DE19743330A1 - Verfahren zur Gewinnung von Hämin aus Schlachtblut - Google Patents

Description

Aus der Literatur (z. B. Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie, Hrsg. W. Forth, D. Henschler, et al., 5. Aufl., B1 Wissenschaftsverlag, Mannheim, 1987, S. 389ff.) ist bekannt, daß Hämeisen zur Eisenfortifikation geeignet ist. Der Vorteil von Hämeisen im Gegensatz zu dem in der Nahrung enthalte­ nen Eisen ist darin zu sehen, daß das Eisen in der Nahrung überwiegend als Non-Hämeisen vorliegt, dessen Verfügbarkeit durch pflanzliche Nahrungsliganden (Phytate, Oxalate, Tanine usw.) herabgesetzt ist. Diesen Resorptionseinschränkungen unterliegt Hämeisen nicht, das zudem in hohen Dosen die Darmschleimhaut erheblich weniger reizt und dadurch besser verträg­ lich ist.

In der Literatur ist allerdings bisher noch kein Ver­ fahren bekannt geworden, mit dem Häminpräparate mit einem entsprechend hohen Gehalt an Globin hergestellt werden können. Aus Ital. J. Gastroenterol. 27, 167, 1995, "Intestinal transfer of different haemin prepa­ rations in vitro", einem Artikel von K. Schümann und A. Mäurer, et al. ist lediglich bekannt geworden, daß Hämeisen zur Eisenfortifikation geeignet ist, und daß es durch Säurehydrolyse hergestellt werden kann.

Ausgehend hiervon, ist es die Aufgabe der vorliegen­ den Erfindung, ein Verfahren zur Gewinnung von Hämei­ sen vorzuschlagen, das zur Eisenfortifikation geeig­ net ist, wobei das hergestellte Häminpräparat einen hohen Gehalt an Globin (Protein) enthalten soll.

Die Aufgabe wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Patentanspruchs 1 gelöst. Die Unteransprüche zei­ gen vorteilhafte Weiterbildungen auf.

Erfindungsgemäß wird somit vorgeschlagen, ausgehend von Schlachtblut, eine Säurebehandlung unter genau definierten Bedingungen durchzuführen. Erfindungsge­ mäß wird vorgeschlagen, das Schlachtblut zur Trennung des Hämins vom Globinanteil einer Säurebehandlung bei pH 1,2 bis 3 bei 45 bis 80°C zu unterziehen. Es hat sich herausgestellt, daß nur unter diesen genau be­ stimmten Bedingungen ein entsprechendes Häminpräparat erhalten wird.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist es dabei bevor­ zugt, daß vor der Säurebehandlung eine Trennung des Schlachtbluts in Dickblut und eine Plasmafraktion vorgenommen wird, und daß dann die Säurebehandlung nur beim Dickblut durchgeführt wird.

Besonders bevorzugt ist es, wenn die Säurebehandlung bei einem pH von 1,3 bis 2,0 und bei einer Temperatur von 60 bis 75°c erfolgt. Beim erfindungsgemäßen Ver­ fahren ist es weiterhin bevorzugt, wenn das Hämin vom Globin erst nach einer bestimmten Agglomerationszeit, bevorzugt nach einer Zeit von 15 Minuten bis 2 Stun­ den, besonders bevorzugt nach 30 Minuten bis 1,5 Stunden, abgetrennt wird. Es hat sich weiterhin ge­ zeigt, daß es zur Maximierung des Hämingehalts im Präparat vorteilhaft ist, mit relativ verdünnten Lö­ sungen (bevorzugter Konzentrationsbereich 2 bis 10%) und verlängerten Aggregationszeiten (bis 1 Stunde) zu arbeiten. Dadurch erhöht sich auch gleichzeitig die Häminabtrennbarkeit und Ausbeute pro Fällansatz, so daß bei verbesserter Produktqualität kein Durchsatz­ verlust eintritt. Als optimalste Parameter für die Säurespaltung und anschließende Polymerisation des Hämins wurden ermittelt: Hämin-Globin-Konzentration 3,5%, pH-Wert 1,5, Temperatur 72°C und Reaktions­ zeit 50 Minuten.

Eine weitere Verfahrensvariante sieht vor, daß vor der Hämintrocknung die jeweils nach dem letzten Ver­ fahrensschritt durchgeführt werden muß, eine Disso­ ziation der Häminaggregate durch Ultraschall erfolgt, um die gute Bioverfügbarkeit weiter zu verbessern. Dazu kann das feuchte Häminprodukt für 5 bis 60 Minu­ ten, bevorzugt für 15 Minuten, im Ultraschallbad be­ handelt und anschließend im Gefriertrockner getrock­ net werden.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht insbesondere darin, daß eine Verwertung des Kosten verursachenden Abfallproduktes Schlachtblut zu einer entfärbten Globinfraktion und einem eisenhaltigen Häminprodukt möglich wird. Das mit dem erfindungsge­ mäßen Verfahren hergestellte Häminprodukt weist zudem eine hohe Eisenbioverfügbarkeit auf und eröffnet fol­ gende Anwendungsmöglichkeiten:

• - Zusatzstoff zur Eisenfortifikation von pflanzli­ cher Nahrung für Menschen (Lebensmittelzusatz­ stoff, insbesondere für Dritte-Welt-Diät) und von Tierfutter (z. B. bei der Schweinemast),
• - Pharmazeutische Eisenpräparate mit guter Ver­ träglichkeit.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat weiterhin den Vor­ teil, daß durch die gewählten Prozeßbedingungen eine wirksame Inaktivierung möglicherweise vorhandener pathogener Bakterien/Keime und Viren im Schlachtblut eintritt. Außerdem werden die Produktqualität min­ dernde Abbauenzyme (Proteasen etc.) inaktiviert. Auf­ grund der erhalten gebliebenen natürlichen Bindung des Eisens im Hämin (Komplexierung durch Protoporphy­ rin-Ring) erweist sich das starke katalytische Poten­ tial des Eisens bezüglich Fettsäureoxidation und Aminsäureabbau als unbedenklich.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Fig. 1 und mehreren Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Fig. 1 zeigt beispielhaft den Verfahrensablauf zur Gewinnung von Hämin mit einer Reinheit von <50% für den Fall, daß vor der Säurebe­ handlung eine Auftrennung in Dickblut und eine Plasmafraktion erfolgt.

Wie aus Fig. 1 hervorgeht, wird demnach das Blut, das vorteilhafterweise mit Citrat stabilisiert ist, zentrifugiert und dann die Plasmafraktion von dem Dickblut getrennt. Nach einem Waschschritt mit Koch­ salzlösung wird das Dickblut eingefroren.

Zur Säurehydrolyse wird das so hergestellte Dickblut mit einer 0,1 normalen HCl versetzt, so daß eine Hä­ minfällung eintritt. Zur Abtrennung der Globinlösung vom Hämschlamm wird eine Zentrifugation durchgeführt. Der Hämschlamm wird dann mit demineralisiertem Wasser gewaschen und ggf. einer Ultraschallbehandlung unter­ zogen. Zum Abschluß erfolgt eine Trocknung.

Herstellungsbeispiele 1. Kleiner Laboransatz

50 ml Blut werden 15 Minuten bei 3.300 g zentrifu­ giert. Es bilden sich 12 ml Dickblut (Erythrozyten) und 38 ml farbloses Blutplasma. Die Erythrozyten wer­ den zweimal mit je 40 ml 0,9%iger NaCl nachgewaschen und zentrifugiert. Das gewaschene Dickblut (20 g) wird mit 30 g deionisiertem Wasser aufgefüllt und bei -70°C schockgefroren. Nach 3 Stunden wird es bei Raumtemperatur aufgetaut, die Erythrozytenmembranen (Ghosts) abzentrifugiert und der Überstand, die Hämo­ globinlösung, in einen 250 ml Erlenmeyerkolben über­ führt. Auf einem Magnetrührer mit Heizplatte wird die tiefrote Lösung mit 1 normaler HCl auf pH 1,5 einge­ stellt und nach Erreichen von 71°C für 30 min unter schwachem Rühren (150 Umin^-1) bei der Temperatur ge­ halten. Nach Abkühlen ohne Rühren bildet sich ein Sediment, der Hämschlamm, der in der Zentrifuge für 15 min bei 3.300 g abzentrifugiert wird. Dreimaliges Nachwaschen mit 0,1 normaler HCl und erneutes Zentri­ fugieren ergibt das Häminprodukt mit etwa 40% Hämin-Gehalt und 70% Ausbeute.

Optional erfolgt vor der Hämintrocknung eine Disso­ ziation der Häminaggregate durch Ultraschall, um die gute Bioverfügbarkeit weiter zu verbessern. Dazu wird das feuchte Häminprodukt für 15 min im Ultraschallbad behandelt und anschließend im Gefriertrockner ge­ trocknet.

2. Großer Laboransatz

In einem 15 l Rührreaktor mit dampfbeheiztem Doppel­ mantel werden 8 l deionisiertes Wasser auf 67°C er­ hitzt, mit ca. 1,5 l 1-normaler HCl auf pH 1,4 einge­ stellt und mit 2 kg tiefgefrorenem (stückigem) Dick­ blut versetzt. Die Temperatur wird auf 67°C gehal­ ten, der pH-Wert auf 2 eingestellt und mit 250 Umdre­ hungen pro Minute 1 Stunde lang gerührt. Nach Ab­ schalten des Rührers erfolgt die Separation des Häm­ schlamms in einem Tellerseparator (Westfalia TA1) bei 9.000-10.000 U/min mit einem Durchsatz von 0,2 l/min. Das feuchte Produkt (Trockensubstanzgehalt 10%) wird ohne Nachwaschen im Gefriertrockner oder alternativ im Umluft-Bandtrockner bei 80°C Zuluft­ temperatur getrocknet (Reinheit: 30% Hämingehalt; Ausbeute: 55% der Theorie).

In der abgetrennten Globinlösung sind 0,06% Hämin und 3,4% teilweise lysiertes Protein enthalten. Be­ zogen auf die abgetrennte Menge bedeutet das einer­ seits einen Häminverlust von 45% und zeigt anderer­ seits, daß durch anschließendes Nachwaschen eine gute nachträgliche Häminreinigung (Globinabtrennung) mög­ lich ist.

Derivatherstellung

Analoge Ansätze werden in einem 5 l-Becherglas auf einem Magnetrührer mit Heizplatte mit jeweils 500 g gefrorenem Hämschlamm und mit 2 l Ascorbinsäure, bzw. 2 l Citronensäure, bzw. 2 l Essigsäure durchgeführt. Die Reaktionstemperatur beträgt 70°C, der einge­ stellte pH-Wert ist 2,3 (für Ascorbat- und Citratan­ satz) bzw. 1,7 (Essigsäure). Bezüglich Ausbeute, Hä­ mingehalt und Bioverfügbarkeit ergeben sich keine signifikanten Unterschiede.

3. Ansatz im Technikumsmaßstab

10 kg tiefgefrorenes, stückiges Dickblut (Hämoglobin­ gehalt ca. 35%) werden in einem 150 l Rührbehälter mit direkter Dampfheizung unter schwachem Rühren (150 Umin^-1) in 90 kg vorgeheizte (75°C) 0,01 n Salzsäure zugefügt. Der pH-Wert wird durch automatische Säure­ dosierung mit 6 n Salzsäure bei pH 1,6 konstant ge­ halten. Es erfolgt die Hämolyse, Säurespaltung der Hämin-Globin-Bindung, Häminaggregation und Sedimenta­ tion des Hämschlamms. Nach 1 Stunde Reaktionszeit bei 70°C wird die Suspension mittels eines Dekanters aufgetrennt und der feuchte Hämschlamm (Trockensub­ stanzgehalt 12%) mit einem Bandtrockner bei 80°C Zulufttemperatur getrocknet. Das hergestellte Produkt enthält etwa 40% Hämin (Ausbeute 65% der Theorie).

Die Hämin-Präparationen im 1000 Liter-Maßstab erfol­ gen in einem indirekt dampfbeheizten 3000 l Rührbe­ hälter. Die Versuchsparameter entsprechen dem obigen Ansatz. Die eingesetzten Mengen sind 10fach größer.

100 kg tiefgefrorenes, stückiges Dickblut (Hämoglo­ bingehalt ca. 35%) werden in einem 3000 l Rührbehäl­ ter mit indirekter Dampfheizung unter schwachem Rüh­ ren (150 Umin^-1) in 900 kg vorgeheizte (75°C) 0,01 n Salzsäure zugefügt. Der pH-Wert wird durch automati­ sche Säuredosierung mit 6 n Salzsäure bei pH 1,6 kon­ stant gehalten. Es erfolgt die Hämolyse, Säurespal­ tung der Hämin-Globin-Bindung, Häminaggregation und Sepimentation des Hämschlamms. Nach einer Stunde Re­ aktionszeit bei 70°C wird die Suspension mittels eines Dekanters aufgetrennt und der feuchte Häm­ schlamm (Trockensubstanzgehalt 12%) mit einem Band­ trockner bei 80°C Zulufttemperatur getrocknet. Das hergestellte Produkt enthält etwa 40% Hämin (Ausbeu­ te 65% der Theorie).

Für eine großtechnische Häminpräparation ist es sinn­ voll, auch den diskontinuierlichen Fällschritt in einen kontinuierlichen Prozeß zu wandeln. Dabei las­ sen sich durch einen Kreislaufbetrieb der heißen, sauren Globinlösung zusätzlich Energie, Rohstoffe und Abwasserkosten einsparen. Dazu erfolgt die Zugabe und das Mischen der verdünnten Säure mit dem Dickblut in einem separaten Apparat (Rührbehälter) und die an­ schließende Häminpolymerisation und Fällung in einem Rohr- oder Rohrbündelreaktor, in dem eine langsame Strömung mittlere Verweilzeiten von ca. 1 Stunde er­ zeugt.

Aus der mit dem Dekanter abgetrennten Globinlösung wird das Protein durch Ultrafiltration entfernt und das Permeat erneut zur Häminfällung genutzt.

Als kritische Denaturierungstemperatur wurde für die relevanten Verfahrensbedingungen 75°C über etwa 10 min ermittelt. Die Säurespaltung eines thermisch de­ naturierten Hämoglobins ist nicht möglich.

Claims (11)

1. Verfahren zur Gewinnung von Hämin aus Schlachtblut, dadurch gekennzeichnet, daß das Schlachtblut zur Trennung des Hämin vom Glo­ binanteil einer Säurebehandlung bei pH 1,2-3 bei 45-80°C unterzogen und anschließend das Hämin vom Globin getrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Säurebehand­ lung das Schlachtblut in Dickblut und eine Plas­ mafraktion getrennt, und das Dickblut der Säure­ behandlung zugeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Säurebehandlung bei pH 1,3-2,0 bei einer Temperatur von 60-75°C durchgeführt wird.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämin vom Globin nach einer Agglomerationszeit von 15 Minuten bis 2 Stunden abgetrennt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Agglomerations­ zeit von 30 Minuten bis 1,5 Stunden eingehalten wird.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Säurebehand­ lung eine Hämoglobinkonzentration von 2 bis 10% eingestellt wird.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämin vor der Trocknung einer Ultraschall-Behandlung unterzo­ gen wird.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es kontinuierlich betrieben wird.

9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die heiße, saure Globinlösung, von Globin gereinigt, einem Kreis­ laufbetrieb zugeführt wird.

10. Hämin, hergestellt nach einem Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es 20 bis 80% Glo­ bin enthält.

11. Verwendung von Hämin, hergestellt nach einem Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, für die Eisenfortifikation von Lebensmitteln.