes - weist eine Membranhalterung in Form einer oder mehreren um den Umfang der Einheit bzw. des Dialysekopfes herumlaufenden Ringnuten auf, in die Gummi-O-Ringe eingelegt werden können, die die über die Spitze der Probenahmeeinheit bzw. des Dialysekopfes gezogene Dialysemembran festlegen. Die Nuten sollten keine scharfkantigen Ränder aufweisen, die die empfindliche Dialysemembran beschädigen könnten. Die Dialysemembran ist somit am vorderen Ende der Probe­ nahmeeinheit, vorzugsweise am vorderen Ende des abnehmbaren Dialysekopfes, mittels einer Membranhalterung abnehmbar befestigt. Die sich durch die Vorrichtung und ggf. den abnehmbaren Dialyse­ kopf erstreckenden Kanäle sind vorzugsweise so angeordnet, daß sie an verschiedenen Stellen der Spitze der Vorrichtung bzw. des Dialysekopfes enden, wodurch die an der Dialysemembran vorbei­ geführte Pufferlösung eine möglichst große Fläche bestreicht. Die Kanäle und damit verbundenen Leitungen besitzen üblicherweise einen Innendurchmesser von 0,1 bis 3 mm und vorzugsweise zwischen 0,8 und 1,3 mm.

In vielen Fällen können neben Dialysemembranen für die Probenahme, insbesondere zellfreier Medien, gelöster Gase und flüchtiger Komponenten, auch Ultrafiltrations- oder Mikrofiltrationsmembranen eingesetzt werden. Insbesondere für die Entnahme gelöster Gase, aber auch für die Entnahme hochmolekularer Verbindungen bieten sich darüber hinaus auch in-situ-Filter an. Als Membran kann jede geeignete Membran eingesetzt werden, beispielsweise Membranen aus Cellulose oder Kunststoffen, Teflon, PVC, Silikon, allgemein keramische oder polymere Membranen.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Probenahmeeinheit bzw. der abnehmbare Dialysekopf zusätzlich zu einer Dialysemembran einen Tiefenfilter auf, der insbesondere für die Probenahme von höher- und niedermolekularen Stoffen geeignet ist. Abhängig von der Porengröße des Filters können so auch nicht dialysierbare bzw. ungelöste Stoffe entnommen werden. Besonders bevorzugt ist die Verwendung eines Tiefenfilters in Kombination mit einem Pulsier­ verfahren, mittels dessen über der Oberfläche des Filters turbu­ lente Strömungen erzeugt werden, durch welche die Filteroberfläche von Ablagerungen freigeschwebt wird. Auf diese Weise wird verhin­ dert, daß der Filter insbesondere bei hohen Dichten der Medien zugesetzt wird. Der Einsatz eines Pulsierverfahrens erlaubt die Probenahme trotz hoher Dichen auch über einen längeren Zeitraum. Das Freihalten des Filters kann auch durch die vorrübergehende oder kontinuierliche Erzeugung von Vibrationen bzw. Schwingungen des in den Reaktor ragenden Vorrichtungsteiles bzw. eines Teiles davon erreicht werden.

Im Falle des kombinierten Einsatzes einer Dialysemembran und eines Tiefenfilters umfaßt die Vorrichtung mindestens drei Kanäle, also mindestens einen Zuführ- und Rückführkanal für die Dialyse und mindestens einen weiteren Kanal, durch den das Filtrat von dem Filter in den außerhalb des Reaktors liegenden Teil der Vorrich­ tung geführt wird. Im Falle des Einsatzes des Tiefenfilters allein muß die Vorrichtung lediglich mindestens einen Kanal aufweisen, der die filtrierte Probe der Analyseneinheit, und dort vorzugs­ weise dem Biosensor, zuführt.

Da die erfindungsgemäße Vorrichtung vorzugsweise im eingebauten Zustand zusammen mit dem Fermenter sterilisiert wird, muß bei Einsatz einer empfindlichen Membran diese durch Drucküberlagerung gegen das Zerplatzen geschützt werden. Dies erfolgt dadurch, daß während der Sterilisationsphase der Innenraum des Bioreaktors durch Schließen eines oder mehrerer in der Vorrichtung angeord­ neter Ventile nach außen hin abgeschlossen wird. Durch diese sog. in-situ-Brücke wird gewährleistet, daß sich bei der Sterilisation der Druck auf beiden Seiten der Membran gleich stark aufbaut, so daß keine Beschädigungen der Membran zu befürchten sind. Nach Beendigung der Sterilisation wird, nachdem sich der Druck wieder abgebaut hat, die durch die in-situ-Brücke erreichte Drucküber­ lagerung durch Öffnen des bzw. der Ventile wieder entfernt. Die in-situ-Brücke sollte allerdings nicht nur beim Einsatz von Mem­ branen, sondern auch bei der Verwendung von Filtern zur Druck­ überlagerung eingesetzt werden, um auf diese Weise das Zusetzen bzw. Zukleben des Filters während der Sterilisationsbehandlung zu verhindern.

Die in-situ-Brücke kann durch jedes geeignete Ventil, beispiels­ weise ein Absperrventil, Umschalt-/Umleitventil, beispielsweise 3-Wegeventil, Stempelventil, in Gestalt eines Magnet-, pneumatischen oder manuell bedienbaren Ventils, bewirkt werden. Die Position des Ventils innerhalb der Vorrichtung, ggf. innerhalb der Kombination aus Vorrichtung und Dialysekopf, muß lediglich die Voraussetzung erfüllen, daß das Öffnen/Schließen des Ventils an dem nach dem Verbinden der Vorrichtung mit dem Bioreaktor außerhalb des Bioreaktors liegenden Teils der Vorrichtung bzw. allgemein von außerhalb des Reaktors bewerkstelligt werden kann. Die Abriegelung innerhalb der Vorrichtung kann allerdings auch innerhalb des in den Reaktor ragenden Teils der Vorrichtung erfolgen.

Die Zulauf- und Rücklaufkanäle bzw. -leitungen der Vorrichtung werden am hinteren Ende der Analyseneinheit mit geeigneten Leitungen, bspw. Gummi- oder Kunststoffschläuchen, verbunden. Diese können der Zufuhr von Flüssigkeiten, insbesondere Puffer­ lösungen, und der Ableitung der Proben, beispielsweise zu zusätzlichen Analysevorrichtungen, dienen. Soll eine Probe nicht bzw. nicht vollständig dem Biosensor zugeführt werden, sondern insgesamt oder teilweise direkt zu einem außerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorliegenden Analysegerät (z. B. Massenspektrometer oder Fließinjektionsanalyse) geleitet werden, kann dies über zusätzliche Leitungen bzw. Ableitungen und entsprechende Ventile innerhalb des außerhalb des Reaktor vorliegenden Teils der Vorrichtung erreicht werden.

Im allgemeinen wird die für die Dialyse und/oder Filtration erforderliche Pufferlösung geeigneter Zusammensetzung über die Zuführungsleitungen in die Zulaufkanäle gespeist und von dort zum vorderen Ende der Probenahmeeinheit geführt. Über Dialyse bzw. Filtration werden die in dem zu analysierenden Medium vorliegenden dialysierbaren bzw. filtrierbaren Stoffe in dem Pufferstrom aufgenommen und anschließend über die Rückführkanäle und -leitungen zu der Analyseneinheit transportiert. Parallel hierzu kann der Pufferstrom auch direkt zu einem außerhalb der Vorrich­ tung vorliegenden Analysator geleitet werden. Die Strömungs­ geschwindigkeit des Pufferstroms kann so reguliert werden, daß sich die zu bestimmenden Substanzen beiderseits der Membran bzw. des Filters im Gleichgewicht befinden.

Des weiteren kann die Analyseneinheit der Vorrichtung durch eine Temperaturvorrichtung ergänzt sein, um Temperaturveränderungen zu kompensieren und hierdurch bedingten fehlerhaften Meßergebnissen entgegenwirken zu können. Die Temperaturregulierung kann bei­ spielsweise durch eine Kühlspule oder Mantelkühlung bewirkt werden.

Darüber hinaus kann die Vorrichtung durch eine zwischen die Entnahme- und Analyseneinheit geschaltete Ultraschalleinheit für Zellaufschlüsse ergänzt werden. Diese ermöglicht die Analyse von intrazellulären Stoffen, wie Enzymen und anderen aus den Zellen nicht herausgeschleusten Substanzen.

Um die mit der zu analysierenden Flüssigkeit innerhalb des Reak­ tors in Kontakt stehende Oberfläche der Vorrichtung zu vergrößern und auf diese Weise beispielsweise die Konzentration der Probe er­ höhen zu können, kann die Analyseneinheit durch eine bewegliche, vorzugsweise aufklappbare Ummantelung ergänzt werden. Eine solche teilweise oder vollständige Ummantelung des vorderen Endes der Probenahmeeinheit bzw. des Dialysekopfes kann beispielsweise fächerförmig bzw. (halb)schalenförmig ausgestaltet sein. Während des Einführens der Vorrichtung durch die Reaktorwand liegt die Ummantelung eng an dem vorderen Ende der Probenahmeeinheit bzw.

des Dialysekopfes an und kann anschließend durch eine außerhalb des Reaktors vorliegende Vorrichtung zum Aus- und Zuklappen gebracht werden. Hierdurch erfüllt die Ummantelung im geschlos­ senen Zustand gleichzeitig eine Schutzfunktion für die empfindliche Membran bzw. Filter.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Vorrichtung, insbesondere die eine oder mehrere Biosensoreinheiten, an eine Rechnereinheit angeschlossen, die eine kontinuierliche Prozeßüber­ wachung und -steuerung ermöglicht. Zusätzlich können die gewon­ nenen Analysendaten mittels Ferndatenübertragung weitergegeben werden, wodurch eine on-line-Überwachung und -steuerung des Prozesses möglich wird. Hierbei kommt der besondere Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung, nämlich eine Echtzeitmessung ohne die üblichen Verzögerungen zwischen Probenahme und Analyse, besonders zum tragen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die von mehreren Biosensoren generierten Signale unmittelbar zu einer Rechnereinheit übertragen und in komplexer Form aufgezeich­ net und ausgewertet.

Die erfindungsgemäße Kombinationssonde ermöglicht die Bestimmung und Analyse sämtlicher Stoffe, die durch Dialyse und/oder Filtra­ tion aus dem Medium abgetrennt werden können. Hieraus ergibt sich ein besonders breites Spektrum an Anwendungsmöglichkeiten. Die Möglichkeit, neben gelösten Stoffen (z. B. Glucose, Nitrate, Ammoniak, Phosphate, Schwermetalle, Gase wie Stickstoff, Kohlen­ säure, Cyanide) auch nicht gelöste Stoffe (z. B. Proteine, Enzyme, Antikörper) effizient analysieren zu können, eröffnet einen viel­ fältigen Einsatz beispielsweise in Brauereien und Brennereien (z. B. zur Bestimmung von Zucker, Alkohol, Kohlendioxid etc.), in der Umweltbiotechnologie (Abwasser- und Abgasreinigung, Wasser­ aufbereitung, Biogas- und Kläranlagen), Verfahren der Nahrungs­ mittelherstellung (Hefeproduktion, Käse, Molkereiprodukte), Gewinnung von Pharmaka, Carbonsäuren, Lösungsmitteln, Proteinen, Enyzmen, Aminosäuren, in der Fischzucht und dem Gewässerschutz, in petrochemischen und allgemein in chemischen Prozessen. Insgesamt kann die erfindungsgemäße Vorrichtung, in sämtlichen Prozessen eingesetzt werden, in denen dialysierbare und/oder filtrierbare Stoffe nachgewiesen werden sollen, wobei die Vorrichtung besonders für Prozesse mit hohen Anforderungen an sterile Prozeßbedingungen geeignet ist, wie beispielsweise Verfahren zur Kultivierung von Säugerzellen für die Produktion hochwertiger pharmazeutischer Wirkstoffe und die Wirkstoffproduktion mit rekombinanten Zellen.

Weitere Ausführungsformen, Gegenstände und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, in der auf die Zeichnungen Bezug genommen wird. In den Zeichnungen zeigt

Fig. 1 eine schematische Schnittansicht einer ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung,

Fig. 2 eine schematische Schnittansicht einer zweiten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

In der Fig. 1 ist eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Kombinationssonde dargestellt, die eine Probenahmeeinheit (3), mit einem Dialysekopf (2), und eine im eingebauten Zustand außerhalb des Bioreaktors liegende Analyseneinheit (8), einschließlich Biosensoreinheit (9) umfaßt. Die Vorrichtung kann über ein Schraubgewinde (4) an dem Bioreaktor befestigt werden. Der Dialysekopf (2) umfaßt eine Membran (1), die über den Randbereich und einen Teil des Dialysekopfes herumgelegt ist und mit Hilfe eines Gummiringes an dem Dialysekopf festgehalten wird. In den Dialysekopf (2) sind im Abstand voneinander ein Zulaufkanal (6a) und ein Rücklaufkanal (7a) eingearbeitet, über die die für die Dialyse erforderliche Pufferlösung zugeführt bzw. abgeführt wird. Diese Kanäle (6a, 7a) sind mit den sich durch die Probenahme­ einheit (3) zur Analyseneinheit (8) erstreckenden Zuführ- und Rückführkanälen (6, 7) verbunden. Die Pufferlösung wird über die Zuführungskanäle (6, 6a) zur Dialysemembran geführt und über die Rückführkanäle (7, 7a) in die Analyseneinheit abgezogen. In dieser Ausführungsform bildet sich unter der Membran (1) ein Pufferraum, der über die genannten Zuführ- und Rückführkanäle mit der Analyseneinheit (8) bzw. der von der Analyseneinheit umfaßten Biosensoreinheit (9) in Verbindung steht. Das äußere Ende der Vorrichtung wird durch einen die Analyseneinheit abschließenden Schraubverschluß (10) gebildet, der einen festen und dichten Zusammenbau der Vorrichtung sicherstellt. Die Analyseneinheit ist mit einem über der Biosensoreinheit liegenden Deckel (11) ausgestattet, der den einfachen Einsatz eines Biosensors, beispielsweise in Form eines Chips oder eines anderen Biosensor­ bausteins, ermöglicht. Die Möglichkeit, die Vorrichtung zusammen mit dem Bioreaktor zu sterilisieren, wird durch eine durch ein Absperrventil (5) bewirkte in-situ-Brücke gewährleistet.

Fig. 2 zeigt die schematische Ansicht einer zweiten Ausführungs­ form der erfindungsgemäßen Kombinationssonde, in der die Probe­ nahmeeinheit (3) neben einer Dialysemembran (1) einen Tiefenfilter (13) umfaßt. Zusätzlich wird der Kopf der Probenahmeeinheit, umfassend die Membran (1) und den Tiefenfilter (13), durch ein Schutzgitter (12) geschützt. In dieser Ausführungsform wird eine Pufferlösung über die Zuführleitung (6) zu der Dialysemembran (1) geführt und über die Rückführleitung (7) zu der Analyseneinheit (8) geleitet. Durch entsprechende Einstellung eines 3-Wegeventils (17) kann die Pufferlösung der Biosensoreinheit (9) zugeführt oder über eine Rückführleitung (16) direkt zu einem außerhalb der Vorrichtung vorliegenden Analysengerät geleitet werden. Die Biosensoreineinheit ist über eine Leitung (15) mit einer Rechner­ einheit verbunden. Der Tiefenfilter (13) ist mit der Biosensor­ eineinheit über einen Kanal (14) verbunden, durch den das Filtrat von der Probenahmeeinheit zur Analyseneinheit geleitet wird. Während der Sterilisationsbehandlung wird das Innere des Bioreak­ tors mit Hilfe von die Zuführ- und Rückführkanäle abriegelnden Ventilen (5a, b, c) nach außen abgeschlossen und auf diese Weise eine in-situ-Brücke bewirkt.

Claims (12)

1. Vorrichtung zur Bestimmung von Biomolekülen und gelösten Stoffen in Flüssigkeiten, insbesondere in Flüssigkeiten von Sterilprozessen, umfassend ein mit der zu analysierenden Flüssigkeit innerhalb eines Gefäßes, insbesondere innerhalb eines Bioreaktors, in unmittelbaren Kontakt bringbares Probenahmesystem (3) und eine Analyseneinheit (8), dadurch gekennzeichnet, daß das Probenahmesystem (3) und die Analyseneinheit (8) als kompakte Einheit ausgebildet und als solche mit dem Gefäß verbindbar sind.

2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Einheit aus Probenahmesystem (3) und Analyseneinheit (8) derart mit dem Gefäß verbindbar ist, daß zumindest ein Teil des Probenahmesystems (3) in die Flüssigkeit eintaucht und die Einheit anschließend zusammen mit dem Gefäß einer Sterilisationsbehandlung unterzogen werden kann.

3. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sich durch das Probenahmesystem (3) zur Analyseneinheit (8) erstreckende Zufuhr- und Rückführkanäle (6,7,14) während des Sterilisationsvorganges durch mindestens ein als in-situ-Brücke wirkendes Ventil (5), vorzugsweise ein Magnet- und/oder Dreiwege-Ventil, verschließbar sind.

4. Vorrichtung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyseneinheit (8) im Anschluß an eine Sterilisationsphase und ggf. darauffolgende Abkühlungsphase mit mindestens einem eine bioaktive Komponente umfassenden Biosensor, innerhalb einer Biosensoreinheit (9) in der Analyseneinheit (8), ausgerüstet werden kann.

5. Vorrichtung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenahme über eine Dialysemem­ bran (1), angeordnet am vorderen Ende des im Einbauzustand in das Gefäß hineinragenden Probenahmesystems (3), erfolgt.

6. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenahme über einen Tiefenfilter (13), angeordnet am vorderen Teil des im Einbauzustand in das Gefäß hineinragenden Probenahmesystems (3), erfolgt.

7. Vorrichtung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Tiefenfilters (13) durch kontinuierliches oder vorübergehendes Pulsieren von Materialablagerungen freigehalten wird.

8. Vorrichtung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenahme sowohl über eine Dialysemembran (1) als auch einen Tiefenfilter (13) erfolgt.

9. Vorrichtung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die von mindestens einem Biosensor innerhalb der Biosensoreinheit (9) ausgehenden Meßsignale zu einer mit der Analyseneinheit (8) verbundenen Rechnereinheit geleitet werden.

10. Vorrichtung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die von der Rechnereinheit erstellten Daten per Ferndatenübertragung weitergeleitet werden können und die Vorrichtung somit eine Fernüberwachung und -steuerung des Bioprozesses ermöglicht.

11. Verwendung der Vorrichtung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche zur Detektion von gelösten Stoffen, wie beispielsweise Glukose, Nitrate, Phosphate, Ammoniak, Stickstoff, Schwermetalle, Kohlensäure, Cyanide und/oder nicht gelösten Stoffen, wie beispielsweise Proteine und Enzyme.

12. Verwendung der Vorrichtung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche zur Kontrolle von Brauprozessen, von Bioprozessen in der Nahrungsmittelherstellung, beispielsweise der Käseherstellung und der Erzeugung anderer Molkereiprodukte, von Bioprozessen in der Umwelt- und Wasserwirtschaft, von Bioprozessen zur Herstellung pharmazeutischer Wirkstoffe und zur Kultivierung prokaryontischer oder eukaryontischer Organismen bzw. Zellen, von petrochemischen Prozessen und allgemein von chemischen, biochemischen oder biologischen Prozessen mit hohen Anforderungen an eine sterile Prozeßführung.