DE19608688C2 - Bestimmungssystem zum unmittelbaren qualitativen und quantitativen, quasi-zeitverzugsfreien, hochspezifischen Nachweis von Antikörper-Antigen-Reaktionen durch elektrische Messung spezifischer Änderungen relevanter Parameter der Oberflächenleitfähigkeit bei ultraengen Poren in synthetischen Nuklear-Membranen - Google Patents

Description

A. Die Zielsetzung des Systems

Die Zielsetzung des neuartigen Bestimmungssystems ist der unmittelbare, qualitative und quantitative, quasi­ zeitverzugsfreien, hochspezifische Nachweis von Antikörper-Antigen-Reaktionen.

B. Stand der Technik

Für die bisher zum Einsatz gelangenden Verfahren zur Feststellung von Antikörper-Antigen-Reaktionen, von denen eine Vielzahl ebenfalls hochempfindlich detektieren, sind zumeist besonders gekennzeichnete Antikörper (z. B. durch Radioaktiv- Marker, Fluoreszenz-Marker oder durch Enzym-Kopplung) erforderlich. Vor allem jedoch ist beim gegenwärtigen Stand der Technik keine Methode zum unmittelbaren und somit quasi­ zeitverzuasfreien Nachweis einer Immunoreaktion bekannt. Die derzeit schnellste, aber äußerst komplizierte Methode benötigt bei erheblichem präparativen und apparativen Aufwand mindestens 15 Minuten zur Feststellung einer eventuell stattfindenden Reaktion. Zudem wird, abhängig von der Art der Präparate, dem Typ der stattfindenden Immunoreaktion, der durchgeführten Vorbereitung, sowie der Art der Reaktion nur eine unzureichende Spezifizitäts-Indikation der Antikörper- Antigen-Reaktion erzielt.

Zum Stand der Technik für Meßanordnungen, die einen vergleichbaren Zweck erfüllen wie die vorliegende Erfindung, ist auf Grund eines Vergleiches folgender Sachstand zu berichten:

a) Patent EP 0239969 A2

Das Patent EP 0239969 A2 verwendet eine potentialerzeugende Membran, wie sie auch für einen Biosensor geeignet ist, bestehend aus einem elektrisch leitenden Film, der durch elektrolytische Polymerisation eines Monomers gewonnen wird. Der Film enthält mindestens eine funktionale Gruppe, die ein Antigen oder einen Antikörper binden kann und die das Antigen oder den Antikörper durch diese funktionale Gruppe an den Film bindet.

Ein oder mehrere Monomere werden zum Zwecke der elektrolytischen Polymerisation in einem polaren Lösungsmittel bis zu einer Konzentration im Bereich von 20 bis 200 mMol/l gelöst, wobei die Polymere nicht in Lösung gehen. In die Lösung wird eine geeignete elektrolytische Substanz beigefügt. Bei Verwendung eines relativ leitfähigen Lösungsmittel, wie z. B. Wasser, werden zu diesem Zweck Säuren oder eine Pufferlösung verwendet.

In die so vorbereitete elektrolytische Polymerisationslösung werden eine Arbeits- und eine Gegenelektrode eingefügt, wobei üblicherweise auch eine Referenzelektrode benutzt wird. Die Polymerisation wird durch einen zwischen den Elektroden fließenden Strom einer bestimmten Stärke und Dichte durchgeführt.

Es ist empfehlenswert, den gelösten Sauerstoff aus der Lösung zu entfernen und den Prozeß bevorzugt in einer Stickstoffatmosphäre durchzuführen. Der Polymerfilm bildet sich an der Arbeitselektrode, wobei Filmdicke und Filmbildungsrate bevorzugt durch die elektrischen Arbeitsparameter bestimmt werden.

Als Material für die Arbeitselektrode kann jeder Elektrodentyp verwendet werden, wie er auch für Biosensoren geeignet ist. Die Form der Elektrode ist der Meßaufgabe entsprechend anzupassen.

Der Elektrodenkörper, auf dem sich der Polymerfilm bildet, wird einem Waschvorgang unterzogen und dann in eine Lösung eingetaucht, die die Antigene oder die Antikörper enthält, und welche damit an die entsprechende Oberfläche gebunden werden. Alternativ kann der Polymerfilm auch vom Elektrodenkörper abgezogen, dann gewaschen und in die Lösung mit den Antigenen bzw. den Antikörpern zur Anbindung derselben an den Film eingetaucht werden.

Die Einbringung der filmbedeckten Elektrode oder des Polymerfilms in die Antigen-/Antikörper-Lösung muß sorgfältig erfolgen, sodaß die Antigene oder die Antikörper an jede funktionale Gruppe des Films mit hoher Dichte angebunden werden. Zudem muß ein homogener Status erreicht werden, um die Adsorption jeder nicht-spezifischen Substanz zu vermeiden. Der Grad der Unterdrückung solcher nicht- spezifischen Adsorptionen mit gleichzeitiger Stabilisierung der Bindung kann durch Behandlung der die Antigene/Antikörper fixierenden Elektroden oder der Membrane mit einer geeigneten Substanz erhöht werden.

Die Fixierung oder die Bindung der Antigene oder der Antikörper an den Polymerfilm kann auch so erfolgen, daß Antigen oder Antikörper vordem in die Lösung für die elektrolytische Polymerisation eingebracht werden.

Für die Messung muß die elektrische Leitfähigkeit über eine erheblichen Zeitdauer auf einen bestimmten Wert von mehr als 10^-4 Ohm^-1 cm² gehalten werden.

Wird der Wert unterschritten, dann ergibt sich ein ungünstiges Signal/Rauschverhältnis, und damit wird die Meßwertbestimmung zu unsicher.

Der antigen- oder antikörperbehaftete Film kann als Element für einen Immunosensor in Form einer Elektrode, die mit einer Membran überzogen ist oder in Form einer Membrane genutzt werden. Die Dicke der Membran ist vorzugsweise zwischen etwa 0,5 µm und etwa 5 µm ausgelegt, also etwa 10 bis 20 mal größer als jene der Elektrode mit Abmessungen zwischen etwa 0,05 µm und etwa 0,25 µm.

Die Vorrichtung kann als Sensor für die Vermessung markierter Immunsysteme mit Markierungen wie Radioisotopen, Enzymen oder Fluoreszenz-Molekülen für Anwendungen der Mikroanalyse eingesetzt werden.

b) Patent US 4849343

Die Erfindung US 4849343 bezieht sich auf die chemische Bestimmung und insbesondere auf die Ermittlung der Konzentration chemischer Substanzen in wässrigen Flüssigkeiten durch Verwendung einer ionenpermeablen Lipidmembran. Im allgemeinen handelt es sich um zweilagige Lipidmembranen, bestehend aus zwei benachbarten, symmetrisch gegenüberliegenden Lipidmonolagen, deren Schichtung eine Gesamtdicke von etwa 6 nm bis 8 nm aufweist. Die hydrophobe Anziehung der nichtpolaren Region im Wasser hält die Membranstruktur zusammen. Durch Einbringung von Stabilisatoren kann sie chemisch modifiziert werden.

Für den vorliegenden Fall wird eine Lipidmembrane als chemo­ rezeptiver Übermittler für die quantitative und semi-quantitative Analysen chemischer Spezien in einem Elektrolyten verwendet. Die Lipidmembran wird mit dem Elektrolyten in Kontakt gebracht, und dann wird eine elektrische Potentialdifferenz über die Membrane hinweg angelegt. Durch Messung der Variation des Ionenstroms als Folge des Vorhandenseins der Meßsubstanz kann eine quantitative Bewertung der Spezies auf der Grundlage einer hochselektiven Diskriminierung vorgenommen werden.

Die Konzentration einer bestimmten Substanz im Elektrolyten wird durch Bestimmung des Sromflusses durch die Membrane ermittelt. Da die Membrane mehrere Möglichkeiten des Ionentransports bietet, sind unterschiedliche Verfahrensvarianten zu berücksichtigen.

In einem Fall wird die zu bestimmende Substanz bei Komplexbildung eines hydrophobischen Ions durch die Membran hindurchgeleitet. Dadurch wird das polare Ion von der nicht-polaren internen Struktur der Membran abgeschirmt. Dies führt zu einer Erniedrigung des Energiebedarfs für die Ioneneinbringung in die hydrophobe Zone. Die Diffusion der gebildeten hydrophoben Ionen ist durch das Oberflächen- oder Dipolpotential und die Membranflüssigkeit beeinflußt.

Durch die Verwendung einer komplexbildenden Substanz, die extrem selektiv ist bezüglich des anorganischen Ions kann dessen Konzentration im Elektrolyten durch die Änderung der Membranleitfähigkeit infolge Bestimmung des Ionenflusses bestimmt werden. Der Komplexbildner sollte mindestens 10³ mal selektiver sein bezüglich des ausgewählten Ions im Vergleich zur Affinität bezüglich der Bestandteile des Umgebungs-Elektrolyten. Der Komplexbildner kann entweder extern zur Membran bereitgestellt werden oder dessen Komponenten können zur Bildung der Membran hinzugefügt werden.

Bei der zweiten Art des Transportmechanismus bewegen sich die Ionen in einem Polypeptid- oder einem Proteinkanal. Der Kanal oder die Pore verbindet die beiden wässrigen elektrolytischen Lösungsabteilungen. Das Poreninnere ist polar im Gegensatz zum umgebenden nicht-polaren Kern und unterstützt damit den Ionentransport. So gestaltete Poren sind extern selektiv bezüglich anorganischer Ionen und führen damit zu einem ionenselektiven Strom durch den Kanal, der sich für die Messung der ionenspezifischen Konzentrationen eignet.

Durch den Einfuß eines elektrischen Feldes ändert sich die geometrische Ausbildung bzw. die Elektrostatik der Poren, und sie öffnen sich selektiv zur Ermöglichung des Flusses bestimmter Ionenarten.

Bei der dritten Transportart bewegen sich die Ionen mit Hilfe des Diffusionsmechanismus durch die Membran. Die Diffusionsrate wird wesentlich durch das molekulare Flüssigkeitsverhalten und die Packungsdichte des nichtpolaren Kerns und der Kopfgruppenregion der Lipidmembran sowie das elektrostatische Potential bestimmt. Die Einbringung von polaren Gruppen in den Kohlenwasserstoff-Kern unterstützt die Ionenleitung durch Bereitstellung von Bindestellen niederer Energie. Dadurch wird die Energieanforderung bezüglich der Diffusion vermindert, die Fluidizität erhöht und die Packungstendenz reduziert. Zudem beeinflußt die Anwesenheit einer Stabilisierungssubstanz die Ionenleitfähigkeit.

Für die praktische Messung wird jeweils nur einer der möglichen Mechanismen genutzt. Dessen Festlegung hängt von der Natur der zu bestimmenden Substanz und damit der Natur des geeigneten Rezeptors ab.

Es muß betont werden, daß die Parameter des zu bestimmenden und zu untersuchenden Stoffes nicht direkt, sondern indirekt über den Ionenstrom und die Leitfähigkeit der Membran bestimmt werden. Aus diesem Grunde kann eine große Anzahl von Ionenarten benutzt werden; monovalente Ionen werden jedoch bevorzugt. Ist die anorganische Substanz selbst ionisch, dann erfolgt eine Komplexbildung mit einem geeigneten Rezeptor und dieser wird selbst registriert, wenn er beim Transport durch die Membran einen Ionenstrom erzeugt.

Eine Bewertung der unter a) und b) herangezogenen Patente erbringt im Vergleich zur vorliegenden Erfindung folgende Erkenntnisse:

• - Die Herstellung der Meßvorrichtung, also insbesondere der Membran und der Poren ist bei der vorliegenden Erfindung wesentlich weniger arbeitsaufwendig und erfordert auch keine besonderen Kalibrierungs- und Produktionsmaßnahmen, wie dies bei den Patenten a) und b) der Fall ist;
• - Bei der vorliegenden Erfindung erfordert die Bestückung der Poren zum Zwecke der Bindung von Antikörpern/Antigenen und/oder zum Transport von Ladungsträgern durch die Poren keine besonderen Maßnahmen bei der Einbringung bzw. Aufbringung auf die Bindeoberfläche bzw. zur Erreichung des Transports. Wegen der eindeutigeren Geometrie der Poren und der höheren Homogenität der Poreneigenschaften im Gegensatz zur Geometrie und Strukturierung von Membranen in den herangezogenen Patenten a) und b) ist somit auch eine höhere Meßsicherheit bei der vorliegenden Erfindung gegeben;
• - Die Meßzeiten der bei beiden herangezogenen Patenten a) und b) zugrundeliegenden Vorrichtungen beträgt mindestens zehn Minuten, bis ein gesichertes Meßwert erreicht ist. Demgegenüber wird mit der der Erfindung zugrundeliegenden Vorrichtung ein zuverlässiges Ergebnis bereits nach wenigen Sekunden erzielt.

C. Beschreibung des neuartigen Systems

Für den Fall des neuartigen Systems werden diese Nachteile grundsätzlich ausgeschlossen.

Das neuartige System nutzt die Ausprägung der elektrischen Leitfähigkeit von Poren in sog. Nuklear-Membranen (NM) oder sog. Nuklearporen-Membranen (NPM). Diese NPM sind zumeist flexible plastische Folien aus bestimmten Materialien, wie z. B. aus Polyethylen, Polyester (wie Polyethylen-Terephtalat), Polycarbonat und anderen Materialien mit extrem engen Porendurchgängen. Die Poren werden durch Anwendung verschiedener Verfahren erzeugt, wie z. B. durch Beaufschlagung mit einem Strom schwerer Ionen (z. B. ³⁹Co, ⁸⁴Kr, ¹³²Xe) höchster Energie in einem Cyclotron. Die Anzahl der erzeugten Poren zylindrischer oder konischer Gestalt ist im wesentlichen abhängig von der Dichte des Teilchenstroms, während die Größe des Porendurchmessers im wesentlichen durch die Bedingungen beim nachfolgenden Ätzvorgang (z. B. die verwendete Lösungssubstanz, die Temperatur und die Einwirkzeit der Lösungssubstanz) festgelegt werden. Es lassen sich Porenanzahldichten von 10⁶ bis 10⁹ Poren (aber auch einzelne Poren) pro Quadratzentimeter und Porendurchmesser von 10 nm (oder weniger) bis 50 nm bzw. 100 nm (oder mehr) erreichen.

Aus Gründen der sprachlichen Vereinfachung wird hier der Begriff "Membrane" verwendet. Dieser Begriff ist jedoch, wenn nicht anders definiert, so zu verstehen, daß hierin die Begriffe Folie, Film, Blatt jeder beliebiger Form oder Dicke eingeschlossen sind, wobei die Dicke der Membran über die Fläche nicht gleichförmig ausgeprägt sein muß, und dafür auch jede Kombination einer oder mehrerer, wie auch immer gearteten Lagen gleicher oder verschiedener Membranschichten, aus welchen Materialien und mit welcher Vorbehandlung auch immer, in Betracht kommen und dieser membranspezifische Aufbau mindestens eine Pore enthält.

Aus Gründen der sprachlichen Vereinfachung wird unter "Pore" in diesem Zusammenhang ein durch die genannte Membran hindurchgehendes Loch verstanden bei dem die Einflüsse durch die Seitenwandeffekte in Relation zu den Volumeneffekten signifikant hervortreten, mit jedem beliebigen, bevorzugt jedoch kreisförmigem Querschnitt, wobei die Querschnittsform entlang der Lochtiefe beibehalten wird oder sich sowohl bezüglich Form als auch Abmessung ändern kann, wobei bevorzugt eine konstante Beibehaltung der Form/der Abmessung oder gegebenenfalls eine konische Ausprägung bevorzugt werden.

Unter Verwendung einer oder mehrerer Kammern (z. B. aus Teflon oder anderen Materialien) mit jeweils mindestens zwei Abteilungen, die jeweils identische oder verschiedenartige Wasser-Elektrolyt-Lösungen enthalten und die durch die NPM gegeneinander abgetrennt sind, ergibt sich prinzipiell ein Meßsystem zur hochsensitiven Bestimmung der NPM- Leitfähigkeit dadurch, indem eine Potentialdifferenz über die Membran so angelegt wird, daß die durch die Porengestalt und Poreninhalte bestimmten Einflüsse auf die elektrische Leitfähigkeit des Porenraums, insbesondere des Porenwandbereichs in Wechselwirkung mit den Poreninhaltssubstanzen in optimaler Weise (das ist mit Zielsetzung einer möglichst umfassenden und eindeutigen Überwachung des Reaktionsablaufs) ermittelt werden und durch eine Auswertung spezifischer Meßsignalinhalte der Reaktionsnachweis erfolgt.

Bezüglich der Formgebung und Abmessungsfestlegung der Poren besteht weitgehende Freiheit; beide variablen Größen sind jedoch so festzulegen, daß die Poreneffekte, und hier insbesondere die Porenwand- und Grenzschichteffekte zum Porenvolumen hin, gegenüber den Volumeneffekten des durch die Poren gebildeten Volumens einen signifikanten reaktions­ spezifischen Anteil am Gesamtmeßsignal der Reaktion annehmen.

D. Physikalische Grundlagen des neuartigen Meßsystems und dessen Meßsignalverhalten

Grundsätzlich setzt sich die Leitfähigkeit der engen Poren, die die hochgradig nichtleitende Membran durchdringen, zusammen aus der "Volumen-Leitfähigkeit" sowie der "Oberflächen-Leitfähigkeit" [1] der Porenwände und der sich in dem Grenzbereich zwischen den beiden Regionen befindlichen "Übergangs-" bzw. "Doppelschichtbereich".

Die Volumenleitfähigkeit, das ist die Leitfähigkeit jenes Bereichs innerhalb der Poren, der von den Oberflächen- und Übergangsbereichseffekten der Porenwände nicht mehr oder in vernachlässigender Weise beeinflußt wird, hängt prinzipiell von der Art, der Zusammensetzung und dem physikalisch­ chemischen Zustand des in den Poren vorhandenen Elektrolyten ab. Die Oberflächenleitfähigkeit hängt demgegenüber wesentlich vom Material der Porenwand, der daran adsorbierten Komponenten als auch vom Elektrolyten innerhalb der Poren ab. Die Oberflächeneffekte üben einen über eine endliche Entfernung von der Porenwand aus in das Porenvolumen hinein, mit der Distanz von dieser abnehmenden, Einfluß auf die Gesamtleitfähigkeit aus.

Die Gesamtheit all dieser Einflüsse aus dem Volumen- und dem Porenwandbereich bestimmen die Form und die Ausprägung des elektrischen Potentialprofils quer und parallel zu den Porenwänden. Eine signifikante und bestimmende Wirkung geht hierbei von ionischen Einflüssen, von ladungsbehafteten, aber auch von ladungsfreien Komponenten aus.

Insbesondere die Oberflächenleitfähigkeit wird von der Mobilität von Ionen und anderen Ladungsträgern und auch ladungsfreien Partikeln an der Porenwand und im daran angrenzenden Übergangsbereich zum freien Volumenbereich hin innerhalb der Poren beeinflußt. Auch der "Doppelschicht­ bereich" unterliegt der Wirkung der an der Porenwand fixierten Oberflächenladungen als auch dem Einfluß aus dem Konzentrationsverhalten der Co- und Counter-Ionen aus der elektrolytischen Volumenlösung heraus. Der Einfluß geht soweit, daß selbst in der diffusen elektrischen Grenzschicht die Mobilität der Ionen sich gegenüber jener im Volumen des "freien Elektrolyts" unterscheidet.

Ein wesentlicher Einfluß auf die Ausprägung der Oberflächenleitfähigkeit geht auch vom Phänomen des "spontanen sprunghaften Ortswechsels" der Ionen entlang der Wandoberfläche der Poren aus. Dieser "spontane sprunghafte Ortswechsel" reagiert äußerst empfindlich auf die Oberflächeneigenschaften der Porenwand, die direkten oder indirekten Einfluß ausüben auf die über einen Zeitraum hinweg beobachtbare "mittlere (spontan sprunghafte) Dislozierungsdistanz der Ladungsträger" als Folge der Wechselwirkung mit den Wand- und Elektrolyteinflüssen.

Alle Modifikationen der Eigenschaften im Wand- und Grenzbereich, die sich auf die bestehende Volumendichte der Ladungsträger (das ist in erster Linie das Grenzschichtpotential), die mittlere spontane Dislozierungsdistanz (abhängig vom Besetzungszustand der Energiebarrieren bzw. Energiesenken entlang der Porenwand) und der Viskosität des Mediums auswirken, beeinflussen auch die Oberflächenleitfähigkeit.

Letzthin [2, 3, 4] wurde auch nachgewiesen, daß die Oberflächenleitfähigkeit eine fluktuierende Ausprägung aufweist, die durch eine unterscheidbaren Kombination aus einem sich (relativ) langzeitig auf diskrete Intensitätsniveaus (quasi-multistabil) einstellenden und einem sich (relativ) kurzzeitig auf scheinbar zufällige Intensitätsniveaus (quasi-stochastisch) einstellenden Anteil charakterisiert ist. Zum Gesamtwert der Leitfähigkeit trägt noch ein stetig konstanter (quasi-statischer) Anteil, wesentlich geprägt durch die Volumeneinflüsse, bei.

In Abhängigkeit von den Einflüssen aus dem Bereich entlang der Porenwände und aus dem Übergangsbereich zum freien Porenvolumen hin kann der fluktuierende Anteil der Oberflächenleitfähigkeit eine dominierende Ausprägung erlangen.

Es wurde auch gezeigt, daß die (quasi-multistabilen) Fluktuation des Oberflächenleitfähigkeitwertes (meßbar als Schwankungen des Oberflächenstroms unter "voltage clamp"- Bedingungen) irregulär auftretende Sprünge zwischen bistabil bzw. multistabil ausgeprägten Niveaus aufweisen. ("Voltage clamp conditions" ist ein gängiger Ausdruck für elektrophysiologische und biophysikalische Membranuntersuchungen. Bei dieser Technik wird unter Einsatz eines operationellen Verstärkers erreicht, eine vorgegebene Spannungsdifferenz an der zu untersuchenden Membran zeitlich konstant zu halten trotz einer zeitlichen Veränderung des Membranwiderstandes.) Diese Ereignisse sind durch einzelne bzw. überlappende Leistungsspektren des Lorentz-Typs charakterisiert. Die Niveauzuweisungen entsprechen den Ausprägungen und Schwankungen der elektrischen Leitfähigkeit. Die bi- bzw. multistabilen Fluktuationen sind ähnlich dem "burst noise" bei Halbleitern [5] oder bei "Einkanal-" ("single channel")-Phänomenen, wie sie charakteristisch sind für elektrische Ströme durch besonders enge Ionenkanäle bei lebenden Zellmembranen oder modellmäßig bei bimolekularen Lipidfilmen, wobei letztere durch "kanalbildende" ("channel-forming") Substanzen modifiziert werden [6, 7, 8, 9].

Eine Analyse der spektralen Dichte der elektrischen Stromwerte der quasi-stochastischen Fluktuationen zeigten das Vorliegen einer sog. 1/f-Ausprägung (f: = Frequenz) der statistischen (Rausch-)Ereignisse.

Es wurde experimental nachgewiesen, daß der fluktuierende Anteil der Oberflächenleitfähigkeit besonders empfindlich gegenüber kleinsten Änderungen in der Zusammensetzung des Elektrolyten reagiert, der sich in Kontakt mit der NPM befindet. So erzeugt die Anwesenheit einiger divalenter (z. B. Hg²⁺-) oder multivalenter (z. B. Al³⁺-) Ionen bei mikromolaren Konzentrationen (in 0,1 M KCl- Hintergrundlösung) Veränderungen des Summenanteils aus quasi-statischem und quasi-multistabilem Beitrag der Leitfähigkeit der NPM-Oberfläche und damit auch signifikant ausgeprägte Änderungen in seinem fluktuierenden Summenanteil, bestehend aus dem quasi-multistabilen und dem quasi-stochastischen Beitrag. (Tabelle 1).

Die Leitfähigkeit der NM-Oberfläche reagiert auch empfindlich auf die Anwesenheit von Substanzen, die die dielektrische Konstante der Lösung in den Poren ändern. Ethylalkohol bei millimolarer Konzentration verändert z. B. den fluktuierenden Anteil der Oberflächenleitfähigkeit der NPM in Kontakt mit einer 0,1 M KCl-Lösung.

Die Oberflächenleitfähgkeit der NPM hängt zudem stark von der 1 Anwesenheit nicht-elektrolytischer Polymere in der Lösung innerhalb der Poren ab. Untersuchungen zeigten, daß die Anwesenheit von Polyethylenglycolen verschiedener Molekular- Massen (im Variationsbereich von 600 bis 20000) die Oberflächenleitfähigkeit der NPM um den zweifachen Wert zu ändern in der Lage sind (im Kontakt mit 0,1 M KCl).

In Experimenten mit Polyethylenglycol enthaltenden Lösungen wurde nachgewiesen, daß Änderungen der Leitfähigkeit der NPM- Oberfläche, verursacht durch Polymere, "langzeitbeständig" sind und über mehrere Tage hinweg bestehen bleiben, eine Tatsache, die auf eine starke Adsorption der nicht-geladenen Polyelektrolyte an den NPM-Porenwänden hinweist. Die oben dargelegten Daten zeigen weiterhin, daß Änderungen in der Oberflächenleitfähigkeit der NPM für die Bestimmung der Anwesenheit einiger Ionen oder organischer Verbindungen im Medium, das sich in Kontakt mit der Membran befindet, herangezogen werden können. Es ist offensichtlich, daß die Ausprägung der Oberflächenleitfähigkeit, die sehr empfindlich gegenüber der Zusammensetzung des Mediums ist, im Verhältnis zum Wert der Volumenleitfähigkeit oder das Werteverhältnis der Oberflächenleitfähigkeit zur integralen NPM-Leifähigkeit hoch genug sein sollte, um damit ein sensorisches System der genannten Art zu realisieren.

Die oben erwähnten NPM-Verhältniswerte können leicht bestimmt werden durch Vergleich der gesamten NPM-Leitfähigkeit in Anwesenheit bzw. Abwesenheit von Verbindungen, die die Oberflächenleitfähigkeit blockieren. Ein niederer pH-Wert des Mediums oder eine hohe Konzentration divalenter oder multivalenter Kationen in der Lösung stellen die notwendigen Kriterien für eine solche Abblockung, zumindest für Polyethylen-Terephtalate-NPM, dar.

Untersuchungen zeigten, daß das Verhältnis der derart bestimmten Oberflächenleitfähigkeit im Verhältnis zur integralen Leitfähigkeit sogar für Membranen mit verhältnismäßig großen Poren (mit Durchmessern von 15 bis 20 nm) im Wertebereich von 0,35 bis 0,45 liegt. Das bedeutet, daß ein außergewöhnlich signifikanter Anteil der NM-Leitfähigkeit durch den Zustand des Grenzbereichs beeinflußt wird und deshalb sehr empfindlich reagiert gegenüber kleinen Konzentrationen einiger Verbindungen, die sich in der Lösung in Kontakt mit der NPM befinden. Aus diesem Grunde können selbst einfach durchzuführende Messungen der NPM-Leitfähigkeit bei konstanter, an die Membran angelegter Spannungsdifferenz (in der Größenordnung von 100 mV) für die Bestimmung der Anwesenheit einiger Substanzen in Medium oder zur Bestimmung der Konzentrationsänderung der Substanzen verwendet werden.

Wie oben dargelegt, stellt der fluktuierende Beitrag der Oberflächenleitfähigkeit den empfindlichsten Anteil dar. Mit Hilfe recht einfacher differenzierender elektronischer Schaltkreise kann man diesen "empfindlichsten Teil" des Transmembran-Stroms separieren und anteilmäßig aufgliedern. Damit ist es problemlos möglich, ein einfaches System für die Detektion (und quantitative Bestimmung) von Veränderungen in der Zusammensetzung des sich in Kontakt mit der NPM befindlichen Mediums zu erzielen.

E. Erreichung der hochspezifischen Eindeutigkeit des Meßsignals in Bezug auf die Antikörper-Antigen-Reaktion beim neuartigen Meßsystem

Bedauerlicherweise ist die Selektivitäts- bzw. Spezifizitäts- Ausprägung der Oberflächenleitfähigkeit auf beteiligte Komponenten hin, sehr gering. Das bedeutet, daß die grundlegend durchführbare Erfassung der Anwesenheit von divalenten oder multivalenten Ionen im Medium noch keinen Rückschluß auf die spezifische Art der einzelnen Ionen erlaubt. Die gleiche Aussage gilt auch für die Detektion von organischen Substanzen in den Medien.

Zur Erreichung dieser Leistungsfähigkeit macht sich das neuartige Verfahren, dessen Wirkungsweise in den folgenden Ausführungen dargelegt wird, die hochsensitive Empfindlichkeit der Oberflächenleitfähigkeit von NPM und insbesondere deren quasi-stochastischen Anteil zunutze und bildet somit eine neuartige hochspezifische, schnelle und einfache Methode zur Bestimmung der wichtigsten biologischen organischen Verbindungen (Polypeptide, Proteine und insbesondere Polysaccharide). Zur Erreichung einer hohen Nachweisspezifizität nutzt das neuartige Verfahren zudem die hinreichend bekannte hochempfindliche Selektivität von Immun- (Antikörper-Antigen)-Reaktionen.

Die Selektivität der Immunreaktionen erlaubt eine Unterscheidung zwischen Antigenen (Ag), die untereinander chemisch sehr ähnlich sind, wie z. B. zwischen zwei Proteinen, die sich nur durch eine Aminosäure oder durch eine optische Isomere unterscheiden. Beim derzeitigen Stand der Technik ist die Erzeugung verschiedener Spezien von Antikörpern (Ak) durch gängige Standardverfahren Gegenstand täglicher Laborroutine. Eine Anzahl der wichtigsten Antikörper-Immunglobuline (z. B. IgG, IgA oder IgM) sind käuflich erwerbbar. Die Herstellung monoklonaler Antikörper stellt eine etwas kompliziertere Prozedur dar, sie wird aber ebenfalls weitverbreitet angewandt.

Es ist bekannt, daß nicht alle, aber eine große Anzahl von organischen Verbindungen immunogen sind und sie deshalb die Erzeugung spezifischer Antikörper zulassen. Polypeptide, Proteine und Polysaccharide, die im allgemeinen verschiedene antigene Determinaten haben, besitzen eine hohe antigene Befähigung im Gegensatz zu jenen der niedermolekularen Carbohydrate und Nuclein-Säuren. Einige organische Substanzen, die sich ausgesprochen an die Oberflächen-Rezeptoren von antikörperproduzierenden Lymphozyten binden, können keine Immunreaktion auslösen, d. h. keine spezifische Antikörper produzieren. Trotzdem wird es durch chemische Kopplung solcher Substanzen (Haptene) mit einigen Proteinen möglich, sie in Immunogenreagierende zu transformieren. Damit erhält man spezifische Antikörper für eine sehr große Anzahl chemisch sehr verschiedener Verbindungen.

Hochspezifische Antikörper-Antigen-Immunreaktionen in lebenden Organismen finden nicht nur in flüssigen Medien (Blut, Lymphe, Speichel, Tränen) statt, sondern auch auf Zelloberflächen, indem sie von der Zellwand adsorbiert oder teilweise in die lebende Zellmembran eingebettet werden. Das bedeutet, daß eine Fixierung von Antikörpern an einer Oberfläche spezifische Immunreaktionen nicht unterbindet. Das zuletzt angedeutete Verfahren wurde bei einigen Immunoassay-Methoden angewandt, indem die Antikörper-Antigen-Reaktionen an der Oberfläche einiger Kunststoffe mit vorher adsorbierten Antikörpern vorgenommen wurde. Es ist bekannt, daß schwere Ketten (H- Ketten) der Immunoglobuline oligosaccharide Regionen besitzen, die wahrscheinlich verantwortlich sind für die Ig-Adsorptions- Affinität.

Jedes Immunoglobulin-Molekül trägt vier Carboxyl-Gruppen, die bei geeignetem pH-Wert negativ geladen werden und somit den elektrophoretischen Transport der Moleküle erlauben, eine Eigenheit, die gewöhnlicherweise auch in vielen Immunoassay- Methoden zur Anwendung gelangt.

Die Antigen-Antikörper-Anbindereaktion wird als reversibel angesehen. Im Falle einer einzigen Lokalität zur Anbindung an das Antigen kann die Stärke dieser Wechselwirkung mit dem Antikörper durch die Affinitätskonstante K = [AgAb]/[Ag][Ab] beschrieben werden.

In Abhängigkeit von der Ag- und Ab-Spezies kann die Affinitätskonstante K im Bereich von 5.10⁴ bis 10¹² variieren. Die Anbindungsstärke hängt auch von der Anzahl der Anbindelokalitäten am Antikörper und der Anzahl der Determinanten am Antigen ab. Die gesamte "Avidität" ("avidity") der Antigen-Bindung an den IgM-Antikörper-Komplex mit zehn Bindelokalitäten (pentamerisch) sollte damit fünf Mal größer sein als die Anbindung mit einem IgG-Antikörper mit zwei Bindelokalitäten. ("Avidität" ("avidity") ist ein spezifischer immunologischer Ausdruck der das Produkt der Affinitätskoeffizienten einer spezifischen Bindelokalität in Bezug zur Anzahl der an einem Antikörper vorhandenen Bindelokalitäten bezeichnet.) Als ein Ergebnis der Sekundärreaktion zwischen Ag-Ab-Komplexen werden oft große Aggregationen gebildet. Die Präzipitation, das ist ein Vorgang der Aggregatsbildung, gefolgt von der Sedimentation des Reaktionsproduktes, wird allgemein zum Nachweis der Immunoreaktion herangezogen.

Bei dem neuartigen Verfahren werden in den Poren einer NPM hochspezifische (Antikörper-Antigen-)Reaktionen vorgenommen. Die Bildung von Antikörper- Antigen-Komplexen werden durch kontinuierliche Messungen der NPM-Leitfähigkeit überwacht. Insbesondere die Ausprägung der Oberflächenleitfähigkeit und deren Änderung im Laufe der Zeit mit fortschreitender Reaktion erweist sich hierbei als äußerst aussagekräftig. Zu diesem Zweck wird die durch die Komponenten der Antikörper-Antigen- Reaktion vor und während des Ablaufs und nach Abschluß des Reaktionsvorganges aktuelle Leitfähigkeit bestimmt. Insbesondere aus den quasi-stochastischen Fluktuationsausprägungen der Leitfähigkeit können Hinweise für die Antikörper-Antigen-Reaktion abgeleitet werden.

Zur Vorbereitung werden die Antikörper an der Porenwand adsorbiert und dann die Antigene, in welcher Weise auch immer, zur Herbeiführung der Reaktion zugeführt. Die damit ausgelöste Antikörper-Antigen-Reaktion führt zu einer Veränderung der in den Poren vorhandenen (fallweise an den Porenwänden haftenden bzw. nichthaftenden) Komponenten in der (für einige Fallbeispiele) hier wiedergegebenen Weise:

• a) die sich an den Anbindelokalitäten befindlichen negativ geladenen COO^--Gruppen der Immunoglobuline (gebildet durch die verbindende Enden der schweren und leichten Ketten) werden im allgemeinen in Laufe der Immunkomplex-Bildung kompensiert. Das äußert sich durch eine Änderung der Ladung der an den Poren der NPM fixierten Antikörper-Komplexe.
  Aus diesem Grunde ändert sich auch die Konzentration der Counter-Ionen, die die Leitfähigkeit der Oberfläche wesentlich beeinflussen;
• b) Die Bildung von Immunkomplex-Aggregaten an der Porenwand verändert die effektive dielektrische Konstante des Übergangsbereiches. Letzteres wird als bestimmend für die Wahrscheinlichkeit zur Bildung von Wasserstrukturen ("structural water") angesehen. Im Falle eines "spontanen sprunghaften Ortswechsels" der Ionenmobilität ist die Bildung von Wasserstrukturen von großer Bedeutung für die Ausprägung der Oberflächenleitfähigkeit. Im letzteren Fall führen Änderungen im Energieprofil der Ionenbewegung (insbesondere die Änderung in der Besetzung der Energiepotentiale) zu einer Beeinflussung der Oberflächenleitfähigkeit;
• c) Die Aggregatbildung im Porenraum ändert die effektive Viskosität im Medium und damit auch die ionische Mobilität. Für den Fall, daß ein signifikanter Teil des Porenvolumens durch die Aggregatprodukte belegt ist, wird nicht nur die Oberflächen-, sondern auch die Volumenleitfähigkeit beeinflußt.

F. Mögliche Ausführungen des neuartigen Meßsystems

Folgende Meßsystemausführungen sind denkbar:

• 1. Die in einer speziellen Teflonkammer fixierte NPM aus Polyethylen-Terephtalate ("Lavsan") mit einer Vielzahl von Poren (Porendichte etwa 10⁶ /cm² bis etwa 10⁹ /cm² Porendurchmesser zwischen etwa 15 nm bis etwa 20 nm. Membrandicke etwa 5 µm bis etwa 10 µm) wird mit einer Salzwasserlösung bedeckt, die die Antikörper (z. B. Immunglobulin IgG oder IgA) enthält. Nach kurzer, für die Adsorption der Antikörper an der Porenwand notwendigen Wartezeit, wird eine Lösung mit korrespondierenden (oder als korrespondierend vermuteten) Antigenen beigefügt. Die Zeit für die Diffusion in die Porenöffnungen nimmt selbst für viskose Lösungen und bei ungestörter, lediglich durch Reibungskräfte beeinflußter hydrodynamischer Bewegung der Lösungsgrenzschicht entlang der Porenwandoberfläche, nur etwa 5 s bis 10 s in Anspruch. Die NPM-Leitfähigkeit der Membran wird kontinuierlich bei konstantem Stromwert unter "voltage clamp"- Bedingungen (z. B. bei einer Potentialdifferenz von etwa 100 mV in den durch die NPM gegeneinander abgetrennten Kammerabteilungen) mit Hilfe zweier Ag-AgCl-"Reversible- Elektroden" ("reversible electrodes") erfaßt. (Bei "reversible electrodes" handelt es sich um Elektroden, deren elektrischer Widerstand sich bei Stromdurchgang nicht ändert.) Änderungen der Oberflächenleitfähigkeit infolge der Bildung von Antigen- Antikörper-Komplexen werden registriert und zeigen das Ende der Reaktionsvorganges an.
  Die quantitative Bestimmung der Reaktionscharakteristik und insbesondere die Abschätzung der Affinitätskonstanten, kann durch Eichung des Systems unter Verwendung von Standards und auf der Basis von Erfahrungen mit detailliert untersuchten Antigen-Antikörper-Reaktionen durchgeführt werden.
  Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß der fluktuierende quasi-stochastische Anteil der Oberflächenleitfähigkeit wesentlich empfindlicher auf die Änderungen der Verhältnisse und der Eigenschaften an der Porenwand und im Übergangsbereich zum Porenvolumenbereich reagiert, ist es nutzbringender, insbesondere diesen Anteil der Oberflächen-Leitfähigkeit für die Detektion der Immunoreaktion zu verwenden.
• 2. Die "Beladung" der Porenoberfläche mit Antikörperkomponenten wird nicht vor, sondern während der Prozeßdurchführung durch Erzeugung einer Potentialdifferenz zur Auslösung einer elektrophoretischen "Injektion" der negativ geladenen Immunoglobuline innerhalb der Poren vorgenommen was insgesamt eine vernachlässigbar kurze Zeit in Anspruch nimmt. Nach Abklingen der Potentialdifferenz wird die die Antigene enthaltende Lösung in beide durch die NPM getrennte Kammerabteilungen eingebracht. Der weitere Verlauf des Prozesses wird durchgeführt, wie unter 1. geschildert.
  Die Elektrophorese kann auch für die "Entladung" der Membrane als Vorbereitung zur Durchführung von nachfolgenden Immunoreaktionen mit andersartigen Antikörpern zur Anwendung gebracht werden.
• 3. Für den Fall der positiv geladenen Antigen-Moleküle ist es möglich, das Verfahren der Gegenstrom-Elektrophorese einzusetzen. In diesem Fall wird die die Antikörper enthaltende Lösung (mit im allgemeinen einer negativen Netto- Ladung bei neutralem pH-Wert) in die Kammerabteilung eingebracht, die an die negative Elektrode angeschlossen ist, und die Lösung mit den Antigenen in die Kammerabteilung mit den positiven Elektrodenanschluß eingebracht. Die elektrophoretischen Bewegungen der Komponenten der Immunoreaktion beschleunigen die Reaktion. Diese Variante stellt im Prinzip eine Kombination der üblichen "Dialyse" und "Elektrophorese"-Immuno-Assays dar, jedoch bei Anwendung einer grundsätzlich verschiedenen Nachweismethode der Immuno- Reaktion.

G. Alternative prozedurale Varianten beim neuartigen System

Grundsätzlich ist es möglich, die prozedurale Rolle der Antikörper mit jener der Antigene und die prozedurale Rolle der Antigene mit jener der Antikörper zu vertauschen. Dieser Rollentausch bezieht sich im wesentlichen auf die Anbindung der Reaktionspartner, die Art der Lösungszusammensetzung als auch die zeitliche Sequenz der Prozedurabfolge im Rahmen der prozeduralen Maßnahmen zur Durchführung der Antikörper- Antigen-Reaktion, wobei jedoch alle Maßnahmen zweckgerichtet zur Erreichung einer Antikörper-Antigen-Reaktion in analoger Übereinstimmung mit der Zielsetzung des neuartigen Bestimmungssystems erfolgen.

H. Referenzen

[1] Smoluchowski. M.; 1903; Kraftfahrz.-Anz., p. 182;
[2] Lev, A. a., Korchev, Y. E., Rostovtseva, T. K., Bashford, C. L., Edmonds, D. T., Pasternak, C. A.; 1993; Proc. Roy. Soc. London, B, vol. 252, p. 187;
[3] Pasternak, C. A., Bashford, C. L., Korchev, Y. E., Rostovtseva, T. K., Lev, A. A.; 1993; Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, vol. 77, p. 119;
[4] Pasternak, C. A., Alder, G. M., Apel, P. Yu., Bashford, C. L., Edmonds, D. T., Korchev, Y. E., Lev, A. A., Lowe, G., Milovanovich, M., Pitt, C. W., Rostovtseva, T. K., Zhitariuk, N. I.; 1995; Radiation Measurements, vol. 25, p. 675;
[5] Card, W. H., Chaudchari, P. K.; 1965; Proc. IEEE (Letters), vol. 53, p. 652;
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[8] Anderson, O. S.; 1983; Biophys. J., vol. 41, p. 119;
[9] Rostovtseva, T. K., Bashford, C. L., Lev, A. A., Pasternak, C. A.,; 1994; J. Membrane Biol., vol. 141, p. 83;

Tabelle 1

Änderungen im Anteil der Leitfähigkeit (G_st), gebildet aus der Summe des quasi-statischen und des quasi-multistabilen Beitrags und dem fluktuierenden Anteil (G_f1), gebildet aus der Summe des quasi-multistabilen und des quasi-stochastischen Beitrags bei der Polyethylene-Terephtalate Nuclearporen-Membran bei Anwesenheit von Hg²⁺-Ionen (A) und Al³⁺-Ionen (B) in 0,1 M KCl-Lösung

Claims (12)

1. Meßanordnung zum unmittelbaren, qualitativen und quantitativen, quasi zeitverzugsfreien, hochspezifischen Nachweis von Antikörper-Antigen-Reaktionen durch elektrische Messung spezifischer Änderungen relevanter Parameter der Oberflächenleitfähigkeit bei ultraengen Poren in einer synthetischen Nuklear-Membran, bei der

• 1. die periphere Form der Poren entlang der Porentiefe und deren Wandfläche in der Membran derart gestaltet sind, daß sich die Oberflächenleitfähigkeit von der Volumenleitfähigkeit der Poren unterscheidet und sich der Signalbeitrag durch die Oberflächenleitfähigkeit vom Gesamtsignal der Leitfähigkeit abtrennen läßt;
• 2. die Poren mit Antikörpern oder Antigenen beladen sind und
• 3. die Membran so in eine Meßkammer eingesetzt ist, daß die Membran mindestens zwei Meßkammerabteilungen gegeneinander abgrenzt, die durch Elektroden mit einer Meßschaltung zur Bestimmung der Leitfähigkeit verbunden sind.

2. Meßanordnung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke der Membran 5 µm bis 10 µm beträgt.

3. Meßanordnung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Poren einen Druchmesser von 10 nm bis 20 nm besitzen.

4. Meßanordnung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Porenflächendichte 1 Pore/cm² bis 10⁹ Poren/cm², vorzugsweise 10⁶ Poren/cm² bis 10⁹ Poren/cm² beträgt.

5. Meßanordnung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran aus Polyethylen-Terephtalat besteht.

6. Meßanordnung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Poren durch Beaufschlagung mit einem Strahl schwerer Ionen und anschließender Atzung mit Hilfe einer heißen Alkalilauge erzeugt wurden.

7. Meßanordnung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sich in den Meßkammerabteilungen entweder die gleiche Lösungssubstanz oder verschiedene Lösungssubstanzen befinden, die die zu den Antikörpern oder Antigenen korrespondierenden, nachzuweisenden Bindungspartner enthalten.

8. Meßsystem zum unmittelbaren, qualitativen und quantitativen, quasi zeitverzugsfreien, hochspezifischen Nachweis von Antikörper-Antigen-Reaktionen durch elektrische Messung spezifischer Änderungen relevanter Parameter der Oberflächenleitfähigkeit bei ultraengen Poren in einer synthetischen Nuklear-Membran, bei dem

• 1. die periphere Form der Poren entlang der Porentiefe und deren Wandfläche in der Membran derart gestaltet sind, daß sich in den Poren die Oberflächenleitfähigkeit von der Volumenleitfähigkeit unterscheidet und sich der Signalbeitrag durch die Oberflächenleitfähigkeit vom Gesamtsignal der Leitfähigkeit abtrennen läßt,
• 2. die Membran so in eine Meßkammer eingesetzt wird, daß sie mindestens zwei Meßkammerabteilungen gegeneinander abgrenzt, die durch Elektroden mit einer Meßschaltung zur Bestimmung der Leitfähigkeit verbunden werden,
• 3. die Poren mit Antikörpern oder Antigenen beladen werden und
• 4. die Oberflächenleitfähigkeit vom Gesamtsignal der Leitfähigkeit abgetrennt wird.

9. Verfahren gemäß dem Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Beladung der Poren mit Antikörpern oder Antigenen vor der Antikörper-Antigen-Reaktion erfolgt.

10. Verfahren nach dem Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Beladung der Poren im Verlauf der Antikörper-Antigen- Reaktion erfolgt, indem eine Potentialdifferenz mit geeigneter Polarität angelegt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Poren von vorhandenen Antikörpern bzw. Antigenen durch Anlegen einer Potentialdifferenz mit geeigneter Polarität entladen werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beschleunigung des Reaktionsvorganges das Prinzip der Gegenstrom-Elektrophorese angewandt wird.