DE1963733A1

DE1963733A1 - Acylderivate des KTI

Info

Publication number: DE1963733A1
Application number: DE19691963733
Authority: DE
Inventors: Hans Dr Fritz; Harald Dipl-Chem Schult; Eugen Prof Dr Dr Werle
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1969-12-19
Filing date: 1969-12-19
Publication date: 1971-06-24
Also published as: FI47891C; FR2081386A1; CA923493A; CH546796A; JPS4821938B1; NO130481C; IL35726A; IL35726A0; ZA708057B; ES386644A1; BE760540A; NO130481B; AT300187B; GB1306819A; FR2081386B1; NL7018351A; FI47891B

Description

FARBENFABRIKEN BAYER AG

Leverkusen.Beyerwerk, 17* Dezember 1969

P.tenl-Abteilun*

Äcylderivate des KfI - '

Der Kallikrein-Trypsin-Inhibitor, im. folgenden als KTI bezeichnet (Warenzeichen Trasylol ^ der Farbenfabriken Bayer AG, Leverkusen), stellt seit vielen Jahren ein ganz besonders wertvolles Arzneimittel, vor allem gegen entzündliche Prozesse und gegen Verbrauchskoagulopathien dar.

KTI wird sehr stark in den Nieren gespeichert, was zur Folge hat, daß der KTI-Blutspiegel ziemlich schnell absinkt. Han hat sich aus diesem Grunde bemüht, KTI - Derivate aufzufinden, welche in den Nieren weniger stark gespeichert werden und welche daher einen länger anhaltenden hohen Blutspiegel ergeben.

Es wurde nun gefunden, daß Aylderivate des KTI dieser Forderung in hohem Maße entsprechen.

Unter Acylderivaten sollen hier alle diejenigen Derivate des KTI verstanden werden, in denen die β-Amino-Gruppen der Lysinreste des KTI in Stellung 26, 41 und 46 sowie die' Amino-Gruppe des N-terffiinalen Arginine des KTI teilweise oder vollständig acyliert sind, und zwar sowohl durch Garbonsäure- als auch' durch Sulfonsäurereste.

Die Zahl der in Frage kommenden Acylierungsmittel ist sehr groß* Beispieleweise seien genannt $

Xe A 12 703 - 1 -

109820/1888 ■

Essigsäureanhydrid

Acetylchlorid .

Diacetyl

Trifluoressigsäure-thioäthylester

1J, S-Diacetyl-2-aminoäthanthiöl

Kitrophenylacetat

Trinitrobenzolsulfonsäure

!f-Trifluoracetylimidäzol

If—Acetyl imidazo I

Tetrafluorbernsteinsäureanhydrid

Trifluoreasigsäureanhydrid

Keten

R-Aeetyl-alanin-p-nitrophenylester

Homoserinlacton _:

H-Benzyloxycarbonylchlorid

ΪΤ-Äthoxycarbonyl-phthalimid .

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen sind ebenso gut verträglich wie KTI. Ein wesentlicher Vorteil der neuen Verbindungen besteht darin, daß sie in den Nieren nicht sehr stark gespeichert werden und daher einen lang anhaltenden hohen Blutspiegel ergeben. Die neuen Verbindungen werden außerdem mit dem Harn ausgeschieden und erweisen sich daher besonders wertvoll bei Erkrankungen des Urogenitaltraktes. Sie besitzen im übrigen die gleiche Aktivität wie KTI selbst.

Diese Aktivität wird gemessen in Inhibitor-Einheiten IE. Eine IE entspricht der Hemmung der Aktivität von 1 mg Trypsin, gemessen mit N-U-Benzoyl-DI-arginin-p-nitro-anilid als Substrat unter den folgenden Standardbedingungent

5 ml Gesamtvolumen

Temperatur 25⁰C

1 cm Lichtweg

1 mg Substrat in 1 ml dest. Wasser

Le A 12 705 - 2 -

109826/1888

+ 10 mE Trypsin in 0,00.1 normaler HCl + χ ml Inhibitor-Losung :. ad 3,0 ml 0,2 molarem Triäthanolamin-Puffer,

pH 7,8

+ 0,02 Hole Calciumchlorid.

Die neuen Verbindungen werden dadurch hergestellt, daß man zunächst in an sich bekannter Weise den KTI mit Enzymen, z.B. Trypsin in einen KTI-Enzym-Komplex überführt /Chauvet u. Acher, J. Biol. Chemistry 2Ag₁ (1967), S. 42747- Dieser Komplex wird anschließend mit den o.a. Äcylierungsmitteln umgesetzt. Aus den so erhaltenen Acyl-KTI-Komplexen wird das Enzym in an sich bekannter Weise abgespalten /siehe die o.g. Literatur7« Man erhält dabei die Acylderivate des KTI in verhältnismäßig reiner Form, zweckmäßig werden sie jedoch den an sich bekannten Reinigungsmethoden unterzogen, z.B. Gel-Filtration oder Ionenaustausch-Chromatographie.

Die in diesem "Verfahren durchgeführte Bindung des KTI an ein Enzym und spätere Abspaltung des Enzyms ist erforderlich, um eine "Acylierung des reaktiven Zentrums des KTI zu verhindern.

Die erfindungsgemäßen Acylderivate des KTI können in der Medizin für die gleichen Indikationen eingesetzt werden, für die man den KTI selbst seit vielen Jahren mit großem Erfolg anwendet. Auch die Applikationsformen und anzuwendenden Dosen entsprechen weitgehend denen, die vom KTI her bekannt sind.

Beispiel 1

50 mg KTI und 188 mg Trypsin werden in 30 ml eisgekühltem (O⁰C) 0,1 M NaHCO₃-PUffer pH 8,5 (eingestellt mit 2 N NaOH) gelöst« Die Lösung wird so lange mit kleinen Mengen Trypsin bzw- KTI versetzt, bis mit 0,05 ml-Proben keine trypsinhemmende bzw. tryptisehe Aktivität mehr feststellbar ist. Die so erhaltene Lösung des KTI-Trypsin-Komplexes wird nach 2-stündi^·

Le A 12 703 - 3. -

1098 26/188 8

gem Stehenlassen (.OC.) mit 0,5 g feingepulvertem Maleinsäureanhydrid versetzt und der pH-Wert der Lösung durch laufende Zugabe von 2 N NaOH auf 8,5 gehalten» Jeweils gegen Ende .dar \ Verseifungsreaktion (erkennbar am starken Rückgang des Ver- , brauches an Natronlauge) werden weitere 0,5 g Maleinsäureanhydrid zugegeben, insgesamt 2 g in 4 Portionen. Wenn sich nach der letzten Zugabe von Maleinsäureanhydrid der pH-Wert stabilisiert hat, werden 18,5 g Harnstoff bis zu einer Endkonzentration von 6 M zu der lösung zugegeben und mit 2 N HCl der pH-Wert auf 1,9 eingestellt, wobei Maleinsäure und ein Teil des modifizierten Trypsins ausfallen. Zur vollständigen Ausfällung des modifizierten Trypsins werden 2,5 g Ammoniumsulfat in die auf O⁰C gekühlte Suspension eingerührt. Der Nieder- -

w schlag wird anschließend unter Kühlung abzentrifugiert, die überstehende klare Lösung abdekantiert, mit 2 ml 0,2 M TrI-äthanolamin-Puffer, pH 7,8, versetzt und mit 2 N NaOH neutralisiert (pH 7-8). Die neutrale, den Tetra(maleOyI)-KTI neben kleineren Mengen an Maleinsäure und modifiziertem KTI-Trypsin-Komplex enthaltende Lösung wird auf eine Sephadex G—50-Säule aufgetragen, die vorher mit 0,02 M Ammoniumacetat-Puffer, .pH 6,0, äquilibriert wurde. Die fraktionierung nach der Mole— külgröße erfolgt mit dem gleichen Puffer als Elutionsmittel. Die den Tetra(maleoyl)-KTI enthaltende Fraktion wird im Vakuum-Rotationsverdampfer bei 20⁰C Badtemperatur auf ca, 5 ml eingeengt und mit Hilfe einer Bio-gel-P-2-Säule entsalzt;, wpbei als Elutionsmittel dest. Wasser verwendet wird. Die salzfreie Fraktion des Tetra(maleoyl)-KTI wird lyophilisiert.

Ausbeute? Bezogen auf die eingesetzte Menge an nativem KTI · beträgt die Ausbeute an lyophilisiertem Tetra(maleoyl)-KTI 84 i» mit einer spezifischen Aktivität von 5,3 IE/mg.

Le A 12 703 - 4 -

10 9 8 2 6/1 888

Beispiel 2

Analog dem in Beispiel 1 geschilderten Verfahren wird durch Umsetzung des KTI-Trypsin-Komplexes mit der halben Menge an Maleinsäureanhydrid der Tri(maleoyl)-KTI dargestellt, wobei neben diesem noch Tetra(maleQyI)-KTI gebildet wird. Nach der Fraktionierung durch Gelfiltration an Sephadex G-50 werden 300-500 ¹J des Gemisches der Reaktionsprodukte auf. Celluloseacetatfolie, die mit 0,05 M Boratpuffer, ρΗ,.8,0, getränkt wurde, aufgetragen. Die Laufzeit des Elektropherogramms beträgt 1 Stunde bei einer Spannung von 6 V/cm. Es werden 2 Banden erhalten, die durch die Wanderungsstrecken von 0,56 für Tetra(maleoyl)-KTI und 0,64 für Tri(maleoyl)-KTI, bezogen auf eine Wanderungsstrecke von 1,0 für den nativen KTI charakterisiert sind. Durch präparative Elektrophorese mit z.B. Polyacrylamidgel als Trägermaterial lassen sich die beiden Derivate des KTI in größerem Maßstab gewinnen. Ausbeute: Bezogen auf die eingesetzte Menge an nativem KTI, beträgt die Ausbeute an lyophilisiertem Material 85 i° mit einer spez. Aktivität von 3,3 ΙΕ/mg. Das Verhältnis von Tetrazu Tri(maleoyl)-KTI beträgt 2/3 zu 1/3.

Beispiel 3

200 mg KTI und 715 mg Trypsin werden in 50 ml eisgekühltem Puffer gelöst und analog dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren der KTI-Trypsin-Kömplex dargestellt. Die Lösung des KTI-Trypsin-Komplexes wird mit 2 g Bernsteinsäureanhydrid, in 4- Portionen zugegeben, zum TetraCsuccinyl^l-KTI umgesetzt. Nach der Fällung des modifizierten Trypsins mit Ammoniumsulfat wird der Niederschlag abfiltriert und das FiItrat mit 8 N NaOH auf pH 6,.5 eingestellt. Diese Lösung wird auf eine Sephadex G-50-Säule, die mit 0,01 M Essigsäure äquilibriert wurde, aufgetragen. Als Blutionsmittel dient 0,01 M Essigsäure. Die den Tetra(succinyl)-KTI enthaltende Fraktion wird lyophilisiert. Ausbeuteί Bezogen auf die eingesetzte Menge an nativem KTI,

Le A 12 703 - 5 -

109828/1888

beträgt die Ausbeute (in mehreren Versuchen) an lyophilisier-r tem TetraCsuccinylJ-KTI 80-90 fo mit einer spezifischen Aktivität von 3,3-3,7 IE/mg.

, Beispiel 4

200 mg KTI werden analog dem in Beispiel 1 geschilderten Verfahren mit 715 mg Trypsin zum KTI-Trypsin-Komplex umgesetzt. Die Lösung des Komplexes wird mit 2 g Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid, zugegeben in 4 Portionen, zu einem Gemisch von Tetra-, Tri-, Di- und Mono(acetylmercaptosuccinyl)-KTI umgesetzt, das sich nach bekannten Methoden elektrophoretisch in ^ die Einzelkomponenten auftrennen läßt. Ausbeute! Bezogen auf die Menge an eingesetztem nativem KTI, beträgt die Ausbeute an lyophilisiertem Material 80- $■ mit einer spez. Aktivität von 3,3-3,7 IE/mg.

Beispiel 5

50 mg KTI und 188 mg Trypsin reagieren analog dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren zum KTI-Trypsin-Komplex. Der Lösung des Komplexes werden 2 g Garboxymethylmercaptobernsteinsäureanhydrid in 4 Portionen zugesetzt. Fach Zugabe von Harnstoff und Ansäuern des Reaktionsansatzes mit 2 H HCl auf pH 2,0 wird Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 3 i° zuge- W geben. Das ausgefällte modifizierte Trypsin wird abfiltriert und das Filtrat mit 8 N NaOH auf pH 6,5 eingestellt. Die Lösung wird an einer Sephadex G-50-Säule, die mit 0,01 M Essigsäure äquilibriert wurde, chromatographiert und die den modifizierten KTI enthaltende Fraktion lyophilisiert. Der modifizierte KTI wird gemäß dem in Beispiel 2 geschilderten Verfahren durch Elektrophorese auf Celluloseacetatfolie in Tetra(carboxymethylmercaptosuccinyl)-KTI und Tri(carboxymethylmercaptoBUccinyl)-KTI aufgetrennt. .

Ausbeute» Bezogen auf die eingesetzte Menge an nativem KTT, beträgt die Ausbeute an lyophilisiertem Tetra- und Tri(carboxymethylmercapto8Uceinyl)-KTI 65 1° mit einer spezifischen Akti-

• Ie A 12 703 - 6 -

109826/1888

vität von 3,3-3,7 IE/mg. .-....-. Beispiel 6

Die Lösung von 50 mg des nativeη-KTT und 190 mg Trypsin in 15 ml 0,1 M NaHGO,-Puffer, pH 8,5 wird mit einer lösung von 50 mg i-Dimethylaminonaphthalin-5-sulfonyl (= Dansyl) Chlorid in 7,5 ml Aceton gut vermischt und der Eeaktionsansatz 18 Stunden hei 2O⁰C inkubiert. Danach wird das Seaktionsgemisch mit 2 Ii HCl auf pH 2,0 angesäuert und Trichloressigsäure his zu einer Endkonzentration von 3 $> zugegeben. Nach kurzem Stehen wird das modifizierte Trypsin abfiltriert und das Filtrat auf eine Sephadex G-50-Säule, die mit verdünnter Ameisensäure, pH 2,0, äquilibriert wurde, aufgegehen. Die Fraktionen werden mit Ameisensäure, pH 2,0, eluiert und die den Dansyl-KTI enthaltende Lösung lyophilisiert.

Ausbeute: Bezogen auf die Menge an eingesetztem nativem KTI, beträgt die Ausheute an lyophilisiertem PoIy(I-DimethyIaminonaphthalin-5-sulfonyl)-KTI 35 $ mit einer spezifischen Aktivität von 3,3-3,7 IE/mg.

Beispiel 7

Die Lösung von 50 mg des nativen KTI und 190 mg Trypsin in 30 ml 0,1 M NaHCO,-Puffer, pH 8,5, wird im Verlauf von 2 Stunden unter lebhaftem Rühren mit 2 g Homocystein-thiolactonhydrochlorid in Portionen von 0,5 g versetzt, wobei in Stickstoff atmosphäre gearbeitet wird. Nach Zugabe von Harnstoff bis zu einer Endkonzentration von 6 M und Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 3 # wird ohne Stickstoffatmosphäre weitergearbeitet. Der Ansatz wird kurze Zeit stehengelassen, anschließend wird der Niederschlag abfiltriert und das Filtrat mit 8 N NaOH auf pH 6,0 eingestellt. Die Fraktionierung durch Gelfiltration an Sephadex G—50 erfolgt gemäß

Le A 12 703 - 7 -

10 9 8 2 6/1888

der in Beispiel 1 beschriebenen Methode. Die das Gemisch von PoIy(Ot-Amino-iT -mercaptobutyryl)-KTI enthaltende Fraktion
wird lyophilisiert.

Ausbeute: Bezogen auf die eingesetzte Menge an nativem KTI, · beträgt die Ausbeute an lyophilisiertem Poly(bi-Amino-^-mercaptobutyryl) -KTI 60 $> mit einer spezifischen Aktivität von 3,3-3,7 IE/mg.

Le A 12 703 - 8 -

109826/1888

Claims

Patentansprüche · *

1. Acylderivate des KTI.

2. Verfahren zur Herstellung von Acylderivaten des KTI, dadurch gekennzeichnet, daß man KTI in einen Enzymkomplex überführt, diesen mit acylierenden Mitteln behandelt und den dabei erhaltenen Acyl-KTI-Enzym-Komplex in an sich bekannter Weise spaltet.

5· Verwendung der Acylderivate des KTI als Arzneimittel.

Le A 12 703 - 9 -

10 9 8 2 6/1888