DE102005059536B4

DE102005059536B4 - Verfahren und Biochip zur Untersuchung einer biologischen Probe

Info

Publication number: DE102005059536B4
Application number: DE200510059536
Authority: DE
Inventors: Klaus Abraham-Fuchs
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Priority date: 2005-12-13
Filing date: 2005-12-13
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2025-12-14
Also published as: DE102005059536A1; US9005951B2; US20070141553A1

Abstract

Verfahren zur Untersuchung einer biologischen Probe in einem Biochip (1) mit einem miniaturisierten Labor ("Lab-on-a-Chip"), bei welchem eine biologische Probe in den Biochip (1) eingegeben wird, die Probe zumindest einem Aufbereitungsschritt (28, 32) unterworfen wird, und am Ende eines Messablaufs die Konzentration oder das Vorhandensein eines bestimmten Analyten in der aufbereiteten Probe gemessen wird (36), wobei darüber hinaus die Konzentration oder das Vorhandensein einer Markersubstanz gemessen wird (34), dadurch gekennzeichnet, dass eine am Aufbereitungsschritt (28, 32) beteiligte Reaktionssubstanz vor dem Messablauf in einem mit einer Schutzmembran abgetrennten Reservoir (6, 14) auf dem Biochip (1) vorgehalten wird, und die Markersubstanz ein Abbauprodukt der Schutzmembran ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung einer biologischen Probe in einem Biochip sowie einen zur Durchführung dieses Verfahrens geeigneten Biochip.
Biochips messen die Konzentration bzw. das Vorhandensein von Biomolekülen (z. B. DNA, Proteinen) in biologischen Proben. Eine besonders innovative Art von Biochip ist so gestaltet, dass von der Eingabe der Probe bis zum Messergebnis alle Schritte zur Probenaufbereitung und Detektion innerhalb der geschlossenen Einheit des Biochips durchgeführt werden. Solche Biochips werden auch mit "Lab-on-a-Chip" bezeichnet.
Die Messabläufe in einem solchen "Lab-on-a-Chip" können sehr komplex sein und eine Vielzahl von Probenaufbereitungsschritten umfassen, die der eigentlichen Detektion des gesuchten Analyten vorgeschaltet sind, wie z. B. Trennung, Anreicherung, Filterung, Zell-Lyse oder PCR. Hierbei kann es sich sowohl um mechanische als auch um biochemische Aufbereitungsschritte handeln.
Reaktionssubstanzen, die im Verlauf der Probenaufbereitung oder der Detektion benötigt werden, werden entweder aus Vorratsbehältnissen im externen Auslesegerät dem Mikrofluidiksystem des Biochips zugeführt, oder sie sind in Vorratskammern, so genannten Reservoirs, des Biochips bereits gebrauchsfertig vorkonfektioniert. Um die Haltbarkeit und die Lagerfähigkeit der Biochips zu verbessern, werden insbesondere biochemische Reaktionssubstanzen wie Proteine und Enzyme oft in trockener Form gelagert.
Im Stand der Technik wird im Allgemeinen im Sensorteil des Biochips nur die Konzentration des gesuchten Analyten gemessen. Ist diese Messung fehlerbehaftet, stehen keine weiteren Messgrößen zur Verfügung, die Aufschluss über die Ursache des Messfehlers geben könnten, oder gar eine Korrektur des Messfehlers zulassen würden.
Aus der WO 00/50172 A1 und der WO 00/37163 A1 sind Verfahren zur Untersuchung einer biologischen Probe in einem Biochip mit einem miniaturisierten Labor gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und ein entsprechender Biochip gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 8 bekannt, mit denen sich eine gewisse Qualitätskontrolle der Messung des gesuchten Analyten erzielen lässt.
Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zur Untersuchung einer biologischen Probe in einem Biochip sowie einen entsprechenden Biochip zur Verfügung zu stellen, mit denen eine verbesserte Qualitätskontrolle der Messung des gesuchten Analyten möglich ist.
Diese Aufgabe erreicht die Erfindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nach Anspruch 1 sowie einem Biochip nach Anspruch 8. Erfindungsgemäß wird eine biologische Probe in den Biochip eingegeben, die Probe zumindest einem Aufbereitungsschritt unterworfen, und am Ende eines Messablaufs die Konzentration oder das Vorhandensein eines bestimmten Analyten in der aufbereiteten Probe gemessen, wobei darüber hinaus die Konzentration oder das Vorhandensein einer Markersubstanz gemessen wird.
Mit „Messablauf" ist der auf dem Biochip ablaufende Prozess gemeint, welcher z. B. einen oder mehrere Probenaufbereitungsschritte umfassen kann. Ein Aufbereitungsschritt kann ein beliebiger mechanischer oder chemischer Prozess ein, insbesondere einer der oben genannten biochemischen Reaktionsschritte. Bei den Analyten kann es sich um einen beliebigen gesuchten Stoff handeln, insbesondere Biomoleküle wie DNA, RNA oder Proteine.
Die Erfindung zeichnet sich dadurch aus, dass zusätzlich zur Bestimmung der Konzentration oder des Vorhandenseins des gesuchten Analyten eine Markersubstanz detektiert wird. Die Schutzschicht über einem Reaktionssubstanz-Reservoir ist so gestaltet, dass Abbauprodukte der Schutzschicht als diese Markersubstanz im Mikrofluidiksystem nachgewiesen werden können, wenn die Schutzschicht vorschriftsgemäß aufgelöst worden ist. Die Messung der Markersubstanz dient als Qualitätsparameter und ermöglicht daher, ein Messergebnis entweder als fehlerhaft zu kennzeichnen oder sogar gegebenenfalls vorliegende Messfehler korrigieren zu können. Diese gemessene Information kann zur Qualitätskontrolle des Messablaufs dienen, da aus dieser Information darauf geschlossen werden kann, dass eine bestimmte Schutzschicht aufgelöst worden ist, und über den Zeitpunkt der Detektion auch auf den Zeitpunkt der Auflösung geschlossen werden kann.
Der erfindungsgemäße Biochip ist dementsprechend dadurch gekennzeichnet, dass neben dem Sensor zur Messung des gesuchten Analyten zumindest ein weiterer Sensor zur Messung der Konzentration oder des Vorhandenseins einer Markersubstanz vorhanden ist. Der Biochip kann dann so gestaltet werden, dass einer der Detektionssensoren des Biochips die Konzentration bzw. das Vorhandensein von Abbauprodukten (z. B. Proteinen) der Schutzschicht in der Detektionskammer misst. Besonders bevorzugt wird hierfür die so genannte Array-Technologie verwendet, bei der ein Sensorarray in einen Biochip integriert ist, der es erlaubt, ohne nennenswerte Mehrkosten eine Vielzahl verschiedener Substanzen gleichzeitig zu messen.
Besonders bevorzugt wird die Konzentration oder das Vorhandensein der Markersubstanz nicht oder nicht nur am Ende des Messablaufs gemessen, sondern nach einem bestimmten Schritt während des Messablaufs, also als „Zwischenergebnis". Dies hat den Vorteil, dass das Ergebnis der Messung der Markersubstanz zur Steuerung des weiteren Messablaufs verwendet werden kann.
In einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens und Biochips werden die Reaktionssubstanzen für einen Probenaufbereitungsschritt, z. B. die Zell-Lyse, als Trockenreagenzien, abgedeckt mit einer Schutzmembran, in einem Reservoir im Biochip vorgehalten. Die Reaktionssubstanzen können z. B. Enzyme sein. Für eine erfolgreiche Messung ist es notwendig, dass diese Enzyme in ausreichender Konzentration im Biochip deponiert sind, die Aktivität des Enzyms durch die Lagerdauer und Lagerbedingungen nicht eingeschränkt worden ist, dass die Schutzmembran über dem Reservoir ausreichend aufgelöst worden ist, und letztendlich, dass eine ausreichende Menge des Enzyms mit der Probe in Kontakt gebracht wird. Diese Tatsache kann dadurch bestätigt werden, dass die im Mikrofluidik-Kreislauf des Biochip vorhandene Konzentration des Enzyms entweder am Ende des gesamten Messablaufs oder nach einem bestimmten Schritt im Messablauf, parallel zur Bestimmung der Konzentration der Analyten, gemessen wird. Unterschreitet die so bestimmte Konzentration des Enzyms eine vorbestimmte Schwelle, so wird die Messung des Analyten als fehlerhaft gekennzeichnet.
Es kann auch vorkommen, dass eine unzureichende Konzentration einer Reaktionssubstanz den Messwert für den gesuchten Analyten in bekannter Weise verfälscht. So kann z. B. bei einer Konzentration des Reaktionssubstanz unterhalb einer vorgegebenen Schwelle der Messwert linear mit der Konzentration des Reagenz abnehmen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann in solch einem Fall aus der gemessenen Konzentration einer Markersubstanz der Messwert des Analyten korrigiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann mit Hilfe der gemessenen Information über eine Reaktionssubstanz-Konzentration zu bestimmten Zeitpunkten im Messablauf auch der weitere Messablauf im Biochip gesteuert werden. So kann z. B. ein nachfolgender Schritt im Messablauf durch die gemessene Information „Schutzschicht X aufgelöst" in zeitlich definierter Folge ausgelöst werden. So kann z. B. eine Vervielfältigung von DNA-Material in der Probe durch eine Polymerase Chain Reaction (PCR) erst nach einem vordefinierten Zeitintervall nach Auflösung einer bestimmten Schutzschicht gestartet werden, um sicherzustellen, dass ein bestimmter Schritt der Probenaufbereitung, wie z. B. ein Zellaufschluss, ausreichend Zeit zur vollständigen Umsetzung hatte. In diesem Ausführungsbeispiel kann zusätzlich vorgesehen sein, unterschiedliche Schutzschichtmaterialien für unterschiedliche Reservoirs im selben Biochip zu verwenden, um so für jedes Reservoir getrennt und spezifisch dessen Freigabe zu messen.
In einer weiteren Ausführungsform werden die zu bestimmenden Markersubstanzen mit chemischen Labeln gekoppelt, um die Messung zu vereinfachen oder genauer zu machen.
Die Erfindung wird nun anhand eines Ausführungsbeispiels mit Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen näher beschrieben. In den Zeichnungen zeigen:
1 eine schematische Draufsicht auf einen Biochip gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;
2 ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die 1 und 2 zeigen jeweils eines einer Fülle von denkbaren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. Biochips. Für den Fachmann ist deutlich, dass Markersubstanzen an weiteren oder anderen Punkten im Messablauf gemessen werden können und auf vielfältige Weise zur Steuerung des Messablaufs sowie zur Qualitätskontrolle verwendet werden können.
Der schematisch in 1 dargestellte Biochip 1 umfasst einen Träger 3, in den ein System aus Mikrofluidikkanälen 4 enthalten ist. Die Probe wird am Eingang 2 eingegeben und durch den Mikrofluidikkanal 4 weitergeleitet. Im Reservoir 6 ist eine Reaktionssubstanz enthalten, welche z. B. zur Zell-Lyse benötigt wird. Das Reservoir 6 ist durch eine Schutzschicht (nicht gezeigt) abgedeckt, die bei Initialisierung des Messablaufs auf bekannte Weise, z. B. durch Lichteinstrahlung, aufgelöst wird. Die im Reservoir 6 enthaltene Reaktionssubstanz vermischt sich somit im Kanal 4 mit der Probe 2 und führt dort zur Zell-Lyse.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung ist am Verzweigungspunkt 8 bereits ein erster Sensor 10 angeschlossen, der die Konzentration einer Markersubstanz misst. Diese ist ein Abbauprodukt der aufgelösten Schutzschicht. Jedenfalls kann durch den Sensor 10 bereits frühzeitig im Messablauf detektiert werden, ob der Inhalt des Reservoirs 6 ordnungsgemäß mit der Probe in Kontakt gekommen ist. Abhängig von dem Ergebnis dieser Messung kann entweder der Messablauf abgebrochen, das Auflösen der Schutzschicht wiederholt, oder ein später gemessener Messwert korrigiert werden.
Die so behandelte Probe wird weitergeleitet in die Einrichtung 12, in der ein weiterer Probenaufbereitungsschritt stattfindet, z. B. eine Polymerase Chain Reaction (PCR).
Nach dem Durchlauf der PCR-Einrichtung 12 wird die Probe in den Kanal 9 weitergeleitet. Optional kann der Probe hier noch der Inhalt eines weiteren Reservoirs 14 beigemischt werden. Daraufhin wird die Probe im Multiplexer 16 auf mehrere Sensoren 18a, 18b, 18c und 18d aufgeteilt. In diesem Sensoren-Array wird z. B. durch Sensor 18a die Konzentration des eigentlichen Analyten gemessen, während die Sensoren 18b bis 18c weitere Markersubstanzen detektieren. Ggf. kann hier auch festgestellt werden, ob der Inhalt des Reservoirs 14 ordnungsgemäß in Kontakt mit der Probe gekommen ist.
Die Ausgestaltung der Sensoren 10, 18a–18d ist an und für sich bekannt. Diese umfassen insbesondere an einer Messsonde immobilisierte Fängermoleküle, die an den gesuchten Analyten bzw. die Markersubstanz spezifisch binden. Als Fängermoleküle können z. B. Antikörper verwendet werden. In das Fängermolekül integriert ist ein Reportermolekül, welches die Bindung detektiert und ein von außen messbares elektrisches, optisches oder magnetisches Signal abgibt. Dieses kann gemessen werden und gibt so Aufschluss über das Vorhandensein oder die Konzentration des Analyten bzw. der Markersubstanz. Die Sensoren 10 und 18a–18d sind elektrisch mit einer (nicht gezeigten) Auswerteeinheit verbunden, welche die Messergebnisse verarbeitet.
Ein Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in 2 dargestellt. Demgemäß folgt auf die Eingabe der Probe in Schritt 20 die Auflösung der Schutzmembran eines Reservoirs 6 für ein Zell-Lyse-Enzym in Schritt 22. Im nächsten Schritt 24 wird, z. B. durch den Sensor 10, die Konzentration des Abbauproduktes der Schutzmembran gemessen. Liegt die Konzentration unter einem vorbestimmten Grenzwert, so wurde die Schutzmembran nicht genügend aufgelöst. Diese Information kann nun zur Steuerung des Messablaufs dahingehend verwendet werden, dass der Mechanismus zur Auflösung der Schutzmembran nochmals aktiviert wird. Wird das Abbauprodukt der Schutzmembran in ausreichend hoher Konzentration detektiert, kann in Schritt 26 ein vordefiniertes Zeitintervall T gewartet werden, um sicherzustellen, dass die Zell-Lyse ausreichend Zeit zur vollständigen Umsetzung hatte. Danach wird der erste Aufbereitungsschritt 28, z. B. eine PCR, durchgeführt.
In einem späteren Schritt 30 wird optional die Schutzmembran des Reservoirs einer weiteren Reaktionssubstanz aufgelöst. Ebenfalls optional kann ein zweiter Aufbereitungsschritt 32 folgen. Schließlich wird das Vorhandensein bzw. die Konzentration des Analyten in Schritt 36 gemessen. Parallel dazu kann in Schritt 34 auch eine weitere Markersubstanz gemessen werden, die z. B. dem in Schritt 30 aufgelösten Reservoir beigemischt war. Die Messwerte der Schritte 34 und 36 werden schließlich in Schritt 38 in der oben erwähnten Auswerteeinrichtung ausgewertet. In Schritt 38 kann z. B. eine Korrektur des Messwerts des Analyten vorgenommen werden.
Die erfindungsgemäße Messung insbesondere von am Messablauf beteiligten Reaktionssubstanzen ermöglicht eine neuartige, quantifizierte Form der Qualitätskontrolle, der Fehlerquellenanalyse, der Messwertkorrektur oder aber auch der verbesserten Steuerung des Messablaufs in einem Biochip.

Claims

Verfahren zur Untersuchung einer biologischen Probe in einem Biochip (1) mit einem miniaturisierten Labor ("Lab-on-a-Chip"), bei welchem eine biologische Probe in den Biochip (1) eingegeben wird, die Probe zumindest einem Aufbereitungsschritt (28, 32) unterworfen wird, und am Ende eines Messablaufs die Konzentration oder das Vorhandensein eines bestimmten Analyten in der aufbereiteten Probe gemessen wird (36), wobei darüber hinaus die Konzentration oder das Vorhandensein einer Markersubstanz gemessen wird (34), dadurch gekennzeichnet, dass eine am Aufbereitungsschritt (28, 32) beteiligte Reaktionssubstanz vor dem Messablauf in einem mit einer Schutzmembran abgetrennten Reservoir (6, 14) auf dem Biochip (1) vorgehalten wird, und die Markersubstanz ein Abbauprodukt der Schutzmembran ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Ergebnis der Messung (34) der Markersubstanz zur Qualitätskontrolle der Messung des Analyten (36) und/oder zur Fehlerquellenanalyse bei einer fehlerhaften Messung des Analyten verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Ergebnis der Messung (34) der Markersubstanz zur Korrektur des Ergebnisses der Messung (36) des Analyten verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass verschiedene Schutzmembranen auf einem Biochip (1) aus verschiedenen chemischen Zusammensetzungen bestehen, um die Auflösung der Schutzmembranen einzeln nachweisen zu können.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration oder das Vorhandensein der Markersubstanz nach einem bestimmten Schritt während des Messablaufs gemessen wird (24).
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Ergebnis der Messung (24) der Markersubstanz zur Steuerung des weiteren Messablaufs verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration oder das Vorhandensein der Markersubstanz mehrmals während des Messablaufs gemessen wird.
Biochip (1) mit einem miniaturisierten Labor ("Lab-on-a-Chip"), mit – einem Eingang (2) zur Eingabe einer biologische Probe, – einer Einrichtung (12) zur Durchführung mindestes eines Proben-Aufbereitungsschritts, und – einem Sensor (18a) zur Messung der Konzentration oder des Vorhandenseins eines bestimmten Analyten in der aufbereiteten Probe, wobei zumindest ein weiterer Sensor (18a, 18b–18d) zur Messung der Konzentration oder des Vorhandenseins einer Markersubstanz vorhanden ist, dadurch gekennzeichnet, dass ein mit einer Schutzmembran abgetrenntes Reservoir (6, 14) auf dem Biochip (1) vorgesehen ist, in dem eine am Aufbereitungsschritt (28, 32) beteiligte Reaktionssubstanz vorgehalten ist, und die Markersubstanz ein Abbauprodukt der Schutzmembran ist.
Biochip nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Sensor (18a, 18b–18d) für die Markersubstanz eine Messsonde umfasst, auf der Fängermoleküle angeordnet sind, die an die Markersubstanz binden.
Biochip nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Sensoren (10, 18b–d) für die Markersubstanz vorgesehen sind, die die Konzentration oder das Vorhandensein der Markersubstanz an verschiedenen Stellen auf dem Biochip (1) messen.
Biochip nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass verschiedene Schutzmembranen auf einem Biochip (1) aus verschiedenen chemischen Zusammensetzungen mit verschiedenen Markersubstanzen bestehen.