DE19817180A1 - Biosensor mit modifizierter Edelmetalloberfläche und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biosensor (Affinitätssensor), bei dem ein Hydrogel über einen kurzkettigen Linker an die Edelmetalloberfläche des Biosensors gebunden ist, und ein Verfahren zu seiner Herstellung. Die vollständige Bedeckung der Biosensoroberfläche mit Hydrogel wird durch Wasserstoffbrückenbindungen, Aromaten-Aromaten-Wechselwirkungen oder durch kovalente Bindungen erzielt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biosensor (Affinitätssensor), bei dem ein Hydrogel über einen kurzkettigen Linker an die Edelmetalloberfläche des Sensors gebunden ist und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Oberflächen von Affinitätssensoren auf der Basis von Oberflächen­ plasmonenresonanz (surface plasmon resonance, SPR) müssen für die Erzeugung eines Signals eine ca. 50 nm dicke Edelmetallschicht, meist aus Gold, aufweisen. Es hat sich jedoch als unzweckmäßig erwiesen, Rezeptoren, typischerweise Proteine, unmittelbar an die Edelmetalloberfläche zu binden, da sie in dieser Umgebung leicht denaturieren und auf diese Weise ihre Rezeptorfunktion verlieren. Hinzu kommt, daß an unbedeckten Teilen der Edelmetalloberfläche unspezifische Adsorptionsphänomene stattfinden können, die dann das Meßergebnis erheblich verfälschen.

Dieser Nachteil wird in der Regel dadurch umgangen, daß man an die Edelmetallschicht eine mehrere Nanometer dicke Dextranschicht kovalent ankoppelt, die in wäßrigem Milieu zu einer Dicke von ca. 100 nm aufquillt und die Edelmetalloberfläche vollständig bedeckt. Die gequollene Polymerschicht ahmt die natürliche Umgebung von Biomolekülen nach und ist geeignet, eine Denaturierung und somit Inaktivierung der Rezeptoren zu verhindern. Zusätzlich wird die Adsorption von anderen als den zu analysierenden Molekülen wirksam unterdrückt. Außerdem ist die gequollene Dextranschicht in der Lage, Unregelmäßigkeiten der Oberfläche auszugleichen: Die Anbindung von Rezeptormolekülen findet in der gequollenen Matrix und nicht nur unmittelbar an der Oberfläche statt. Hierdurch verringert sich die Bedeutung von Oberflächenunebenheiten, die sonst zu einer schlecht definierten Oberfläche und dadurch zu schlecht quantifizierbaren Meßergebnissen beitragen.

Es sind Beschichtungen bekannt, die auf Sensoroberflächen aufgebracht werden können und die sowohl unspezifische Adsorption verhindern als auch als Matrix für Rezeptormoleküle dienen sollen (Molecular Resolution Imaging of Dextran Monolayers Immobilized on Silica by Atomic Force Microscopy, Langmuir, 1996, 12, 6436). Solche Strukturen weisen aber häufig aufgrund ihres molekularen Aufbaus Defektstellen auf und verhindern dadurch die unspezifische Adsorption nur unzureichend.

In EP-B-589 867 ist eine Biosensor-Meßoberfläche beschrieben, bei der eine poröse Matrix, z. B. ein Hydrogel, wie Dextran, über eine Monoschicht aus organischen Molekülen (Linker) an eine Metalloberfläche gebunden ist. Diese Beschichtungen werden bei der Herstellung von Disposables für kommerzielle SPR-Sensoren verwendet. Um eine vollständige Bedeckung der Biosensoroberfläche mit der porösen Matrix und gute Stabilität zu erreichen, verlangt EP-B-589 867 die Verwendung von Molekülen mit einer Kohlenwasserstoffkette mit einer Länge von mehr als 10 Atomen als Linker. Als funktionelle Gruppe, an die die poröse Matrix gebunden wird, werden für die Linker Hydroxyl-, Carboxyl-, Amino-, Aldehyd-, Hydrazid-, Carbonyl-, Epoxy- oder Vinylgruppen angegeben. Bevorzugter Linker ist 16-Mercaptohexadecanol, dessen Hydroxylgruppe durch Umsetzung mit Epichlorhydrin aktiviert werden muß, bevor Dextran an die Sensoroberfläche gebunden wird. Hinsichtlich der Bedingungen der weiteren Umsetzung der übrigen funktionellen Gruppen mit einer porösen Matrix finden sich in EP-B-589 867 keine Angaben.

Die Notwendigkeit, langkettige Linker zur Anbindung der porösen Matrix an die Edelmetalloberfläche zu verwenden, ist im Hinblick auf die aufwendige Herstellung solcher Verbindungen von Nachteil. Ein weiterer Nachteil ist die Verwendung des toxischen und karzinogenen Epichlorhydrins zur Aktivierung der funktionellen Gruppe des Linkers.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, einen Biosensor mit modifizierter Edelmetalloberfläche bereitzustellen, in dem ein Hydrogel über einfacher aufgebaute, möglichst kommerziell erhältliche Linkermoleküle mit der Edelmetalloberfläche verbunden ist.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines Biosensors mit einer modifizierten Edelmetalloberfläche der genannten Art bereitzustellen, das kostengünstiger und einfacher durchzuführen ist als die im Stand der Technik bekannten Verfahren.

Diese Aufgaben konnten auf der Basis des Befundes gelöst werden, daß auch bei Verwendung von Linkermolekülen, die eine Kohlenwasserstoff-Kettenlänge von bis zu 10 Atomen aufweisen, eine vollständige Bedeckung der Edelmetalloberfläche durch Hydrogel erreicht werden kann, wenn die Monoschicht aus Linkermolekülen durch Wasserstoffbrückenbindungen, Aromaten-Aromaten-Wechselwirkungen oder kovalente Bindungen stabilisiert wird.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Biosensor, dessen Oberfläche eine Edelmetallschicht umfaßt, an die über eine Monoschicht aus organischen Molekülen ein Hydrogel gebunden ist, wobei die eingesetzten organischen Moleküle die Formel A-R-B aufweisen, in der A ein(e) an das Edelmetall bindende(s) Atom oder Gruppe bedeutet; R eine verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffkette mit einer Kettenlänge von bis zu 10 Kohlenstoffatomen ist, wobei die Kohlenwasserstoffkette bis zu zweimal jeweils durch eine Phenylengruppe oder ein Heteroatom unterbrochen sein kann; und B ein(e) an das Hydrogel bindende(s) Atom oder Gruppe bedeutet.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung des obengenannten Biosensors gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14.

Die erfindungsgemäßen Biosensoren mit einer modifizierten Edelmetalloberfläche finden bevorzugt in der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) Verwendung.

Um unspezifische Adsorptionen von Rezeptormolekülen zu vermeiden, ist es nötig, die Biosensoroberfläche vollständig mit Hydrogel zu bedecken. Eine der Voraussetzungen für eine stabile Hydrogelschicht ist, daß die darunterliegende Linkermolekülschicht eine hinreichende Stabilität aufweist. Diese Stabilität kann durch Wasserstoffbrückenbindungen, Aromaten-Aromaten-Wechselwirkungen (π- π-Wechselwirkungen) oder, gegebenenfalls über eine Metalloxid umfassende Zwischenschicht, durch kovalente Bindungen gewährleistet werden. Die Wechselwirkungen bzw. Bindungen treten zwischen den Linkermolekülen oder zwischen den Linkermolekülen und dem Hydrogel auf.

Wasserstoffbrückenbindungen sind z. B. zwischen Amidbindungen (z. B. B = Amingruppe, carboxyfunktionalisiertes Hydrogel) oder zwischen Hydroxy- und Carboxygruppen (z. B. B = Epoxygruppe, carboxyfunktionalisiertes Hydrogel) vorhanden. In Systemen, die Wasserstoffbrückenbindungen aufweisen, können Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Linkermolekülen und dem Hydrogel ausgebildet werden. Hierdurch werden lokale Fehlstellen überspannt oder vermieden.

Aromaten-Aromaten-Wechselwirkungen werden zwischen aromatischen Ringsystemen in den Linkermolekülen beobachtet. Diese Wechselwirkungen führen zu Anziehungskräften zwischen den Linkermolekülen, die die Monoschicht stabilisieren. Geeignete aromatische Gruppen sind Phenylengruppen. Besonders bevorzugt sind Phenylengruppen, die in para-Stellung in das Linkermolekül eingebaut sind. Die Phenylengruppen können gegebenenfalls mit kleineren nicht sperrigen Alkylgruppen wie z. B. Methyl- oder Ethylgruppen substituiert sein.

Eine weitere Möglichkeit eine stabile Linkermolekülschicht zu erzeugen, ist durch Einführen von kovalenten Bindungen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird nach Anbindung eines erfindungsgemäßen niedermolekularen kurzkettigen Linkers an die Edelmetallschicht zuerst, vorzugsweise über einen Sol-Gel- Prozeß, eine dichte Metalloxid umfassenden Zwischenschicht aufgebaut (Stepwise Adsorption of Metal Alkoxides on Hydrolyzed Surfaces: A Surface Sol- Gel Process, Chemistry Letters, 1996, 831), die dann über die darin vorhandenen Hydroxygruppen mit dem Hydrogel verknüpft wird (Surface Modification for Direct Immunoprobes, Biosensors & Bioelectronics, 1996, 11, 579; Dissertation G. Elender, TU München, 1996, S. 113).

Im Stand der Technik wird bisher die Stabilisierung der Linkermolekülschicht durch die Verwendung langer Alkylketten im Linker erreicht, die durch Kristallisation der Alkylketten eine dichte stabile Schicht bilden (EP-B-589 867).

Die Verwendung eines Schichtaufbaus unter Ausnutzung von Wasserstoffbrückenbindungen oder Aromaten-Aromaten-Wechselwirkungen hat insbesondere den Vorteil einer sehr einfachen Herstellung. Demgegenüber sind Schichtaufbauten unter Verwendung einer Metalloxidzwischenschicht zwar aufwendiger zu fertigen, bieten aber die Möglichkeit, die Schichtdicke des Gesamtsystems gezielt einzustellen, in dem gegebenenfalls mehrere Sol-Gel- Prozeßschritte hintereinander ausgeführt werden. Über die Schichtdicke läßt sich dann wiederum Einfluß auf die Lage des Oberflächenplasmonenresonanzsignals nehmen, was aus meßtechnischer Sicht erstrebenswert sein kann.

Der erfindungsgemäße Biosensor umfaßt eine Edelmetallschicht. Im Rahmen der Erfindung können beispielsweise Silber oder Gold verwendet werden. Die Dicke der Schicht beträgt zwischen 30 und 70 nm, vorzugsweise zwischen 40 und 60 nm.

Als Linkermolekül werden kurzkettige organische Moleküle A-R-B eingesetzt, die ein an Edelmetall bindendes Atom oder Gruppe A aufweisen. Bevorzugt finden Thiole, Disulfide, Selenide und Diselenide mit einer weiteren funktionellen Gruppe Verwendung. Das Linkermolekül weist eine verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffkette mit einer Kettenlänge von bis zu 10 Kohlenstoffatomen auf, wobei die Kohlenwasserstoffkette bis zu zweimal durch jeweils eine Phenylengruppe oder durch ein Heteroatom, wie z. B. -O- oder -NH-, unterbrochen sein kann. Bei der Berechnung der Kettenlänge werden die Heteroatome bzw. die Kohlenstoffe der Phenylengruppen nicht mitgezählt. Die Kohlenwasserstoffkette weist bevorzugt eine Kettenlänge von bis zu 6 Kohlenstoffatome auf. Die Kohlenwasserstoffkette ist vorzugsweise unverzweigt.

Da Thiole und Disulfide kostengünstiger sind als die entsprechenden Selenverbindungen, werden sie vorzugsweise in den erfindungsgemäßen Biosensoren mit einer modifizierten Edelmetalloberfläche verwendet.

Die zweite funktionelle Gruppe B des Linkermoleküls dient der Verknüpfung mit dem Hydrogel oder der Verbindung zur dichtenden Metalloxidschicht. Grundsätzlich können alle aus dem Stand der Technik bekannten Gruppen B verwendet werden. Beispiele sind Hydroxyl-, Carboxyl-, Epoxy- oder Aminogruppen. Im Falle der Metalloxid umfassende Zwischenschicht ist die Verwendung von Hydroxylgruppen besonders bevorzugt, während bei der direkten Anbindung des Hydrogels an den niedermolekularen Linker die Verwendung von Epoxy- oder Aminogruppen besonders vorteilhaft ist.

Bei den Hydrogelen kann es sich um ein Polysaccharid, ein Derivat davon oder um ein quellbares organisches Polymer wie Poly{N-[tris-(hydroxymethyl)-methyl]- acrylsäureamid}, Polyvinylalkohol oder Polyethylenglykol handeln. Bevorzugt sind Poly{N-[tris-(hydroxymethyl)-methyl]-acrylsäurnamid} und Polyethylenglykol. Beispiele für Polysaccharide sind Amylose, Inulin, Pullulan oder Dextran. Bevorzugt sind Pullulan oder Dextran. Besonders bevorzugt ist Dextran.

Um eine Ankopplung des Hydrogels an die Linkermoleküle zu erleichtern, kann das Hydrogel derivatisiert werden, so daß es beispielsweise Hydroxyl-, Carboxyl-, Amino- oder Carbonylgruppen aufweist. Besonders bevorzugt ist ein Carboxymethyl-derivatisiertes Hydrogel.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von zwei bevorzugten Ausführungsformen näher erläutert. In der ersten Ausführungsform wird das Hydrogel direkt an die Linkermoleküle gebunden, d. h. ohne daß weitere Atome zwischen dem Hydrogel und den Linkermolekülen eingefügt werden. Ein Beispiel hierfür zeigt Reaktionsschema 1. Zunächst wird eine Monoschicht eines Aminothiols auf eine Edelmetalloberfläche aufgebracht. An diese Monoschicht aus Linkermolekülen wird anschließend direkt über Amidbindungen ein Carboxyalkyl-derivatisiertes Polysaccharid gebunden.

Reaktionsschema 1

Typischerweise erfolgt die Amid-Kopplung unter Verwendung von Ethyl-3- dimethylamino-propyl-carbodiimid und N-Hydroxysuccinimid. Nach diesem Schritt ist die Funktionalisierung so weit abgeschlossen, daß der Endanwender die Anbindung von Rezeptormolekülen vornehmen kann.

Bei dieser Ausführungsform werden für die Herstellung einer carboxyalkylierten Polysaccharidoberfläche also nur zwei Schritte benötigt. Außerdem kann die Verwendung von hochtoxischen und karzinogenen Substanzen vermieden werden. Der Einsatz einer hochkonzentrierten Polymerlösung ist nicht erforderlich. Als weiterer Vorteil kommt hinzu, daß in der hier beschriebenen Ausführungsform nur wäßrige Lösungen verwendet werden.

In der zweiten bevorzugten Ausführungsform wird das Hydrogel über eine Metalloxidzwischenschicht an die Linkermoleküle gebunden. Ein Beispiel hierfür zeigt Reaktionsschema 2. Zunächst wird eine Monoschicht eines Hydroxythiols an eine Edelmetallschicht gebunden. Diese Linkermoleküle werden anschließend mit einem Metallalkoxid, vorzugsweise Ti(IV)butoxid, umgesetzt. Um eine hydroxyfunktionalisierte Oberfläche zu erhalten, wird nachfolgend hydrolysiert. Die so erhaltene Metalloxidschicht ist in ihrer chemischen Reaktivität mit gereinigtem Glas äquivalent. Nun kann z. B. ein Epoxysilan an die Hydroxygruppen gebunden werden, das dann wiederum die Bindung eines Hydroxypolymers erlaubt. Als Hydroxypolymer können Polysaccharide oder synthetische Polymere, die Hydroxygruppen tragen wie z. B. Dextran oder dessen Derivate, Polyvinylalkohol, Pullulan und Poly{N-[tris-(hydroxymethyl)-methyl]- acrylsäureamid} verwendet werden. Die Metalloxid umfassende Zwischensicht besteht bevorzugt ausschließlich aus Metalloxid.

Reaktionsschema 2

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Biosensoroberfläche wird zunächst ein mit einer Goldschicht bedampfter Glasträger in eine, vorzugsweise wäßrige, Lösung erfindungsgemäßer Linkermoleküle gegeben. Die Dauer dieser Funktionalisierung beträgt zwischen 2 h und 24 h, typischerweise 12 h. Die Temperatur kann zwischen 15°C und 35°C betragen. Die Konzentration der Linkermoleküle in der Lösung reicht von 5.10^-4 bis 2.10^-1 mol.l^-1, bevorzugt von 5.10^-3 bis 5.10^-2 mol.l^-1.

Das so hergestellte Zwischenprodukt weist eine Monoschicht aus erfindungsgemäßen organischen Linkermolekülen auf. Die Anbindung des Hydrogels kann entweder direkt oder über eine Metalloxid umfassende Schicht erfolgen.

Zur direkten Anbindung des Hydrogels an die Monoschicht aus Linkermolekülen wird der Träger zwischen 1 h und 5 h, typischerweise 3 h, in eine frisch bereitete wäßrige Hydrogellösung gegeben. Die Hydrogelkonzentration liegt zwischen 10 und 50 mg.ml^-1. Gegebenenfalls kann das Hydrogel nach bekannten Methoden derivatisiert werden.

Zur Erzeugung einer Metalloxidzwischenschicht wird dagegen zunächst eine Metallalkoxidlösung aus Metallalkoxid, Wasser und organische Lösungsmittel, wie z. B. Ethanol und Toluol, hergestellt. Zur Herstellung der Metalloxidschicht können z. B. Titan(IV)butoxid, Tetramethoxysilan, Aluminium(III)butoxid, Zirkon(IV)propoxid oder Niobium(V)butoxid verwendet werden. Bevorzugt ist Titan(IV)butoxid. Das Zwischenprodukt wird dann 5 bis 20 Minuten in diese Metallalkoxidlösung getaucht.

Um eine Anbindung des Hydrogels zu ermöglichen, muß die so hergestellte Metalloxidschicht funktionalisiert werden. Dies kann durch Epoxysilanverbindungen, wie z. B. (3-(2,3-Epoxypropoxy)propyl)triethoxysilan, nach bekannten Verfahren geschehen. Dieser Funktionalisierungsschritt kann bei Raumtemperatur erfolgen und dauert zwischen 10 und 40 Minuten.

Die Ankopplung eines Hydroxypolymers erfolgt ähnlich wie bei der ersten Ausführungsform, wobei allerdings die Verweilzeit in der Hydroxypolymerlösung auf 12 h bis 48 h, typischerweise 24 h, erhöht wird.

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Herstellung der funktionalisierten Oberfläche

Ein mit Gold beschichteter Glasträger (Schichtdicke: ca. 50 nm) wird 12 h in eine 2.10^-2 mol.l^-1 wäßriger Cysteaminiumhydrochloridlösung getaucht. Nach Spülen mit 100 ml Reinstwasser und mit 10 ml 0,1 mol.l^-1 NaOH wird der Träger 3 h in eine Lösung von 22 mg Carboxymethyldextran-Natriumsalz (Fluka), 77 mg Ethyl- 3-dimethylamino-prnpyl-carbodiimid (EDC) und 12 mg N-Hydroxysuccinimid (NHS) in 1 ml Reinstwasser gestellt. Abschließend wird dreimal mit 20 ml Reinstwasser gespült.

Der carboxymethylfunktionalisierte Sensor wird in ein SPR-Gerät eingebaut. Bei dem verwendeten SPR-Gerät handelt es sich um einen Eigenbau mit θ/2θ- Aufbau (analog E. Kretschmann und H. Raether, "Radiative Decay of Non- Radiative Surface Plasmons Exicted by Light", Z Naturforsch., Band 23a, S. 2135 (1968)), der über einen Infrarotlaser (Wellenlänge 784 nm) als Lichtquelle verfügt.

Fig. 1 zeigt die Messung der Oberflächenplasmonenresonanz nach der Aminofunktionalisierung (durchgezogene Linie) und nach der Kopplung des Carboxymethyldextrans (gestrichelte Linie).

Die Verschiebung des Minimums zu höheren Winkeln dient als Indikator für die Zunahme der Schichtdicke.

Anbindung eines Proteins

Zur Aktivierung der Carboxylgruppen der Dextranschicht wird die Oberfläche 10 Minuten mit 77 mg EDC und 12 mg NHS kontaktiert. Anschließend wird eine Rinderserumalbuminlösung (BSA) (16,7 µmol.l^-1) in Kontakt mit der Oberfläche gebracht. Nach 20 Minuten wird mit 1 ml Wasser und dann mit 1 ml 0,01 mol.l^-1 Salzsäure gespült, um nur unspezifisch gebundenes BSA zu entfernen. Anschließend erfolgt eine Oberflächenplasmonenresonanzmessung, um das Schichtdickenwachstum zu verfolgen (s. Fig. 2).

Beispiel 2

Ein mit Gold beschichteter Glasträger (Schichtdicke: ca. 50 nm) wird 12 h in eine wäßrige 2.10^-2 mol/l^-1 Mercaptoethanollösung getaucht. Nach gründlichem Spülen mit Reinstwasser wird der Träger in eine frisch bereitete Titan(IV)butoxidlösung gegeben. Hierzu werden 7 ml Wasser und 34 mg Titan(IV)-butoxid (Aldrich) unter Rühren zu einer Mischung von 0.5 ml Ethanol und 0.5 ml Toluol gegeben. Nach einer Verweilzeit von 10 Minuten, wird der Träger mit viel Reinstwasser gewaschen. Danach wird die weitere Funktionalisierung mit (3-(2,3- Epoxypropoxy)propyl)triethoxysilan (Wacker GF 82) vorgenommen.

Hierzu werden 7 ml des Silans und 3 ml H₂O gemischt, mit 190 ml Isopropanol verdünnt, und bei Raumtemperatur gerührt. Die Verweildauer des Trägers in dieser Lösung beträgt wiederum 20 Minuten. Anschließend wird der Träger mit viel Reinstwasser gewaschen und danach 24 h, in eine 30 Gew.-% Lösung von Dextran (Dextran T500, Pharmacia) in Wasser gestellt.

Nach dem Waschen wird der Träger anschließend zur Carboxymethylierung in eine frisch bereitete Lösung von Bromessigsäure in wäßriger NaOH gestellt. Diese Lösung hat eine Bromessigsäurekonzentration von 1 mol.l^-1 und eine Natriumhydroxidkonzentration von 2 mol.l^-1. Die Verweildauer beträgt 20 h.

Der carboxymethylfunktionalisierte Sensor wird in das in Beispiel 1 beschriebene SPR-Gerät eingebaut. Die Sensoroberfläche wird durch Inkubation in einer wäßrigen Lösung von 77 µg.ml^-1 Ethyl-3-dimethylamino-propyl-carbodiimid und 12 µg/ml N-Hydroxysuccinimid 10 Minuten aktiviert.

Zur Anbindung des Rezeptors wird eine Lösung von Protein A (10 µg.ml^-1) in PBS-Puffer (0,15 mol.l^-1 NaCl, 0,38 mmol.l^-1 NaH₂PO₄.H₂O, 1,67 mmol.l^-1 Na₂HPO₄, pH 7,4) auf die so vorbehandelte Oberfläche gegeben. Die Inkubationszeit beträgt 60 Minuten. Zur Deaktivierung nicht umgesetzter aktivierter Carboxylgruppen wird 20 Minuten eine Inkubation mit einer 1 mol.l^-1 Lösung von Ethanolamin in Wasser durchgeführt.

Nach Spülen mit PBS-Puffer kann das Studium der Ligand/Rezeptor- Wechselwirkung erfolgen. Hierzu wird eine Lösung von Schaf-anti-Maus-IgG (270 µg.ml^-1) in PBS-Puffer in Kontakt mit der Sensoroberfläche gebracht. Der zeitliche Verlauf der Ligandanbindung von Schaf-anti-Maus-IgG (Kreise) läßt sich durch Verfolgung der Lage des Plasmonenminimums in Abhängigkeit von der Zeit verfolgen (Fig. 3). Hierbei dient die Verschiebung des Minimums zu höheren Winkeln als Indikator für die Zunahme der Schichtdicke. Nach erfolgter Bindung kann die Sensoroberfläche durch zweimaliges Spülen mit verdünnter Salzsäure regeneriert werden (Dreiecke). Eine Kontrollmessung mit Rinderserum­ albuminlösung vergleichbarer Konzentration (270 µg.ml^-1) zeigt, daß die Wechselwirkung mit Schaf-anti-Maus-IgG spezifischer Natur ist: eine Anbindung des sehr stark zu unspezifischer Adsorption neigenden Rinderserumalbumins erfolgt nicht (Rauten).

Claims (14)

1. Biosensor, dessen Oberfläche eine Edelmetallschicht umfaßt, an die über eine Monoschicht aus organischen Molekülen ein Hydrogel gebunden ist, wobei die eingesetzten organischen Moleküle die Formel A-R-B aufweisen, in der

• - A ein(e) an das Edelmetall bindende(s) Atom oder Gruppe bedeutet;
• - R eine verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffkette mit einer Kettenlänge von bis zu 10 Kohlenstoffatomen ist, wobei die Kohlenwasserstoffkette bis zu zweimal jeweils durch eine Phenylengruppe oder ein Heteroatom unterbrochen sein kann; und
• - B ein(e) an das Hydrogel bindende(s) Atom oder Gruppe bedeutet,

gekennzeichnet dadurch, daß die Monoschicht aus organischen Molekülen durch Wasserstoffbrückenbindungen, Aromaten-Aromaten-Wechsel­ wirkungen oder kovalente Bindungen stabilisiert wird.

2. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Edelmetall Gold ist.

3. Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß A eine Thio-, Disulfid-, Selenid- oder Diselenidgruppe bedeutet.

4. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Alkylengruppe mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen bedeutet.

5. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß B eine Hydroxyl-, Epoxy- oder Aminogruppe bedeutet.

6. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrogel ein Polysaccharid, ein Derivat davon, oder ein quellbares organisches Polymer ist.

7. Biosensor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrogel ein Polysaccharidderivat ist, wobei das Polysaccharidderivat Hydroxyl-, Carboxyl-, Amino- oder Carbonylgruppen aufweist.

8. Biosensor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrogel Carboxymethyldextran ist.

9. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrogel direkt an die organischen Moleküle der Formel A-R-B gebunden ist.

10. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrogel über eine Metalloxid umfassende Zwischenschicht an die organischen Moleküle der Formel A-R-B gebunden ist.

11. Verfahren zur Herstellung eines Biosensors, umfassend die Erzeugung einer Monoschicht aus organischen Molekülen auf einer Edelmetallschicht und Bindung eines Hydrogels an diese Monoschicht, wobei die eingesetzten organischen Moleküle die Formel A-R-B aufweisen, in der

• - A ein(e) an das Edelmetall bindende(s) Atom oder Gruppe bedeutet;
• - R eine verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffkette mit einer Kettenlänge von bis zu 10 Kohlenstoffatomen ist, wobei die Kohlenwasserstoffkette bis zweimal jeweils durch eine Phenylengruppe oder ein Heteroatom unterbrochen sein kann; und
• - B ein(e) an das Hydrogel bindende(s) Atom oder Gruppe bedeutet,

gekennzeichnet dadurch, daß die Monoschicht aus organischen Molekülen durch Wasserstoffbrückenbindungen, Aromaten-Aromaten-Wechsel­ wirkungen oder kovalente Bindungen stabilisiert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrogel direkt an die organischen Moleküle der Formel A-R-B gebunden ist.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bindung des Hydrogels an die Monoschicht über eine Metalloxid umfassende Zwischenschicht bewirkt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Metalloxid umfassende Zwischenschicht über einen Sol-Gel-Prozeß aufgebaut wird.