DE19610119A1 - Antikörper zum Nachweis von Cytosin Deaminase - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper gegen Cytosin Deaminase, Ver­ fahren zur Herstellung solcher Antikörper und ihre Verwendung.

Die selektive Abtötung von Zellen wird in der Tumortherapie angestrebt. Hierzu könnte sich die Kombination aus Cytosin Deaminase (CD) und 5-Fluorcytosin eignen. (CD) ist ein Enzym, das in Bakterien und Pilzen, nicht aber in Säugetier­ zellen vorkommt. Es katalysiert die Deaminierung von Cytosin zu Uracil und auch die Umwandlung von für Säugetierzellen nicht-toxischem 5-Fluorcytosin in toxisches 5-Fluoruracil. Für die selektive Abtötung von Zellen müßte diesen 5- Fluorcytosin verabreicht werden. Gleichzeitig müßte in diesen Zellen (CD) ex­ primiert werden. Der Nachweis der Expression von (CD) in Zellen kann bisher aber nicht spezifisch geführt werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu­ stellen, mit dem die Expression von (CD) spezifisch nachgewiesen werden kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit gegen Cytosin Deaminase (CD) gerichtete Antikörper.

Der Ausdruck "Cytosin Deaminase (CD)" umfaßt eine Cytosin Deaminase jegli­ cher Art und Abstammung. Vorzugsweise stammt (CD) von E.coli. Auch kann (CD) als Fragment vorliegen. Desweiteren kann (CD) Bestandteil eines Fusions­ polypeptids sein.

Erfindungsgemäße Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein, wobei monoklonale Antikörper bevorzugt sind. Die Antikörper können aus jeglichem Tier oder dem Menschen erhalten sein, wobei für polyklonale Antikörper Kanin­ chen und für monoklonale Antikörper Mäuse bevorzugt sind.

Ferner können die Antikörper synthetisch sein, wobei ihnen ggfs. Teile, die für die Erkennung von (CD) nicht notwendig sind, ganz oder teilweise fehlen bzw. diese Teile durch andere ersetzt sind, die den Antikörpern weitere günstige Eigenschaften verleihen.

Bevorzugte Antikörper der vorliegenden Erfindung sind gegen (CD) von E.coli gerichtet. Besonders bevorzugt sind solche Antikörper, die monoklonal sind. Beispiele solcher Antikörper wurden als 16D8F2 bei der DSM unter DSM ACC 2220 am 14. Juni 1995 hinterlegt.

Erfindungsgemäße Antikörper können nach üblichen Verfahren hergestellt werden. Sollen polyklonale bzw. monoklonale Antikörper hergestellt werden, ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen für polyklonale und Mäuse für mono­ klonale Antikörper, mit (CD), insbesondere von E.coli, und/oder Fragmenten davon, zu immunisieren. Besonders geeignet ist hierfür ein Fusionspolypeptid von (CD), insbesondere von E. coli-(CD). Der Ausdruck "Fragmenten davon" umfaßt auch synthetische Peptide, die Teilsequenzen von (CD), insbesondere von E. coli-(CD), aufweisen. Vorteilhaft kann es auch sein, die Tiere mit einem Gemisch von (CDs) und/oder Fragmenten und/oder Fusionspolypeptiden davon zu immunisieren. Weitere "Boosts" der Tiere können mit den gleichen (CDs) und/oder Fragmenten und/oder Fusionspolypeptiden erfolgen. Die polyklonalen Antikörper können dann aus dem Serum der Tiere erhalten werden. Für die monoklonalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusio­ niert.

Zur Herstellung von synthetischen Antikörpern kann z. B. von vorstehend erhalte­ nen monoklonalen Antikörpern ausgegangen werden. Hierzu bietet sich an, die Antigen-Bindungsregionen der monoklonalen Antikörper zu analysieren und die für die spezifische (CD)-Erkennung notwendigen und nicht notwendigen Teile zu identifizieren. Die notwendigen Teile werden dann modifiziert und die nicht notwendigen Teile ganz oder teilweise eliminiert bzw. durch Teile ersetzt, die den Antikörpern günstige Eigenschaften verleihen. Auch können Teile außerhalb der Bindungsregionen der Antikörper modifiziert, eliminiert oder ersetzt werden. Der Fachmann weiß, daß sich für vorstehende Maßnahmen insbesondere die DNA-Rekombinationstechniken eignen. Diese sind ihm bestens vertraut.

Erfindungsgemäße Antikörper zeichnen sich dadurch aus, daß sie (CD), ins­ besondere von E. coli, bzw. Fragmente davon spezifisch erkennen. Die Antikör­ per eignen sich somit zum Nachweis von (CD). Hierfür können die Antikörper in beliebigen Nachweisverfahren, z. B. ELISA, Immunpräzipitation, Western-Blot, FACS-Analyse, Immunfluoreszenz und Immunhistochemie-Verfahren, eingesetzt werden. Die Antikörper können markiert sein oder in Kombination mit markier­ ten, gegen sie gerichteten Antikörpern eingesetzt werden. Desweiteren können die Antikörper in Kits vorliegen, die Trägermaterialien und übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, enthalten. Solche Kits sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die vorliegende Erfindung eignet sich besonders, die Funktionsfähigkeit eines die Komponenten (CD) und 5-Fluorcytosin umfassenden Tumortherapie-Systems zu kontrollieren. Dies beinhaltet sowohl den Nachweis der Expression von (CD) als auch das aktive Eingreifen dergestalt, daß mit den erfindungsgemäßen Antikör­ pern exprimiertes (CD) bewußt abgefangen und somit in seiner Menge reguliert werden kann. Die vorliegende Erfindung stellt somit einen wichtigen Beitrag zur selektiven Zell-Abtötung dar.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

BEISPIELE Beispiel 1 Herstellung eines polyklonalen Antikörpers

Gemäß Standardverfahren wurde ein Histidin-E.coli-(CD)-Fusionspolypeptid, das 6 Histidinreste enthält, in E. coli MC4100 hergestellt und mit Hilfe der Histidin­ reste über eine Nickel-Chelat-Agarose-Säule aufgereinigt. Zur Immunisierung wurde jeweils 1 mg des His-(CD)-Fusionspolypeptids in 1xPBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,4 mM KH₂PO₄, pH 7,4) aufgenommen und Kaninchen verabreicht. Die erste Immunisierung wurde subcutan mit Freund′s Adjuvans (komplett) durchgeführt und die Kaninchen wurden jeweils zwei und sechs Wochen nach der 1. Immunisierung durch subcutane Injektion von 1 mg His-(CD)-Fusionspolypeptid in Freund′s Adjuvans (inkomplett) geboostert. Es wurde jeweils eine Woche nach jeder Immunisierung Blut abgenommen und der Antikörpertiter mittels ELISA bestimmt.

Beispiel 2 Herstellung von monoklonalen Antikörpern

Zur Immunisierung wurden jeweils 75 µg des His-(CD)-Fusionspolypeptids von Beispiel 1 in 1xPBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,4 mM KH₂PO₄, pH 7,4) aufgenommen und Mäusen verabreicht. Der Immuniserungs­ abstand betrug jeweils 2 Wochen und 9 Tage nach jeder Immunisierung wurde Blut zur Titerbestimmung abgenommen. Die erste Immunisierung wurde mit Freund′s Adjuvans (komplett) intraperitoneal und subcutan durchgeführt. Für Booster-Injektionen wurde Freund′s Adjuvans (inkomplett) verwendet. Für die ersten und zweiten Booster-lnjektionen wurde subcutan injiziert. Bei der dritten Booster-Injektion wurde das His-(CD)-Fusionspolypeptid, aufgenommen in 1x PBS, intravenös verabreicht. Nach der letzten Titerbestimmung mittels ELISA wurde den immunisierten Mäusen die Milz entnommen und eine Fusion mit der Maus-Myelomzellinie Ag8 (vgl. Kearney, J.F. et al., The Journal of Immunology, Band 123, Nr. 4 (1979), 1548-1550) zur Herstellung von Hybridomzellen durchgeführt. Das Screening der Hybridomzellen auf anti-(CD)-Antikörperproduk­ tion wurde im ELISA durchgeführt, indem die Zellkulturüberstände gegen das His-(CD)-Fusionspolypeptid getestet wurden. Die in diesem Test positiven Hybridomzellen wurden weiterhin im Western Blot getestet. Dazu wurden die Antikörper gegen verschiedene Histidin-Fusionspolypeptide (z. B. His-DHFR oder His-Cofilin) eingesetzt. Auf diese Weise wurden Hybridomzellen selektiert, die spezifische Antikörper gegen E.coli-(CD) produzieren. Einer dieser Antikörper wurde 16D8F2 genannt und hat den Typ IgG1. Dieser Antikörper wurde bei der DSM unter ACC 2220 am 26. Juni 1995 hinterlegt.

Claims (10)

1. Antikörper, gerichtet gegen eine Cytosin Deaminase.

2. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Cytosin Deaminase von E.coli stammt.

3. Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie polyklonal sind.

4. Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie monoklonal sind.

5. Antikörper nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er bei der DSM unter DSM ACC 2220 am 14. Juni 1995 hinterlegt ist.

6. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Tier mit einer Cytosin Deaminase, insbesondere von E.coli, einem Fragment davon, einem His-Fusionspoly­ peptid davon und/oder einem synthetischen, eine Teilsequenz einer Cyto­ sin Deaminase, insbesondere von E. coli, aufweisenden Peptid immunisiert wird, und

• a) polyklonale Antikörper aus dem Serum des Tieres erhalten werden, oder
• b) monklonale Antikörper nach Fusion von Milzzellen des Tieres mit Mye­ lomzellen erhalten werden.

7. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1-5 in einem Verfahren zum Nachweis von Cytosin Deaminase.

8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei der Nachweis in Säugetierzellen erfolgt, die mit einem Cytosin Deaminase-Gen, insbesondere von E.coli, transfiziert worden sind.

9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Säugetierzellen Tumorzellen sind.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das Nachweisver­ fahren ein Western Blot, ein ELISA, eine FACS-Analyse, ein Immunfluo­ reszenz-Verfahren, Immunhistochemie-Verfahren, eine Immunpräzipitation oder ein Biosensor-Verfahren ist.