DE19727879A1 - Verfahren zur Bestimmung der Anzahl von Komponenten in Peaks, Banden und Signalen von Chromatogrammen, Elektrogrammen und Spektrogrammen aller Art - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Anzahl von Komponenten in Peaks, Banden und Signalen von Chromatogrammen, Elektrogrammen und Spek­ trogrammen aller Art.

Die moderne Analytik und Trenntechnik für Stoffe jedweder Art bewegt sich immer mehr in Richtung der vollständigen Automatisierung von der Probennahme bis zur Erlangung der gesuchten Endergebnisse. Dabei läuft das Verfahrensschema unab­ hängig von der Art der Analyse immer wieder identisch ab, sei es bei der allgemei­ nen Stoffauffindung und ihrer Identifizierung, als auch bei besonderen Beispielen, wie bei der Sequenzierung von Proteinen, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten, Lipiden etc.: Progressives Anheften, Verteilen aufgrund individuellen Wanderungsverhaltens und Desorbieren von Substraten an Trägermaterialien verschiedenster Art und die anschließende Substrat-Detektion mittels eines darauf ansprechenden Dispositivs, vorzugsweise spektroskopischer Natur.

Erfahrungsgemäß ist es dabei unvermeidlich, daß sich neben den homogenen De­ tektionspeaks, die jeweils nur aus einer Reinkomponente stammen (= 100%ige Peakreinheit), in anderen Signalen die spektralen Beiträge zweier oder mehrerer Komponenten mischen (= Mischpeaks). Hauptursachen dafür sind:

• - Quasi-Identität der zu trennenden Komponenten, z. B. kommt es in der Naturstoff­ chemie zum Auftreten von Wirkstoffamilien, deren Einzelkomponenten sich von­ einander nur geringfügig unterscheiden.
• - Anwendung eines unangepaßten Trennverfahrens, das mehrere Komponenten in der gleichen Detektionszone erscheinen läßt.
• - Peak-Erfassung unter nicht optimalen Detektionsbedingungen.

Die Peakreinheit und ggf. die Anzahl der sich spektral überlappenden Komponenten konnte bisher geräte-logistisch nicht ohne weiteres erkannt und verwertet werden. Sie ist jedoch für die Erlangung eindeutiger Meßergebnisse von fundamentaler Be­ deutung. Das Gerät reagiert beim Auftreten einer solchen Unsicherheit mit Verzöge­ rung und Zweifelsbehaftung der Endergebnisse.

Hochentwickelte, in jeder sonstigen Weise optimierte Meß- und Trennverfahren wer­ den durch diesen generellen Unsicherheitsfaktor in ihrer Effizienz limitiert.

Daraus ergibt sich die Aufgabe, diesen das Gesamtinstrument limitierenden Mangel zu beheben.

Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Präzisions- und Schnellverfahren zur Ermittlung der Anzahl von Komponenten in Peaks, Banden und Signalen, die zum Zwecke der Analyse und Stofftrennung in Spektrogrammen aller Art überall dort erhalten werden, wo energiekorrelierte Meßwerte in Funktion eines evolutiven Parameters auf und wieder abgebaut werden, wobei die aus jeweils einem solchen Parameterwert her­ vorgehende, unterschiedlich energiekorrelierte Meßwerte-Schar gegeneinander in Beziehung gesetzt wird, wodurch charakteristische geometrische Figuren entstehen, in denen der verursachende evolutive Parameter nicht mehr enthalten ist und wobei die erhaltenen Figuren in Funktion ihrer Komplexität stufenweise erst zu Geraden, dann zu Punkten reduziert werden, womit auf einfachste Weise die Anzahl der zu den Peaks beitragenden Komponenten und damit die bestandteilmäßige Zusam­ mensetzung des gesamten Spektrogramms sowie des zu untersuchenden und/oder zu trennenden Stoffgemisches erhalten wird.

Eine vorteilhafte Ausgestaltung besteht darin, daß anstelle der energiekorrelierten Direkt-Meßwerte deren Differenzen, Quotienten oder Quotienten der Differenzen in einfacher oder multipler Weise zueinander in Bezug gebracht werden, wodurch es progressiv möglich wird, 2, 3, 4 oder mehr Einzelbestandteile sicher aus dem Peak zu extrahieren sowie sie zu identifizieren und zu trennen, oder daß die in jeweils einem Parameterbereich von den zugehörigen Energiemeßwerten umschlossenen Flächen als Integrale miteinander in Bezug gesetzt werden, wodurch geometrische Figuren entstehen, aus denen Peakzusammensetzung und Analysenergebnis abzulesen ist, was zusätzlich mit einer entscheidenden Verbesserung des Signal/Rauschverhältnis­ ses und mit einem entsprechenden Gewinn der Empfindlichkeit des zugehörigen technischen Verfahrens verbunden ist.

Die Unteransprüche beschreiben vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens.

Eine weitere Variante des Verfahrens zur Bestimmung der Anzahl von Komponenten in Strukturen von Spektrogrammen, wobei die Strukturen energiekorrelierte Meßwerte sind, die sich als Funktion eines evolutiven Parameters auf- und wieder ab­ bauen und sich so mit dem Parameter verändern, besteht aus folgenden Verfah­ rensschritten:

• a) Ermitteln von mindestens 2 verschiedenen Funktionswerten von Meßwerten, wo­ bei jeder Meßwert einer anderen Energie zugeordnet ist, bei gleichem Parame­ ter,
• b) Ermitteln von weiteren mindestens 2 weiteren Funktionswerten mit den gleichen Energiezuordnung wie bei Schritt a) bei mindestens zwei weiteren verschiedenen Parametern, so daß jedem Energiewert mindestens drei Funktionswerte bei drei verschiedenen Parametern zugeordnet sind,
• c) Interpretieren der zu den verschiedenen Energien gehörenden Funktionswerte als Parameterdarstellung einer mindestens zweidimensionalen Kurve und
• d) Auswerten der Kurve anhand vorgegebener Kriterien. Dabei können die Meß­ werte Extinktionswerte und der Parameter die Zeit sein.

Bekanntlich laufen die Trennungs- und Analysenverfahren von Stoffgemischen in ihrer entscheidenden Phase über die Registrierung von solchen Detektionspeaks, die vorzugsweise aus spektroskopischen Meßdaten resultieren. Dies ist beispiels­ weise so bei der HPLC, der Flüssigkeits-, Gas-, Dünnschicht-, Affinitäts-, Adsorp­ tions- und Ionenaustausch-Chromatographie sowie bei den elektrophoretischen Verfahren und jeder analogen Trenntechnik.

Von einer einfachen und effizienten Behebung des oben charakterisierten zentralen Mangels ist ein bedeutender technischer Fortschritt für alle automatisierten Trenn- und Analyseverfahren zu erwarten.

Die geschilderten Mängel werden durch das beanspruchte Verfahren behoben. Es ist direkt, einfach, verzögerungsfrei und signifikant.

Es arbeitet mit einem Minimum an Auswertungsaufwand und führt zu unzweifelhaf­ ten Ergebnissen.

Der Detektionspeak steht im Zentrum der Lösung des gestellten Problems.

Ausgehend von den ersten klassischen Trennverfahren hat insbesondere die Zahl der durch Chromatographie bewältigten analytischen und präparativen Stofftrennun­ gen ständig zugenommen. Allein in Europa werden in allen Forschungs- und Berufs­ zweigen über 100 000 Geräte dieser Art betrieben. Man kann davon ausgehen, daß sich dieser Trend fortsetzt. Dabei werden meistens solche Detektions- und Meßme­ thoden eingesetzt, die spektroskopische Daten in Abhängigkeit von einer Reten­ tionszeit und/oder einem Wanderungsverhalten registrieren. Die so erhaltenen Chromatogramme werden dann für die Identifizierung und für die quantitative Be­ stimmung von Einzelkomponenten herangezogen. Von entscheidender Bedeutung war dabei bisher, daß die einzelnen Stoffe auch tatsächlich voneinander getrennt werden und homogene Einzelsignale liefern.

In der Tat stellt sich bei jedem chromatographischen Trennverfahren auf der Basis spektroskopischer Meßmethoden immer wieder die Grundfrage: Wieviele Kompo­ nenten machen sich in den einzelnen Peaks der Chromatogramme spektroskopisch bemerkbar?

Wegen der zentralen Bedeutung des Einzelbeitrags jeder Komponente zum mehr oder weniger komplexen Chromatogramm sind bislang zahlreiche Methoden für ihre individuelle Charakterisierung entwickelt worden. Die großen Anstrengungen, die bis zur Gegenwart in dieser Richtung unternommen wurden, und immer wieder unter­ nommen werden, belegen, daß dieses Problem trotz anhaltender Bemühungen bis heute noch nicht befriedigend gelöst worden ist.

Die Lösung dieses Problems hat für alle Meß- und Trennungsmethoden, die auf der Registrierung zeitabhängiger Signale basieren, grundsätzliche Bedeutung. Diese Bedeutung erweitert sich auf jedes andere Verfahren, bei dem evolutiv ein Signal auf- und wieder abgebaut wird. Wie in der Chromatographie können beispielsweise auch in der laufenden Elektrophorese die einzelnen separierten Banden zeitabhän­ gig und positionsabhängig spektroskopisch untersucht werden.

Das Driften von Basislinien und das partielle Untertauchen von schwachen Signalen im Rauschen stellen zusätzliche Komplikationsparameter dar, für die von der erfin­ dungsgemäßen Lösung entscheidende Verbesserungen erwartet werden müssen.

Bei Konzentrationen an der Detektionsgrenze wie z. B. beim Erreichen der Sequen­ zierungsgrenze von Proteinen stellt sich die Frage: Real-Peak, Rausch-Peak, Verun­ reinigungs-Peak oder Mischung aus ihnen? Die Lösung des Problems erfordert notwendigerweise einen neuen Weg zur Analyse und Behandlung von Detektionspeaks und ihre sinnvolle Einordnung in einen vor­ zugsweise vollautomatisierten Gesamtprozeß.

Für die Peak-Analyse werden in der HPLC und der spektroskopischen Elektropho­ rese bevorzugt Diodenarrayspektrometer im UV-VIS-Bereich eingesetzt. Dadurch können heute mit leistungsfähigen Rechnern Chromatogramme und Elektrogramme bis hinunter in den Millisekundenbereich spektral aufgelöst werden. Die so regi­ strierten 3D-Chromatogramme und Elektrogramme (Extinktion versus Wellenlänge versus Retentionszeit bzw. einem elektrochemischem Parameter) werden dann in der Regel einer aufwendigen numerischen Analyse unterworfen. Beispielhaft wurden dazu die folgenden Verfahren entwickelt:

• - Flächenschwerpunktsanalyse
• - "Peak-Dekonvolution"
• - Lot- und Abschälmethode
• - Spektrenvergleich mit Hilfe chemometrischer Verfahren
• - "Peak-Purity-Index"
• - "Rationing" (Ratiobildung).

Die meisten dieser Verfahren sind aufwandsmäßig hoch anspruchsvoll und sind in den kommerzialisierten Geräten kostenintensiv integriert. So werden multivariate Methoden oder Kurvenanalysen mit Hilfe von Gauss-Verteilungskurven angewendet. Alle diese Verfahren weisen jedoch ernste Nachteile auf:

• - der Anwender kann diese Verfahren meistens nur schematisch routinemäßig ohne weitere Modifizierung anwenden, da diese Methoden in der Regel ohne Varia­ tionsmöglichkeiten als feste, starre unbeeinflußbare und unkontrollierbare "black­ box"-Einheiten angeboten werden,
• - der Anwender kann bei widersprüchlichen Aussagen verschiedener Verfahren selbst nicht entscheiden, welchen Ergebnissen ein höheres Gewicht beizumessen ist,
• - numerische Artefakte und Probleme, die mathematisch schlecht konditioniert sind, können bei Routineanwendungen nur schwer erkannt werden,
• - die Erfahrung des Anwenders ist in die Auswertung nicht integrierbar: Das Instru­ ment ist nicht "lernfähig".

Die Extinktions(E)-, Extinktionsdifferenzen(ED)- und Extinktionsdifferenzen-Quotien­ ten(EDQ)-Diagramme wurden 1968 für die Theorie der Reaktionskinetik eingeführt (H. Mauser, Z. Naturforsch. 23b (1968), S. 1025-30).

Dabei wurde an reagierenden chemischen Systemen mit zum Teil kurzlebigen Inter­ mediaten gezeigt, daß man durch Auftragen der zeitlich aufeinanderfolgenden Ex­ tinktionswerte bei einer Wellenlänge (λ_i) gegen die korrespondierenden Werte zu gleicher Zeit bei einer anderen Wellenlänge (λ_j) unter Eliminierung des Zeitparame­ ters charakteristische Kurven erhält. Solche Diagramme E_λi versus E_λj werden Ex­ tinktionsdiagramme genannt (= E-Diagramme).

Bildet man Differenzen von Extinktionswerten und trägt diese gegen die korrespon­ dierenden Differenzen anderer Wellenlängen auf, so entstehen in gleicher Weise Extinktionsdifferenzendiagramme (= ED-Diagramme). Zur Differenzenbildung werden Extinktionswerte zu verschiedenen Reaktionsphasen herangezogen.

Dividiert man korrespondierende Differenzen verschiedener Wellenlängen durchein­ ander, entstehen Extinktionsdifferenzen-Quotienten-Diagramme (= EDQ-Dia­ gramme). Solche Differenzen stellen Determinanten des Ranges 1 dar. Man kann das System auf Determinanten des Ranges 2, 3. . . bis s weiterführen.

Trotz der Existenz solcher Diagramme im theoretischen Bereich der Kinetik seit über 25 Jahren einerseits und der ebenfalls langandauernden, bisher wenig effizienten Bemühungen der Gerätehersteller andererseits, die zentrale Schwachstelle der Peakauswertung, z. B. in der Chromatographie zu überwinden, ist bisher keine An­ wendung der obigen Diagramme auf eine rationalisierende Verarbeitung der in den Analysengeräten registrierten Datenflut vorgeschlagen worden. Dies liegt wohl daran, daß die kinetische Untersuchung von Reaktionsmechanismen und die chro­ matographischen Trennverfahren für Stoffgemische keinerlei Berührungspunkte aufweisen. Sie dienen völlig verschiedenen Zwecken. Reaktionskinetische Theorien und die praktischen Probleme der Trennung von Stoffgemischen stellen weit vonein­ ander entfernte Disziplinen dar. Die Einführung von E-Diagrammen in die Stofftren­ nung war sichtlicherweise nicht naheliegend.

Es hat sich nun herausgestellt, daß durch die Anwendung der E-, ED-, EDQ-Dia­ gramme und insbesondere der speziell für das erfindungsgemäße Verfahren ent­ wickelten und nachfolgend beschriebenen, integralen Extinktions-Diagramme (= iE- Diagramme) auf die Analyse der Spektren die Substanzzuordnung und Bestimmung bei chromatographischen Trennungsverfahren überraschenderweise extrem einfach und überschaubar werden. Es kann auf Anhieb entschieden werden: Mono-Peak, Doppel-Peak oder Multi-Peak, ggf. die Komponentenzahl. Auch ein eingelagerter Rausch-Peak kann als solcher erkannt werden. Komplizierte logistische Hilfseinhei­ ten werden dadurch überflüssig. Das Gesamtinstrumentarium wird durch das neue Verfahren einfacher, sicherer und kostengünstiger. Für das Gesamtverfahren bis zum Analysenendergebnis wird zusätzlich ein bedeutender Zeitgewinn erzielt.

Die Geschwindigkeit, die Sicherheit und die Kostenverhältnisse der Analysen werden in spektakulärer Weise verbessert.

In der Chromatographie basiert das Verfahren darauf, daß sich die registrierten Spektren in Abhängigkeit von der Retentionszeit ändern. Indem Extinktionen ver­ schiedener Wellenlängen E_λi (t), die jeweils aus gleichen Retentionszeiten (t) her­ vorgehen, gegeneinander aufgetragen werden, erhält man charakteristische geome­ trische Gebilde und damit die gesuchte Aussage über die Authentizität und die Kom­ plexität der untersuchten Signale. Solche Gebilde sind Punkte, Geraden, Flächen oder multidimensionale Gebilde (Polyeder). Von einer Peakextremität mit niedrigen E-Werten ausgehend evoluieren die Kurven im E-Diagramm entlang solcher Figuren bis zu einem Umkehrpunkt mit maximalen E-Werten und kehren an der anderen Peakextremität zum Ursprungspunkt im E-Diagramm zurück. Das so gespannte Diagramm heißt Extinktionsraum. Die verursachende Retentionszeit ist darin nicht mehr enthalten.

Durch die Einführung der erfindungsgemäßen Vereinfachung in den chromatogra­ phischen Analysen- und Trennprozeß wird ein langanhaltender Mangel behoben. Auf einfachste Weise ergeben sich Reinheit bzw. Multiplizität der Peaks.

Auch auf jedes andere Verfahren, bei dem mit Hilfe zeitlich und/oder räumlich evo­ luierender Parameter Signale auf- und wieder abgebaut werden (z. B. NMR, Absorp­ tions- oder Reflexions-Spektroskopie an Test-Trägermaterialien, Doppelwellen- Spektroskopie, Fluoreszens-Spektroskopie, Optische Rotationsdispersion, Circular­ dichroismus), ist die Erfindung anwendbar.

Bevor die Entwicklung und beispielhafte Anwendung der verschiedenen Diagramme auf die Erfindung beschrieben werden, wird in den nachfolgenden Tabellen die Lei­ stungsfähigkeit schematisiert:

• a) Signalpeaks mit 1 oder 2 Komponenten decken die überwiegende Mehrzahl der chromatographischen Probleme ab. Diese werden ad hoc mit Hilfe von E- und ED-Diagrammen unterschieden:
  
  Tabelle 1
• b) Universell ist die Erkennung und erfindungsgemäße Behandlung von Multikompo­ nenten-Signalen mit Hilfe weiter entwickelter Diagramme möglich.
  Tab. 1 erweitert sich dabei nach folgendem Schema:
  
  Tabelle 2

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen mit Hilfe der Figuren näher erläutert.

I. Konstruktionen von E-, ED-, integralen E- und integralen ED-Diagrammen

Zu Detektionszwecken werden in der Chromatographie Spektren im UV-VIS-Ge­ biet meistens wellenlängenabhängig (λ) zu verschiedenen Retentionszeiten (t) re­ gistriert. Im E-Diagramm werden die zu den t-Werten gemessenen Extinktionen bei verschiedenen Wellenlängen (λ_i, λ_j) gegeneinander aufgetragen, d. h.

E_λi (t) versus. E_λj (t) oder vereinfacht E_i (t) vs. E_j (t).

Bei den registrierten Spektren wird in der Regel die Gültigkeit des verallgemei­ nerten Lambert-Beer-Bouguer'schen Gesetzes vorausgesetzt:

(d = Schichtdicke des Meßraumes von Lösung, Gas oder der Elektrophoresema­ trix; ε_λi = Extinktionskoeffizient der Komponente i; c_i = Konzentration von i; s = maximale Anzahl der absorbierenden und ggf. zum Peak beitragenden Kompo­ nenten).

Bei den Extinktionsdifferenzen (ED)-Diagrammen werden die entsprechenden Plots konstruiert:

ΔE_λi (t) vs. ΔE_λj (t) oder vereinfacht ΔE_i (t) vs. ΔE_j(t).

Dabei gilt

ΔE_i,j (t) = E_i,j (t) E_i,jk E_i,j k = Bezugswert.

Während ΔE_i,j und E_i,j bei den Wellenlängen i und j zeitabhängige Größen sind, stellen die Werte E_{i,j k} im Fall eines konstanten spektralen Untergrundes (keine Drift der wellenlängenabhängigen Basislinien) Konstanten dar. Für E_λi,jk kann allgemein jeder k-te Meßwert (k = 0, 1. . ., wobei k = 0 den durch das Eluationsmittel verursachten Anfangswert darstellt) herangezogen werden, jedoch empfiehlt es sich, erfindungsgemäß dafür die Anfangsmeßwerte (E_{i,j o} mit k = 0) oder Meß­ punkte in der Nähe von k = 0 zu verwenden.

Wenn "Peakreinheit" vorliegt, also nur eine einzige Komponente (s = 1) in dem zu analysierenden Peak des Chromatogramms spektroskopisch erfaßt wird, resultie­ ren in den E- und ED-Diagrammen Geraden. Damit werden alle Einkomponenten- Signale des Chromatogramms sofort erkannt, von den inhomogenen Peaks ge­ trennt und der quantitativen Auswertung zugeführt.

Meßbeispiel für Mono-Peak

Bei einer beispielshaften Ausführung des Verfahrens wurde Chlorogensäure (1,3 mg/ml) in Methanol gelöst, auf eine C₁₈-HPLC-Säule eingespritzt und mit Methanol (40%) und Wasser (mit 1% Essigsäure) eluiert. Die mit Hilfe eines UV-VIS-Di­ odenarrayspektrometers spektral bei 250 bis 400 nm registrierten Chromato­ gramme wurden anhand von E-Diagrammen ausgewertet. Dies führte am Beispiel des hier zwangsweise erhaltenen Mono-Peaks zu eindeutigen Geraden (Fig. 1).

Um sicher zu sein, daß sich die Homogenität über die gesamte Geometrie des Peaks erstreckt, ist es notwendig, die Extinktionen verschiedener Wellenlängen­ paare miteinander zu kombinieren, wodurch man eine Serie von Geraden erhöht. Auf diese Weise wird der Peak als Mono-Peak bestätigt.

Beginnend beim Peakanfang mit niedrigen Extinktionswerten sieht die Entstehung einer solchen Geraden so aus, daß sich die Punkte vom Koordinatenursprung des Diagramms in Richtung höherer E-Werte bis zu einem Kulminationspunkt bewe­ gen und auf derselben Geraden wieder in den Ursprung zurückwandern.

Die fast inexistente Streuung der die Geraden bildenden Meßpunkte in Fig. 1 spricht für die absolute Präzision des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Leistungsfähigkeit des Verfahrens

Vollständig unabhängig von der Peakform (Gaußsche Glockenkurve, Poisson- Verteilung u. a.) werden immer dann Geraden in den E- und ED-Diagrammen er­ halten, wenn die Anzahl der zum Peak beitragenden Komponenten s = 1 ist. Der Peak ist rein und von keiner anderen Komponente gestört. Die Präzision des Verfahrens kommt daher, daß das beschriebene Verfahren vollständig unabhän­ gig ist von dem sonst äußerst störenden Abklingverhalten (= asymptotische Rückführung auf den Anfangswert) des betreffenden Peaks. Damit wird ein Hauptstörfaktor bisheriger chromatographischer und sonstiger Detektionsverfah­ ren auf einfachste Weise ausgeschaltet.

Dieses Verfahren ist die einfachste Methode zur Bestimmung der "Peakreinheit", das bisher entwickelt wurde und das zugleich hoch empfindlich ist. Geringste sy­ stematische Abweichungen können noch signifikant erkannt werden. Mathemati­ sche Manipulationen bestehen hier nicht, abgesehen von elementaren Operatio­ nen wie der Bildung von Differenzen (ED-Diagramme), Quotienten (EDQ-Dia­ gramme) und/oder von Integralen bei den nachfolgend beschriebenen iE-Dia­ grammen.

Das Verfahren ist frei von undurchsichtigen logistischen Operationen und auf diese Weise vollständig transparent für den Anwender. Es setzt beim Benutzer le­ diglich ein Minimum an Grundkenntnissen der Spektroskopie voraus. Rechen­ akrobatik und aufwendige chemometrische Methoden sowie das dazugehörige In­ strumentarium werden überflüssig.

In der Praxis und in der Routinemeßtechnik empfiehlt es sich, die Wellenlängen λ_i und λ_j so auszuwählen, daß diese in den registrierten Spektren möglichst weit verteilt liegen. Auf diese Weise überstreicht man ein Feld mit ausgeprägten Ände­ rungen der Extinktion und sichert so ein eindeutiges Ergebnis. Vorteilhaft wird da­ bei der gesamte Detektionsbereich erfaßt. Ausreichend sind jedoch bereits 5 Wellenlängen. Optimal kann man 10 oder mehr Wellenlängen verwenden.

Integrale Diagramme für Hochleistungs-Detektionstechnik und Grenzfälle

Wie bereits dargestellt, erfolgt die Detektion der Peaks zunehmend mit Hilfe von ultraschnellen Diodenarrayspektrometern, wobei die klassisch mit Hilfe von Pho­ tomultipliern registrierenden Spektralphotometer zunehmend verdrängt werden. Man nimmt allerdings damit ein unvorteilhaftes Signal/Rausch (S/R)-Verhältnis in Kauf. Die folgende Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe schließt die Kom­ pensation eines ungünstigen S/R-Verhältnisses beispielsweise bei Dioden­ arrayspektrometern ein. Dies geschieht durch eine Weiterentwicklung der Erfin­ dung: Anstelle der beschriebenen E- und ED-Diagramme werden die entspre­ chenden integralen Konstrukte aufgestellt und in den automatisierten Analysen­ prozeß eingespeist.

Indem die Signale von mehreren Dioden integral zusammengefaßt werden, kön­ nen im einfachsten Fall die Flächen unter den entsprechenden E-λ-Kurven durch einfaches Aufsummieren der Signal-Trapezflächen, die das Signalflächenintegral aufbauen, in Abhängigkeit von den Retentionszeiten bestimmt werden. In dieser Weise oder mit Hilfe anderer gängiger numerischer Verfahren können Integrale der Form

präzise, schnell und sehr einfach ermittelt werden. Dadurch lassen sich die sog. integralen Extinktions(iE)-Diagramme konstruieren:

Dabei können λ₂ = λ₃ oder λ₁ = λ₃ sein. Praktisch hat sich für die Integrations­ grenzen ein Wellenlängenbereich (Δλ = λ₂ - λ₁ = λ₄ - λ₃) in der Größe von etwa 4-10 nm im UV-VIS-Gebiet als vorteilhaft erwiesen. Die so konstruierten iE-Dia­ gramme führen zu den gleichen Aussagen wie die E-Diagramme, jedoch wird die Präzision dadurch noch einmal erhöht.

Strenge Peakreinheit (s = 1) liegt vor, wenn in den iE-Diagrammen Geraden ent­ stehen. Die Verwendung integraler iE-Diagramme führt noch im Falle sehr ungün­ stiger Signal/Rausch-Verhältnisse zu abgesicherten Ergebnissen, d. h., in den klassischen Detektionsverfahren vorerfindungsgemäß nicht mehr verwertbare Chromatogramme führen hier noch zu eindeutigen Resultaten.

Eine derartige Anwendung ergibt sich beispielsweise für die Sequenzierung von Peptiden, Proteinen und Proteinfraktionen mittels Edmann-Abbau, wo mit zuneh­ mender Entfernung vom N-terminalen Ausgangspunkt die Signale schließlich im Rauschen untergehen und die Weitersequenzierung dadurch gestoppt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es hier, das Rauschen herauszuglätten, ohne Verluste an der Realpeakintensität hinnehmen zu müssen. Es wird möglich, ohne Erhöhung des apparativ-materiellen Aufwandes die Proteinkette um weitere Aminosäurebausteine zu sequenzieren.

In analoger Weise werden die integralen Extinktionsdifferenzen (iED)-Diagramme) angewendet:

Die genannten Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens können auch dann angewendet werden, wenn die Basislinie in Funktion der Wellenlängen zeitlich driftet. Indem die zeitabhängigen Werte der Basislinien (E_λ ^B(t)) ermittelt werden (z. B. mit Hilfe von Polynomen), kann ΔE_λ(t) wie folgt definiert werden:

ΔE_λ(t) = E_λ(t) - E_λ ^B(t).

In dieser Weise werden "korrigierte ED-" bzw. "korrigierte iED-Diagramme" kon­ struiert, mit denen auch hier eine Prüfung auf Peakreinheit möglich ist.

Der Riesenvorteil der verschiedenen integralen E-Diagramme (iE) kombiniert so die Grunderfindung der eindeutigen Peak-Analyse mit zusätzlicher Detektions- Empfindlichkeit und mit der Eliminierung von klassischen Störfaktoren wie Basisli­ niendrift. Dies wird mit einem geringfügig erhöhten Rechenaufwand erkauft, der jedoch computermäßig mühelos beherrschbar ist.

Doppel- und Mehrfach-Peaks

Systematische Abweichungen von den Geraden werden gefunden, wenn sich in den zu analysierenden Kurven des Chromatogramms bzw. Elektrogramms meh­ rere (s ≧ 2) Komponenten spektroskopisch bemerkbar machen. In diesen Fällen empfiehlt es sich, die weiter unten beschriebenen EDQ-Diagramme zu verwen­ den.

Wenn zwei oder mehrere Komponenten während der Chromatographie oder Elektrophorese nicht vollständig aufgetrennt werden, können Doppel- bzw. mul­ tiple Peaks entstehen. Auch quasi einfache Peaks, gegebenenfalls mit Schultern, werden beobachtet. Um festzustellen, ob dabei zwei oder mehrere Stoffe spek­ troskopisch erfaßt wurden, können erfindungsgemäß EQ-, EDQ-, integrale EQ- und integrale EDQ-Diagramme angewendet werden.

Dies wird an dem folgenden Meß-Beispiel erläutert (Fig. 2):
Zwei Stoffe werden in einem Trennverfahren nicht vollständig separiert: Es han­ delt sich um eine Mischung aus Epicatechin und Chlorogensäure (zwei miteinan­ der verwandte Flavonoide). Verwendet wurde eine C₁₈-HPLC-Säule. Als Elua­ tionsmittel dienten Methanol (40%) und Wasser sowie Essigsäure (1%). Die Peak-Detektion erfolgte mit Hilfe eines Diodenarrayspektrometers.

Der erste Stoff wird zwar im Anfangsbereich des chromatographischen Prozesses deutlich vom zweiten Stoff getrennt, jedoch werden in der Abklingphase beide Stoffe nicht mehr weiter getrennt. Im Endbereich ist das Konzentrationsverhältnis beider Stoffe nahezu konstant. Da sich insgesamt beide Stoffe unterschiedlich spektroskopisch bemerkbar machen, werden charakteristische E-, ED-, E- und iED-Diagramme erhalten.

Das Prinzip eines solchen Diagramms, exemplarisch wird dazu das einfache ED- Diagramm betrachtet, gilt analog für die EDQ- und für alle integralen Diagramme.

Das ED-Diagramm ist auf die Anfangsmeßwerte (E_i,jk mit k = 0) bezogen. In dem Maße, wie sich der chromatographische Peak entwickelt, beginnen sich die Meß­ punkte auf einer Geraden aus dem Nullpunkt heraus fortzubewegen (Aufwärtspfeil in Fig. 2). Dieser lineare Bereich des ED-Diagrammes ist umso stärker ausge­ prägt, je vollständiger die Trennung des ersten Stoffes vom zweiten ist. Wenn während des chromatographischen Prozesses die Konzentration des ersten Stof­ fes nach dem Erreichen eines Maximalwertes abnimmt, ohne daß sich dabei be­ reits der zweite Stoff spektroskopisch bemerkbar macht, laufen die Punkte im ED- Diagramm auf der ursprünglichen Geraden ein Stück in Richtung des Nullpunktes zurück. So liegen in Fig. 2 alle Aufwärtspunkte und die ersten Abwärtspunkte auf einer Geraden. Die Steigung dieser Geraden besitzt dann einen Wert, für den bei den Wellenlängen i und j gilt:

Im Laufe des chromatographischen Prozesses macht sich nun der zweite Stoff spektroskopisch bemerkbar. Dies bedeutet für die ED-Diagramme, daß die Punkte von der ursprünglichen Nullpunktsgeraden weglaufen (= nicht-lineare Fortsetzung der Rücklaufkurve in Fig. 2). Dies hat folgende Konsequenzen:
Anhand der ED-Diagramme kann sofort erkannt werden, ab welcher Retentions­ zeit der zweite Stoff spektroskopisch erfaßt wird; es ist also möglich, den ersten Stoff bis zu diesem Zeitpunkt in reiner Form anzusammeln.

Beim Erscheinen der zweiten Komponente verlassen im EDQ-Diagramm die nun folgende Punkte den Anfangspunkt und ordnen sich ihrerseits auf einer Geraden an.

II. EQ-, EDQ-Diagramme und ihre integralen Analogen

Die Quotienten ΔE_i/ΔE_j werden zur Konstruktion von EDQ-Diagrammen ver­ wendet. Fig. 3 stellt ein EDQ-Diagramm für das in Fig. 2 beschriebene Stoffge­ misch dar. Dazu werden die Quotienten verschiedener Wellenlängenkombinatio­ nen

gegeneinander aufgetragen (3 Wellenlängen i,j,k). Die geometrische Interpretation dieses Quotientenpaares sind die Steigungen von ausgezeichneten Geraden in den Diagrammen

ΔE_i vs. ΔE_j (Fig. 2)

und

ΔE_k vs. ΔE_j.

Mindestens 2 ED-Diagramme werden benötigt, um ein EDQ-Diagramm zu kon­ struieren (Fig. 3). So führen die beiden Aufwärtsgeraden von 2 ED-Diagrammen im korrespondierenden EDQ-Diagramm zu einem Punkt.

Ermittelt man die EDQ-Werte für die Punkte, die nicht im linearen Anfangsbereich bei den ins Verhältnis gesetzten ED-Diagrammen liegen und trägt diese im kor­ respondierenden EDQ-Diagramm gegeneinander auf, so ergibt sich eine Gerade.

Beim Erscheinen der 2. Komponente in dem von uns beschriebenen Anwen­ dungsbeispiel ordnen sich die resultierenden EDQ-Punkte ihrerseits auf einer Ge­ raden in Fig. 3 an. Um Entartungsfälle zu erkennen, werden mehrere Wellenlän­ genkombinationen getestet. Werden ausschließlich Geraden erhalten, ist sicher­ gestellt, daß der Chromatographie-Peak genau 2 Komponenten enthält (s = 2), wie im Ausführungsbeispiel beschrieben.

An diesem, wie an anderen Beispielen war es möglich, hochsignifikant nachzu­ weisen, daß in derartigen Peaks ausschließlich 2 Komponenten spektroskopisch erfaßt wurden.

Allgemein werden in den Peaks der Chromatogramme sowie der Elektrogramme ausschließlich nur dann zwei Komponenten (s = 2) spektroskopisch erfaßt, wenn die spektralen Meßdaten zu Geraden in den EDQ-Diagrammen führen. Praktisch empfiehlt es sich, Wellenlängen auszuwählen, die möglichst weit verteilt in den Spektren liegen. Wiederum genügen 5-10 Wellenlängen, um eindeutige Ergeb­ nisse zu erlangen. Das Verfahren ist auch hier für den Anwender völlig transpa­ rent. Es werden lediglich Differenzen und Quotienten gebildet. Dies geschieht ohne rechnerischen Aufwand.

Für die Quotientenbildung lassen sich verschiedene Ausdrücke heranziehen, so daß neben den EDQ-Diagrammen auch Extinktions-Quotienten (EQ)-, integrale EDQ- und integrale EQ-Diagramme konstruiert werden können. Das EDQ-Dia­ gramm geht direkt in das EQ-Diagramm über, wenn die Bezugswerte E_i,jk null betragen, so daß für die Extinktionsdifferenz ΔE_i,j (t) gilt:

ΔE_i,j(t) = E_i,j(t) - E_i,jk = E_ij(t).

Demnach werden bei den EQ-Diagrammen die Plots

hergestellt.

Bei den integralen EDQ-Diagrammen werden die entsprechenden Quotienten gebil­ det und gegeneinander aufgetragen:

Analog dazu wird das integrale EQ-Diagramm (iEQ) verwendet.

Für das Integrationsintervall Δλ (λ₂ - λ₁, λ₄ - λ₃, λ₆ - λ₅) hat sich bei Dioden­ arrayspektrometern im UV-VIS-Gebiet ein Differenzwert von etwa 4-10 nm bewährt.

Ein besonderer erfindungsgemäßer Vorteil der Verwendung der integralen iEQ- und iEDQ-Diagramme besteht darin, daß beispielsweise Chromatogramme im Falle des 2- oder Mehrkomponentensystems auch dann noch signifikant ausgewertet werden, wenn die Spektren stark verrauscht sind und/oder sich die Spektren der Einzelkom­ ponenten nur geringfügig voneinander unterscheiden. Durch die Integrationsbildung werden verrauschte Daten sichtbar gemacht, das Glätten des Rauschens erfolgt ohne Verlust am Real-Peak.

Differentielle Diagramme

Umgekehrterweise können anstelle der integralen Werte auch die durch Ableitung erhaltenen differentiellen Werte miteinander in Bezug gesetzt werden.

Dadurch wird eine Serie von differentiellen (d-)Diagrammen erhalten, die analog zu den normalen und den integralen Werten aus dE, dED, und/oder dEDQ Werten ge­ bildet werden. Diese Derivativ-Technik bringt den Vorteil einer noch schärferen Un­ terscheidung der Peak-Komponenten, jedoch wird dadurch auch das Rauschen der Basislinien amplifiziert.

Glättung von Meßkurven

Darüber hinaus empfiehlt es sich in vielen Fällen, zusätzlich eine Glättung der Meß­ daten mit Hilfe von Polynomen vorzunehmen, bevor die E-, ED-, EDQ-, iE-, iED-, iEDQ-, dE-, dED- und dEDQ-Diagramme konstruiert werden.

III. Verallgemeinerung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf Multipomonenten­ systeme beliebigen spektroskopischen Ursprungs

Bei Peaks mit Multikomponenten-Zusammensetzungen (s-Komponenten) wer­ den EQs und EDQs-Diagramme sowie deren integrale Formen konstruiert.

Ganz allgemein wird im EDQs-Diagramm der folgende Plot konstruiert (ΔE_λi = ΔE_i):

Es werden hier also die Quotienten von Determinanten des Ranges (s-1) in ei­ nem zweidimensionalen Diagramm gegeneinander aufgetragen. Dazu müssen Extinktionsdifferenzen von mindestens (s+1) Wellenlängen in die Auswertung einbezogen werden. Die doppelt indizierten Größen ΔE_mn (m = 1, 2 . . . (s+1), n = 1, 2. . . (s-2) beziehen sich auf experimentell bestimmte Extinktionsdifferenzen von (s-2) ausgewählten Meßwerten bei (s+1) Wellenlängen. Aus den Größen ΔE_i und ΔE_mn werden demnach Matrizen aufgebaut, deren Determinanten nach Quotientenbildung direkt zu den EDQs-Diagrammen führen.

In den EDQs-Diagrammen werden immer dann Geraden erhalten, wenn im zu untersuchenden Peak des Chromatogramms bzw. Elektrogramms sich genau s Komponenten spektroskopisch unterschiedlich bemerkbar machen. Auch hier werden in der Praxis durch Wellenlängenvariation verschiedene EDQs-Dia­ gramme konstruiert. Geraden, die parallel zu den Koordinatenachsen und durch den Ursprung führen, sind als Entartungsfälle zu verwerfen.

Das gesamte Verfahrensschema für die Erkennung und die Entflechtung von Multi-komponenten-Peaks ist in den Tabellen 1 und 2 zusammengefaßt.

Die erfindungsgemäßen Analysen- und Trennverfahren sind völlig unabhängig von der Kenntnis der Spektren und/oder von den Extinktionskoeffizienten einzel­ ner Komponenten.

Die Rechenoperationen einschließlich der Auflösung der Matrizen werden com­ putermäßig ausgeführt. Die Diagramme sind in allen Analysenstadien abrufbar und visualisierbar, wodurch der Anwender eines auf diesem Verfahren beruhen­ den Instrumentes bei nicht routinemäßigem Lauf Eigenentscheidungen einspei­ sen kann: Er verfügt über ein in allen Phasen transparentes, hochkontrollierba­ res, lernfähiges und steuerbares Instruments.

Selbst hochproblematische Trennungsprobleme werden auf diese Weise rasch, aufwandsarm und kostengünstig gelöst.

Dazu werden nachfolgend noch zwei besonders charakteristische Anwendungs­ beispiele von hoher Aktualität angeführt. Es handelt sich um Problemstellungen, für die ein dringender Lösungsbedarf besteht und die beim augenblicklichen Stand der Technik weitgehend ungelöst sind bzw. deren Bewältigung augen­ blicklich mittels vorerfindungsgemäßer Methoden einen unverhältnismäßig ho­ hen Aufwand erfordert.

Dopingkontrolle bei Vorhandensein von Markierungssubstanzen

Es kommt immer häufiger vor, daß ein gesetzlich untersagtes Dopingmittel durch zusätzliche Einnahme einer an sich harmlosen Substanz maskiert wird. Letztere hat die Eigenschaft, in den gesetzlich festgelegten Analysenverfahren eine Peakposition zu besetzen, die von den gesuchten Dopingsubstanzen ebenfalls eingenommen wird. Damit wird die analytische Dopingkontrolle unterlaufen. Die Analyse geht ihrer juristischen Beweiskraft verlustig. Zumindest ergibt sich ein nicht eindeutiger Zustand, der beim augenblicklichen Stand der Routine-Kon­ trollen ungelöst ist. Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem.

Durch fortschreitende, computergestützte Peakanalyse, beginnend bei einfachen E-Diagrammen und fortschreitend über ED-, EDQ-, EDQs-Diagramme und wei­ ter über ihre integralen und differentiellen Analoga bis zu Kombinationen dersel­ ben untereinander wird es grundsätzlich möglich, selbst quasi-identisch gele­ gene Peaks als eine Peak-Gruppe zu entlarven. Damit wird ein beabsichtigtes oder unbeabsichtigtes Unterlaufen der gesetzlichen Kontrollen aufgehoben und deren juristische Beweiskraft wiederhergestellt. Dazu finden die bisher üblichen Routine-Analysengeräte Verwendung, die lediglich um ein Dispositiv zur erfin­ dungsgemäßen automatisierten Peakzerlegung in seine Einzelbestandteile er­ gänzt werden.

Auffinden viröser und subviröser Erregermoleküle und ihre Unterscheidung von der Vielzahl nicht pathogener, zelleigener Komponenten

Die zunehmende Durchseuchung der gesamten belebten Welt durch immer neue Viren, Viroide, subviröse Erreger aller Art sowie unzählige intra- und extra­ zelluläre Übergangsformen zwischen ihnen (wie z. B. Satelliten, subgenome Segmente, Pseudoviren, Transposonen, Retrotransposonen, Plasmide) stellt eine bisher nicht dagewesene Gefahrensituation dar. Zahlreiche dieser Erreger sind hochpathogen im humanen, veterinären und phytosanitären Bereich bzw. modifizieren das Verhalten normalerweise harmloser Mikroorganismen im glei­ chen Sinne, so daß auch diese für Mensch und Tier gefährlich werden ("Killerbakterien").

Dazu gehören die Erreger neurodegenerativer Pathologien wie der Creutzfeldt- Jacob-Krankheit, von BSE und Scrapie, Erreger, die, wie zahlreiche andere, bis­ her unauffindbar geblieben sind. Die Aufgabe besteht darin, den jeweiligen Erre­ ger aus einer Suppe zelleigener quasi-identischer Nukleinsäuren herauszutren­ nen, dies zunächst zu seiner wissenschaftlichen Entdeckung, später zur routi­ nemäßigen Diagnose des entsprechenden Krankheitsfalles.

Ihrer insignifikantiven Unterschiede wegen erscheinen diese Moleküle bei den verschiedenen Detektionsmethoden samt und besonders in dem gleichen Peak, der seinerseits wieder von dem entsprechenden Peak aus nicht-infektiösem Zellmaterial nicht unterschieden werden kann.

Wegen dieser Schwierigkeiten ist z. B. die Entdeckung der Viroide durch T.O. Diener um Jahre verzögert worden, bis diese schließlich als eigenständige, hantelförmige Partikel elektronenmikroskopisch sichtbar gemacht werden konn­ ten. Diese Methode ist aufwendig und zeitraubend, auch ist sie für infektiöse Agentien im Tier- und Humanbereich wenig erfolgversprechend, da eine korpus­ kuläre visualisierbare Eigenexistenz der gesuchten viroid-analogen Nukleinsäu­ ren in der Tierzelle beim jetzigen Stand der Kenntnis ausgeschlossen scheint.

Die Entdeckung und Diagnose ist nur aus chromatographischen und elektropho­ retischen Trennmethoden zu erwarten, wobei es darum geht, aus einem multi­ kompositen Peak, der von quasi-identischen Molekülen verursacht wird, die An­ wesenheit oder Abwesenheit eines zusätzlichen Erregermoleküls abzulesen. Die bisherige Unmöglichkeit einer präzisen Peak-Fein-Analyse muß als Ursache dafür angesehen werden, daß es bisher nicht gelang, den primären Erreger von beispielsweise BSE zu finden, d. h. ihn aus einer Suppe quasi-identischer, nor­ mal-zellulärer Nukleinsäuren herauszufischen. Es ist charakteristisch für den un­ entwickelten Stand der Technik, daß zur Zeit die leicht identifizierbaren entarte­ ten Prion-Proteine als Verursacher der Krankheit angesehen werden, wobei zu bemerken ist, daß Prion-Proteine der molekularbiologischen Logik und der Ge­ samtheit der Befunde nach zwar das gut sichtbare Endergebnis, aber nicht die Ursache der Pathogenese darstellen und allenfalls als auto-katalysierender Ko- Faktor in einem bereits engagierten Krankheitsverlauf funktionieren können.

Wie bereits beschrieben, erlaubt auch hier das erfindungsgemäße Verfahren die Überschreitung bisher bestehender technischer Grenzen: multi komposite De­ tektionspeaks, die von quasi-identischen Molekülen oder sogar von verschieden stabilen schmelzisomeren Formen ein und derselben Nukleinsäure (z. B. Viroid) verursacht werden, können in ihre Einzelbestandteile feinaufgetrennt werden.

Je nach Schwierigkeitsgrad des gegebenen Falles wird dabei die Peak-Analyse mit immer weitergehender Perfektion vorangetrieben. Die Zahl der Parameter, der Kombinationen und die Organisation der Diagramme werden weiter ent­ wickelt, bis jede einzelne Peak-Komponente als identifizierbares Einzelphäno­ men erscheint.

Insbesondere können Erregermoleküle aus infiziertem Material, die im normalen, nicht pathogenen Zellmaterial nicht vorhanden sind, als solche ausgegrenzt wer­ den, dies sowohl zu ihrer Erst-Erforschung als auch später zur medizinischen Routine-Diagnostik.

Auch die verschiedenen Schmelz-Isomeren einer schließlich identifizierten Erre­ ger-Nukleinsäure sind voneinander unterscheidbar und als Einzelspezies er­ kennbar. Sie erlauben Aussagen darüber, ob es sich um schwach oder hochvi­ rulente oder ggf. nicht pathogene Erregerformen handelt.

Die daraus resultierenden Krankheitsverläufe können prognostiziert werden. Die Effizienz möglicher Medikamente kann rascher abgeschätzt werden, ohne mo­ nate- oder jahrelang auf das Erscheinen oder Nichterscheinen der langsamen progredienten letalen Syndrome warten zu müssen.

Von überragendem Interesse wäre dabei die Identifizierung bzw. Diagnose von nicht oder schwach pathogenen Erregerformen:

• - Sie erlauben im Einzelfall eine positive Diagnose:
  extrem lange Inkubationszeiten, kein Ausbruch der Krankheit zu "Lebenszeit"
• - Sie inspirieren ihre Verwendung als nicht-immunogener "Impfstoff", z. B. gegen BSE, da diese Moleküle durch Inkompatibilitäts-Besetzung der aktiven Zentren in der Zellmaschinerie einem später eindringenden virulenten Erreger den Zu­ tritt verweigern.

Dies ist ein weiteres Beispiel dafür, daß mit Hilfe des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens zahlreichen, durch den augenblicklichen Stand rein technisch limitierten Methoden in der Medizin und auf allen anderen Gebieten grenzüberschreitend neue Anwendungsgebiete und bisher nicht erwartete Perspektiven erschlossen werden.

Claims (7)

1. Verfahren zur Ermittlung der Anzahl von Komponenten in Peaks, Banden und Signalen, die zum Zwecke der Analyse und Stofftrennung in Spektrogrammen al­ ler Art überall dort erhalten werden, wo energiekorrelierte Meßwerte in Funktion eines evolutiven Parameters auf und wieder abgebaut werden, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die aus jeweils einem solchen Parameterwert hervorgehende, un­ terschiedlich energiekorrelierte Meßwerte-Schar gegeneinander in Beziehung ge­ setzt wird, wodurch charakteristische geometrische Figuren entstehen, in denen der verursachende evolutive Parameter nicht mehr enthalten ist und wobei die er­ haltenen Figuren in Funktion ihrer Komplexität stufenweise erst zu Geraden, dann zu Punkten reduziert werden, womit auf einfachste Weise die Anzahl der zu den Peaks beitragenden Komponenten und damit die bestandteilmäßige Zusammen­ setzung des gesamten Spektrogramms sowie des zu untersuchenden und/oder zu trennenden Stoffgemisches erhalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle der energie­ korrelierten Direkt-Meßwerte deren Differenzen, Quotienten oder Quotienten der Differenzen in einfacher oder multipler Weise zueinander in Bezug gebracht wer­ den, wodurch es progressiv möglich wird, 2,3,4 oder mehr Einzelbestandteile si­ cher aus dem Peak zu extrahieren sowie sie zu identifizieren und zu trennen.

3. Verfahren zur Ermittlung der Anzahl von Komponenten in Peaks, Banden und Signalen, die zum Zwecke der Analyse und Stofftrennung in Spektrogrammen al­ ler Art überall dort erhalten werden, wo energiekorrelierte Meßwerte in Funktion eines evolutiven Parameters auf und wieder abgebaut werden, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die in jeweils einem Parameterbereich von den zugehörigen Ener­ giemeßwerten umschlossenen Flächen als Integrale miteinander in Bezug gesetzt werden, wodurch geometrische Figuren entstehen, aus denen Peakzusammen­ setzung und Analysenergebnis abzulesen ist, was zusätzlich mit einer entschei­ denden Verbesserung des Signal/Rauschverhältnisses und mit einem entspre­ chenden Gewinn der Empfindlichkeit des zugehörigen technischen Verfahrens verbunden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle der Flächen- Integrale die Derivativ-Werte der 1., 2. oder höheren Ableitungen miteinander in Bezug gebracht werden, wodurch die mittels Anspruch 3 anvisierten Effekte um­ gekehrt werden. d. h. daß hierbei eine noch schärfere Peak-Komponenten-Tren­ nung erzielt wird, die jedoch mit einem ungünstigeren Signal-Rausch-Verhältnis verbunden ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der evolutive Parameter die Retentionszeit der Kolonne ist und der korrespondierende optische Meßwert die Extinktionsdifferenzen- und Extinktionsdifferenzen-Quo­ tienten-Diagramme und/oder ihre integralen Analoge bzw. ihre Differentialwerte konstruiert und in den technischen Prozeß manuell oder automatisch integriert werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der von dem evolutiven Parameter auf- und abgebaute Meßwert jede weitere spek­ trometrische Größe wie Fluoreszenzintensität, Drehwinkel, Reflexionsvermögen, Elliptizität sowie quantitativ gemessene NMR-lntensitäten, Röntgen- und Gamma- Strahlungen sein kann.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß an­ stelle der homologen Kombination von gleichen Meßwertgrößen, z. B. nur Extink­ tionen E_i, die aus ein und demselben Detektionsinstrument hervorgehen, hier si­ multan entstandene Meßwerte verschiedenartigster Natur, z. B. Extinktionen E_i und Drehwinkel α oder Extinktionen E_i und NMR-Werte heterolog miteinander kombiniert werden, was durch simultane Multi-Detektion mittels verschiedener In­ strumente realisiert wird und wodurch grundsätzlich alles was, vorher nicht trenn­ bar war, mit Hilfe einer geeigneten Kombination heterologer Detektionswerte trennbar wird.