DE19617822A1

DE19617822A1 - Vorrichtung zur Verbesserung der Trennung in der Flüssigkeitschromatographie

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Publication number: DE19617822A1
Application number: DE1996117822
Authority: DE
Original assignee: PFEIFFER WOFDIETRICH
Current assignee: PFEIFFER WOFDIETRICH
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1996-05-03
Publication date: 1997-11-13

Description

In der Flüssigkeitschromatographie wird die Trennleistung über die Trennbodenzahl definiert. Die Trennleistung kann durch Veränderung der Trenn matrix bei Verwendung von feinkörnigeren, größen homogeneren, sowie poröseren Partikeln erhöht werden.

Das Verhältnis von Fließgeschwindigkeit zu Partikelgröße und Bindefestigkeit der Trennmatrix spielt auch eine entscheidende Rolle. Dieses die Beziehung zwischen Druck und Fließgeschwindigkeit bekommt bei Verwendung einer kompressiblen Trenn matrix eine erhöhte Bedeutung, weil es hier bei hohen Drücken zu einer vollständigen Blockierung kommen kann.

Zugang zur Literatur der hier behandelten Probleme: Trennbodenzahl, verschiedene Typen von Kompressions säulen, Krümmung der Elutionsfront in der konventionennen Chromatographie findet sich über: M. Perrut: J. Chrom. Ser. A 658 (1994) 293-313: Advances in supercritical fluid chromatographic processes.

Eine ausgezeichnete Trennung an der Matrix kann aber immer dadurch zu Nichte gemacht werden, daß es bei der Fraktionierung, beim Anschluß an die Trennung, zu einer erneuten Durchmischung kommt. Ursachen für dies als "tailing" bekannte Phänomen sind zu große Todräume am Ende des Chromatographie rohres, in der Ableitung. In den Detektoren. Aber auch eine Krümmung der Elutionsfront trägt hierzu bei. Durch die Verwendung von der der Elutionsfront angepaßter Abschlußstücke schafft folgende deutsche Offenlegungsschrift Abhilfe: P 44 40 805.6-41, Priorität 16.11.1993: Verfahren und Vorrichtung zur effektiven Trennung gelöster und ungelöster Stoffgemische.

Unbehandelt blieb hierin, wie bei Säulen mit sehr großen Durchmessern der zeitliche Elutions unterschied zwischen der Randzone und dem Zentrum ausgeglichen werden kann. Dieser Zeitunterschied bestimmt gegenwärtig die maximal möglichen Durchmesser von Chromatographiesäulen.

Das entsprechende Problem des Zeitversatzes zwischen Randzone und Zentrum tritt an beiden Enden des Trennrohres beim Übergang zu den zuführenden bzw. ableitenden Schläuchen auf.

Das "tailing" stört besonders dort wo scharfe und homogene Auftragszonen eine wesentliche Voraus setzung für gute Trennungen sind.

Dies gilt zum einen für alle analytischen Trennungen.

Zum Anderen trifft es auf alle Trennungen im preparativen Maßstab zu, weil ein höherer Reinigungsfaktor sich direkt in geringeren Kosten sowie einen höheren Reinheitsgrad niederschlägt.

Dies gilt in ganz besonderen Maße für die Gelchromatographie (Ausschlußchromatographie) und die fraktionierende Kristallisation. Denn bei den in diesen Verfahren verwendeten Gelen kommt es zu einer vom Elutionspuffer abhängigen Volumen schwankung, die einen zusätzlichen Todraum an der Auftragstelle schafft und außerdem die Gefahr von Rißbildungen ("channeling") heraufbeschwört. Zur Behebung dieser bekannten Störungen wurde die Auftragszone z. B. als Stempel ausgeführt und z. B. hydraulisch nachgeführt. Bei einem anderen Säulentyp wird die Packungshöhe der Trennmatrix durch Hin- und Herschieben eines Kegels konstant gehalten - allerdings wird dort ein zylindrisches Trennrohr verwendet.

Für diese Kompressionssäulen ist eine aufwendige Regelung und Mechanik notwendig, außerdem treten Dichtungsprobleme an den beweglichen Teilen auf.

Wir sehen unsere erfinderische Aufgabe darin chromatographische Vorrichtungen zu entwickeln, die die beschriebenen Nachteile nur in sehr viel geringerem Umfange zeigen. Dies sind:
das zeitlich ungleichmäßige Durchströmen der Trennmatrixendflächen,
das durch Volumenänderungen bedingte "tailing" und "channeling",
die Durchmesserbegrenzung präperativer Säulen, die Verbreiterung der Auftragszone durch Turbulenzen und Diffusion,
komplizierte Vorrichtungen zum Druckaufbau in Kompressionssäulen.

Die Lösung der erfinderischen Aufgabe besteht zum einen darin Endstücke zu konstruieren, die den Zu- und Abfluß jeweils in unmittelbarer Nachbarschaft zur Trennmatrix in mehrere gleichgroße Teilströme erlaubt, und dadurch einen zeitgleichen und getrennten Stofftransport ermöglichen. Dies wird dadurch gelöst, daß der Stoffstrom durch die Trennmatrixendflächen in Einzelströme aufgeteilt wird, die nach definierter Zeit durch die Art ihrer konstruktiven Verbindung, zusammengeführt werden.

Zur Lösung dieser Aufgabe haben wir zwei Bautypen entwickelt, die sich in der Art des Probenauftrages unterscheiden.

Im ersten Bautyp werden Probe und Elutionspuffer über zwei verschiedene Leitungssysteme zugeführt.

Im zweiten Bautyp wird hierfür dasselbe verzweigte Leitungssystem benutzt.

Beim ersten Bautyp findet sich die Zuleitung für den Elutionspuffer an der Spitze des kegelförmig ausgebildeten Innenlumens an der Zulaufseite.

Entgegen gängiger Praxis kann hier trotz eines großvolumigen Auftragendstückes, bei richtiger Anwendung, ein unverdünnter Probenauftrag erreicht werden.

In der typischen Ausführungsform wird der Proben auftrag dem Elutionspuffer, bei anfangs geschlossenem Auslaß, unterschichtet. Der Auftrag muß also spezifisch schwerer sein - oder er muß schwerer gemacht werden. Falls dies nicht möglich oder nicht erwünscht ist, kann man die Säule umdrehen, so daß der Auftrag aufschwimmt und sich dadurch unterhalb der Trennmatrix sammelt.

In beiden Fällen der Anordnung bildet sich in unmittelbarer Nachbarschaft zur Trennmatrix eine durch die Schwerkraft bedingte homogene Schicht über den ganzen Querschnitt aus. Wesentlich hierbei ist, daß am Anfang des Probenauftrages der Säulenauslaß nicht geöffnet wird.

Wenn äußerst scharfbegrenzte Auftragszonen notwen dig sind kann die Zone des ersten verdünnten Auftrages über ein geöffnetes Ausgleichsventil entfernt werden. Mit geringen Verlusten an Ausgangs produkt kann so eine zusätzliche Zonenverschärfung erzielt werden. Bei dem beschriebenen Proben auftrag in einer scharfen Zone entfällt die bisherige Durchmesserbegrenzung des Trennrohres, weil sich diese Schicht über den ganzen Durchmesser erstreckt und mit der Trennung erst begonnen wird, wenn ein geschichteter Gradient sich ausgebildet hat.

Störungen, die durch Volumenänderungen der Matrix entstehen werden mittels Kompression und beweglich gelagerter Loch- und Filterplatten behoben. In einfachster Ausführung erfolgt das Anpressen über Federn aus rostfreien Stahl.

Alle beweglichen Teile sind vollständig im Trennrohr eingeschlossen. Die Dichtunsprobleme an beweglichen Teilen entfallen damit.

Die zweite Störung des "channeling" wird durch Ver wendung eines konischen Trennrohres behoben. Dies hat allerdings zur Folge, daß zum Ausgleich der unterschiedlichen Trennstrecken im Zentrum und am Rande von konischen Trennsäulen ein dazu passender gekrümmter Siebboden verwendet werden muß, der die Unterschiede in der Laufstrecke ausgleicht.

Damit die erzielte Auftrennung nicht wieder verlorengeht ist es notwendig, daß am Ende der Trennmatrix austretende Eluat in Einzelströme aufzuteilen und sie auch einzeln abzuleiten.

Es besteht aber auch die Möglichkeit die von der konischen Form des Trennrohres herrührende Krümmung der Elutionsfront auf andere Art zu eliminieren. (Dies ist in Fig. 6B dargestellt.) In die konische Trennvorrichtung wird ein Kegel mit gleicher Neigung wie das Trennrohr eingebracht. Hierdurch kommt es zu einer parallelen als auch beschleunigten Durchströmung der Trennmatrix - hierdurch wird außerdem der Stoffstromanteil ausgeblendet, der zur Verzerrung der Elutions front führt (vergl. Fig. 7). Dies geht allerdings gleichzeitig zu lasten der Trennkapazität. Dies dürfte in vielen Fällen aber tolerierbar sein.

Der zweite Bautyp zeichnet sich dadurch aus, daß für den Proben- und Pufferauftrag dasselbe verzweigte Stoffverzweigungssystem verwendet wird.

Die Vorteile dieser Erfindung treten bei präperativen Säulen mit großen Durchmessern am deutlichsten hervor. Sie lassen aber auch bei Säulen mit geringen Durchmessern Vorteile erwarten, wie die zitierte Arbeit von Perrut nahelegt.

Die hier vorgestellten Kompressionssäulen bauen den Druck im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Trennsäulen mit Hilfe des in der Trennmatrix beschleunigten Stoffstromes an dem Ort auf wo er gebraucht wird.

Die Kompression setzt sich genaugenommen aus zwei Anteilen zusammen, aus dem mechanischen In-Position-Halten der Trennmatrix, z. B. durch Federn aus nichtrostenden Stahl innerhalb des Druck gehäuses, und aus dem im konischen Rohr auf jedes Partikel wirkenden Kräfte der beschleunigten Strömung.

Die letztgenannte Kraft ist dabei die wichtigere. Aus diesem Grunde sind Federn im Gehäuse im normalen Betrieb im Niederdruckbereich entbehrlich, wenn die Schwerkraft bei normaler Anordnung der Trennvorrichtung die Loch- und Siebplatte anpreßt. In der hier beschriebenen Bauform der Trennvor richtung wird ohne eine zusätzliche Druckquelle eine Kompression innerhalb der Trennmatrix erzeugt, der für eine feste Packung auch bei großen Durch messern sorgt, und die Trennleistung erhöht und gleichzeitig die Gefahr des "channeling" mindert. Hierdurch werden größere Durchmesser mit kürzeren Bauhöhen möglich.

Bei geringerer Bauhöhe bleibt der Druckabfall an der Trennmatrix klein. Was verschiedene Vorteile mit sich bringt:
Druckempfindliche Trennmedien bekommen einen größeren Einsatzbereich.
Bei gleicher Betriebsdruck und gleicher Trennkapazität verkürzt sich die Trennzeit.
Im analytischen Betrieb bekommt man steilere und symmetrischere Peaks.
In der Produktion sind im automatischen Betrieb bei gleichen Druck pro Zeiteinheit mehr Zyklen als bisher möglich.
Wegen der erhöhten Trennbodenzahl werden die Verluste geringer und die Produkte sauberer.

1. Beispiel

Vorrichtung zur preparativen Auftrennung von Inhaltsstoffen aus einer im Vergleich zum Elutionpuffer spezifisch schwereren Lösung oder Suspension.

Besonders vorteilhafte Anwendungen für dies Bei spiel sind die Entsalzung einer Proteinlösung und die fraktionierende Kristallisation. Fig. 2 zeigt das Oberteil, Fig. 6 das Unterteil des Trennrohres und Fig. 1 das Flußschema für seine Anwendung. (Die zusätzlichen Öffnungen des Auffangtrichters Fig. 6-8,-9 bleiben in diesem Beispiel verschlossen. Von den in Fig. 1 gestrichelt gezeichneten Stoffstromverlauf wird in diesem Beispiel kein Gebrauch gemacht.)

2. Beispiel

Vorrichtung zur preparativen Auftrennung von Inhaltsstoffen aus einer im Vergleich zum Elutionspuffer spezifisch leichteren Lösung oder Emulsion.

Im Vergleich zu Beispiel 1 muß die Vorrichtung modifiziert werden. Die Trennrichtung ist jetzt von unten nach oben (Richtung weicht von der Darstellung in Fig. 1 ab). Entsprechend muß auch das in Fig. 3 dargestellte Auftragsendstück verwendet werden. Da die Schwerkraft der Trennrichtung entgegenwirkt muß auch eine andere Eluatableitung gewählt werden die nicht mehr von der Schwerkraft abhängt. Ein geeignetes Endstück ist in Fig. 5 dargestellt.

3. Beispiel

Für die gleiche Aufgabe wie in Beispiel 1 bzw. 2 kann man auch präparative Säulen mit einem kegelförmigen Verdrängungskörper wählen. Diese Säulen haben dann im Gegensatz zu den in Beispiel 1 verwendeten Trennrohren mit gewölbten Boden einen geraden Boden.

Zu diesem Zweck kombiniert man das Oberteil in Fig. 8 mit dem Unterteil aus Fig. 11 zu einem Trennrohr.

4. Beispiel

Vorrichtung zur analytischen Auftrennung

Für die analytische Trennung wird im Vergleich zu den vorherigen Beispielen ein sehr viel schlankeres Trennrohr verwendet. Die Elutionsfront wird durch den eingesetzten Kegel weitgehend begradigt, so daß die Siebendplatte zur Entzerrung der Elutionsfront nur schwache gekrümmt zu sein braucht, um auch für die Wandeffekte zu korrigieren.

Diese Säule ist wegen der eingebauten Feder für beide Trennrichtungen geeignet.

5. Beispiel

Trennsäule mit externer Kompression

Nach dem in Fig. 10 und Fig. 11 dargestellten Prinzip, der Aufteilung der Austrittsfläche in kleinere Flächen von denen einzeln zu- bzw. abgeleitet wird, können nicht nur präperative Säulen (wie hier dargestellt) sondern auch analytische Säulen (hier nicht dargestellt) konstruiert werden. Bei solchen Säulen kommt man wegen der kleineren Durchmesser mit einer geringeren Zahl von Stoffströmen aus. Eine geeignete Anordnung ist der Auftrag über einen Ringkanal (entsprechend Fig. 10-5) mit der Zuführung von 6 Teilströmen und die Ableitung über nur eine zentrale trichterförmige Bohrung (entsprechend Fig. 11-5).

Für dieses Beispiel findet das Stoffstromschema aus Fig. 12 Anwendung.

Legende zu den Abb. 1 bis 12

Fig. 1
Fließschema für getrennten Probe- und Pufferauftrag
1 Ventil zur Wahl zwischen Probe (A) und Puffer (B)
2 Pumpe zum Proben- und Pufferauftrag
3 Ventil zur Wahl des Auftragortes in der Trennsäule
4 Ventil zur Wahl zwischen Pufferauftrag und Öffnen des Druckausgleiches/Überlaufes.
5 Absperrventil am Trennrohrende
6 Ventil zur Wahl des Behälters für Produkt/Abfall
10 Ventil zur Belüftung des Auffangtrichters. Das Öffnen führt zur Entkoppelung von Trennungs vorgang und Elution.
7 Pumpe mit Laufrichtung B: Elution
Laufrichtung A: Befüllen und Waschen des Auffangtrichters
8 Ventil zur Wahl zwischen Waschen und Elution
9 Ventil zur Wahl zwischen Abfall und Produkt

Fig. 2
Auftragseite für normale Trennrichtung und ge trennten Auftrag von Probe und Puffer
1 Trennmatrix
2 Verteilerlochplatte mit hohem Eigengewicht
3 konisches Trennrohr
4 konischer Deckel
5 Siebplatte
6 Diffusor: Siebplatte zur Verteilung des Puffers
7 Probenzuleitung
8 Ringdichtung mit Dreiecksquerschnitt
12 Clampdichtung
13 Deckel
14 Überlauf bzw. Pufferzuführung
15 Verschluß/Stopfen
16 O-Ring

Fig. 3
Auftragsseite für beliebige Trennrichtung mit getrennter Zuleitungen für Probe und Puffer
1 bis 4; 6, 7 und 12 bis 16 sind identisch mit Fig. 2
5 Faservließ dient als Sieb und als seitliche Abdichtung
8 Druckfeder aus nichtrostenden Stahl
9 Platten aus nichtrostenden Stahl zur Positio nierung der Federn
10 Lochplatte zur Aufnahme des Federdruckes
11 Flanschdichtung für Druckplatte und Deckel

Fig. 4
Kompressionssäule für analytische Trennungen
1 Trennmatrix
2 Lochplatte mit integriertem Verdrängungskörper
3 Trennrohr
4 Schraubdeckel
5 Siebplatte
6 Diffusor
7 federnde Kanüle als Probenzuleitung
8 Anpreßfeder aus nichtrostenden Stahl
9 schwach gewölbte Siebplatte
10 Auffangtrichter mit Gewinde
11 O-Ringe
12 Ringdichtungen mit Dreiecksquerschnitt
13 Führungsrillen, die als Pufferzuleitung dienen
14 Pufferzuleitung

Fig. 5
Ableitung von der gewölbten Lochplatte durch ein geschlossenes Schlauchsystem für beliebige Trenn richtung
1 gekrümmte Lochplatt mit konischen Bohrungen und Nippeln zur Ableitung des Eluates
2 Siebplatte aus nichtrostenden Faserfließ
3 konisches Trennrohr
4 Schlauchlumen der Ableitungen sind gleich groß
5 Konische Bohrung
6 Zusammenführung der Schlauchleitungen

Fig. 6
Fakultativ offene Stoffstromableitung am gewölbten Chromatographieboden
1 gekrümmte Lochplatte
2 drahtgewebeverstärktes Faservließ
3 komisches Trennrohr
4 Abtropfdrähte
5 Auffangtrichter
6 Auslauf
7 absperrbare Belüftungs-/Waschöffnung
8 Zusätzliche Öffnung für Puffer bzw. Eluat
9 Buchse für Meßfühler

Fig. 7
Schematische Darstellung des durch den Verdrängungs körper veränderten Stromlinienverlaufes
A Stromlinienverlauf im konischen Trennrohr
B Stromlinienverlauf nach Einsetzen des Ver drängungskörpers

Fig. 8
Auftragseite mit getrennter Zuführung von Probe und Puffer mit integrierten Verdrängungskegel
Die Benennungen sind identisch mit Fig. 2, lediglich der Verdrängungskegel (2) ist zusätzlich in die Lochplatte integriert. Bei normaler Trennrichtung ist er massiv und bei umgekehrter Trennrichtung hohl ausgebildet damit er aufschwimmt.

Fig. 9
Auftragseite für normalen und umgekehrten Betrieb mitverzweigter Zu- und Ableitung
Die Benennungen sind außer denen von 7 und 14 mit denen in Fig. 2 identisch.
7 Druckzufuhrleitung
14 Puffer und Probenzuleitung

Fig. 10
Auftragsseite für normalen und umgekehrten Betrieb mit verzweigter Zu- und Ableitung sowie Ver drängungskörper
Die Benennungen sind identisch mit Fig. 9

Fig. 11
Ebene Trennrohrendplatte zur Verwendung mit Verdrängungskegel in beliebiger Fließrichtung
1 Lochplatte mit konischen Bohrungen
2 Verdrängungskegel
3 konisches Trennrohr
4 Nippel zur Eluatableitung
5 Siebplatte
6 Schlauchsystem zur Ableitung

Fig. 12
Fließdiagramm des Stoffstromes bei Kompressions säulen mit verzweigtem Leitungssystem
1 Ventil zur Wahl zwischen Probe und Puffer
2 Ventil zur Druckregulierung
3 Absperrventil des Trennrohres
4 Ventil zur Wahl zwischen Produkt und Abfall
5 Pumpe zum Flüssigkeitstransport

Claims

1. Eine Vorrichtung zur Verwendung in der Flüssig keitschromatographie, bestehend aus einem sich in Trennrichtung verjüngenden Trennrohr, zwei Abschluß stücken, die die Trennmatrix im Trennrohr zurück halten und den flüssigen Stoffstrom verteilen, wobei die am Auftragsende gelegene Siebplatte und die ihr anliegende Lochplatte durch die auf sie wirkende Kraft die Trennmatrix zusammenpressen ist dadurch gekennzeichnet,

- daß durch die beschleunigte Strömung im konischen Rohr die Trennmatrix kompremiert wird
- daß die größere bewegliche Lochplatte den Zustrom zu den einzelnen Löchern in gleichgroße, zeitgleich bei der Trennmatrix ankommende, Teilströme aufteilt
- daß die kleinere Lochplatte in der Form der Elutionsfront ausgebildet ist und das Eluat in gleichgroße Teilströme so aufteilt, daß sie gleich zeitig an der Zusammenlaufstelle eintreffen.

2. Die Vorrichtung nach Anspruch 1 ist dadurch gekennzeichnet, daß ein raumfüllender geschlossener Kegel, der den gleichen Winkel wie das konische Trennrohr zeigt in die Trennmatrix eingesetzt ist. Dieser Konus bildet zusammen mit der Lochplatte am Auftragsende eine Einheit, der den Stoffstrom auf teilt und seine Fließrichtung bestimmt.

3. Die Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2 mit beliebiger Trennrichtung ist dadurch gekenn zeichnet, daß sowohl die Probe als auch der Puffer über das selbe verzweigte Leitungssystem zugeführt werden.

4. Die Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2 mit der Trennrichtung von oben nach unten ist dadurch gekennzeichnet,

- daß der Puffer und die Probe mit zwei verschiedenen Leitungssystemen aufgetragen werden
- daß am Auftragsende des Trennrohres die Probe dem Puffer über eine Zuleitung, die direkt an der Lochplatte mündet, unterschichtet wird
- daß für den Druckausgleich beim Probenauftrag ein separate verschließbare Öffnung am höchsten Punkt des Trennrohres vorhanden ist
- daß nach der Auftrennung das Eluat über einen Trichter aufgefangen und abgeleitet wird.

5. Die Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2 mit der Trennrichtung von unten nach oben ist dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer und die Probe mit zwei verschiedenen Leitungssystemen aufgetragen werden

- daß am tiefsten Punkt des Auftragsendes zum Druck ausgleich beim Probenauftrag eine verschließbare Öffnung vorhanden ist
- daß die Probe direkt unterhalb der Trennmatrix dem Elutionspuffer überschichtet wird
- daß sich der Zulauf für den Elutionspuffer am äußersten unteren Ende des Trennrohres befindet
- daß das Eluat über ein Schlauchsystem das in eine Lochplatte mit konischen Bohrungen als Verteiler mündet abgeleitet wird.

6. Der Trichter der Vorrichtung nach Anspruch 4 ist dadurch gekennzeichnet, daß er in Nachbarschaft zur kleinen Lochplatte verschließbare Belüftungs kanäle enthält

- daß er neben dem normalen Auslaß einen zusätzlichen Auslaß mit getrennter Absaugung bzw. Pufferzuführung besitzt.