DE19753176A1 - Nicht rekombinante Subunitvakzine - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft nicht rekombinante
Subunitvakzine aus Zelloberflächenproteinen erhältlich
durch Kultivierung einer Bakterienkultur und
anschließende Anreicherung protektiver Antigene unter
Verwendung von Detergenzien, Verfahren zu deren
Herstellung, diese enthaltende Impfstoffe sowie einen
diagnostischer Test.
Die äußere Membrane stellt die außen liegende
kontinuierliche Struktur der Oberfläche von gram
negativen Bakterien dar und ist somit für die
Wechselwirkung der Bakterien mit dem Immunsystem der
Wirte von großer Bedeutung. An der äußeren Oberfläche der
äußeren Membrane sind in unterschiedlichem Maße
Zelloberflächenproteine vorhanden, welche die
Immunantwort des Wirts in wesentlichen beeinflussen.
Es werden daher zur Herstellung von Impfstoffen Fragmente
der äußeren Membrane verwendet, welche die gewünschte
Immunantwort im Wirt hervorrufen. Dazu werden
beispielsweise die äußeren Membranen von Bakterien
isoliert, gereinigt und als Impfstoffe verwendet.
Verfahren zur Isolierung äußerer Membranen sind
beispielsweise beschrieben von H. Nikaido (Methods in
Enzymology, 235, S. 225-234).
Es ist ferner bekannt, daß die Virulenz von Bakterien in
großem Maße von den Bedingungen bestimmt wird, unter
denen sich die Bakterien entwickeln können. J. J.
Mekalanos (J. Bacteriol., 174, S. 1-7) beschreibt
Umweltbedingungen, unter denen die Ausbildung der
Virulenzfaktoren von Bakterien kontrollierbar sind. Die
Bakterien bilden dabei u. a. auf der äußeren Membrane
vermehrt bestimmte Proteine, wie beispielsweise
Lipoproteine aus, welche als OMP (Outer Membrane
Proteine) bezeichnet werden.
Ein besonders wichtiger Keim aus der Reihe der
gramnegativen Bakterien ist Actinobacillus
pleuropneumoniae. Actinobacillus pleuropneumoniae (A.pp.)
gehört in die Familie der Pasteurellaceae und ist der
obligat pathogene Erreger der infektiösen Pleuropneumonie
des Schweines, einer hoch kontagiösen Atemwegserkrankung
mit oft dramatischem Verlauf. A.pp. ist weltweit
verbreitet und führt in der Schweineproduktion zu
erheblichen wirtschaftlichen Verlusten (NICOLET, J. in
LEMAN, A. D. et al. (ed.), Disease of swine, Iowa State
Press, Ames., 401-408 (1992)). Weltweit sind 12
Serotypen von A.pp. anhand ihrer kapsulären
Polysaccharide unterscheidbar (PERRY, M. et al.,
Serodiagn. Immunother. Infect. Dis. 4: 299-308 (1990)).
In Deutschland sind vor allem die Serotypen 2, 3, 7 und 9
von Bedeutung, aber in letzter Zeit traten vermehrt auch
Infektionen mit den Serotypen 5 und 6 auf.
Rekonvaleszente Schweine (Schweine, die eine A.pp.
Infektion überleben) sind im allgemeinen gegen erneute
Erkrankungen geschützt, können aber den Erreger noch über
längere Zeit (Wochen bis Monate) ausscheiden. Die
ausgebildete Immunantwort schützt diese Tiere
serotypübergreifend in Bezug auf das Auftreten einer
klinischen Erkrankung bei Infektionen mit A.pp. (NIELSEN,
R., Nord. Vet. Med. 31, 407-413 (1979), NIELSEN, R.,
Nord. Vet. Med. 36, 221-234 (1984)); eine Neubesiedlung
der Schleimhäute und damit die mögliche Ausscheidung
anderer Serotypen wird jedoch nicht verhindert.
Geimpfte Schweine, die eine inaktivierte Ganzzellvakzine
durch intramuskuläre Applikation erhalten, bilden
vorwiegend Antikörper, die gegen kapsuläre Polysaccharide
gerichtet sind; der induzierte Impfschutz beschränkt sich
auf den A.pp.-Serotyp, der als Grundlage der Vakzine
verwendet wurde. Eine Kreuzprotektion gegen andere
A.pp.-Serotypen wird nicht erreicht. Dieser Gegensatz zwischen
Infektion und Impfung mit inaktivierten Ganzzellvakzinen
zeigt, daß während der Infektion Antigene von A.pp.
exprimiert werden, die zu einer serotypübergreifenden
protektiven Immunität gegen A.pp. beitragen (FENWICK, B.
u. HENRY, S., J. Am. Vet. Med. Assoc., 204, 1334-1340
(1994)).
Die nach herkömmlichen Methoden hergestellten bekannten
Impfstoffe weisen den Nachteil auf, daß ein hoher Anteil
an Fremdproteinen aufwendige Reinigungsoperationen
erfordern. Weiterhin führen die Endotoxine in
herkömmlichen Impfstoffen zu den bekannten
Nebenwirkungen, so daß deren Gehalt in Impfstoffen gering
sein muß.
Die Entfernung der Endotoxine bereitet in vielen Fällen
Probleme, da herkömmliche Impfstoffe häufig kolloidale
Lösungen sind oder aber partikuläre Bestandteile
enthalten.
Daher ist man bei der Impfstoffherstellung auf
Adjuvantien angewiesen, welche in der Lage sind, die
Endotoxine zu binden. Hier kommt in erster Linie
Aluminiumhydroxid zur Anwendung, obwohl dieses Adjuvans
in vielen Fällen nur eine geringe Wirksamkeit hat. Das
hochpotente Emulsigen kann daher in vielen Fällen nicht
angewendet werden.
Ein in der Praxis sehr großer Nachteil der herkömmlichen
Impfstoffe ist es, daß in der serologischen Diagnostik
eine Impfung nicht von einer Infektion mit dem
Krankheitserreger zu unterscheiden ist. Bei der heutigen
Situation der Massentierhaltung wird jedoch auch aus
Gründen des Verbraucherschutzes ein Nachweis gefordert,
daß die Tiere des Bestandes zwar geimpft, aber nicht
infiziert waren. Mit herkömmlichen Impfstoffen ist dieser
Nachweis nicht oder nur schwer zu führen.
Ein Ausweg hieraus ist die Herstellung von rekombinanten
Subunitvakzinen. Diese haben jedoch den Nachteil, daß die
Herstellung sehr kompliziert und äußerst kostenintensiv
ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vakzine
zu schaffen, welche die Nachteile des Standes der Technik
überwindet.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine
nicht rekombinante Subunitvakzine enthaltend
Zelloberflächenproteine erhältlich durch Kultivierung
einer Bakterienkultur und anschließende Anreicherung
protektiver Antigene unter Verwendung von Detergenzien
zur Verfügung gestellt wird.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß man die
Kultivierung der Bakterienkultur unter Streßbedingungen
durchführt. Bevorzugt ist ferner, daß die
Streßbedingungen Mineralstoffmangel und/oder
Nährstoffmangel sind.
Vorteilhaft ist es, wenn man der Bakterienkultur
Mineralstoffe komplexierende Stoffe zusetzt. Es ist
insbesondere bevorzugt, daß man der Bakterienkultur Eisen
komplexierende Stoffe zusetzt. Erfindungsgemäß besonders
bevorzugt ist es, daß man der Bakterienkultur
Komplexbildner ausgewählt aus chelatisierenden
Ionenaustauscherharzen, 2,2'-Dipyridyl, Desferrioxamin,
Alkali- und/oder Erdalkalisalze von Diethylamin
pentaessigsäure, Ethylendiaminotetraessigsäure oder
Nitrilotriessigsäure zusetzt.
Erfindungsgemäß geeignete chelatisierende
Ionenaustauscherharze sind beispielsweise Harze auf einer
Styrol-Divinylbenzol-Copolymer Basis, welche
Iminodiessigsäure-Reste tragen.
Insbesondere bevorzugt ist es ferner, daß man der
Bakterienkultur Trinatrium-Calci
um-Diethylaminopentaessigsäure oder deren Salze zusetzt.
Bevorzugt ist es weiterhin, daß man der Bakterienkultur
ein oder mehrere Monosaccharide, Disaccharide,
Oligosaccharide, Polysaccharide, Aldohexosen,
Ketohexosen, Aldopentosen und/oder Ketopentosen zusetzt.
Bevorzugterweise kann man erfindungsgemäß der
Bakterienkultur Serum und/oder Lungenlavage vom
natürlichen Wirt des Bakteriums zusetzen.
Es ist ferner bevorzugt, daß man die Kultivierung der
Bakterienkultur oberhalb der für diesen Keim
gebräuchlichen Kultivierungstemperatur durchführt.
Erfindungsgemäß ist es vorgesehen, daß man zur
Anreicherung der protektiven Antigene Detergenzien
ausgewählt aus Cholsäure, Cholinsäure, Deoxycholsäure,
Deoxycholinsäure, deren Konjugate mit Glycin oder Taurin
oder deren Alkali- oder Erdalkalisalze sowie nicht
ionischen Detergenzien, anionischen Detergenzien und/oder
zwitterionischen Detergenzien verwendet.
Besonders bevorzugt ist es, daß man zur Anreicherung
Natriumlaurylsulfat, Natrium-N-laurylsarcosinat,
Alkybenzylsulfonate, quaternäre Ammoniumsalze, wie
Cetyltrimethylammoniumbromid, Cholsäure, Deoxycholsäure,
Taurocholsäure, Taurodeoxycholsäure und andere
Gallensäuren und deren Salze, Lithiumdodecylsulfat,
Natriumdodecylsulfat, 3-[N-(3-Cholanamidopropyl)
dimethylammonio]-1-propansulfonat CHAPS), 3-[N-(3-
Cholanamidopropyl)-dimethylammonio]-2-hydroxy-1-
propansulfonat (CHAPSO), N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-
ammonio-1-propansulfonat (Sulfobetain SB 12),
N-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat
(Sulfobetain SB 14), Tergitol®, Brij® 35, Brij® 58,
Genapol® X-080, Nonidet® P40, Synperonic® PE/F 68,
Synperonic® PE/F 127, Thesit®, Triton® X-100, Triton®
X-114, Tween® 20, Tween® 48, Tween® 80, Decanoyl-N-
methylglucamid (MEGA 10), Deoxy BIGCHAP,
n-Dodecylglycosid, n-Dodecylmaltosid, Octanoyl-N-methyl
glucamid (MEGA 8), n-Octylglucosid, Sucrosemonolaurat
und/oder dergleichen sowie deren Mischungen verwendet.
Bevorzugt ist es, daß die Bakterienkultur aus
gramnegativen Bakterien besteht. Erfindungsgemäß
besonders bevorzugte Bakterien sind beispielsweise
Neisseriaceae, wie beispielsweise Moraxella bovis,
Moraxella catarrhalis, Moraxella lacunata, Neisseria
meningitidis, Neisseria gonorrhoeae und Pasteurellaceae,
wie beispielsweise Actinobacillus actinomycetecomitans,
Actinobacillus equuli, Actinobacillus pleuropneumoniae,
Haemophilus Agnii, Haemophilus avium, Haemophilus
influenzae, Haemophilus paragallinarum, Haemophilus
somnus, Haemophilus parasuis, Pasteurella haemolytica,
Pasteurella multocida.
Ganz besonders bevorzugt ist eine Bakterienkultur aus
Actinobacillus pleuropneumoniae.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren
zur Herstellung der erfindungsgemäßen nicht rekombinanten
Subunitvakzine zur Verfügung zu stellen.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur
Herstellung einer nicht rekombinanten Subunitvakzine
enthaltend Zelloberflächenproteine erhältlich durch
Kultivierung einer Bakterienkultur und anschließende
Anreicherung protektiver Antigene unter Verwendung von
Detergenzien.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß man die
Kultivierung der Bakterienkultur unter Streßbedingungen
durchführt. Bevorzugt ist ferner, daß die
Streßbedingungen Mineralstoffmangel und/oder
Nährstoffmangel sind.
Vorteilhaft ist es, wenn man der Bakterienkultur
Mineralstoffe komplexierende Stoffe zusetzt. Es ist
insbesondere bevorzugt, daß man der Bakterienkultur Eisen
komplexierende Stoffe zusetzt. Erfindungsgemäß besonders
bevorzugt ist es, daß man der Bakterienkultur
Komplexbildner ausgewählt aus chelatisierenden
Ionenaustauscherharzen, 2,2'-Dipyridyl, Desferrioxamin,
Alkali- und/oder Erdalkalisalze von Diethylamin
pentaessigsäure, Ethylendiaminotetraessigsäure oder
Nitrilotriessigsäure zusetzt.
Erfindungsgemäß geeignete chelatisierende
Ionenaustauscherharze sind beispielsweise Harze auf einer
Styrol-Divinylbenzol-Copolymer-Basis, welche
Iminodiessigsäure-Reste tragen.
Insbesondere bevorzugt ist es ferner, daß man der
Bakterienkultur Trinatrium-Calci
um-Diethylaminopentaessigsäure oder deren Salze zusetzt.
Bevorzugt ist es weiterhin, daß man der Bakterienkultur
ein oder mehrere Monosaccharide, Disaccharide,
Oligosaccharide, Polysaccharide, Aldohexosen,
Ketohexosen, Aldopentosen und/oder Ketopentosen zusetzt.
Bevorzugterweise kann man erfindungsgemäß der
Bakterienkultur Serum und/oder Lungenlavage vom
natürlichen Wirt des Bakteriums zusetzen.
Es ist ferner bevorzugt, daß man die Kultivierung der
Bakterienkultur oberhalb der für diesen Keim
gebräuchlichen Kultivierungstemperatur durchführt.
Erfindungsgemäß ist es vorgesehen, daß man zur
Anreicherung der protektiven Antigene Detergenzien
ausgewählt aus Cholsäure, Cholinsäure, Deoxycholsäure,
Deoxycholinsäure, deren Konjugate mit Glycin oder Taurin
oder deren Alkali- oder Erdalkalisalze sowie nicht
ionischen Detergenzien, anionischen Detergenzien und/oder
zwitterionischen Detergenzien verwendet.
Besonders bevorzugt ist es, daß man zur Anreicherung
Natriumlaurylsulfat, Natrium-N-laurylsarcosinat,
Alkybenzylsulfonate, quaternäre Ammoniumsalze, wie
Cetyltrimethylammoniumbromid, Cholsäure, Deoxycholsäure,
Taurocholsäure, Taurodeoxycholsäure und andere
Gallensäuren und deren Salze, Lithiumdodecylsulfat,
Natriumdodecylsulfat, 3-[N-(3-Cholanamidopropyl)
dimethylammonio]-1-propansulfonat CHAPS), 3-[N-(3-
Cholanamidopropyl)-dimethylammonio]-2-hydroxy-1-
propansulfonat (CHAPSO), N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-
ammonio-1-propansulfonat (Sulfobetain SB 12),
N-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat
(Sulfobetain SB 14), Tergitol®, Brij® 35, Brij® 58,
Genapol® X-080, Nonidet® P40, Synperonic® PE/F 68,
Synperonic® PE/F 127, Thesit®, Triton® X-100, Triton®
X-114, Tween® 20, Tween® 48, Tween® 80, Decanoyl-N-
methylglucamid (MEGA 10), Deoxy BIGCHAP,
n-Dodecylglycosid, n-Dodecylmaltosid, Octanoyl-N-methyl
glucamid (MEGA 8), n-Octylglucosid, Sucrosemonolaurat
und/oder dergleichen sowie deren Mischungen verwendet.
Bevorzugt ist es, daß die Bakterienkultur aus
gramnegativen Bakterien besteht. Erfindungsgemäß
besonders bevorzugte Bakterien sind beispielsweise
Neisseriaceae, wie beispielsweise Moraxella bovis,
Moraxella catarrhalis, Moraxella lacunata, Neisseria
meningitidis, Neisseria gonorrhoeae und Pasteurellaceae,
wie beispielsweise Actinobacillus actinomycetecomitans,
Actinobacillus equuli, Actinobacillus pleuropneumoniae,
Haemophilus Agnii, Haemophilus avium, Haemophilus
influenzae, Haemophilus paragallinarum, Haemophilus
somnus, Haemophilus parasuis, Pasteurella haemolytica,
Pasteurella multocida.
Ganz besonders bevorzugt ist eine Bakterienkultur aus
Actinobacillus pleuropneumoniae.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist
ein Impfstoff, enthaltend nicht rekombinante
Subunitvakzine enthaltend Zelloberflächenproteine
erhältlich durch Kultivierung einer Bakterienkultur und
anschließende Anreicherung protektiver Antigene unter
Verwendung von Detergenzien, zusammen mit pharmazeutisch
verträglichen Hilfsstoffen, Trägerstoffen, Lösemitteln
und/oder Adjuvantien. In den erfindungsgemäßen
Impfstoffen sind somit die Subunitantigene, welche aus
der erfindungsgemäßen Subunitvakzine gewonnen werden,
enthalten.
Es ist bekannt, daß die Wachstumsbedingungen in vitro
kultivierter pathogener gramnegativer Bakterien einen
bedeutenden Einfluß auf die Expression protektiver
Antigene haben. So bewirkt ein Eisenmangel während des
Wachstums von Actinobacillus pleuropneumoniae (A.pp.) die
Induktion mindestens eines zusätzlichen protektiven
Antigens auf der äußeren Membran (DENEER, H. G. u.
POTTER, A. A., Infect. Immun. 57, 798-804 (1989),
ROSSI-CAMPOS, A. et al., Vaccine 10, 512-518 (1992)). Dieser
Eisenmangel wird bei A.pp. nach dem Stand der Technik
ausschließlich durch Substanzen wie Dipyridil, EDTA oder
EDDA induziert; diese Substanzen scheiden aber aufgrund
ihrer Giftigkeit für die Benutzung bei der
Impfstoffherstellung (Dipyridil) bzw. zu geringer
Selektivität für Fe3+-Ionen (EDTA, EDDA) aus. Auch andere
Substanzen wie zum Beispiel Maltose können bei einigen
A.pp.-Serotypen zumindest ein weiteres OMP (Outer
Membrane Proteine) induzieren (DENEER, H. G. u. POTTER,
A. A., Microb. Pathog. 6, 425-432 (1989)).
Lipoproteine der äußeren Membranen von A.pp. besitzen ein
hohes immunogenes Potential und sind teilweise durch
Änderungen der Wachstumsbedingungen induzierbar, z. B. das
transferrinbindende Protein TfbA (DENEER, H.G. u. A. A.
POTTER, Infect. Immun. 57, 798-804 (1989), ROSSI-CAMPOS,
A. et al., Vaccine 10, 512-518 (1992), GERLACH, G. F. et
al., Infect. Immun. 60, 892-898 (1992), GERLACH, G. F. et
al., Infect. Immun. 61, 565-572 (1993)).
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß sich mehrere
der beschriebenen protektiven Antigene insbesondere von
A.pp., welche Lipoproteine der äußeren Membran sind, als
solche mit Detergenzien aus den Bakterien extrahieren
lassen, ohne eine Bakterienlye zu verursachen. Durch
diese Extraktion wird die Freisetzung einer Vielzahl
weiterer, für die Induktion einer protektiven
Immunantwort nicht relevanter oder sogar störender
Proteine (Fremdproteine) vermieden.
Diese Extraktion protektiver Antigene zur Herstellung
einer nicht rekombinanten Subunitvakzine ist bisher nicht
beschrieben worden. Die Verwendung einer derartigen
Präparation als Vakzine eröffnet zusätzlich die
Möglichkeit einer potentiellen Unterscheidung von
geimpften und infizierten Tieren (Markervakzine).
Die erfindungsgemäße Subunitvakzine weist den Vorteil
auf, daß die Herstellung mit einem einfachen
Extraktionsverfahren mittels eines Detergens erfolgen
kann. Diese Extraktion ist ein einstufiger Schritt und
stellt somit ein einfaches und kostengünstiges Verfahren
dar. Ferner ist der Anteil an Fremdproteinen im Vergleich
zu Ganzzellysaten und auf anderen Wegen hergestellten
Impfstoffen äußerst gering.
Die erfindungsgemäße Subunitvakzine weist den Vorteil
auf, eine Subunitvakzine zu sein, welche nicht mit
rekombinanten Methoden hergestellt wird. Da die
herkömmlichen und technisch einfach durchführbaren
Kultivierungsmethoden angewendet werden, ist die
Herstellung der erfindungsgemäßen Subunitvakzine sehr
wirtschaftlich. Prinzipiell können im wesentlichen die
dem Fachmann bekannten Methoden der Herstellung von
Kulturen wie sie bei der Herstellung von Ganzzellysaten
angewendet werden, gebraucht werden.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Subunitvakzine
ist es, daß der Anteil an Fremdproteinen und
Membranbestandteilen und somit Endotoxinen sehr gering
ist. Durch das Herstellungsverfahren werden nämlich
spezifisch im wesentlichen nur die protektiven Antigene
aus der Membran herausgelöst. Die Membrane selbst und
auch die Bakterienzelle bleiben dabei unbeschädigt. Dabei
ist die erfindungsgemäße Subunitvakzine hoch immunogen.
Die Immunantwort ist wesentlich spezifischer, da weniger
Fremdproteine in der Vakzine enthalten sind.
Die erfindungsgemäße Subunitvakzine hat ferner den
Vorteil, daß die immunogenen Proteine im wesentlichen in
Lösung vorliegen. Die Reinigung von Lösungen ist besser
möglich, als die Reinigung der Suspensionen herkömmlicher
Impfstoffe. Dadurch ist auch die Entfernung von Resten an
Endotoxinen aus der erfindungsgemäßen Subunitvakzine
leichter möglich.
Auch können bei der erfindungsgemäßen Subunitvakzine die
optimalen Adjuvantien verwendete werden. Die Auswahl,
welche bei den herkömmlichen Impfstoffen durch die
erforderliche Eigenschaft der Endotoxinbindung
eingeschränkt war, entfällt bei den erfindungsgemäßen
Subunitvakzinen.
Die erfindungsgemäße Subunitvakzine hat ferner den
Vorteil, als Markervakzine geeignet zu sein. Mit einem
ELISA ist es möglich, eine Infektion mit einem Wildstamm
von einer Impfung mit der erfindungsgemäßen
Subunitvakzine zu unterscheiden. Der mit einem Wildstamm
infizierte Organismus weist nämlich zusätzliche
Antikörper auf, welche keine Entsprechung in der
erfindungsgemäßen Subunitvakzine haben. Somit ist es
möglich, geimpfte von infizierten Organismen zu
unterscheiden.
Die erfindungsgemäße Detergensextraktion erreicht eine
möglichst vollständige Extraktion immunogener Proteine
aus der äußeren Membran, wobei die Bakterienzellen
weitgehend intakt bleiben. Die Struktur der äußeren
Membran wird durch das Detergens gelockert, eine Ruptur
und Bildung von Protein-Detergensmizellen aber
weitgehend, wegen der damit verbundenen Erhöhung des
LPS-Gehaltes (Endotxin) in den Extrakten, vermieden. Nach der
allgemeinen Kinetik von Detergenzien sind für die
Extraktion von Proteinen an der Oberfläche von Membranen
niedrige Detergenskonzentrationen notwendig (HELENIUS, A.
et al. Methods Enzymol. 56, 734-749 (1979)). Die äußere
Membran von Enterobakterien und anderer gramnegativer
Bakterien ist gegenüber einer Extraktion mit nicht
ionischen und schwach ionischen Detergenzien relativ
widerstandsfähig (SCHNAITMAN, C. A. J. Bacteriol. 104,
890-910 (1970); FILIP, C. et al. J. Bacteriol. 115,
717-722 (1977)).
Besonders geeignet sind Detergenzien, welche bereits in
geringer Konzentration in der Lage sind, an der äußeren
Membran der Bakterien verankerte immunogene
Proteinstrukturen zu extrahieren. Zudem ist eine solche
Detergensextraktion direkt in der Flüssigkultur möglich
und ist somit auch für Fermenter anwendbar, um im
wirtschaftlichem Maße Impfstoffe herstellen zu können.
Erfindungsgemäß verwendete Detergenzien können anionisch,
zwitterionisch oder nichtionisch sein. Geeignete
Detergenzien sind beispielsweise Natriumlaurylsulfat,
Natrium-N-laurylsarcosinat, Alkybenzylsulfonate,
quaternäre Ammoniumsalze, wie
Cetyltrimethylammoniumbromid, Cholsäure, Deoxycholsäure,
Taurocholsäure, Taurodeoxycholsäure und andere
Gallensäuren und deren Salze, Lithiumdodecylsulfat,
Natriumdodecylsulfat, 3-[N-(3-Cholanamidopropyl)
dimethylammonio]-1-propansulfonat CHAPS), 3-[N-(3-
Cholanamidopropyl)-dimethylammonio]-2-hydroxy-1-
propansulfonat (CHAPSO), N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-
ammonio-1-propansulfonat (Sulfobetain SB 12),
N-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat
(Sulfobetain SB 14), Tergitol®, Brij® 35, Brij® 58,
Genapol® X-080, Nonidet® P40, Synperonic® PE/F 68,
Synperonic® PE/F 127, Thesit®, Triton® X-100, Triton®
X-114, Tween® 20, Tween® 48, Tween® 80, Decanoyl-N-
methylglucamid (MEGA 10), Deoxy BIGCHAP,
n-Dodecylglycosid, n-Dodecylmaltosid, Octanoyl-N-methyl
glucamid (MEGA 8), n-Octylglucosid, Sucrosemonolaurat und
dergleichen sowie deren Mischungen.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Impfstoffe erfolgt
in an sich bekannter Weise. Dazu wird eine
erfindungsgemäße nicht rekombinante Subunitvakzine
zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen,
Trägerstoffen, Lösemitteln und/oder Adjuvantien gemischt
und sterilisiert. Die Verfahren sind dem Fachmann
bekannt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist
ein diagnostischer Test in Form eines ELISA.
Dieser ELISA wird in an sich bekannter Weise hergestellt.
Als Nachweisantikörper wird beispielsweise biotinyliertes
Anti-Schweine-Konjugat (Ziege-Anti-Schwein-IgG, schwere
und leichte Kette) verwendet. Als Enzymkonjugat zur
Sichtbarmachung wird beispielsweise SA-PO (Streptavidin-Peroxidase)
verwendet. Die Herstellung der ELISA-Platten
und deren Auswertung und Messung sind dem Fachmann
bekannt.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
A.pp.-Flüssigkulturen (PPLO-Medium + IsoVitaleX) wurden
bei 37°C und 180 rpm im Schüttelinkubator angezüchtet.
Bei einer OD660 = 0,2 wurde zur Erzeugung eines
Eisenmangels der Eisenchelator 2,2'-Dipyridil (SIGMA,
D7505) in einer Endkonzentration von 100 µM zum
Wachstumsmedium hin zugegeben und die Kultur unter den
oben genannten Bedingungen für weitere zwei Stunden
inkubiert. Die erreichte OD660 schwankte je nach
A.pp.-Stamm zwischen 0,4 und 0,6. Die Reinheit wurde durch
Ausstrich eines Aliquots aus der Kultur auf PPLO- und
Luria-Agar kontrolliert.
Anschließend wurden die Bakterien schonend
abzentrifugiert, das Wachstumsmedium abgegossen und das
Bakterienpellet in 10 ml Aqua dest. resuspendiert.
Aliquots von 200 µl wurden bis zur weiteren Verwendung
bei -20°C eingefroren.
Die Detergensextraktion der OMP erfolgte in 1,5 ml
Reaktionsgefäßen. Hierzu wurden die Aliquots, falls
notwendig, so verdünnt, daß pro Extraktionsansatz ca. 10
mg Bakterien (Naßgewicht) eingesetzt werden konnten. Die
Bedingungen für die Detergensextraktion wird in den
jeweiligen Beispielen beschrieben. Nach Zugabe des
Extraktionspuffers wurden die Ansätze kurz mittels
Vortex-Schüttler gemischt und im Wasserbad bei unten
beschriebenen Temperaturen für 15 Minuten inkubiert.
Anschließend nach erneutem Mischen der Ansätze wurden die
Bakterienzellen durch Zentrifugation sedimentiert, die
Überstände mit den extrahierten Proteinen abpipettiert.
Die Bakterienzellpellets wurden in 10 mM Tris-HCl pH 8,0,
150 mM NaCl resuspendiert und durch "hot-cold-lysis" oder
mittels "bead beater" weiter aufgeschlossen.
Von jedem A.pp.-Stamm wurde zusätzlich mit Hilfe des
"bead beater" ein Ganzzellysat hergestellt.
Die Proteinkonzentration wurde mittels des BCA-Protein-Assay
(Fa. PIERCE) oder BIORAD-DC-Protein-Assay (Fa.
BIORAD) bestimmt, wobei letzterer weniger sensitiv, aber
unempfindlicher gegenüber Detergenzien ist.
Die gewonnenen Proteinextrakt wurden durch SDS-PAGE (4%
PAG-Sammelgel, 10% PAG-Trenngel) aufgetrennt. Zur
Beurteilung der Proteinprofile erfolgten teilweise eine
Coomassie- oder Silberfärbung der Gele. Weitere Parameter
wurden durch Immunoblotting mit spezifischen Antikörpern
bestimmt. Spezielle Proteine wurden in Western-Blots,
teilweise nach Titration und Dot-Blotting
immunodetektiert. In einigen Fällen erfolgte vor der
SDS-PAGE ein Einengen der Detergensextrakte durch
TCA-Fällung.
In einem Mikrotiterplatten-Assay wurden über den Umsatz
von p-Nitrophenylphosphat die Aktivität der alkalischen
Phosphatase (AP) in den Detergensextraktionen bestimmt.
Die Messung des quantitativen Extraktionserfolges
erfolgte durch Bestimmung der Proteinkonzentration der
Detergensextraktionen, teilweise auch semiquantitativ
nach SDS-PAGE und Coomassie- oder Silberfärbung. Zur
Beurteilung des qualitativen Extraktionserfolges wurden
Immunoblots mit Antikörpern gegen die
transferrinbindenden Proteine TfbA und TfbB von A.pp.
durchgeführt. TfbA ist ein ca. 60 kDa großes Lipoprotein,
das unter Eisenmangelbedingungen verstärkt von A.pp. auf
der Oberfläche der äußeren Membran exprimiert wird
(GERLACH, G. F. et al., Infect. Immun. 60, 892-898
(1992)). Es repräsentiert eines der gewünschten OMP in
den Detergensextrakten.
Das ebenfalls durch Eisenmangel induzierbare TfbB-Protein
von ca. 100 kDa ist dagegen ein integrales Protein der
äußeren Membran (WILKE, M., Diss. med. vet.
Hannover(1996)). Der Nachweis von TfbB in den
Detergensextrakten ist daher ein Zeichen für eine
partielle bzw. vollständige Solubilisierung der äußeren
Membran. In den Immunoblots zum Nachweis der oben
genannten Proteine wurden laboreigene Kaninchensera gegen
rekombinantes TfbA bzw. TfbB (GERLACH, G. F. et al.,
Infect. Immun. 60, 892-898 (1992), WILKE, M., Diss. med.
vet. Hannover(1996)) verwendet. Der Nachweis von
alkalischer Phosphatase(AP)-Aktivität in den
Detergensextrakten wurde als ein Parameter für die Ruptur
der äußeren Membran (Freisetzung des Periplasmas)
eingesetzt.
Immunoblots mit Serum von SPF-Schweinen bzw.
rekonvaleszenten Schweinen geben Auskunft über das
Verhältnis antigener Strukturen in den Detergensextrakten
im Vergleich zu denen in Ganzzellysaten.
Mit dem nicht-ionischen Detergens Tergitol® (NP 40,
SIGMA) in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM NaCl, 3 mM
MgCl2-Puffer wurden an dem A.pp.-Feldisolat C7812
(Serotyp 2) Vorversuche für die allgemeine
Durchführbarkeit des Verfahrens und die Applizierbarkeit
der oben genannten Parameter unternommen. Hierbei wurden
NP 40-Konzentrationen von 0,1-3% untersucht. Als
Extraktionstemperaturen wurden 4°C, 37°C und 42°C
gewählt. In den Versuchen wurden die extrahierten
Proteine mit einer TCA-Fällung angereichert. Schon eine
Konzentration von 0,1% NP 40 erhöhte deutlich den
Proteingehalt in den Detergensextrakten im Vergleich zu
Extrakten, die mit detergensfreiem Puffer hergestellt
wurden. Zudem steigern höhere Temperaturen den
Extraktionserfolg. Die Intaktheit der Bakterienzellen
zeigte sich dadurch, daß sich nach der oben genannten
Extraktion durch Zentrifugation sedimentierte
Bakterienpartikel einfach und klumpenfrei in TBS-Puffer
resuspendieren ließen.
Weitere Versuche wurden mit dem A.pp.-Stamm DM 322/5
(Serotyp 2/IMPFSTOFFWERK DESSAU-TORNAU) durchgeführt.
Dieser Stamm zeichnet sich durch gutes, klumpenfreies
Wachstum in der Flüssigkultur aus.
Es wurden die Salze der Cholin- (SIGMA, C1254) und der
Deoxycholinsäure (DIFCO, 750637) verwendet. Die
Detergensextraktionen wurden wie in Beispiel 1
beschrieben durchgeführt.
In 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA, 100 mM
NaCl-Puffer wurden Extraktionsansätze in einem Volumen von
200 ml mit Detergenskonzentrationen von 0,05% bis 2%
bei 37°C extrahiert.
Eine Erhöhung der Konzentration der Detergenzien bewirkt
einen deutlichen Anstieg der Proteingehalte in den
Detergensextrakten im Vergleich zu Extrakten, die mit
detergensfreiem Puffer hergestellt wurden. TfbA- und
TfbB-Antigene wurden mit den entsprechenden Antikörpern
in Protein-Dot-Blots und Western-Blots nach
SDS-Gelelektrophorese sowohl in Detergensextrakten als auch
den Bakterienzellpellets nach Extraktion
immunodetektiert. Ab einer Konzentration von 1%
Cholsäure und 0,1% Deoxycholsäure erhöht sich deutlich
der Anteil von TfbA in den Detergensextrakten. Bei einer
Konzentration von 0,25% Deoxychol- bzw. 1% Cholsäure
ist zudem eine deutliche Erhöhung der TfbB-Menge in den
Detergensextrakten detektierbar. Die Erhöhung der
detektierbaren TfbB-Proteine korreliert mit einer Zunahme
der Aktivität der alkalischen Phosphatase in den
Detergensextraktionen. Hier erfolgt bei einer
Deoxycholinsäurekonzentration von 0,25% und
Cholinsäurekonzentration von 1% ein abrupter Anstieg des
Umsatzes von p-Nitrophenylphosphat durch die erhöhte
AP-Konzentration. Im Gegensatz hierzu scheinen die
Bakterienzellpelletextrakte an TfbA, TfbB und
AP-Aktivität mit steigender Detergenskonzentration zu
verarmen (Fig. 1).
Fig. 1 zeigt die Ergebnisse der Detergensextraktion von
A.pp.-DM 322/5 mit Na-Salzen von Cholin- und
Deoxycholinsäure. Dargestellt sind die untersuchten
Parameter für die Detergensextrakte (A und C) sowie die
Extrakte der Bakterienzellpellets (B und D). Über den
Diagrammen ist die Auswertung eines Immunoblots
(Protein-Dot-Blot) der jeweiligen Extrakte mit α-TfbA (TfbA) und
α-TfbB (TfbB). Die Säulen geben die Aktivität der AP
gemessen an der Extinktion (OD410) der Gelbfärbung bei
Umsatz von p-Nitrophenylphosphat durch die AP der
Extrakte. Die jeweilige Proteinkonzentration der Extrakte
sowie der tendenzielle Verlauf der Proteinkonzentrationen
(mg/ml) bei steigender Detergenskonzentration (Grade)
sind dargestellt.
Immunoblots der Detergensextrakte und eine
Ganzzellpräparation von DM 322/5 mit Serum von einem
SPF-Schwein und dem Rekonvaleszentenserum C2142 gegen
A.pp.-Serotyp 2 (Titer: 1 : 80) zeigen zudem eine deutliche
Zunahme der immunogenen Strukturen in den
Detergensextraktpräparationen bei steigender
Detergenskonzentration. Einige Banden immunogener
Proteine treten verstärkt schon bei niedrigen
Detergenskonzentration auf.
Die Ergebnisse zeigen, daß schon geringe Detergensmengen
in der Lage sind, auf der äußeren Membran verankerte
Proteine zu extrahieren. Bei zu hoher Detergenskon
zentration erfolgt zumindest bei Cholin- und
Deoxycholinsäure eine Lyse und/oder Ruptur der äußeren
Membran, und damit eine Erhöhung von TfbB sowie der
AP-Aktivität.
Der für die Expression einiger immunogener Strukturen bei
A.pp. notwendige Eisenmangel in Kulturmedium wurde durch
eine Zugabe des Eisenchelators Na3CaDTPA in das
Wachstumsmedium induziert. Die Toxizität des
Eisenchelators Na3CaDTPA (Trinatrium-Calci
um-Diethylaminopentaessigsäure, FLUKA 32325) ist gering.
Na3CaDTPA findet in der Humanmedizin Anwendung als
Antidot in der Therapie der akuten Eisenintoxikation.
Für die Prüfung der Wirksamkeit von Na3CaDTPA wurde der
A.pp.-Stamm DM 322/5, wie unter Beispiel 1 beschrieben,
kultiviert. Na3CaDTPA wurde in den Endkonzentrationen von
50 µM, 100 µM, 150 µM und 200 µM zugegeben. Ein Vergleich
der OD660 bei Zugabe des Chelators und 2 Stunden nach
Zugabe des Chelators zeigten im Vergleich zum
unbehandelten Ansatz eine geringfügige Verringerung der
Wachstumsrate. Immunoblots von Ganzzellysaten der
Na3CaDTPA behandelten Ansätze mit den Antikörpern gegen
TfbA und TfbB zeigten eine deutlich höhere Expression von
TfbA und eine Induktion und Steigerung der Expression von
TfbB bei steigender Na3CaDTPA-Konzentration.
Die Ergebnisse zeigen, daß ein durch Na3CaDTPA erzeugter
Eisenmangel immunogene Strukturen induziert. Na3CaDTPA
ist aufgrund seiner geringen Toxizität für die
Impfstoffherstellung geeignet.
Der für die Expression einiger immunogener Strukturen bei
A.pp. notwendige Eisenmangel in Kulturmedium wurde mit
Desferrioxamin erzeugt.
Für die Prüfung der Wirksamkeit von Desferrioxamin wurde
der A.pp.-Stamm DM 322/5, bis zu einer OD660 von 0,2 in
Schüttelkolben mit Schikanen kultiviert. Aus der
Schüttelkultur wurden 5 Ansätze zu je 4 ml hergestellt
und Desferrioxamin in den Endkonzentrationen von 50 µM,
100 µM, 150 µM und 200 µM zugegeben. Ein Vergleich der
OD660 bei Zugabe des Chelators und 2 Stunden nach Zugabe
des Chelators zeigten im Vergleich zum unbehandelten
Ansatz keine Verringerung der Wachstumsrate. Immunoblots
von Ganzzellysaten der mit Desferrioxamin behandelten
Ansätze mit den Antikörpern gegen TfbA und TfbB zeigten
eine deutlich höhere Expression von TfbA und eine
Induktion und Steigerung der Expression von TfbB (Fig.
2).
Fig. 2 stellt Immunoblots von mit TCA präzipitierten
A.pp.-Flüssigkulturen ohne (-) und mit Zugabe von
Desferrioxamin in den angegebenen Konzentrationen mit
Kaninchenhyperimmunseren gegen TfbA (A) und TfbB (B) dar.
Die Position der spezifischen Banden sind jeweils mit
Pfeilen gekennzeichnet. Molekulargewichtsstandard in kDa.
Die Ergebnisse zeigen, daß Desferrioxamin schon in einer
Konzentration von 50 µM einen absoluten Eisenmangel und
die absolute Induktion immunogener Strukturen auszulösen
vermag.
PPLO-Medium wurde mit einem Mediumzusatz bestehend aus 10
g/l Glutamin, 1 g/l NAD, 26 g/l L-Cystein-HCl, 1 g/l
L-Cystin sowie 200 g/l Glucose gelöst in Aqua dest.
angereichert (1 l PPLO mit 10 ml des Mediumzusatzes).
Die A.pp.-Stämme DM 322/5 (Serotyp 2) und 811/051
(Serotyp 9) (IMPFSTOFFWERK DESSAU-TORNAU) (gutes,
klumpenfreies Wachstum in der Flüssigkultur), wurden in
Flüssigkulturen bis zu einer OD660 = 0,3 im
Schüttelinkubator kultiviert. Na3CaDTPA wurde in einer
Endkonzentration von 150 mM hinzugegeben, und die
Kulturen bis zu einer OD660 = 0,75 für 811/051 und OD660
= 0,64 für DM 322/5 weiterkultiviert. Es folgte die
Zugabe eines Pufferkonzentrates für unterschiedliche
Detergensendkonzentrationen (Cholinsäure 0,5%-1,25%,
Deoxycholinsäure 0,05%-0,125% für 811/051;
Deoxycholinsäure 0,05%-0,125%, Tergitol® 0,05%-0,125%
für DM 322/5). PPLO- Medium enthält 5 g/l NaCl (=
85 mM). Durch die Pufferzugabe wurde das Kulturmedium ca.
10 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl. Extrahiert wurde bei
37°C für 30 Minuten unter Schütteln bei 120 rpm. Die
Bakteriensuspension wurde anschließend zentrifugiert und
die Überstände steril filtriert. Bei der folgenden
Untersuchung dieser Detergensextrakte wurde als weiterer
Parameter durch Immunoblots mit einem Antikörper gegen
ein A.pp. RTX-Toxin der Gehalt an RTX-Toxin in den
Überständen detektiert.
Coomassie-Färbung nach SDS-PAGE der Detergensextrakte
zeigt einen deutlichen Anstieg der Proteinkonzentration
mit zunehmender Detergenskonzentration von Cholin, und
Deoxycholinsäure. Immunoblots zeigen einen Anstieg der
TfbA-Konzentration bei Detergensextraktion im Vergleich
zur einfachen Pufferextraktion ohne Detergens. Zudem war
in allen Detergensextrakten RTX-Toxin nachweisbar.
Allerdings scheinen höhere Konzentrationen von Cholin- oder
Deoxycholinsäure den detektierbaren RTX-Toxinanteil
zu verringern.
Zum Nachweis des immunogenen Potentials der
Detergensextrakte wurden gleiche Volumina von A.pp.-
Flüssigkulturen der Serotypen 2 und 9, die mit und ohne
Eisenmangelinduktion bis zu gleichen OD660-Extinktionen
kultiviert worden waren, sowie ihre Detergensextraktionen
und Überstände mit TCA präzipitiert. Die Proteinpellets
wurden in gleichen Volumina SDS-Spaltpuffers
resuspendiert und mittels SDS-PAGE nach Größe
aufgetrennt.
In Fig. 3 sind die Proteinprofile von Ganzzellysaten von
A.pp.-Flüssigkulturen der Serotypen 2 und 9 nach
Kultivierung mit und ohne Eisenmangelinduktion sowie
ihrer Detergensextraktionen und Kulturüberstände im
Immunoblot mit Rekonvaleszentenserum gegen A.pp.-Serotyp
2 (Fig. 3: A) und in der Coomassie- Färbung nach SDS-PAGE
(Fig. 3: B) dargestellt.
Fig. 3 zeigt die Proteinprofile der A.pp.-Serotypen 2
(S2) und 9 (S9). A: Westernblot nach dem "Screening" mit
einem Rekonvaleszentenserum eines mit A.pp.-Serotyp2
infizierten Schweins; B: SDS-Gel derselben Proben nach
Coomassie-Färbung. 1: Ganzzellysate vor
Eisenmangelinduktion, 2: Ganzzellysate nach
Eisenmangelinduktion, 3: Detergensextraktpräparationen,
4: Kulturüberstände. Der Pfeil kennzeichnet eine durch
Eisenmangel induzierbare Proteinbande. Links neben den
Abbildungen sind jeweils die Positionen des
Molekulargewichtsstandard in kDa dargestellt.
Im Immunoblot mit dem Rekonvaleszentenserum zeigen sich
durch den Vergleich der Bandenmuster der Ganzzellysate
von A.pp.-Flüssigkulturen, die ohne (Spur 1) und mit
(Spur 2) Eisenmangelinduktion kultiviert worden waren,
deutliche Unterschiede in den Proteinprofilen bei beiden
A.pp.-Serotypen. Beispielhaft ist eine durch Eisenmangel
induzierbare Bande bei ca. 65-70 kDa mit einem Pfeil
gekennzeichnet. In den Kulturüberstände nach
Detergensextraktion der gleichen eisenmangelinduzierten
A.pp.-Kulturen (Spur 3) werden vom Rekonvaleszentenserum
deutlich antigene Strukturen erkannt, die teilweise in
ihrer Proteinmenge denen der Ganzzellysate gleichen,
obwohl die Detergensextraktionen gegenüber den
Ganzzellysaten (Spur 2) eine geringere
Gesamtproteinkonzentration aufweisen (siehe Coomassie-Färbung
in Fig. 3B). Im Vergleich hierzu ist im
Immunoblot das Proteinprofil der Kulturüberstände
eisenmangelinduzierter A.pp.-Kulturen (Spur 4) qualitativ
und quantitativ schwächer ausgeprägt.
Die Ergebnisse verdeutlichen, daß sich durch eine
Detergensextraktion von A.pp.-Flüssigkulturen der Anteil
antigener Strukturen in den Kulturüberständen qualitativ
und quantitativ erhöht und sich dadurch das immunogene
Potentials der Detergensextrakte wesentlich an das von
Gesamtzellen annähert.
Impfstoffherstellung:
Für den Impfstoff wurden die 0,075% Deoxycholinextraktion vom A.pp.-Stamm 811/051 (Serotyp 9) und die 0,05% Deoxycholinextraktion vom A.pp.-Stamm DM 322/5 (Serotyp 2) verwendet. Beide Präparationen weisen einen erhöhten Anteil an TfbA im Vergleich zur detergensfreien Extraktion auf. Zudem sind bei diesen niedrigen Detergensextraktionen noch RTX-Toxine gut im Immunoblot nachweisbar. Die LPS-Gehalte waren für die Präparation von A.pp. 811/051 1,2×105 IE/ml sowie 6×105 IE/ml für die DM 322/5 Präparation. Zur Sterilkontrolle wurden je 100 µl der Flüssigkulturen auf PPLO + IsoVitaleX-Agar und Luria-Agar ausgespatelt. Beide Kontrollen waren negativ.
Für den Impfstoff wurden die 0,075% Deoxycholinextraktion vom A.pp.-Stamm 811/051 (Serotyp 9) und die 0,05% Deoxycholinextraktion vom A.pp.-Stamm DM 322/5 (Serotyp 2) verwendet. Beide Präparationen weisen einen erhöhten Anteil an TfbA im Vergleich zur detergensfreien Extraktion auf. Zudem sind bei diesen niedrigen Detergensextraktionen noch RTX-Toxine gut im Immunoblot nachweisbar. Die LPS-Gehalte waren für die Präparation von A.pp. 811/051 1,2×105 IE/ml sowie 6×105 IE/ml für die DM 322/5 Präparation. Zur Sterilkontrolle wurden je 100 µl der Flüssigkulturen auf PPLO + IsoVitaleX-Agar und Luria-Agar ausgespatelt. Beide Kontrollen waren negativ.
Durch SDS-PAGE (4% PAG-Sammelgel; 10% PAG-Trenngel)
wurden die Proteinkonzentrationen der beiden
Detergensextraktpräparationen semiquantitativ bestimmt.
Zur Impfstoffherstellung wurden die Extraktpräparationen
von 811/051 und DM 322/5 im Verhältnis 1 : 2 eingesetzt.
Mit den Detergensextraktpräparationen wurden drei
Impfstofformen hergestellt. Als Adjuvans diente Emulsigen
Plus (MVP LABORATORIES, Ralston, Nebrak., USA). Für eine
1 ml Impfstoffdosis/Tier wurden die Impfstoffe wie folgt
gemischt:
Impfstoff A:
Impfstoff A:
- - 1 : 10 verdünnte Detergensextrakte 811/051 und DM 322/5 im Verhältnis 1 : 2
- - 0,05% Formaldehyd
- - 20% Emulsigen Plus
Impfstoff B:
- - unverdünnte Detergensextrakte (vgl. Impfstoff A)
- - 0,05% Formaldehyd
- - 20% Emulsigen Plus
Impfstoff C:
- - unverdünnte Detergensextrakte (vgl. Impfstoff A)
- - 20% Emulsigen Plus
Versuchsverlauf:
Der Immunisierungsversuch wurde in Anlehnung an die vorläufige Monographie "Vaccinum Actinobacillosis (Actinobacillus pleuropneumoniae) inactivatum ad suem" durchgeführt.
Der Immunisierungsversuch wurde in Anlehnung an die vorläufige Monographie "Vaccinum Actinobacillosis (Actinobacillus pleuropneumoniae) inactivatum ad suem" durchgeführt.
20 Schweine im Alter von 5 Wochen (Firma PIG) wurden
verwendet. Nach den Eingangsuntersuchungen wurden die
Tiere in 2 Gruppen zu 4 Tieren und 1 Gruppe zu 12 Tieren
eingeteilt. Nach dem Einstallen wurden die Schweine mit
30 mg Flubendazol (BELA-PHRAM)/kg Futter über 5 Tage
entwurmt.
5 Tage vor der 1. Immunisierung wurde den Tieren Blut
entnommen (Blutung-0) und mit der Komplementbindungs
reaktion (KBR) mit einem Mischantigen die A.pp.-Serotypen
2, 3, 7 und 9 untersucht. Alle Seren der Tiere waren in
der KBR serologisch A.pp.-negativ.
Im Alter von ca. 8 Wochen, 3 Wochen nach dem Einstallen,
erfolgte die 1. Immunisierung der Schweine, 21 Tage
danach die 2. Immunisierung jeweils mit 1 ml der oben
beschriebenen Vakzinen durch i. m. Injektion in den
Nacken. Einen Tag (Tag: -1) vor der Immunisierung sowie
an den beiden der Immunisierung folgenden Tagen (Tag: +1;
Tag: +2) wurde bei den Tieren rektal die Körpertemperatur
gemessen und das Allgemeinbefinden beurteilt. Am Tag der
Immunisierung (Tag: 0) wurde vor sowie 2, 4 und 8 Stunden
nach der Immunisierung die rektale Körpertemperatur
bestimmt. Um eine zusätzliche Aufregung der Schweine
durch die für die Tiere bisher unbekannte Messung zu
vermeiden, wurde am Tag der 1. Immunisierung auf die
Messung vor der Immunisierung verzichtet. Hier wurde die
Messung des Vortages zugrunde gelegt.
Die 2. Blutentnahme (Blutung-1) erfolgte 2 Tage vor der
2. Immunisierung, die 3. Blutentnahme (Blutung-2)
erfolgte 21 Tage nach der 2. Immunisierung.
Die Seren der Blutungen 1 und 2 wurden in der KBR mit
Misch- und Einzelantigenen gegen die A.pp.-Serotypen 2,
3, 7 und 9 untersucht. Zudem wurden die Seren der Blutung
0, 1 und 2 mit einem laboreigenen A.pp.-RTX
II-Toxin-(APXII)-ELISA untersucht. Weiterhin erfolgte eine
Beurteilung der Antikörperantwort auf die im Versuch
eingesetzten Antigene durch einen ELISA und
Immunoblotting.
Ergebnisse und Auswertung:
Die Mittelwerte für die rektale Körpertemperatur der
Schweine aus den einzelnen Versuchsgruppen sind in
Tabelle 1 wiedergegeben. Am Tag der Impfstoffapplikation
war ein deutlicher Anstieg der Körpertemperatur bei den
Schweinen aller Impfstoffgruppen festzustellen. Vor allem
am Tag der 2. Immunisierung betrug bei einigen Tieren die
Abweichung von der mittleren Normaltemperatur vor der
Impfung über 2°C. Die erhöhte Körpertemperatur am Tag
der Impfung war begleitet von starker Mattigkeit, sehr
ruhigem Verhalten und Inappetenz der Tiere. Bei den 4
Schweinen der Impfstoffgruppe A waren diese Erscheinungen
allerdings nicht so deutlich ausgeprägt.
Alle durch die Immunisierung verursachten klinischen
Erscheinungen waren am Tag nach der Immunisierung wieder
verschwunden. An der Injektionsstelle waren adspektorisch
und palpatorisch keine Auffälligkeiten zu bemerken.
Die Ergebnisse von den Untersuchungen der Seren in der
KBR sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Nach der 1.
Immunisierung waren alle Seren, bis auf zwei Ausnahmen,
in der KBR mit dem Mischantigen der A.pp.-Serotypen 2, 3,
7 und 9 positiv. In der Einzelantigenbestimmung wiesen
einige Tiere geringe Antikörperaktivität gegen die
A.pp.-Antigene vor. Nach der 2. Immunisierung war bei allen
Tieren eine Antikörperaktivität gegen A.pp.-Antigen in
der KBR mit Misch- und Einzelantigen feststellbar. Titer
ab 1 : 10 gelten in der KBR als A.pp.-positiv. Auffallend
war allerdings, daß positive Antikörpertiter in der KBR
vorwiegend gegen das im Impfstoff nicht eingesetzte
Antigen vom A.pp.-Serotyp 3 nachweisbar waren. Weiterhin
fehlte vollständig eine Immunantwort gegen das Antigen
vom A.pp.-Serotyp 9.
Eine nochmalig durchgeführte Serotypisierung der beiden
A.pp.-Stämme, die zur Impfstoffherstellung dienten, ergab
eine nur zweifelhafte Zuordnung des Stammes 811/051.
In der KBR haben nur 50% der Schweine in der
Impfstoffgruppe A (verdünnter Impfstoff) einen positiven
Titer nach der 2. Immunisierung. Sonst zeigt die KBR
keine deutlichen Unterschiede zwischen den
Impfstoffgruppen.
In dem APX II-ELISA, der in der A.pp.-Diagnostik
eingesetzt wird, waren alle Seren aus dem
Immunisierungsversuch negativ, auch die nach der 2.
Immunisierung gewonnenen.
Die Schweine scheinen eine nur geringe Antiköperantwort
gegen die im Impfstoff vorhandenen RTX-Toxine von A.pp.
(Synonym, APX) auszubilden. Das APX II-Toxin wird allen
A.pp.-Serotypen mit Ausnahme des Serotyps 10 exprimiert.
Das Fehlen einer nachweisbaren Immunantwort gegen APX
II-Toxin könnte als Möglichkeit genutzt werden über den APX
II-ELISA geimpfte von natürlich infizierten Tieren zu
unterscheiden.
Zur Beurteilung der Immunantwort der Schweine gegen die
in den Impfstoffen vorhandenen Antigene, wurde ein
spezieller ELISA entwickelt. Hierzu wurden Maxisorp®
Mikrotiterplatten (Nunc) mit 100 µl der Detergensextrakte
der A.pp.-Stämmen DM 322/5 und 811/051 (Verdünnung 1 : 100
mit 50 mM Carbonatpuffer pH 9,6) für 16 Std. bei
Raumtemperatur (RT) beschichtet. Nach 3maligem Waschen
mit 100 µl 150 mM phosphatgepufferter Saline + 0,05%
Tween 20 (PBS+T)/Well wurde für 1 Std. mit 100 µl
Blockpuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05%
Tween 20, 0,005% Gelatine) bei RT inkubiert und die
Platten erneut mit PBS-T gewaschen.
1. Antikörper:
Als erster Antikörper wurden die Schweineseren in Zweierverdünnungsreihen (Anfangsverdünnung: 1 : 100) eingesetzt. Als Positivkontrollen dienten die Seren von rekonvaleszenten Schweinen aus Infektionsversuchen mit dem A.pp.-Stämmen DM2142 (Serotyp 2) und F4714 (Serotyp 9). Die Inkubation dieser Seren erfolgte wiederum bei RT für 1 Std. Nach der Inkubation wurden die Platten dreimal gewaschen.
Als erster Antikörper wurden die Schweineseren in Zweierverdünnungsreihen (Anfangsverdünnung: 1 : 100) eingesetzt. Als Positivkontrollen dienten die Seren von rekonvaleszenten Schweinen aus Infektionsversuchen mit dem A.pp.-Stämmen DM2142 (Serotyp 2) und F4714 (Serotyp 9). Die Inkubation dieser Seren erfolgte wiederum bei RT für 1 Std. Nach der Inkubation wurden die Platten dreimal gewaschen.
2. Antikörper:
Als zweiter Antikörper fand biotinyliertes Anti-Schweine-Konjugat (Ziege-Anti-Schwein-IgG, schwere und leichte Kette, Fa. Dianova, Hamburg; Ver dünnung:1 : 5000) Verwendung. Die Inkubation und der Waschgang erfolgten unter den schon erwähnten Bedingungen.
Als zweiter Antikörper fand biotinyliertes Anti-Schweine-Konjugat (Ziege-Anti-Schwein-IgG, schwere und leichte Kette, Fa. Dianova, Hamburg; Ver dünnung:1 : 5000) Verwendung. Die Inkubation und der Waschgang erfolgten unter den schon erwähnten Bedingungen.
Enzymkonjugat:
Jedes Well wurde mit 100 µl SA-PO (Streptavidin-Peroxidase, Fa. Dianova, Hamburg; Verdünnung: 1 : 40.000) gefüllt und wie vorher inkubiert.
Jedes Well wurde mit 100 µl SA-PO (Streptavidin-Peroxidase, Fa. Dianova, Hamburg; Verdünnung: 1 : 40.000) gefüllt und wie vorher inkubiert.
Substrat:
Nach den letzten Waschschritten wurden 100 µl gebrauchsfertige Substratlösung je Well einpipettiert und unter Schütteln bei 37°C inkubiert.
Nach den letzten Waschschritten wurden 100 µl gebrauchsfertige Substratlösung je Well einpipettiert und unter Schütteln bei 37°C inkubiert.
Auswertung:
10 min nach Zugabe des Substrates erfolgte eine bichromatische Messung der Extinktionen bei 410 nm gegen 490 nm Referenzwellenlänge mittels Photometers.
10 min nach Zugabe des Substrates erfolgte eine bichromatische Messung der Extinktionen bei 410 nm gegen 490 nm Referenzwellenlänge mittels Photometers.
Die Datenauswertung erfolgte durch ein PC-gestütztes
Auswertungsprogramm nach der Referenzstandard-Methode.
Als Referenzstandard wurde das Rekonvaleszentenserum
F4714 (Serotyp 9) genommen. Die Ergebnisse für die
einzelnen Impfstoffgruppen sind in Fig. 4 graphisch
dargestellt. Die Tiere aller drei Impfstoffgruppen zeigen
eine deutliche Antikörperbildung gegen die im ELISA
verwendeten Antigene von beiden Detergensextraktionen.
Die Ergebnisse der ELISA-Titer-Messung spiegeln
allerdings nur die Antiköperantwort auf das
Antigengemisch in den Detergenzextrakten wieder. Dennoch
stellt die Höhe der Antikörpertiter im ELISA eine
positive Tendenz für eine protektive Wirkung der
Impfstoffe dar.
Fig. 4 zeigt ELISA mit Antigenen der Detergensextrakte in
den Impfstoffen. Dargestellt sind die Auswertungen der
ELISAs mit Antigenen der Detergensextrakte von DM322/5
(A, C, E) und der Detergensextrakte von 811/051 (B, D,
F). Gezeigt sind der Median (9), das Minimum (t) und das
Maximum (s) der gemittelten, logarithmierten ELISA-Units
(log EU) für die Immunseren der Impfstoffgruppe A (A, B),
B (C, D) und C (E; F).
Für die qualitative Bewertung des Immunisierungserfolges
wurden die Immunseren der Schweine mit dem Multiscreen
Block (BIORAD) auf Antikörperbildung gegen TfbA
untersucht. Hierzu wurde rekombinantes TfbA von
A.pp.-Serotyp 7 mittels SDS-PAGE (12,5 µg TfbA/Gel) aufgetrennt
und auf Nitrocellulosemembranen elektrotransferiert.
Anschließend erfolgte das Immunoscreening mit den
Immunseren in einer Verdünnung von 1:100 mit 3 M
Harnstoff-TBS-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM
NaCl, 0.05% Tween 20) unter Nutzung der oben genannten
Apparatur. Der Zusatz von Harnstoff diente der Hemmung
von unspezifischer Immunglobulinbindung an die Proteine
auf den Nitrocellulosemembranen, die sich durch den
erhöhten Immunglobulinspiegel nach Immunisierungen
zwangsläufig ergibt. Die spezifische Antikörperbindung
wird durch diese "stringenten" Bedingungen deutlicher.
Als Positivkontrollen dienten anti-TfbA-Hyperimmunserum
vom Kaninchen (Verdünnung 1 : 500) und wiederum die Seren
von rekonvaleszenten Schweinen aus Infektionsversuchen
mit dem A.pp.-Stämmen DM2142 (Serotyp 2) und F4714
(Serotyp 9) (Verdünnung 1 : 200). Das Ergebnis dieses
Immunoscreenings ist in Fig. 5 dargestellt.
Fig. 5 zeigt die Immunoblots mit Immunseren. Dargestellt
sind Westernblots mit rekombinantem TfbA vom
A.pp.-Serotyp 7 nach dem "Screening" mit den Immunseren.
Positivkontrollen sind anti-TfbA-Hyperimmunserum vom
Kaninchen (anti-TfbA) und die Seren von rekonvaleszenten
Schweinen aus Infektionsversuchen mit dem A.pp.-Stämmen
DM2142 (Serotyp 2) und F4714 (Serotyp 9). Für die
Schweine der einzelnen Impfstoffgruppen (T) sind in der
1. Spur von links das Serum der Blutung-0, in der 2. Spur
der Blutung-1 und in der 3. Spur der Blutung-2
aufgetragen worden. Die Position der TfbA-spezifischen
Bande wird jeweils durch den Pfeil gekennzeichnet. Links
neben den Westernblots sind jeweils die Positionen des
Molekulargewichtsstandard durch Balken gekoppelt mit dem
Wert des Molekulargewichtes in kDa dargestellt.
Alle Tiere wiesen teilweise schon nach der ersten
Immunisierung eine mehr oder minder starke Immunantwort
gegen das TfbA Antigen auf. Bei 6 Tieren der
Impfstoffgruppe B (50%) war diese sehr deutlich. Nur je
ein Tier der anderen beiden Impfstoffgruppen zeigte eine
deutlichere Immunantwort gegen TfbA.
Die Immunseren wurden zusätzlich im Immunoblot gegen die
Antigene der Detergensextrakte der Impfstoffe sowie der
Ganzzellysate der A.pp.-Stämme, die zur
Extraktpräparation dienten, eingesetzt. Neben der in den
Immunoblots gut erkennbaren Antikörperantwort gegen die
Antigene, war im Immunoblot gegen das Impfstoffantigen
zusätzlich feststellbar, daß die mit Impfstoff C (nicht
formalinaktiviert) immunisierten Schweinen im Vergleich
zu den mit den anderen Impfstoffen immunisierten Tieren
eine stärkere Reaktion mit LPS aufweisen.
Zum Nachweis der universellen Anwendbarkeit der
Detergensextraktionsmethode auf andere gram-negative
Bakterien wurde ein E.coli-Modell gewählt. Dabei wurde
auf einen E.coli-Stamm HB 101 zurückgegriffen, der mit
dem Expressionsvektor pTF205/E1 transformiert worden war,
in dem das TfbA-Gen von A.pp.-Serotyp 7 unter Kontrolle
des tac-Promotors kloniert wurde. Nach einer Induktion
mit IPTG (Isopropylthiogalaktosid), wird das rekombinante
TfbA auf der äußeren Membran der E.coli-Transformanten
überexprimiert. Als Kontrolle diente ein HB101-Stamm,
der mit dem Expressionsvektor pGH 433 ohne TfbA-Gen
transformiert wurde.
E.coli-Transformanten wurden in Luria-Medium ergänzt mit
Ampicillin (100 µg/ml) über Nacht bei 37°C im
Schüttelinkubator kultiviert. Je 4% dieser 'Über
Nacht-Kulturen' werden erneut in Luria-Medium und Ampicillin
inokuliert und bei 37°C im Schüttelinkubator
weiterkultiviert. Bei einer OD660 = 0,4 wurden die
Kulturen geteilt und jeweils einmal ohne IPTG und einmal
mit ITPG (Endkonzentration 10 µM) weiterkultiviert. Aus
einem Aliquot dieser Kulturen wurde mittels "bead beater"
ein Ganzzellysat sowie aus einem weiteren durch
Zentrifugation der Kulturüberstand gewonnen. Anschließend
wurde die IPTG-induzierte HB101 pTF205/E1-Kultur in
Schikanekolben zu gleichem Volumen aufgeteilt und wie in
Beispiel 3 beschrieben, mit dem Detergens
Deoxycholinsäure in Konzentrationen von 0,05%, 0,1% und
0,2% extrahiert.
In Fig. 6 ist der Immunoblot von Proteinpräparationen der
E.coli-Transformanten pGH433 und pTF205/E1 mit
Kaninchenhyperimmunserum gegen rekombinantes TfbA (A)
gezeigt. Aufgetragen wurden Ganzzellysate ohne IPTG
Induktion (Spur 1) sowie mit IPTG-Induktion (Spur 2),
Tris-NaCl-Puffer-extrahierte (Spur 4) sowie mit
Deoxycholinsäure extrahierte IPTG-induzierte E. coli
Kulturen (Spur 5: 0,05%, Spur 6: 0,1%, Spur 6: 0,2%
Deoxycholinsäure). In B ist das Coomassie-gefärbte Gel
nach SDS-Gelelektrophorese der gleichen Proben gezeigt.
In Spur M wurde ein Molekulargewichtmarker aufgetragen.
Die Markerbanden sind von oben 108 kDa, 80 kDa, 50 kDa,
34 kDa, 27 kDa und 17 kDa.
In Fig. 6 sind je 12 µl Aliquote der Ganzzellysate der
pGH433-Transformanten und der pTF205/E1-Transformanten
mit und ohne IPTG-Induktion sowie die Detergensextrakte
von den IPTG induzierten pTF205/E1-Transformanten im
Immunoblot nach SDS-PAGE mit Kaninchenhyperimmunserum
gegen rekombinantes TfbA von APP-Serotyp 7 (A) und im
Coomassie-gefärbten Gel (B) dargestellt.
Im Vergleich hierzu erkennt man in Fig. 3A deutlich die
Expression des TfbA und seine Überexpression bei
IPTG-Induktion in den pTF205/E1-Transformanten (vgl. Spur 1
und 3 von pGH433 mit 1 und 3 von pTF205/E1). Durch den
Vergleich der Proteinanteile der Ganzzellysate in der
Kultur mit denen der Überstände wird deutlich, daß der
überwiegende Anteil von TfbA an die E.coli-Bakterien
zellen gebunden ist (Spur 1+2, Spur 3+4 von
pTF205/E1). In Spur 5-8 von pTF205/E1 ist der
Extraktionserfolg durch die Detergensextraktion mit
steigender Detergensmenge dargestellt.
Claims (33)
1. Nicht rekombinante Subunitvakzine enthaltend
Zelloberflächenproteine erhältlich durch Kultivierung
einer Bakterienkultur und anschließende Anreicherung
protektiver Antigene unter Verwendung von
Detergenzien.
2. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung der
Bakterienkultur unter Streßbedingungen durchführt.
3. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß die Streßbedingungen
Mineralstoffmangel und/oder Nährstoffmangel sind.
4. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur
Mineralstoffe komplexierende Stoffe zusetzt.
5. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur
Eisen komplexierende Stoffe zusetzt.
6. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß einem der
Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man
der Bakterienkultur Komplexbildner ausgewählt aus
chelatisierenden Ionenaustauscherharzen,
2,2'-Dipyridyl, Desferrioxamin, Alkali- und/oder
Erdalkalisalze von Diethylaminpentaessigsäure,
Ethylendiaminotetraessigsäure oder
Nitrilotriessigsäure zusetzt.
7. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß einem der
Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man
der Bakterienkultur Trinatrium-Calcium-Die
thylaminopentaessigsäure oder deren Salze zusetzt.
8. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß mindestens
einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur ein oder
mehrere Monosaccharide, Disaccharide,
Oligosaccharide, Polysaccharide, Aldohexosen,
Ketohexosen, Aldopentosen und/oder Ketopentosen
zusetzt.
9. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß mindestens
einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur Serum
und/oder Lungenlavage vom natürlichen Wirt des
Bakteriums zusetzt.
10. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß mindestens
einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Kultivierung der
Bakterienkultur oberhalb der für diesen Keim
gebräuchlichen Kultivierungstemperatur durchführt.
11. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß mindestens
einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man zur Anreicherung der
protektiven Antigene Detergenzien ausgewählt aus
Cholsäure, Cholinsäure, Deoxycholsäure,
Deoxycholinsäure, deren Konjugate mit Glycin oder
Taurin oder deren Alkali- oder Erdalkalisalze sowie
nicht-ionischen Detergenzien, anionischen
Detergenzien und/oder zwitterionischen Detergenzien
verwendet.
12. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß Anspruch 11,
dadurch gekennzeichnet, daß man zur Anreicherung
Natriumlaurylsulfat, Natrium-N-laurylsarcosinat,
Alkybenzylsulfonate, quaternäre Ammoniumsalze, wie
Cetyltrimethylammoniumbromid, Cholsäure,
Deoxycholsäure, Taurocholsäure, Taurodeoxycholsäure
und andere Gallensäuren und deren Salze,
Lithiumdodecylsulfat, Natriumdodecylsulfat, 3-[N-(3-
Cholanamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat
CHAPS), 3-[N-(3-Cholanamidopropyl)-dimethylammonio]-
2-hydroxy-1-propansulfonat (CHAPSO), N-Dodecyl-N,N-
dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (Sulfobetain SB
12), N-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-
propansulfonat (Sulfobetain SB 14), Tergitol®, Brij®
35, Brij® 58, Genapol® X-080, Nonidet® P40,
Synperonic® PE/F 68, Synperonic® PE/F 127, Thesit®,
Triton® X-100, Triton® X-114, Tween® 20, Tween® 48,
Tween® 80, Decanoyl-N-methylglucamid (MEGA 10), Deoxy
BIGCHAP, n-Dodecylglycosid, n-Dodecylmaltosid,
Octanoyl-N-methylglucamid (MEGA 8), n-Octylglucosid,
und/oder Sucrosemonolaurat sowie deren Mischungen
verwendet.
13. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß mindestens
einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die Bakterienkultur aus
gramnegativen Bakterien besteht.
14. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß mindestens
einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet,
daß die Bakterienkultur aus Neisseriaceae, wie
Moraxella bovis, Moraxella catarrhalis, Moraxella
lacunata, Neisseria meningitidis, Neisseria
gonorrhoeae oder Pasteurellaceae, wie Actinobacillus
actinomycetecomitans, Actinobacillus equuli,
Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus Agnii,
Haemophilus avium, Haemophilus influenzae,
Haemophilus paragallinarum, Haemophilus somnus,
Haemophilus parasuis, Pasteurella haemolytica,
Pasteurella multocida besteht.
15. Nicht rekombinante Subunitvakzine gemäß mindestens
einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die Bakterienkultur aus
Actinobacillus pleuropneumoniae besteht.
16. Verfahren zur Herstellung nicht rekombinanter
Subunitvakzine enthaltend Zelloberflächenproteine
gemäß Anspruch 1, in dem man eine Bakterienkultur
kultiviert und anschließend protektive Antigene unter
Verwendung von Detergenzien anreichert.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Bakterienkultur unter Streßbedingungen
kultiviert.
18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
daß die Streßbedingungen Mineralstoffmangel und/oder
Nährstoffmangel sind.
19. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
daß man der Bakterienkultur Mineralstoffe
komplexierende Stoffe zusetzt.
20. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
daß man der Bakterienkultur Eisen komplexierende
Stoffe zusetzt.
21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 oder 18,
dadurch gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur
Komplexbildner ausgewählt aus chelatisierenden
Ionenaustauscherharzen, 2,2'-Dipyridyl,
Desferrioxamin, Alkali- und/oder Erdalkalisalze von
Diethylaminpentaessigsäure, Ethylendiamino
tetraessigsäure oder Nitrilotriessigsäure zusetzt.
22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 20,
dadurch gekennzeichnet, daß man der Bakterienkultur
Trinatrium-Calcium-Diethylaminopentaessigsäure oder
deren Salze zusetzt.
23. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 16 bis
22, dadurch gekennzeichnet, daß man der
Bakterienkultur ein oder mehrere Monosaccharide,
Disaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide,
Aldohexosen, Ketohexosen, Aldopentosen und/oder
Ketopentosen zusetzt.
24. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 16 bis
23, dadurch gekennzeichnet, daß man der
Bakterienkultur Serum und/oder Lungenlavage vom
natürlichen Wirt des Bakteriums zusetzt.
25. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 16 bis
24, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung
der Bakterienkultur oberhalb der für diesen Keim
gebräuchlichen Kultivierungstemperatur durchführt.
26. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 16 bis
25, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Anreicherung
der protektiven Antigene Detergenzien ausgewählt aus
Cholsäure, Cholinsäure, Deoxycholsäure,
Deoxycholinsäure, deren Konjugate mit Glycin oder
Taurin oder deren Alkali- oder Erdalkalisalze sowie
nicht-ionischen Detergenzien, anionischen
Detergenzien und/oder zwitterionischen Detergenzien
verwendet.
27. Verfahren gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet,
daß man zur Anreicherung Natriumlaurylsulfat,
Natrium-N-laurylsarcosinat, Alkybenzylsulfonate,
quaternäre Ammoniumsalze, wie
Cetyltrimethylammoniumbromid, Cholsäure,
Deoxycholsäure, Taurocholsäure, Taurodeoxycholsäure
und andere Gallensäuren und deren Salze,
Lithiumdodecylsulfat, Natriumdodecylsulfat, 3-[N-
(3-Cholanamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat
CHAPS), 3-[N-(3-Cholanamidopropyl)-dimethylammonio]-
2-hydroxy-1-propansulfonat (CHAPSO), N-Dodecyl-N,N-
dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat (Sulfobetain SB
12), N-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-
propansulfonat (Sulfobetain SB 14), Tergitol®, Brij®
35, Brij® 58, Genapol® X-080, Nonidet® P40,
Synperonic® PE/F 68, Synperonic® PE/F 127, Thesit®,
Triton® X-100, Triton® X-114, Tween® 20, Tween® 48,
Tween® 80, Decanoyl-N-methylglucamid (MEGA 10), Deoxy
BIGCHAP, n-Dodecylglycosid, n-Dodecylmaltosid,
Octanoyl-N-methylglucamid (MEGA 8), n-Octylglucosid,
und/oder Sucrosemonolaurat sowie deren Mischungen
verwendet.
28. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 16 bis
27, dadurch gekennzeichnet, daß man eine
Bakterienkultur aus gramnegativen Bakterien
verwendet.
29. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 16 bis
28, dadurch gekennzeichnet, daß man eine
Bakterienkultur aus Neisseriaceae, wie Moraxella
bovis, Moraxella catarrhalis, Moraxella lacunata,
Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae oder
Pasteurellaceae, wie Actinobacillus
actinomycetecomitans, Actinobacillus equuli,
Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus Agnii,
Haemophilus avium, Haemophilus influenzae,
Haemophilus paragallinarum, Haemophilus somnus,
Haemophilus parasuis, Pasteurella haemolytica,
Pasteurella multocida verwendet.
30. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 16 bis
29, dadurch gekennzeichnet, daß man eine
Bakterienkultur aus Actinobacillus pleuropneumoniae
verwendet.
31. Impfstoff, enthaltend nicht rekombinante
Subunitantigene gemäß Anspruch 1 zusammen mit
pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen,
Trägerstoffen, Lösemitteln und/oder Adjuvantien.
32. Impfstoff, enthaltend nicht rekombinante
Subunitantigene gemäß mindestens einem der Ansprüche
13 bis 15 zusammen mit pharmazeutisch verträglichen
Hilfsstoffen, Trägerstoffen, Lösemitteln und/oder
Adjuvantien.
33. Diagnostischer Test in Form eines ELISA, umfassend
als Antikörper biotinyliertes Anti-Schweine-Konjugat
(Ziege-Anti-Schwein-IgG, schwere und leichte Kette)
und als Enzymkonjugat SA-PO
(Streptavidin-Peroxidase).
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|---|---|---|---|
| DE19753176A DE19753176C2 (de) | 1997-11-20 | 1997-11-20 | Nicht rekombinante Subunitvakzine |
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|---|---|---|---|
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ID=7850344
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|---|---|---|---|
| DE19753176A Expired - Fee Related DE19753176C2 (de) | 1997-11-20 | 1997-11-20 | Nicht rekombinante Subunitvakzine |
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| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19753176C2 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014172435A1 (en) * | 2013-04-16 | 2014-10-23 | University Of Cincinnati | Antimicrobial compositions of aminoglycosidic antibiotics and zinc ion chelators |
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| EP0037931A2 (de) * | 1980-04-14 | 1981-10-21 | Europäisches Laboratorium Für Molekularbiologie (Embl) | Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Membranprotein-aggregats von Influenza-, Parainfluenza- und Rhabdo-Viren |
| DD242716A3 (de) * | 1981-08-28 | 1987-02-11 | Adw Der Ddr Inst F Chem Techno | Verfahren zur herstellung von gereinigten antigenen bzw. biopraeparaten |
| US4845036A (en) * | 1987-02-03 | 1989-07-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Process for isolation of the B oligomer of pertussis toxin |
-
1997
- 1997-11-20 DE DE19753176A patent/DE19753176C2/de not_active Expired - Fee Related
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| WPIDS 91-117748(17)/AN (Abstract zu AU 9061356 A) * |
| WPIDS 97-281314(26)/AN (Abstract zu AU 9534351 A) * |
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| WO2014172435A1 (en) * | 2013-04-16 | 2014-10-23 | University Of Cincinnati | Antimicrobial compositions of aminoglycosidic antibiotics and zinc ion chelators |
| US9821063B2 (en) | 2013-04-16 | 2017-11-21 | University Of Cincinnati | Antimicrobial compositions of aminoglycosidic antibiotics and zinc ion chelators specifically formulated for enhanced inhibition of bacterial colonization and antibacterial efficacy |
| US10124064B2 (en) | 2013-04-16 | 2018-11-13 | University Of Cincinnati | Antimicrobial compositions of aminoglycosidic antibiotics and zinc ion chelators specifically formulated for enhanced inhibition of bacterial colonization and antibacterial efficacy |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE19753176C2 (de) | 2000-04-27 |
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