DE19717431C2 - Verfahren und Vorrichtung zur Circulardichroismusspektroskopie von chiralen Verbindungen auf festen Trägern - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung für Mes­ sungen an chiralen Verbindungen, die an festen Trägern immobili­ siert, z. B. adsorptiv oder durch ionische oder kovalente Bindungen fixiert sind, mittels Circulardichroismus(CD)-Spektroskopie. Das Verfahren und die Vorrichtung liefern strukturelle Informationen über die chiralen Verbindungen.

Mittels CD-Spektroskopie kann die absolute Konformation von chiralen Verbindungen aufgeklärt und können Konformationsänderungen verfolgt werden. Hierbei wird linear polarisiertes Licht, im allgemeinen im sichtbaren oder im UV-Bereich, durch die (in der Regel in Lösung vorliegende) chirale Verbindung gestrahlt. Liegt die eingestrahlte Wellenlänge im Absorptionsbereich der chiralen Verbindung, so können elektronische Übergänge eintreten, die zu einer elliptischen Polari­ sierung des zuvor linear polarisierten Lichtes führen, das als Über­ lagerung einer rechts circular polarisierten und einer links circu­ lar polarisierten Teilwelle mit gleichen Amplituden und derselben Phasengeschwindigkeit aufgefaßt werden kann. Die Absorptionskoeffi­ zienten einer chiralen Verbindung für die rechts circular bzw. links circular polarisierten Teilwellen sind nicht identisch. Die Diffe­ renz der molaren dekadischen Absorptionskoeffizienten für die links circular bzw. die rechts circular polarisierte Teilwelle wird als Circulardichroismus bezeichnet. Nach dem Durchgang durch die Probe überlagern sich die nach der Absorption verbliebenen Anteile der ursprünglichen Teilwellen und ergeben elliptisch polarisiertes Licht, da sie nicht mehr die gleiche Amplitude und die gleiche Pha­ sengeschwindigkeit besitzen. Ändert man die Wellenlänge des einge­ strahlten Lichtes, so erhält man ein Spektrum, das den Circulardi­ chroismus als Funktion der Wellenlänge zeigt.

Ebenso kann die Probe nacheinander mit rechts- bzw. linkspolarisier­ tem Licht durchstrahlt werden, so daß man bei Variation der Wellen­ länge, wie zuvor beschrieben, ein Differenzspektrum gewinnt, das Rückschlüsse auf die Struktur der chiralen Verbindung zuläßt, z. B. auf deren absolute Konformation.

Zu den mittels CD-Spektroskopie untersuchten chiralen Verbindungen gehören u. a. verschiedene Polypeptide und Eiweißstoffe. Auch Konfor­ mationsveränderungen von an Grenzflächen adsorbierten Eiweißstoffen sind bereits CD-spektroskopisch untersucht worden (siehe z. B. Y.H. Chen et al., Biochemistry, Vol. 11, No. 22 (1972), 4120-4131; C.R. MacMillin et al., Journal of Colloid and Interface Science, 48, No. 2 (1974) 345-349; L.J. Smith et al., Biochimica et Biophysica Ac­ ta. 1121 (1992) 111-118; W. Norde et al.. Journal of Colloid and Interface Science. 112. No. 2. 447-456; W. Norde et al., Colloids and Surfaces 64 (1992), 87-93). Die Konformationsänderungen von Protei­ nen an Grenzflächen in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern spielen eine bedeutende Rolle in medizinischen, nahrungsmitteltech­ nischen und anderen technologischen Systemen. So setzen unerwünschte Prozesse an implantierten medizinischen Vorrichtungen, wie Sonden, Kathetern, Herzklappen usw., in der Regel durch Konformationsände­ rungen von Eiweißkörpern ein, die aus Körperflüssigkeiten auf der Oberfläche solcher Vorrichtungen adsorbiert werden. Weiterhin ist es von Interesse, für heterogen katalysierte Enzymreaktionen Enzyme in ihrer nativen Form zu immobilisieren, da sie nur in dieser Form ihre Wirkung entfalten können. Es wäre also aus verschiedenen Gründen er­ wünscht, die Konformation sowie Konformationsänderungen von Eiweiß­ stoffen bestimmen zu können, die auf festen Substraten immobilisiert sind.

Die relevanten spektralen Übergänge bei Polypeptiden und Eiweißstof­ fen liegen im UV-Bereich zwischen ca. 170 und 250 nm. Wenn die Sub­ strate mit den darauf befindlichen Eiweißstoffen durchlässig für Licht des betreffenden Wellenlängenbereiches sind, kann man Trans­ missionsmessungen durchführen. Dies ist jedoch bei den meisten Sub­ straten, wie Polymeren und Gläsern, nicht möglich, da diese in dem genannten Bereich nicht transparent sind.

Zur Lösung des Problems der mangelnden Transparenz der Substrate bieten sich Reflexionsmessungen an. Hierbei wird der Meßstrahl unter einem schrägen Winkel, in der Regel von 30° bis 70°, bezogen auf die zu vermessende Substratoberfläche, auf diese Oberfläche gelenkt, wo er reflektiert wird. Die hierbei eintretende Wechselwirkung mit der auf dem Substrat befindlichen chiralen Verbindung führt zu einer Polarisationsänderung im reflektierten Strahl, der analysiert wird. Voraussetzung hierfür ist lediglich, daß eine hinreichend glatte, stark reflektierende Oberfläche vorhanden ist.

Allerdings liefern Monolagen immobilisierter chiraler Verbindungen, wie sie bei Reflexionsmessungen vorliegen, aufgrund ihrer geringen Anzahldichte nur schwache Signale, die unterhalb der Auflösungsgren­ ze der gegenwärtig verfügbaren CD-Spektrometer liegen. Das Meßsignal der CD-Spektroskopie wächst mit der Anzahldichte der im Meßfleck er­ faßten chiralen Spezies.

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dessen Hilfe sich CD-Spektren von chiralen Verbindungen, wie Polypeptiden oder Eiweißstoffen, die auf Substraten immobilisiert Sind, in Reflexion gewinnen lassen. Die Empfindlichkeit des Verfah­ rens soll hierbei die Erfassung kleinster Konzertrationen der chira­ len Verbindung auf Trägern, wie dies bei Monolagen der Fall ist, ge­ statten. Hierdurch soll eine Nutzung des Verfahrens als Finger- Print-Analysenmethode ermöglicht werden.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Messung von CD- Spektren von chiralen, auf der Oberfläche von Substraten immobili­ sierten Verbindungen unter Reflexion eines Meßstrahles aus polari­ siertem Licht, bei dem der Meßstrahl mindestens zweimal nacheinander unter äußerer Totalreflexion an Oberflächen mit den adsorbierten oder immobilisierten chiralen Verbindungen reflektiert wird.

In der Praxis des Verfahrens wird der Meßstrahl, der in der Regel aus circular polarisiertem Licht besteht, im allgemeinen 2 bis 10 mal reflektiert, bevor er analysiert wird. Da das Licht entsprechend öfter mit der chiralen Verbindung in Wechselwirkung tritt, wird der polarisationsändernde optische Effekt exponentiell verstärkt.

Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Reflexio­ nen an voneinander unabhängigen Oberflächen ist in der Fig. 1 sche­ matisch dargestellt. Bei einer alternativen Ausführungsform, die in Fig. 2 schematisch dargestellt ist, finden die Reflexionen an zwei planparallelen Oberflächen mit darauf adsorbierten oder immobili­ sierten chiralen Stoffen statt.

Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zur Mes­ sung von CD-Spektren von chiralen, auf einem Substrat adsorbierten oder immobilisierten chiralen Verbindungen nach dem erfindungsgemä­ ßen Verfahren zu schaffen. Die Vorrichtung umfaßt eine Quelle für monochromati­ sches Licht von variabler Wellenlänge sowie eine Polarisationsoptik, die es erlaubt, unter äußerer Totalreflexion jeden Polarisationszustand einzustellen. Die Polarisationsoptik kann z. B. einen Polarisator, einen Modulator, einen Analysator für das reflektierte elliptisch polarisierte Licht und muß mindestens zwei Reflexions­ elemente zur Aufnahme des Substrats mit der immobilisierten chiralen Verbindung umfassen. Die Elemente der Vorrichtung müssen, den optischen Reflexionsgesetzen entsprechend, so anordbar sein, daß der von der Quelle für monochromatisches Licht ausgehende Meßstrahl über die Reflexionselemente in den Analysator gelangt. In der Regel weist die Vorrichtung nach der Erfindung 2 bis 10 solcher Reflexionselemente auf.

Die Reflexionskoeffizienten für s- und p-Licht unterscheiden sich in der Regel drastisch in Betrag und Phase. Dies gilt insbesondere für dielektrische Schichten, weniger für Metalle. Als p-polarisiertes Licht bezeichnet man dabei Licht, bei dem der elektrische Feldvektor parallel zu der durch Strahlrichtung und Flächennormale definierten Einfallsebene schwingt. Bei s-polarisiertem Licht schwingt der elek­ trische Feldvektor senkrecht zur Einfallsebene.

Stark unterschiedliche Reflexionskoeffizienten bewirken eine uner­ wünschte Änderung des Polarisationszustandes des Lichtes. Nach eini­ gen Reflexionen wandelt sich das einfallende circular polarisierte Licht in elliptisch polarisiertes um. Im Falle von optisch anisotro­ pen Proben sind in der Regel die s- und die p-Richtung keine Eigen­ polarisationsrichtungen. Die Anisotropie bewirkt eine Drehung der Ellipse. In all diesen ungünstigen Fällen scheitert die bisher be­ schriebene Ausführungsform des Verfahrens, da diese Effekte der eigentlichen CD-Messung überlagert sind und diese unkontrolliert verfälschen.

Bei einer ersten vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird diese unerwünschte Überlagerung der erwähnten Effek­ te vermieden, indem man eine vorzugsweise gerade Zahl von Reflexio­ nen vorsieht und die reflektierenden Oberflächen so orientiert, daß die p-Komponente der elektromagnetischen Welle bei der jeweils darauffolgenden Reflexion zur s-Komponente (und umgekehrt die s-Kom­ ponente zur p-Komponente) wird. Das ist dann der Fall, wenn bei je­ weils aufeinanderfolgenden Reflexionen die Einfallsebenen zueinander orthogonal stehen. Überraschenderweise wurde gefunden, daß bei die­ ser Anordnung und insbesondere bei einer geraden Zahl von Reflexio­ nen alle durch in Betrag und Phase unterschiedliche Reflexionskoef­ fizienten für p- und s-Licht hervorgerufenen Komplikationen bei der Bestimmung des CD-Effektes eliminiert werden. Es wurde gefunden, daß bei einer geraden Anzahl von Reflexionen und in Abwesenheit chiraler Moleküle einfallendes circular polarisiertes Licht am Detektor als weiterhin zirkular polarisiertes Licht ankommt.

Bei einer ersten vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind dementsprechend aufeinanderfolgende Reflexionsele­ mente so angeordnet werden, daß bei der Messung die Einfallsebenen der Reflexionen orthogonal zueinander stehen. Besonders flexibel sind die Vorrichtungen dann, wenn die Anordnung der Reflexionsele­ mente variabel ist, so daß aufeinanderfolgende Reflexionselemente, je nach den Gegebenheiten bei einer bestimmten Meßaufgabe, so an­ geordnet werden können, daß die Einfallsebenen der Reflexionen orthogonal zueinander stehen.

Bei einer zweiten vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens nach der Erfindung wird der Meßstrahl an mindestens zwei dünnen, licht­ durchlässigen Substraten mit einer adsorbierten oder immobilisierten chiralen Verbindung und einem jeweils dahinter angeordneten, zur Substratoberfläche mit der immobilisierten chiralen Verbindung parallelen Reflektor in der Weise reflektiert, daß der Meßstrahl nachdem er mit der chiralen Verbindung in Wechselwirkung getreten ist, zum Teil von der Oberfläche des Substrats als Oberflächenstrahl reflektiert wird, zum Teil durch das Substrat auf den Reflektor fällt und dort als Reflektorstrahl reflektiert wird, der erneut mit der chiralen Verbindung in Wechselwirkung tritt und zusammen mit dem Oberflächenstrahl erneut reflektiert oder analysiert wird.

Bei dieser Ausführungsform des Verfahrens nach der Erfindung wird die Intensität des zu analysierenden Strahles erheblich verstärkt, weil der Reflektor aus einem spiegelnden Material besteht, so daß der Teil des auftreffende Meßstrahles, der nach Reflexion des Ober­ flächenstrahles als Reststrahl verbleibt, dort als Reflektorstrahl reflektiert wird. Auf den Reflektorstrahl entfällt der überwiegende Teil des Lichtes, das schließlich analysiert wird, und damit auch ein bedeutender Teil des gemessenen Effekts. Weiterhin wird der polarisationsverändernde optische Effekt noch verstärkt und die Meß­ empfindlichkeit erhöht, weil das Licht des Reflektorstrahles zweimal in Wechselwirkung mit der immobilisierten chiralen Verbindung tritt. Schließlich eignet sich das Verfahren auch für Messungen an lichtun­ durchlässigen (opaken) Substraten, sofern man genügend dünne und dadurch lichtdurchlässige Substratschichten verwendet.

Der zweiten vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens entspricht eine zweite vorteilhafte Ausführungsform der Vor­ richtung, bei der die Reflexionselemente einen Reflektor tragen, auf dem bei der Messung das Substrat mit der rückseitigen (oder inneren) Oberfläche aufliegt und dessen Oberfläche parallel zu der (äußeren) Oberfläche des Substrats ist, auf der die chirale Verbindung immobi­ lisiert ist.

In Fig. 3 ist der Strahlengang an einem der Reflexionselemente ge­ mäß der zweiten vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens und der Vorrichtung dargestellt. Der einfallende, in der Regel circular polarisierte Meßstrahl 1 tritt in Wechselwirkung mit der immobili­ sierten chiralen Verbindung 2, wird an der Oberfläche des Substrats 3 zum Teil als Oberflächenstrahl 4 reflektiert, tritt zum anderen Teil als Reststrahl 5 in das optisch dichtere Substrat 3 ein, wird daher zur Senkrechten auf der Oberfläche des Substrats hin gebro­ chen, an der Oberfläche des Reflektors 6 als Reflektorstrahl 7 re­ flektiert. Dieser wird beim Austritt aus dem Substrat in das optisch weniger dichte Medium (z. B. Luft, Wasser, wäßrige oder organische Lösungen) von der Senkrechten weg gebrochen, tritt erneut in Wech­ selwirkung mit der immobilisierten chiralen Verbindung 2 und läuft gemeinsam mit und, wegen der geringen Stärke des Substrats, in ge­ ringem Abstand von dem Oberflächenstrahl 4 zum Analysator.

Nach dem Verfahren und mit der Vorrichtung nach der Erfindung können im Prinzip beliebige chirale Verbindungen auf ihre Struktur hin untersucht werden, die auf der Oberfläche von Substraten immobili­ siert sind. Dazu gehören u. a. Eiweißstoffe, wie Enzyme, Fermente, Botenstoffe des Immunsystems, Rezeptor- und Speicherproteine und Gerinnungskörper. Andere zur Messung geeignete chirale Verbindungen sind z. B. pharmazeutische Wirkstoffe. Die chiralen Verbindungen wer­ den im allgemeinen aus einer Lösung auf den Substraten immobili­ siert. Das Absorptionsspektrum der jeweiligen chiralen Verbindungen bestimmt die Wellenlänge des für die Messung verwendeten Lichtes. Im allgemeinen arbeitet man bei der Analyse von Peptiden oder Eiweiß­ stoffen mit Wellenlängen von 170 bis 250 nm.

Die chiralen Verbindungen können auf beliebigen Substraten immobili­ siert sein, die entweder ihrer Natur nach gut reflektierende Ober­ flächen haben, wie polymere Spritzgußplatten, oder deren Reflexions­ vermögen durch entsprechende Oberflächenbehandlung. z. B. Polieren, zweckentsprechend erhöht wurde. Für die erwähnte zweite vorteilhafte Ausführungsform des Verfahrens nach der Erfindung muß das Substrat lichtdurchlässig sein oder in so dünner Schicht vorliegen, daß sie lichtdurchlässig wird. Dies ist eine wichtige Bedingung, da anderen­ falls der Reflektor seine verstärkende Wirkung nicht entfalten kann. Geeignete Materialien sind z. B. Quarzglas, andere durchsichtige anorganische Materialien sowie organische Polymere oder Copolymere, wie Polyolefine, Polyamide, Polycarbonate, gesättigte oder ungesät­ tigte Polyester, Polyesteramide, Polyurethane, Polyetherurethane, Polyetherblockamide, Polystyrol, Polysäuren oder Polysiloxane, so­ weit diese nicht im Spektralbereich des Circulardichroismus der zu untersuchenden chiralen Verbindung absorbieren. Die Substrate können Standardpolymere oder durch Einbau bestimmter Monomere bzw. durch entsprechende Oberflächenbehandlung funktionalisiert, z. B. hydrophil oder hydrophob eingestellt sein, so daß im Hinblick auf die ange­ strebte biologische Wirksamkeit erwünschte Oberflächeneigenschaften erzielt werden.

Für die erwähnte zweite vorteilhafte Ausführungsform des erfindungs­ gemäßen Verfahrens müssen die Substrate dünn, vorteilhaft 5 nm bis 0,5 mm stark sein. Wenn ein Substrat zwar lichtdurchlässig, aber zu dick ist, z. B. 5 mm stark, laufen zwar Oberflächenstrahl und Reflek­ torstrahl parallel, aber in zu großem Abstand, was die Analyse zu­ mindest erschwert. Hinreichend dünne Substrate kann man z. B. durch Beschichtung der Reflektoren nach bekannten Verfahren herstellen. z. B. durch Spritzen, Tauchen, Rakeln oder Spin-Coating. Der Reflek­ tor besteht aus einem hochreflektierenden, spiegelnden Material z. B. einem Glasspiegel, hochpolierten Metallen oder Halbleitern, z. B. einem Siliciumwafer. Das Substrat liegt mit seiner Rückseite (oder inneren Oberfläche) direkt auf dem Reflektor auf. Dies bedeu­ tet nicht, daß das Substrat unbedingt fest, z. B. mittels eines Kle­ bers, mit dem Reflektor verbunden sein muß. Dies ist jedoch für eine hohe Gesamtintensität des Signals von Vorteil.

Wichtig ist weiterhin, daß die Oberfläche des Reflektors parallel zu der Vorderseite (oder äußeren Oberfläche) des Substrats ist, auf der die chirale Verbindung adsorbiert oder immobilisiert ist. Anderen­ falls laufen der Oberflächenstrahl und der Reflektorstrahl nicht parallel und können nicht oder nicht ohne weiteres zusammen analy­ siert werden.

In bezug auf die anderen aufgeführten Merkmale (Lichtquellen, Pola­ risatoren, Modulatoren, Analysatoren) unterscheidet sich die erfin­ dungsgemäße Vorrichtung nicht von entsprechenden bekannten Vorrich­ tungen. Die Vorrichtung kann neben den genannten Merkmalen auch Ele­ mente enthalten, die die Temperatur des Substrats verändern oder dieses während der Messung in Kontakt mit einer Flüssigkeit halten können. Auf diese Weise kann z. B. der Einfluß der Temperatur, des pH sowie von Fremdionen und anderen Molekülen, z. B. von Wirkstoffen, auf die Konformation von Eiweißstoffen untersucht werden.

In bezug auf die hier nicht angesprochenen Verfahrensparameter, wie Meß- und Auswertungsprogramme, bietet das erfindungsgemäße Verfahren keine Besonderheiten.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, nicht jedoch deren Anwendungsbereich begrenzen.

Beispiel 1

Mehrere hydrophobierte Siliciumwaferstücke der Größe 1 × 1 cm (von MEMC Electronic Materials, Inc.) wurden durch Spin-Coaten einer 5 %-igen Lösung von Polystyrol (Vestyron^(R)116 der Hüls AG) in Tetra­ hydrofuran mit einem dünnen Film des Polymeren beschichtet. Vier beschichtete Waferstücke wurden in einer speziell angefertigten Meß­ küvette aus Quarzglas verkippt positioniert, so daß die Einfallsebe­ nen aufeinanderfolgender Waferstücke zueinander orthogonal standen. Die Meßküvette besaß eine Zufluß- und eine Abflußmöglichkeit, so daß über eine Pumpe Flüssigkeiten in die Zelle eingeführt und ausge­ tauscht werden konnten. Die Waferstücke wurden mit einer 10^-6-mola­ ren Lösung von Humanserumalbumin (von Fa. SIGMA), welches bei Raum­ temperatur in einer phosphatgepufferten Lösung mit physiologisch pH (ebenfalls von Fa. SIGMA) von 7,4 vorliegt, 1 Stunde umspült. Nach Austausch der Proteinlösung gegen proteinfreie Pufferlösung (PBS) wurde das in Fig. 4 gezeigte Spektrum aufgenommen.

Beispiel 2

Durch Rakeln wurden zuvor hydrophobierte Siliciumwaferstücke der Größe 1 × 1 cm mit einer dünnen Polysiloxanschicht versehen. Vier be­ schichtete Waferstücke wurden in einer speziell angefertigten Meßkü­ vette aus Quarzglas wie in Beispiel 1 verkippt positioniert, so daß die Einfallsebenen aufeinanderfolgender Waferstücke orthogonal zu­ einander standen. In die Zelle wurde eine 10^-6-molare Lösung von Humanimmunoglobulin G (IgG) in Puffer mit physiologischen pH von 7,4 gefüllt und diese nach einer Stunde gegen reine Pufferlösung ausge­ tauscht. Das anschließend aufgenommene CD-Spektrum von (IgG) zeigt die Fig. 5.

Claims (14)

1. Verfahren zur Messung von CD-Spektren von chiralen, auf der Oberfläche von Substraten immobilisierten Verbindungen unter Refle­ xion eines Meßstrahles aus polarisiertem Licht, dadurch gekennzeich­ net, daß der Meßstrahl mindestens zweimal nacheinander unter äußerer Total­ reflexion an Oberflächen mit den adsorbierten oder immobilisierten chiralen Ver­ bindungen reflektiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die chi­ rale Verbindung ein Polypeptid oder ein Eiweißstoff ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Meßstrahl 2 bis 10 mal reflektiert wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Reflexionen an zwei planparallelen Oberflächen mit darauf immobilisierten chiralen Stoffen stattfinden.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei je­ weils aufeinanderfolgenden Reflexionen die Einfallsebenen zueinander orthogonal stehen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Meßstrahl an mindestens zwei dünnen, lichtdurch­ lässigen Substraten mit einer immobilisierten chiralen Verbindung und einem jeweils dahinter angeordneten, zur Substratoberfläche mit der immobilisierten chiralen Verbindung parallelen Reflektor in der Weise reflektiert wird, daß der Meßstrahl, nachdem er mit der chira­ len Verbindung in Wechselwirkung getreten ist, zum Teil von der Oberfläche des Substrats als Oberflächenstrahl reflektiert wird, zum Teil durch das Substrat auf den Reflektor fällt und dort als Reflek­ torstrahl reflektiert wird, der erneut mit der chiralen Verbindung in Wechselwirkung tritt und zusammen mit dem Oberflächenstrahl er­ neut reflektiert oder analysiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Sub­ strate 5 nm bis 0,5 mm dick sind.

8. Vorrichtung zur Messung von CD-Spektren von chiralen, auf einem Substrat adsorbierten oder immobilisierten chiralen Verbindungen nach den Verfahren der Ansprüche 1 bis 7, enthaltend eine Quelle für monochromatisches Licht von variabler Wellenlänge und eine Polarisationsoptik, die es erlaubt, unter äußerer Totalreflexion jeden gewünschten Polarisationszustand einzustellen, wobei die Polarisationsoptik mindestens zwei Reflexionselemente zur Aufnahme des Substrats mit der immobilisierten chiralen Verbindung aufweist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Polarisationsoptik neben den mindestens zwei Reflexionselementen einen Polarisator, einen Modulator und einen Analysator für das reflektierte elliptisch polarisierte Licht, umfaßt, wobei die genannten Elemente der Vorrichtung so anordbar sind, daß der von der Quelle für monochromatisches Licht ausgehende Meßstrahl in den Analysator gelangt.

10. Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß 2 bis 10 Reflexionselemente vorhanden sind.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Reflexionselemente als zwei planparallele Mehr­ fachreflektoren ausgebildet sind, die das Substrat auf einander zugewandten Seiten aufnehmen.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß aufeinanderfolgende Reflexionselemente so anordbar sind, daß bei der Messung die Einfallsebenen der Reflexionen orthogonal zueinander stehen.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine gerade Anzahl von Reflexionselementen vorhanden ist.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 13, dadurch gekennzeich­ net, daß die Reflexionselemente einen Reflektor tragen, auf dem bei der Messung das Substrat mit der rückseitigen (oder inneren) Ober­ fläche aufliegt und dessen Oberfläche parallel zu der (äußeren) Oberfläche des Substrats ist, auf der die chirale Verbindung immobi­ lisiert ist.