DE19758598A1 - Verfahren zur Prüfung von Materialien hinsichtlich ihrer potentiellen antimikrobiellen Wirksamkeit und der Proliferation von Zellen auf ihrer Oberfläche - Google Patents
Verfahren zur Prüfung von Materialien hinsichtlich ihrer potentiellen antimikrobiellen Wirksamkeit und der Proliferation von Zellen auf ihrer OberflächeInfo
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Abstract
Description
- - entweder das Material läßt eine mikrobielle Besiedelung bzw. Anhaftung nicht zu, oder
- - das Material entfaltet Eigenschaften, die zur Abtötung von Mikroorganismen führen, die das Material besiedelt haben.
- - Zur Prüfung auf antimikrobielle Wirksamkeit sollten potentiell antimikrobielle Probe und Kontrolle (Probe ohne antimikrobielle Wirkung) unter simultanen Versuchsbedingungen gegenübergestellt werden können.
- - Um eine aussagekräftige Statistik und Fehlerrechnung zu ermög lichen und aus Gründen der Ökonomie soll das Verfahren die gleichzeitige Prüfung einer hohen Anzahl von Proben (ca. 100 Pro ben) ermöglichen.
- - Für vergleichende quantitative Aussagen muß sichergestellt sein, daß bei allen Proben eine definierte, gleichgroße Fläche gemessen wird.
- - Das Verfahren soll schnell, reproduzierbar (d. h. mit minimalem statistischen Fehler) und kostengünstig sein.
- - Das Verfahren soll in der Lage sein, geringste Unterschiede in den Aktivitäten verschiedener Proben zu erfassen, d. h. hoch sen sitiv sein.
- - Die Auswertung der Daten sollte durch ein EDV-gesteuertes auto matisiertes Auswerteverfahren erfolgen.
- - Das Wachstumsverhalten (Proliferation) der Mikroorganismen auf den Proben sollte zeitaufgelöst (online) z. B. durch Photometrie (d. h. Messung der optischen Dichte) auswertbar sein.
Eine weltweit angewandte Methode ist der "Semiquantitative" Keimnachweis auf der Oberfläche von Biomaterialien durch Ausroll technik nach Maki (Maki D. G., C. E. Weise, H. W. Sarafin: A semi- quantitative culture method for identifying intravenous catheter related infection. N. Engl J. Med. 296 (1977), 1305-1309). Dabei wird das zu prüfende Biomaterial unter möglichst sterilen Bedin gungen manuell auf einer Agarplatte mit einer Pinzette hin- und hergerollt (eine Probe pro Agarplatte). Nach anschließender Be brütung der Agarplatte kann über das bakterielle Wachstum "semi quantitativ" (durch Zählen der Kolonien) die antimikrobielle Wirksamkeit oder Adhäsions-Eigenschaft des Biomaterials bestimmt werden.
Die manuelle Durchführung ist nicht zu 100% reproduzierbar; au ßerdem bestehen keine simultanen Durchführungsbedingungen. Das Verfahren ist unökonomisch und mit einem hohen statistischen Feh ler belegt. Des weiteren gibt es keine definierte Meßfläche.
Quantitative culture of intravenous catheters and other intra vaskular inserts. J. Infect. Dis. 141 (1980), 781-786) bei der Biomaterialien (Schläuche) durchspült werden, das Eluat in ver schiedenen Verdünnungsstufen (manuell) auf Agarplatten plattiert und die Keimzahlen ausgezählt werden.
- a) Bereitstellung einer Werkstoffprobe definierter Geometrie und Größe,
- b) Inkubation der Probe mit einer Lösung, die den zu testenden Mikroorganismus enthält (Besiedelung der Probe mit dem Mikroorganismus),
- c) Überführung der Probe in ein für den entsprechenden Mikro organismus geeignetes Minimalmedium (Entfaltung der potentiellen antimikrobiellen Wirksamkeit),
- d) Überführung der Probe in eine für den Mikroorganismus geeig nete Nährlösung (Nachweis des Ausmaßes der antimikrobiellen Wirk samkeit),
- e) Bestimmung der optischen Dichte der Nährlösung nach Entnahme der Probe (Endpunktmessung), oder
- f) Entnahme der Probe und Zugabe von 1 bis 1/2000 Volumenanteil Vollmedium zum Minimalmedium,
- g) zeitaufgelöste Bestimmung der optischen Dichte des Mediums (Kinetik).
- 1. Bereitstellung von losen Proben: 12 identische Proben Polyu rethan (ohne Silber), 12 identische Proben Silberpolyurethan-Pro totype I, 12 identische Proben Silberpolyurethan-Prototyp II (alle Prüflinge haben die gleichen Abmessungen) wurden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gelegt. Die Proben waren zy linderförmig mit einer Länge von 1.1 cm und einem Durchmesser von 2 mm.
- 2. Füllen der Mikrotiterplatte mit 20 µl Bakterienlösung pro Ver tiefung (Testkeim Staphylokokkus epidermidis, 108 logphase Zellen pro ml Inkubationsmedium (handelsübliches Trypcase Soja) wurden 1 : 20 mit physiologischem Puffer (Phosphat) verdünnt).
- 3. Inkubation bei 37 C für 60 Minuten (37 C).
- 4. Absaugen der Bakterien und 3-maliges Waschen der Probe mit physiologischem Puffer.
- 5. Setzen der Probe in eine mit Minimal-Medium (physiologischer Phosphat-Puffer mit 0.25% Glucose, 0.2%(NH4)SO4, 1% Trypcase Soja Medium) gefüllte Mikrotiterplatte (200 µl/well), Inkubation für 24 Stunden bei 37 C (Nachweis der Proliferationsaktivität, Fig. 1 entsprechend).
- 6. Entnahme und Verwurf der Probe. Zugabe von 50 µl/well Vollme dium (Trypcase Soja) zur Titerplatte. Kontinuierliche Trübungs messung (48 Stunden, Interval 30 min, 37 C, 578 nm) in einem geeig neten Lesegerät. Aufzeichnung der Kinetik der bakteriellen Pro liferation.
- 7. Interpretation der Wachstumskurven (Fig. 2) oder statt Nr. 6 und 7
- 8. Überführung der Probe in ein Vollmedium.
- 9. Nach entsprechender Inkubationszeit Entnahme der Probe und Messen der Optischen Dichte.
Reihen 1/2: Polyurethan ohne Silber zeigt keine antimikrobielle Aktivität. Alle Prüflinge zeigen ein rapides logarithmisches Wachstum der Bakterien.
Reihen 3/4: Polyurethan-Silberprototype I zeigt antimikrobielle Aktivität. Alle Prüflinge zeigen eine deutlich verlängerte Lag phase. Die ausgedehnte Lagphase deutet auf eine stark verminderte Proliferation der Bakterien. Die Prüflinge zeigen bakteriostati sche Aktivität.
Reihe 5/6: Polyurethan-Silberprototyp II zeigt hohe antimikro bielle Aktivität. Alle Prüflinge zeigen sich steril, Bakterien wurden vollständig abgetötet, eine Proliferation ist nicht nach weisbar. Die Prüflinge zeigen somit bakterizide Aktivität.
Claims (3)
- a) Bereitstellung einer Vielzahl von losen Proben vorgegebener Geometrie und Größe,
- b) Inkubation der Proben mit einer Lösung, die die zu testenden Zellen enthält,
- c) Überführung der Proben in ein für die Zellen geeignetes Mini malmedium,
- d) Überführung der Proben in eine für die Zellen geeignete Nährlösung,
- e) Inkubation und anschließende Bestimmung der optischen Dichte der Nährlösung nach Entnahme der Proben, oder
- f) Entnahme der Proben und Zugabe eines angemessenen Volumenan teils Vollmedium zum Minimalmedium,
- g) zeitaufgelöste Bestimmung der optischen Dichte des Mediums.
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