DE19530816A1

DE19530816A1 - Verwendung von mutierter Subtilisin-Protease in kosmetischen Produkten

Info

Publication number: DE19530816A1
Application number: DE19530816A
Authority: DE
Inventors: Albrecht Dr Weiss; Karl-Heinz Dr Maurer
Original assignee: COGNIS BIO UMWELT; Cognis Gesellschaft fuer Biotechnologie mbH
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 1995-08-23
Filing date: 1995-08-23
Publication date: 1997-02-27
Also published as: ATE209888T1; EP0845972A1; DK0845972T3; JPH11512092A; US6509021B1; ES2169258T3; DE59608385D1; WO1997007770A1; EP0845972B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von mutierten proteolytischen Enzymen mit geringem Irritationspotential gegenüber der Haut, nämlich mutierten Subtilisin-Protea sen, in kosmetischen Produkten, insbesondere Körperreinigungs- und -pflegemitteln sowie Mundpflegemitteln.

Enzyme wie Proteasen, Lipasen, Oxidasen, Peroxidasen, etc. werden seit langem in Wasch- und Reinigungsmitteln zur Unterstützung der Wasch- und Reinigungsleistung ver wendet.

Subtilisine sind eine Familie von bakteriellen, extracellulären Proteasen mit Molekularge wichten von 20 000 bis 45 000 Dalton, die aus Bodenbakterien, z. B. Bacillus amylolique faciens erhalten werden können. Proteasen sind Enzyme, die die Hydrolyse von Peptidbin dungen in Protein- und Peptidsubstraten und von Esterbindungen in einigen endständigen Estern katalysieren. Subtilisine gehören zur Gruppe der Serin-Proteasen, die den nucleo philen Angriff auf die Peptid-(Ester-) Bindung über einen Serin-Rest an der aktiven Stelle initiieren. Sie sind physikalisch und chemisch gut charakterisierte Enzyme. Die dreidimen sionale Struktur von einigen Subtilisinen wurde im einzelnen durch Röntgen-Beugungsauf nahmen aufgeklärt. (Betzel, C., Pal, G.P., and Saenger, W. (1988) Eur. J. Biochem. 178, 155-171; Bott, R., Ultsch, M., Kossiakoff, A., Graycar, T., Katz, B., and Power, S. (1988) J. Biol. Chem. 263, 7895-7906; Goddette, D.W., Paech, C., Yang, S.S., Mielenz, J.R., By stroff, C., Wilke, M., and Fletterick, R.J. (1992) J. Mol. Biol. 228, 580-595; Heinz, D.W., Priestle, J.P., Rahuel, J., Wilson, K.S., and Grütter, M.G. (1991) J. Mol. Biol. 217, 353-371; Kraut, J., (1977) Annu. Rev. Biochem. 46, 331-358; Neidhart, D.J. and Petsko, G.A. (1988) Protein Eng. 2, 271-276; Teplyakov, A.V., Kuranova, I.P., Harutyunyan, E.H., Vainshtein, B.K., Frömmel, C., Höhne, W.-E., and Wilson, K.S. (1990) J. Mol. Biol. 214, 261-279).

Subtilisine werden in großem Umfang in handelsüblichen Produkten, wie zum Beispiel in Wasch- und Geschirrspülmitteln sowie Kontaktlinsen-Reinigungsmitteln, und für For schungszwecke, wie z. B. in der synthetischen organischen Chemie, eingesetzt. Ein Mit glied der Subtilisinfamilie, nämlich eine hoch alkalische Protease, die in Tensidzusammen setzungen verwendet wird, wurde in der Patentanmeldung WO 91/02792 beschrieben. Diese alkalische Protease aus Bacillus lentus (Bacillus lentus alkaline protease (BLAP)) kann in handelsüblichen Mengen aus dem Stamm-Bacillus licheniformis ATCC 53926 er halten werden, welcher ein Expressionsplasmid trägt, das das BLAP-Gen unter der Kon trolle des Promoters der alkalischen Protease von B. licheniformis ATCC 53926 exprimiert. Die Kristallstruktur von BLAP wurde abgeleitet (Goddette, D.W., et al. (1992) J. Mol. Biol. 228, 580-595; WO 92/21760) und die Koordinaten wurden bei der Brookhaven Protein Datenbank hinterlegt. Die Numerierung der Aminosäurepositionen in BLAP (269 Amino säuren), kann mit von der von Subtilisin BPN′ (275 Aminosäuren) verglichen werden. Wenn man eine optimale Sequenzhomologie abgleicht, erhält man folgendes Muster: BLAP Posi tionen 1 bis 35, 36 bis 54, 55 bis 160 und 161 bis 269 entsprechen den Positionen 1 bis 35, 37 bis 55, 57 bis 162 bzw. 167 bis 275 in Subtilisin BPN′.

Um die Protease-Varianten zu beschreiben, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, wird die folgende Nomenclatur verwendet: [ursprüngliche Aminosäure; Position vom N-Terminus des ausgereiften Enzyms; substituierte Aminosäure]. Zum Beispiel wird der Austausch von Valin durch Isoleucin in der Position 4 im BLAP als V4I bezeichnet. Die Liste der Abkürzungen für die Aminosäuren ist in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Nomenclatur der Aminosäuren

Mehrere Mutationen innerhalb desselben Protein-Moleküls werden als Summe der einzel nen Mutationen bezeichnet, d. h. S3T + V4I + A188P + V193M + V199I.

Der Schutz gegenüber thermischer und chemischer Inaktivierung und die Verbesserung der Wasch- und Reinigungswirkung sowie der Hautverträglichkeit sind primäre Aufgaben bei der Forschung und Entwicklung von Proteasen für technische und gewerbliche Anwen dungen. Eine Vielzahl von Enzymen, die Subtilisine enthalten, wurden durch Zufallsmuta genese oder ortsspezifische Mutagenese entwickelt. Sie liefern einige Richtlinien, um eine verbesserte thermische und chemische Stabilität auf rationalem Wege zu erreichen. (Estell, D.A., Graycar, T.P., and Wells, J.A. (1985) J. Biol. Chem. 260, 6518-6521; Matsumura, M., Becktel, W.J., Levitt, M., and Matthews, B.W. (1989) Proc. Natl. Sci. USA 86, 6562-6566; Pantoliano, M.W., Whitlow, M., Wood, J.F., Rollence, M.L., Finzel, B.C., Gilliland, G.L., Poulos, T.L., and Bryan, P.N. (1988) Biochemistry 27, 8311-8317; Russell, A.J. and Fersht A.R. (1987) Nature 328, 496-500; Siezen, R.J., De Vos, W.M., Leunissen, J.A.M., und Dÿkstra, B.W. (1991) Protein Eng. 4, 719-737; van Ee, J.H. (1991) Chimicaoggi (718), 31-35; Wells, J.A. and Estell, D.A. (1988) Trends Biochem. Sci. 13, 291-287). Die Verände rung der enzymatischen Aktivität, insbesondere der Verbesserung oder Optimierung der Geschwindigkeit für eine Vielzahl (subset) von Substraten, ist ein wesentlich komplexeres Problem. EP 0260105 offenbart den Aufbau von Subtilisin-BPN′-Mutanten mit variierenden Verhältnissen von Umesterungsgeschwindigkeit zu Hydrolysegeschwindigkeit und nucleo philen Spezifizierungen durch Verändern der spezifischen Aminosäurereste innerhalb von 15 Å der katalytischen Triade. Russell, A.J. und Fersht, A.R. (1987) J. Mol. Biol. 193, 803-813, beschreiben die Isolierung eines Subtilisin-BPN′-Mutanten (DO99S), der eine Verände rung im Oberflächenabschnitt von 14 bis 15 Å vom Mutationsort aufweist. Diese Substitu tion beeinflußt die pH-Abhängigkeit der katalytischen Reaktion des Subtilisins. Keine dieser Veröffentlichungen lehrt, ob die Veränderungen bei den Aminosäuren auch eine Verände rung der Hautverträglichkeit der Enzyme bewirken. EP 0130756, EP 0247647 und US 4,760,025 offenbaren ein Sättigungsmutationsverfahren, worin eine oder eine Vielzahl von Mutationen in das Subtilisin BPN′ an den Aminosäureresten (BPN′-Numerierung) Asp32, Asn155, Tyr104, Met222, Gly166, His64, Ser221, Gly169, Glu156, Ser33, Phe189, Tyr217 und/oder Ala152 eingeführt werden. Unter Verwendung dieser mutierten Proteasen, die eine verbesserte oxidative Stabilität zeigen, werden eine veränderte Substratspezifizierung und/oder eine veränderte pH-Aktivität erhalten. Diese Veröffentlichungen lehren auch, daß Mutationen innerhalb des Bereiches des aktiven Zentrums der Protease die Aktivität am meisten beeinflussen. Jedoch offenbart weder die EP 0130756, noch die EP 0247647 oder US 4,760,025 ein Verfahren, das voraussagt, daß Veränderungen in der Aminosäurese quenz die Hautverträglichkeit von Proteasen verbessern können.

Die meisten der Informationen über die katalytische Aktivität von Subtilisinen wurden bei Untersuchungen der Hydrolyse von kleinen, gut definierten Peptidsubstraten gesammelt. Bis jetzt ist nur wenig über Wechselwirkungen bei großen Proteinsubstraten bekannt. Dies gilt insbesondere für die Waschwirkung von Proteasen, bei denen das Substrat an eine textile Oberfläche gebunden ist und die Katalyse in Gegenwart von wechselwirkenden Verbindungen wie Bleichmitteln, Tensiden und Buildern stattfindet. Auch ist nichts über die Wechselwirkung der Proteasen mit den in Haut- und Haarpflegemitteln sowie Mundpfle gemitteln enthaltenen Substanzen bekannt.

EP 0 328 229 offenbart die Isolierung und Charakterisierung von PB92 Subtilisin-Mutanten mit verbesserten Eigenschaften beim Einsatz in Waschmitteln, basierend auf den Ergeb nissen von Waschtests. Es wird gesagt, daß biochemische Eigenschaften keine geeigne ten Parameter sind, um das Enzymverhalten bei der Wäsche vorauszusagen. Ein Verfah ren zur Auswahl von Mutationen beinhaltet die Substitution von Aminosäuren durch andere Aminosäuren in der gleichen Kategorie (polar, unpolar, aromatisch, geladen, aliphatisch und neutral), die Substitution von polaren Aminosäuren wie Asparagin und Glutamin durch geladene Aminosäuren, und Erhöhen des anionischen Charakters der Protease an den Mutationsstellen, die nicht zu den Aktivstellen gehören. Es wird kein Verfahren beschrie ben, mit welchem identifiziert werden kann, welche spezifischen Aminosäuren verändert werden sollten.

Es sind mehrere Patentanmeldungen bekannt, in denen die Variation von Subtilisin-Enzy men beschrieben wird, um deren Wirkungsweise in Waschmitteln zu verbessern, z. B. in WO 91/00345 und WO 92/11357.

Die europäische Patentanmeldung 0 571 049 A1 offenbart bestimmte mutierte proteolyti sche Enzyme. Es wird gesagt, daß diese Enzyme zu mindestens 70% homolog sind mit der Aminosäure-Sequenz von PB92 Serin-Protease und sich von der PB92-Serin-Protease durch mindestens eine Aminosäure an den Positionen 99, 102, 116, 126, 127, 128, 130, 160, 203, 211 und 212 unterscheiden. Die mutierte Protease wird durch Züchten eines Wirtstammes, welcher mit einem Expressionssektor, der eine DNA-Sequenz enthält und für eine mutierte Protease codiert, um die gewünschte mutierte Protease herzustellen, herge stellt.

In der internationalen Patentanmeldung PCT/US95/01977 werden neue mutierte Proteasen beschrieben, die als Zusatz zu Wasch- und Reinigungsmitteln deren Wirksamkeit verbes sern.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mutierte Proteasen zur Verfügung zu stellen, die eine gegenüber der handelsüblichen Protease verbesserte Hautverträglich keit aufweist und in in kosmetischen Produkten, insbesondere Körperreinigungs- und pfle gemitteln sowie Mundpflegemitteln, eingesetzt werden kann.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von mutierter Subtilisin-Pro tease in kosmetischen Produkten, dadurch gekennzeichnet, daß die mutierte Subtilisin- Protease mindestens eine Mutation in ihrer Aminosäure-Sequenz enthält, was zu einer reduzierten positiven Ladung oder einer erhöhten negativen Ladung in der Nähe der an das Substrat gebundenen Region des Moleküls führt.

Als Proteasen werden vorzugsweise die in der internationalen Patentanmeldung PCT/US95/01937, deren Offenbarungsgehalt auch für diese Patentanmeldung gilt, be schriebenen Proteasen eingesetzt.

Zu den kosmetischen Produkten, in denen die mutierte Protease erfindungsgemäß einge setzt werden kann, sind insbesondere Körperreinigungs- und -pflegemittel sowie Mund pflegemittel zu nennen, wie z. B. Seifen in fester und flüssiger Form, Peeling-Cremes, Kör perpflegemittel, wie Hautcremes, Softcremes, Nährcremes, Sonnenschutzcremes, Nacht cremes, Hautöle, Pflegelotionen und Körper-Aerosole, Deodorants, Rasiercremes und Ra sierschaum, Haarshampoos, Haarspülungen und Schaumbäder, Mundspülungen und Zahnpasta.

Die erfindungsgemäß verwendeten mutierten Proteasen zeigen überraschenderweise ein geringes Irritationspotential gegenüber der Haut und den Schleimhäuten und eignen sich demgemäß hervorragend zum Einsatz in den voranstehend genannten Produkten.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher die Verwendung der voranstehend beschriebenen Proteasen zur Herstellung von Mitteln zur Haut-, Haar- und Körperpflege. Zur Herstellung dieser Mittel werden die einzelnen Komponenten in an sich bekannter Weise vermischt. Die Mittel können, wenn sie lipophile Stoffe enthalten, sowohl als "Was ser-in-Öl" als auch "Öl-in-Wasser"-Emulsionen vorliegen und weitere übliche Hilfs- und Zusatzstoffe enthalten.

Die Mittel enthalten neben den erfindungsgemäß eingesetzten Proteasen als wesentliche Bestandteile insbesondere Tenside, wie anionische, nichtionische, kationische, amphotere bzw. zwitterionische Tenside.

Als Hilfs- und Zusatzstoffe eignen sich beispielsweise Emulgatoren, Ölkomponenten, Fette und Wachse, Verdickungsmittel, Überfettungsmittel, biogene Wirkstoffe, Filmbildner, Duft stoffe, Farbstoffe, Perglanzmittel, Konservierungsmittel und pH-Regulatoren.

Übliche Ölkomponenten sind Substanzen wie Paraffinöl, Pflanzenöle, Fettsäureester, Sili conöle, Dialkylether, Fettalkohole und Guerbetalkohole, Squalan und 2-Octyldodecanol zu nenne, während als Fette und Wachse beispielsweise Walrad, Bienenwachs, Montan wachs, Paraffin und Cetylstearylalkohol Verwendung finden.

Als Emulgatoren können beispielsweise eingesetzt werden: Sorbitanester, Monoglyceride, Polysorbate, Polyethylenglycolmono/difettsäureester, hochethoxylierte Fettsäureester so wie hochmolekulare Siliconverbindungen, wie z. B. Dimethylpolysiloxane mit einem durch schnittlichen Molekulargewicht von 10 000 bis 50 000. Weitere Zusatzstoffe können sein:
Als Überfettungsmittel können Substanzen wie polyethoxylierte Lanolin-Derivate, Dicytin- Derivate und Fettsäurealkanolamide verwendet werden, wobei die letzteren gleichzeitig als Schaumstabilisatoren dienen.

Geeignete Verdickungsmittel sind beispielsweise Polysaccharide, insbesondere Xanthan- Gummi, Guar, Agar-Agar, Alginate und Tylosen, Carboxymethylcellulose und Hydroxye thylcellulose, ferner höher molekulare Polyethylenglykolmono und -diester von Fettsäuren, Polyacrylate, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrolidon sowie Elektrolyte wie Kochsalz und Ammoniumchlorid.

Unter biogenen Stoffen sind beispielsweise Pflanzenextrakte, Eiweißhydrolysate und Vit aminkomplexe zu verstehen.

Gebräuchliche Filmbildner sind beispielsweise Polyvinylpyrolidon, Vinylpyrolidon-Venylace tat-Copolymerisate, Polymere der Acrylsäurereihe, quaternäre Cellulose-Derivate und ähn liche Verbindungen.

Als Konservierungsmittel eignen sich beispielsweise Formaldehyd-Lösungen, p-Hydroxy benzoesäureester oder Sorbinsäure.

Als Perglanzmittel kommen beispielsweise Glykoldistearinsäureester wie Ethylenglykoldi stearat, aber auch Fettsäuremonoglykolester in Betracht.

Als Farbstoffe können die für kosmetische Zwecke geeigneten und zugelassenen Sub stanzen verwendet werden, wie sie beispielsweise in der Publikation "Kosmetische Färbe mittel" der Farbstoffkommission der deutschen Forschungsgemeinschaft, veröffentlicht im Verlag Chemie, Weinheim, 1984, zusammengestellt sind. Diese Farbstoffe werden übli cherweise in Konzentrationen von 0,001 bis 0,1 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Mi schung, eingesetzt.

In Cremes können neben den bereits genannten Zusätzen auch Antioxidantien, wie z. B. Butylhydroxytoluol, Tocopherol: Feuchthaltemittel, wie z. B. Glycerin, Sorbitol, 2-Pyrrolidin- 5-carboxylat, Dibutylphthalat, Gelatine, Polyglycole mit einem durchschnittlichen Moleku largewicht von 200 bis 600; Puffer, wie z. B. Milchsäure/Triethanolamin oder Milchsäu re/NaOH; milde Tenside, wie z. B. Alkyloligoglucoside, Fettalkoholethersulfate, Fettsäure isethionate, -tauride und -sarcosinate, Ethercarbonsäuren, Sulfosuccinate, Eiweißhydroly sate bzw. -fettsäurekondensate, Sulfotriglyceride, kurzkettige Glucamide; Phospholipide, Pflanzenextrakte, z. B. von Aloe vera; Sonnenschutzmittel, wie z. B. ultrafeines Titandioxid oder organische Stoffe wie p-Aminobenzoesäure und deren Ester, Ethylhexyl-p-methoxy zimtsäureester, 2-Ethoxyethyl-p-methoxyzimtsäureester, Butylmethoxydibenzoylmethan und deren Mischungen sowie Wirkstoffbeschleuniger, insbesondere etherische Öle, wie beispielsweise Eucalyptol, Menthol und ähnliche enthalten sein.

Der ursprüngliche Proteasetyp, von welchem sich die gemäß der Erfindung verwendeten mutierten Proteasen ableiten, ist vorzugsweise eine alkalische Bacillus lentus Protease- (BLAP), die aus dem Stamm DSM 5483 erhalten wird und 269 Aminosäureeinheiten, eine Molekülmasse von 26.823 Dalton und einen berechneten isoelektrischen Punkt von 9,7, bezogen auf pK-Standardwerte, aufweist. Das BLAP-Gen wird durch Isolieren der chromo somalen DNA aus dem B. lentus-Stamm DSM 5483, Herstellen von DNA-Proben mit einer Homologie gegenüber den (putativen) DNA-Sequenzen der für die B. lentus Protease co dierenden Regionen, Herstellen von Genom-Bibliotheken aus der isolierten chromosoma len DNA und Auswählen der Bibliotheken für die interessierenden Gene durch Hybridisie rung der Proben erhalten.

Mutanten von B. lentus DSM 5483 Protease mit verbesserter thermischer und Oberflä chenstabilität wurden in der US Patentschrift US 5,340,735 beschrieben. Im allgemeinen werden die in dieser Erfindung beschriebenen Mutationen in ursprüngliche BLAP-Arten durch Ersatz der folgenden Aminosäure eingeführt: S3T, V4I, A188P, V193M und V199I (Numerierung gemäß der BLAP-Sequenz).

Um Proteasen in den voranstehend beschriebenen Mitteln einsetzen zu können, sind solche erwünscht, die keine oder nur geringe Irritationen gegenüber der Haut bzw. den Schleim häuten hervorrufen.

Figurenbeschreibung

Fig. 1 zeigt ein Modell der Substratbindungsstelle von der Wildtyp-BLAP mit dem syn thetischen Substrat AAPF (= Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-Nitroanilide), das an das Enzym gebunden ist. Die Positionen von Arginin 99, Serin 154 und Leucin 217 in Bezug auf das gebundene Substrat sind wiedergegeben.

Fig. 2 zeigt die Restriktions-Karte für Escherichia coli-Plasmid pCB13C, das ein Hybrid zwischen dem Protease-Gen von Bacillus licheniformis ATCC 53926 und Bacillus lentus DSM 5483 BLAP-Gen enthält. Der Promoter, die ribosomale Bindungsstelle und die Prä- Sequenz (53926) aus ATCC 53926 wurden an die Sequenz von Pro-Region und Protein des BLAP-Gens fusioniert. Der Transcriptionsterminator von ATCC 53926 (T-53926) wurde an die BLAP-Codierungssequenz angehängt.

Fig. 3 zeigt die DNA-Sequenz für das Aval/Clal-Fragment aus der N-terminalen Region des in Beispiel 2 beschriebenen alkalischen Protease-Gens ATCC 53926. Das Fragment beinhaltet den Promoter, die ribosomale Bindungsstelle, das Initiierungscodon und den größten Teil der Prä-Sequenz. Das Basenpaarfragment 292 wird von den Aval und Clal- Restriktions-Stellen an seinen 5,- bzw. 3′-Enden flankiert.

Fig. 4 zeigt die Restriktions-Karte für das E. coli plasmid pMc13C, welches sich von pMac5-8 ableitet und das BLAP-Gen enthält. Das Ampicillin-resistente Gen (Ap^R), das in pMc13C enthalten ist, wurde durch eine "Amber-Mutation" inaktiviert. Das Plasmid codiert nur für die Resistenz gegenüber Chloramphenicol (Cm^R).

Fig. 5 zeigt die Restriktions-Karte für Bacillus plasmid pCB76M131, welches das Gen enthält, das für die BLAP-Variante M131 codiert. Es zeigt auch das Hybrid zwischen der Protease ATCC 53926 und BLAP, wie in Fig. 2 für pCB13C beschrieben. Auch liegt die Transcriptionsterminatorsequenz des alkalischen Protease-Gens 53926 vor. Das Plasmid basiert auf dem Plasmid pUB110, welches für die Resistenz gegenüber Kanamycin codiert.

Fig. 6 zeigt eine Restriktions-Karte für Bacillus plasmid pH70. weiches ein Derivat von Plasmid pUB110 ist, das das alkalische Protease-Gen ATCC 53926 enthält. Ein EcoRI/BamHI-Fragment, das das Protease-Gen trägt, wurde zwischen die EcoRI- und BamHI-Stellen an pUB110 kloniert. Dieses Plasmid wird in Beispiel 3 diskutiert: Klonieren von mutierten Protease-Genen. Das Plasmid pH70 trägt eine Resistenz für Kanamycin.

Fig. 7 zeigt eine Restriktions-Karte für Bacillus-plasmid pC51, einem pBC16-Derivat, das das alkalische Protease-Gen von ATCC 53926 trägt. Ein EcoRI/BamHI-Fragment, das das Protease-Gen trägt, wurde zwischen einer EcoRI-Stelle und den BamHI-Stellen im Plasmid pBC16 kloniert. Dieses Plasmid wird in Beispiel 3 diskutiert: Klonieren von mutier ten Protease-Genen. Plasmid pC51 trägt eine Resistenz für Tetracyclin.

Fig. 8 zeigt eine Restriktions-Karte für Bacillus plasmid pBC56M131, welches das Gen für die BLAP-Variante M131 codiert. Enthalten ist die Fusion zwischen dem alkalischen Protease-Gen ATCC 53926 und dem in Fig. 2 für pCB13C beschriebenen BLAP-Gen. Auch die Transcriptions-Terminatorsequenz aus dem alkalischen Protease-Gen ATCC 53926 liegt vor. Dies ist ein Plasmid auf Basis von pBC16, welches für die Resistenz ge genüber Tetracyclin codiert.

Fig. 9 zeigt die Peptide, die durch Abbau von BLAP mit Trypsin hergestellt wurden. BLAP (11 mg/ml^-1) wurde in 1,6M Harnstoff, 0,16M NH₄HCO₃ mit Trypsin (1%, Gew./Gew., in 1 mM HCl) 10 Minuten bei 37°C aufgeschlossen. Die Probe wurde dann mit 10%iger (V/V) Trifluoressigsäure (TFA) auf eine Endkonzentration von 1% TFA angesäuert. Die Peptide wurden durch Injizieren von 1 µl der Probe auf eine HPLC-Säule, wie in Beispiel 8 beschrieben, abgetrennt. Die tryptischen Peptide entsprechen den folgenden BLAP-Se quenzen:
Fragment Nr. 1 - Alal bis Arg10; Fragment Nr. 2 - Val11 bis Arg19;
Fragment Nr. 3 - Gly20 bis Lys27; Fragment Nr. 4 - Val28 bis Arg44;
Fragment Nr. 5 - Gly45 bis Lys92; Fragment Nr. 6 - Val93 bis Arg99;
Fragment Nr. 7 - Gly100 bis Arg143; Fragment Nr. 8 - Gly144 bis Arg164;
Fragment Nr. 9 - Tyr165 bis Arg180; Fragment Nr. 10 - Ala181 bis Lys229;
Fragment Nr. 11 - Gln230 bis Lys231; Fragment Nr. 12 - Asn232 bis Arg241;
Fragment Nr. 13 - Asn242 bis Lys245 und Fragment Nr. 14 - Asn246 bis Arg269.

Bakterienstämme

Bacillus licheniformis E312 mit Plasmid pBC56M131 ist als ATCC 68614 hinterlegt. Esche richia coli WK6 mit Plasmid pMC13C ist als ATCC 68615 hinterlegt. E. coli GM33 mit Plasmid pCB13C ist als ATCC 68616 hinterlegt. E. coli WK6 mit Plasmid pMa5-8 ist als ATCC 68617 hinterlegt. E. coli WK6 mit pMc5-8 ist als ATCC 68618 hinterlegt.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Ein Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auswählen von Aminosäure-Veränderungen, die zu einer mutierten Protease mit geringem Irritationspoten tial führen. Ein verringertes Irritationspotential gegenüber der Haut und den Schleimhäuten kann erhalten werden, indem Aminosäure-Veränderungen innerhalb des Substratbin dungsbereichs des Enzyms durchgeführt werden, die zu einer Erhöhung der negativen Ladung führen. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann dies beispielsweise durch eine Vermehrung von negativ geladenen Aminosäureresten oder einer Reduktion von positiv geladenen Aminosäureresten im Substratbindungsbereich im Umkreis von 7 Å um ein ge bundenes Substratmolekül, wie z. B. AAPF, erfolgen. Insbesondere wurde gezeigt, daß Aminosäure-Veränderungen an den Positionen 99, 154 und 211 innerhalb der alkalischen Protease (BLAP)-Varianten M130 und M131 von Bacillus lentus ein verringertes Irritations potential der Enzyme gegenüber Haut und Schleimhäuten zeigen.

Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von modifi zierten Enzymen, die ein geringeres Irritationspotential gegenüber Haut und Schleimhäuten verglichen mit den Wildtyp-Enzymen haben. Die in dieser Patentanmeldung beschriebenen Mutationen werden vorzugsweise in die BLAP-Varianten M130 oder M131 eingeführt, wel che in der US 5,340,735 beschrieben wurden. M130 und M131 haben beide gezeigt, daß sie, verglichen mit der natürlich vorkommenden Protease eine verbesserte Stabilität haben. Die Mutante M130 enthält vier Aminosäure-Veränderungen: S3T; A188P; V193M und V199I. Die Mutante M131 enthält fünf Aminosäure-Veränderungen: S37; V41; A188P; V193M und V199I. Das zum Bezeichnen der bevorzugten Proteasen verwendete System listet zuerst den Aminosäurerest in der ursprünglichen Form von BLAP an der numerier ten Position auf, dann folgt die ersetzte Aminosäure unter Verwendung der in einem Buch staben anerkannten Aminsosäure-Codes. Die Aminsosäure-Sequenzen für die Proteasen M130 und M131 sind in der SEQ ID No.: 2 bzw. SEQ ID No.: 1 wiedergegeben, die in der obengenannten US-Patentschrift enthalten sind. M130 und M131 dienen als Basis für wei tere Aminsoäuren-Veränderungen, um Proteasen mit verringertem Irritationspotential zu erhalten. Die mutanten Proteasen gemäß der Erfindung sind solche, die durch Ersatz min destens eines Aminosäurerestes der mutanten Proteasen M130 oder M131 erhalten wer den, worin der Aminosäurerest ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arginin an der Position 99, Serin an der Position 154 und Leucin an der Position 211. Tabelle 2 gibt eine Beschreibung der in dieser Erfindung beanspruchten mutanten BLAP-Proteasen, die F11, F43, F44, F45, F46, F47, F49, F54 und F55 einschließen. Zum Beispiel leitet sich das in Tabelle 2 gezeigte F11 von M130 ab und enthält ein Arginin an der Position 99, wel ches zusammen mit anderen in M130 vorliegenden Mutationen ersetzt wurde (R99S), wo bei diese Mutationen die folgenden einschließen: ein Serin an der Position 3 ersetzt durch ein Threonin (S3T); ein Alanin an der Position 188 ersetzt durch ein Prolin (A188P); ein Valin an der Position 193 ersetzt durch ein Methionin (V193M) und ein Valin an der Posi tion 199 ersetzt durch ein Isoleucin (V1991). Von den verbleibenden mutanten Proteasen leiten sich F43 bis F49 von M131 ab. Die Mutanten F54 und F55 leiten sich von der Mu tante F49 ab. Die Aminosäure-Sequenzen der bevorzugten proteolytischen Enzyme F11, F43, F44, F45, F46, F47, F49, F54 und F55 sind in SEQ ID Nr: 1 bis SEQ ID Nr: 9 dieser Erfindung wiedergegeben.

Die genetische Konstruktion der mutierten Proteasen wird im einzelnen in Beispiel 2 be schrieben. In allen Fällen wurden die Mutationen, die Aminosäure-Veränderungen einfüh ren, unter Verwendung von bekannten Verfahren durchgeführt. Die DNA-Sequenzen co dieren für die reifen Formen der bevorzugten Proteasen F11, F43, F44, F45, F46, F47, F49, F54 und F55. Jedes Hybrid-Gen, das eines der oben aufgeführten mutanten Protea sen codiert, enthält in der Transcriptionsrichtung einen Promoter, eine ribosomale Bin dungsstelle und Initiierungscodon und den Hauptteil der Prä-Region des alkalischen Prote ase-Gens aus B. licheniformis ATCC 53926 operabel fusioniert an einen Teil der Prä-Re gion gefolgt von Pro-Region und dem modifizierten BLAP-Gen, gefolgt von der Transcripti ons-Terminatorsequenz für das alkalische Protease-Gen aus ATCC 53926. Das Hybrid- Gen kann in das Chromosom des Wirts integriert werden oder Plasmid-kodiert vorliegen, welches innerhalb des gewünschten Bacillus-Stammes repliziert. Insbesondere wird das Plasmid pUB110 oder ein Derivat von pUB110 als Plasmid für die Protease-Herstellung in Bacillus-subtilis-Stämmen und Plasmid pBC16 oder ein Derivat von pBC16 für die Pro tease-Herstellung in B. licheniformis-Stämmen ausgewählt. Die mutierten Proteasen wer den durch Anzucht der Bacillus-Stämme in einem geeigneten Medium produziert, die zuvor mit Plasmiden, die die Hybridgene enthalten, transformiert wurden.

Beispiel 1 Identifizierung der Aminosäurepositionen in BLAP für die Mutagenese

Eine Vielzahl von natürlich vorkommenden Subtilisinen und anderen Serin-Proteasen wur den auf ihre Eignung für Kosmetika und Mundepflegemittel getestet. Die Ergebnisse zeig ten, daß die Eignung für Kosmetika und Mundpflegemittel von der Anzahl und der Vertei lung der geladenen Aminosäureresten in der Bindungsregion des Substrates abhängt. Eine Verringerung des Irritationspotentials wurde bei einer verringerten Zahl der negativ gelade nen Aminosäurereste oder bei einem Anstieg der Zahl der positiv geladenen Aminosäure reste in der Bindungsregion des Substrats beobachtet. Demgemäß haben die hier verwen deten BLAP-Mutanten eine reduzierte, positive Netzladung in der Bindungsregion des Substrates und zeigen ein verringertes Irritationspotential gegenüber Haut und Schleim häuten und somit eine verbesserte Hautverträglichkeit. Das verringerte Irritationspotential wurde durch Einführen von Aminosäure-Veränderungen innerhalb der Substratbindungs stellen erhalten, was zu einer Veränderung der Netto-Ladung der Protease führte. Verän derungen wurden an Aminosäuren durchgeführt, die innerhalb der Bindungstasche des Substrates entweder der BLAP-Variante M130 oder der BLAP-Variante M131 gebunden waren. Die Substrat-Bindungstasche dieser Enzyme wird als die Region bezeichnet, die innerhalb von 7 Å des gebundenen Substrats, AAPF, liegt. Fig. 1 zeigt die charakteristi sche Struktur der Substrat-Bindungsstelle von Wildtyp-BLAP, mit dem synthetischen Substrat AAPF. AAPF, gebunden an das Enzym, wurde anhand von kristallografischen Daten der Subtilisin-Inhibitor-Komplexe modelliert, die in der Uteratur beschrieben und von der Brookhaven-Protein-Datenbank verfügbar sind. Die Struktur der Varianten M130 und M131 innerhalb der Substrat-Bindungsstelle ist gemäß der Röntgenstrukturanalyse im we sentlichen mit der von Wildtyp-BLAP identisch. Die Struktur der Wildtyp BLAP mit einer Auflösung von 1,4 Å wurde in US 5,340,735 veröffentlicht, und die entsprechenden Atom- Koordinaten wurden bei der Brookhaven-Protein-Datenbank hinterlegt. Insbesondere zeig ten die Modifikationen an den Positionen 99, 154 und 211 innerhalb der BLAP-Varianten M130 und M131, daß das Irritationspotential des Enzyms verbessert, d. h. verringert, wird. Die parenteralen Aminosäuren, die diese Stellen besetzen, Arginin 99, Serin 154 und Leucin 211, sind in Fig. 1 wiedergegeben. Alle drei Aminosäuren werden innerhalb des spezifizierten Radius von 7 Å von gebundenem AAPF lokalisiert.

Beispiel 2 Konstruktionen der mutanten Gene des Gens BLAP A. Konstruktion der mutanten M130 und M131

Gene, die die erfindungsgemäß brauchbaren Mutanten B. lentus DSM 5483-Proteasen exprimieren, werden durch Veränderung von einem oder mehreren Codon des Wildtyps des alkalischen Protease-Gens B. lentus DSM 5483 hergestellt. Protease M130 wurde aus BLAP durch Einführen der Mutationen S3T, A188P, V193M und V199I erhalten. Protease M131 wurde aus BLAP durch Einführen der Mutationen S3T, V4I, A188P, V193M und V199I erhalten. Gene, die die Proteasen M130 und M131 codieren, wurden unter Verwen dung des PMac-Verfahrens (Stanssens, P., Opsomer, C., McKeown, Y.M., Kramer, W., Zabeau, M., and Fritz, H.-J. (1989) Nucleic Acids, Res. 17, 4441-4445) konstruiert. Die Pro teasen M130 und M131 wurden bereits in der US 5,340,735 beschrieben. Die Proteasen M130 und M131 zeigen eine verbesserte thermische und Oberflächenstabilität verglichen mit der Wildtyp-BLAP und dienen als Basis für die Entwicklung von Proteasen mit verrin gertem Irritationspotential gegenüber Haut und Schleimhäuten. Die genetischen Techni ken, die zum Modifizieren des BLAP-Gens verwendet wurden, um die M130- und M131-Pro teasen zu modifizieren, wurden auch in der Patentanmeldung WO 91/02792 beschrie ben.

Die Proteasen M130 und M131 leiten sich von der alkalischen Protease B. lentus DSM 5483 (BLAP) durch ortsspezifische Mutagenese der DNA ab, die für die reife Form des BLAP-Wildtyp codiert. Das DNA-Fragment, das für die reife Form von BLAP codiert, wurde unter Verwendung von Plasmid pCB13C (Fig. 2) hergestellt. Das Plasmid pCB13C enthält eine Hydridfusion zwischen dem Protease-Gen B. licheniformis ATCC 53926 und dem BLAP-Gen von B. lentus DSM 5483. Insbesondere enthält diese Hybridfusion eine DNA, die codiert für den Promoter, die ribosomale Bindungsstelle und 21 Reste der Prä-Sequenz aus dem Protease-Gen ATCC 53926, fusioniert mit einer DNA-Sequenz, die für die letzten 5 Reste der BLAP-Prä-Sequenz codiert und alle der Pro-Sequenz und der Sequenz von BLAP. Diese Fusion wird als Clal-Fusion bezeichnet, weil ihre Restriktions-Stelle an der Verbindung zwischen der von ATCC 53926 und DSM 5483-DNA lokalisiert ist. Eine neue Clal-Restriktions-Stelle muß in das alkalische Protease-Gen ATCC 53926 in der Nähe der Verbindung zwischen den Prä- und Pro-Sequenzen eingeführt werden. Die Clal-Stelle wurde in das alkalische Proteasegen ATCC 53926 unter Verwendung der Polymerase-Ket tenreaktion (PCR) eingeführt, um ein DNA-Fragment, das die Sequenzinformation aus dem N-terminalen Teil des alkalischen Proteasegens ATCC 53926 enthält, zu amplifizieren. Das amplifizierte Fragment schließt den alkalischen ProteasePromoter ATCC 53926, die ribo somale Bindungsstelle, das Initiierungscodon und den größten Teil der Prä-Sequenz ein. Die DNA-Sequenz des Fragments ist in Fig. 3 gezeigt. Dieses 292-bp-DNA-Fragment war von den Restriktionsstellen Aval und Clal an seinen 5′- bzw. 3′-Enden flankiert. Das BLAP-Gen enthielt bereits eine natürlich vorkommende Clal-Stelle an der entsprechenden Posi tion. Die Analyse der DNA-Sequenz entlang der Fusion von ATCC-53926- und BLAP-Ge nen bestätigte die erwarteten DNA- und Aminosäure-Sequenzen.

Um die Mutagenese des BLAP-Gens durchzuführen, wird der Mutagenese-Vector pMa5-8 subkloniert. Dies wird erreicht, indem ein DNA-Fragment, das das Clal-Fusions-Gen und den ATCC 53926 Transkriptionsterminator als eine Sall-Kassette unter Verwendung der PCR synthetisiert wird. Die PCR wurde unter Verwendung der durch den Hersteller be schriebenen Bedingungen (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) durchgeführt. In der PCR werden zwei synthetische Oligonucleotide, die die Sall-Stellen tragen, als Primer verwendet und der Escherichia Coli-Vector pCB13C-DNA als Matrix. Nach Schneiden des PCR-Pro duktes mit Sall wurde dieses Fragment in das mutierte Plasmid pMc5-8 kloniert, welches vorher mit Sall geschnitten und mit bakterieller alkalischer Phosphatase dephosphoryliert worden ist. Die Plasmide pMc5-8 und pMa5-8 wurden von H.-J. Fritz erhalten und werden von Stanssens, P., et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 4441-4454 beschrieben. Die Sall- Stellen werden derart ausgewählt, daß das PCR-Fragment in pMc5-8 in beide Orientierun gen kloniert werden kann. Das Ligations-Gemisch wird in E. coli WK6 transformiert. Chlor amphenicol-resistente (Cm^R) Transformanten werden auf Gegenwart eines Inserts über prüft und ein richtiger Plasmidaufbau pMc13C wird wie in Fig. 4 gezeigt, identifiziert. Wenn das Gen in den pMc5-8-Vector kloniert ist und für die Mutation gewünschte Stellen identifi ziert sind, wird (werden) die Mutation(en) unter Verwendung von synthetischen DNA-Oli gonucleotiden gemäß einer Modifikation eines veröffentlichten Protokolls (Stanssens, P., et. al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 4441-4454) eingeführt. Das Oligonucleotid, das die einzuführende(n) Mutation(en) enthält, ist an eine Gapped Duplex-Struktur (gd) gebun den, die das BLAP-Gen auf einem Segment der Einzelstrang (ss) DNA trägt. Das Gapped Duplex kann durch Rückbilden linearer ss DNA aus pMc13C mit denaturierter und be schränkter pMa5-8 DNA rückgebildet werden. Das Plasmid pMa5-8 enthält ein aktives Ampicillin-Resistenz-Gen, aber es hat eine inaktivierende Punktmutation im Chlorampheni col-Resistenz-Gen, während das Plasmid pMc13C zusätzlich zu einem intakten BLAP-Gen ein aktives Chloramphenicol-Resistenz-Gen enthält, aber es hat eine inaktivierende Punktmutation im Ampicillin-Restistenz-Gen. Das rückgebildete Produkt ist die gd-DNA, welche ein doppelsträngiger Heteroduplex mit einem ss DNA-Gap, das sich über das ge samte klonierte BLAP-Gen erstreckt. Das mutante Oligonucleotid ist in der Lage, sich zur homologen ss BLAP-DNA innerhalb des Gap zurückzubilden, und das zurückbleibende Gap wird durch DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) gefüllt und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (New England Biolabs Inc., Beverly, MA [NEB]) verbunden. Die mutagene Wirksamkeit eines solchen Systems kann unter Verwendung von Exonuclease III (Exo III, NEB) verbessert werden. Exo III ist eine Exodeoxyribonuclease, die doppelsträngige DNA aus dem 3′-Ende digeriert. Als freies 3′-Ende ist es erforderlich, daß das geschlossene, zirkuläre ss DNA oder ds DNA durch dieses Enzym nicht angegriffen wird. Eine nachfol gende Behandlung des Produktes dieser Auffüllreaktion (fill-in Reaktion) mit Exo III entfernt jede Art mit nur teilweise gefüllten Lücken. Dieses Verfahren verbessert deutlich die muta gene Effizienz und ist das bevorzugte Mutations-auslösende Verfahren. Das Produkt der Auffüllreaktion wird dann in einen Reparaturmangel (repair deficient) E. coli-Strang (WK6mutS) transformiert und Ampicillin-resistente Transformanten (Ap^R) werden ausge wählt. Die Replikation des transformierten Heteroduplex-Plasmids führt zu zwei unter schiedlichen Abkömmlingen. Eine Sorte enthält das BLAP-Wildtyp-Gen und das intakte Chloramphenicol-Resistenz-Gen, aber ein inaktives Ampicillin-Resistenz-Gen. Die andere Sorte enthält ein BLAP-Gen, das die interessierende Mutation enthält und ist gegenüber Ampicillin aber nicht gegenüber Chloramphenicol resistent.

Die Selektion der Ap^R-, Cm^S mutanten Transformanten mit Ampicillin ist nicht ausreichend, um etwas Hintergrundwachstum der Ap^S, Cm^R-Sorte zu stoppen, die den Wildtyp des BLAP-Gens tragen. Daher ist es notwendig, eine zweite Transformation in E. coli durchzu führen, wobei die Plasmid-DNA verwendet wird, die aus den Ap^R-Transformanten des WK6mutS-Stranges hergestellt wurde. Diese zweite Transformation setzt eine niedrige Plasmidkonzentration mit einer großen Anzahl von recipienten Zellen eines Suppressor- Mangelstranges von E. coli, wie WK6, ein. Diese Näherung reduziert die Wahrscheinlich keit, daß eine Zelle beide Sorten von Plasmid DNA aufnimmt. Ap^R-Transformanten werden ausgewählt und Plasmid DNA aus verschiedenen Transformanten wird isoliert und auf das Vorkommen der Mutation untersucht. Das pMa-mutante Derivat der ersten Mutagenese- Runde kann für eine zweite Mutagenese-Runde eingesetzt werden, indem die ss-DNA die ser Spezies präpariert wird und mit XbaI/HindIII verdauter und denaturierter DNA von pMc5-8 zu einem Plasmid verbunden wird. Das Plasmid pMc5-8 ist mit pMa5-8 identisch, mit der Ausnahme, daß es ein aktives Chloramphenicol-Resistenz-Gen und ein inaktives Ampicillin-Resistenz-Gen trägt. Das allgemeine Verfahren ist wie das oben beschriebene. Der Aufbau der Gene, die für Proteasen M130 und M131 codieren, erfordert zwei Mutage nese-Durchläufe. In dem ersten Mutagenese-Durchlauf wurde ein Oligonucleotid aufge baut, um die Mutationen A188P, V193M und V199I einzuführen. In einem zweiten Mutage nese-Durchlauf wurde ein Oligonucleotid aufgebaut, um die Mutation S3T in dem Fall von M130 und die Mutationen S3T und V4I in dem Fall von M131 einzuführen. Die Gegenwart all dieser Mutationen wurde durch Sequenzieren der DNA bestätigt.

B. Aufbau der Gene, die für die neuen Proteasen mit geringerem Irritationspoten tial codieren

Die Mutationen R99G, R99A, R99S, S154D, S154E und S211D wurden in das Gen, das für die Protease M131 codiert unter Verwendung der PCR-Mutagenese durch überlappen de Extension eingeführt. Die Mutation R99S wurde in das Gen eingeführt, das für die Pro tease M130 codiert, wobei die PCR-Mutagenese durch überlappende Extension eingesetzt wurde. Das Construct pCB76M131 (Fig. 5) wurde verwendet, um die Mutanten F43, F44, F45, F46, F47 und F49 (Tabelle 2) aufzubauen. Das Construct pCB76M130 wurde ver wendet, um die Mutante F11 aufzubauen, und das Construct pCB76F49 (eine neu konstru ierte Mutante) wurde verwendet, um die Mutanten F54 und F55 aufzubauen.

Tabelle 2

Beschreibung der BLAP-Mutanten

Die zur Durchführung dieses Verfahrens erforderlichen Materialien sind:
DNA THermal Cycler (Perkin Elmer Cetus); GeneAmp-Kit (Perkin Elmer Cetus); AmplWax (Perkin Elmer Cetus); und sterile Polypropylen-Röhrchen, 0,5 ml (Perkin Elmer Cetus); Mocrocon-100-Konzentratoren (Amicon, Beverly, MA); TE-Puffer (10 mM Tris(hydroxyme thyl)aminoethan [Tris] 1 mM Dinatriumethylendiamintetraessigsäure (EDTA), mit 2 N HCl auf pH 8 eingestellt); Minigel-Elektrophorese-Gerät (Hoefer Scientific, San Francisco, CA); 1% (Gew./V) SeaKem-Agarosegel (FMC, Rockland, ME) in TBE-Puffer (0,089 M Tris, 0,089 M Borsäure, 2 mM EDTA); 0,5 µg·mF^-1 Ethidiumbromid in Wasser; Restriktionsen zyme Nhel (NEB), XbaI (NEB); und Sstl (BRL, Gaithersburg, MD).

Die PCR wurden unter Verwendung von GeneAmp-Kit und AmpliWax, wie durch den Her steller beschrieben, durchgeführt. Sie wurden einem Zyklus von Denaturierung (3 Minuten, 95°C), Annealing (2 Minuten, 50°C) und Extension (2 Minuten, 72°C) und 30 Zyklen von Denaturierung (1 Minute, 94°C), des Annealing (1 Minute, 50°C) und Extension (1 Minute, 72°C) unter Verwendung eines DNA-Thermal-Cycler unterzogen. Jeder Zyklus wurde um 10 Sekunden bei 72°C ausgedehnt.

Stellen-gezielte Mutagenese durch überlappende Extension wird von HO, S.N., Hunt, H.D., Horton, R.M., Pullen, J.K., and Pease, L.R. in Gene 77 (1989), 51-59 beschrieben. Für die BLAP-Mutanten F43, F44, F45, F46, F47 und F49 wurden 10 ng pCB76M131-Plasmid- DNA als Matrix für den ersten Mutagenese-Durchlauf verwendet. Für die BLAP-Mutante F11 wurden 10 ng der pBC76M130 Plasmid-DNA als Matrix und für die BLAP-Mutanten F54 und F55 wurden 10 ng pCB76F49-DNA als Matrix verwendet. Die pUB110-Formen dieser Plasmide wurden ausgewählt, weil sie höhere Ausbeuten der Protease in dem Wert B. subtilis DB104 als die pBC16-Formen der Plasmide ergeben. Die PCR-Fragmente wur den durch Agarosegel-Elektrophorese überprüft und unter Verwendung eines Microcon- 100 Concentrator (Amicon) nach jedem PCR-Durchlauf gereinigt. Nach dem zweiten PCR-Durch lauf wurden die Fragment entweder mit Nhel/XbaI oder Nhel/Sstl (in Abhängigkeit von der Lokalisierung der gewünschten Mutation) digeriert und zurück kloniert in pCB76M131-DNA in dem Fall der Mutanten F43, F44, F45, F46, F47 und F49, pCB76M130-DNA in dem Falle der Mutante F11 und pCB76F49 in dem Falle der Mutanten F54 und F55 unter Verwendung der vorher beschriebenen B. Subtilis DB104 kompetenten Zellen. Die DNA-Isolierung des Plasmids wurde durchgeführt unter Verwendung von Io nenaustauscher-Minisäulen (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA) und die Mutationen wurden durch Sanger ds-DNA-Sequenzierung wie voranstehend beschrieben überprüft.

Beispiel 3 Klonieren von mutierten Protease-Genen A. Klonieren von mutierten, über das pMac-System hergestellten Proteasen

Die Proteasen M130 und M131 können hergestellt werden durch Transferieren des ent sprechenden Gens, das entweder für M130 oder M131 codiert, aus dem bestimmten E. coli pMc13C-Derivat-Vektor in einen Plasmid-Vektor, der im Bacillus replizieren kann. Um dies zu erreichen, wird das gewünschte mutierte Gen abgetrennt vom geeigneten pMc13C-Plas mid durch Digerieren mit den Restriktions-Endonucleasen Aval und Sstl, gefolgt von der Anknüpfung an das größere Aval/Sstl-Fragment aus entweder Plasmid pH70 (Fig. 6) oder pC51 (Fig. 7). Diese Aval/Sstl-Fragmente aus pH70 und pC51 schließen die DNA-Sequenzen ein, die für die Replizierung im Bacillus notwendig sind, ein und codieren ent weder für Kanamycin-Resistenz (Km^R) oder Tetracyclin-Resistenz (Tc^R). Das Plasmid pH70 wird erhalten durch Klonieren des alkalischen Protease-Gens ATCC 53926, getragen auf einem EcoRI/BamHI-DNA-Fragment in das Km^R-Plasmid pUB110 zwischen die Stellen EcoRI und BamHI. Das Plasmid pC51 wird erhalten durch Klonieren des Protease-Gens ATCC 53926, getragen auf einem EcoRI/BamHI-Fragment, in das Tc^R-Plasmid pBC16 zwi schen die Stellen EcoRI und BamHI. Das größere Aval/Sstl-Fragment, sind weder pH70 oder pC51, das zum Klonieren des DNA-Fragments, das entweder für M130 oder M131 kloniert, wird erst von anderen Plasmid DNA-Fragmenten durch Hochdruck-Flüssigchroma tographie (HPLC) auf einer anionischen Austauschsäule (Gen-Pak FAX, Durchmesser 4,6 mm, Länge 100 mm; Waters, Milford, MA) gereinigt. Die Bedingungen für die Eluierung der DNA sind eine Fließgeschwindigkeit von 0,75 ml·min^-1 mit einem Gradienten von 50% Puf fer A (25 mM Tris, enthaltend 1 mM EDTA und auf einen pH von 8,0 mit 2 N HCl einge stellt) und Puffer B (25 mM Tris, enthaltend 1 mM EDTA, 1 M NaCl, und auf eine pH von 8,0 mit 2 N HCl eingestellt) auf 30% von Puffer A und 70% von Puffer B in 30 Minuten.

Die beiden ligierten DNA′s werden in B. subtilis DB104 transformiert. Die Gene, die für die meisten alkalischen und neutralen Proteasen codieren, die in diesem Strang vorliegen, wurden inaktiviert (Kawamura, F. and Doi, R.A. (1984) J. Bacteriol. 160, 442-444). Die Zel len von B. subtilis DB104, die von diesen Plasmiden transformiert wurden, wachsen auf ei nem Nähr-Magermilch-Agar in Gegenwart entweder von Kanamycin oder Tetracyclin. Die Transformanten von DB104, die mutierte Protease herstellen, werden durch die Bildung von klaren Hydrolysezonen in der Magermilch identifiziert. Die Bestätigung, daß die Prote ase-bildenden Transformanten ein aus dem Plasmid erhaltenes M130 oder M131-Gen mit den gewünschten Mutationen trägt, wird durch Reinigen der Plasmid-DNA aus der Kultur jedes Transformanten durchgeführt. Die Plasmid-DNA wird von Zellprotein und chromoso maler DNA durch SDS-Salzausfällung mit anschließender Chromatographie über eine QIAGEN-Ionenaustauschersäule (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA) gereinigt. Die digerierten Plasmid-DNAs Aval/Sstl aus verschiedenen Transformanten werden mit den Aval/Sstl-di gerierten Derivaten des Plasmids pH70 oder pC51 verglichen, von denen bekannt ist, daß sie ein intaktes BLAP-Gen tragen. Restriktions-Übersichten dieser Plasmide werden durch Agarose-Gel Elektrophorese verglichen, um die Plasmide zu identifizieren, die Aval/Sstl- DNA-Fragmente von geeigneter Größe besitzen. Ausgewählte Plasmid-DNAs werden dann entlang der Region der erwarteten M130- oder M131-Mutationen sequenziert, um zu be stätigen, daß diese gewünschte(n) Mutation(en) vorliegt(en). Die in das Derivat von Plas mid pC51 (TcR) klonierten Gene M130 und M131 werden als Plasmide pCB56M130 bzw. pCB56M131 (Fig. 8) bezeichnet, während die gleichen, in ein Derivat des Plasmids pH70 klonierten Gene als Plasmide pCB76M130 bzw. pCB76M131 (Fig. 5) bezeichnet werden. Eins oder mehrere Klone von jeder BLAP-Mutation werden gefroren in 15% Glycerin bei -70°C gelagert und auch in Schüttelflaschen kultiviert, um mutierte Protease für die Charak terisierung herzustellen.

B. Klonieren von mutierten Proteasen, hergestellt über das PCR-Überlappungs verfahren

Wie oben beschrieben, werden die amplifizierten PCR-Fragmente in die Plasmide pCB76M130, pCB76M131 oder pCB76F49 zurückkloniert. Zur Expression in die Produkti onskette B. licheniformis wird das Aval/Sstl-Fragment, das die modifizierten Gene M130, M131 oder F49 trägt, wie voranstehend beschrieben, zurück in den Vector vom pC51-Typ kloniert.

Beispiel 4 Herstellung von mutierten Proteasen

Der Wildtyp des BLAP Proteins und die mutierten Proteine wurden mit transformiertem Bacillus subtilis DB104 in Schüttelkolben hergestellt. Mittels Impföse wurde jeder mutierte Stamm aus einer gefrorenen Kultur auf einen LB-Magermilch Agar, der entweder 20 µg·ml^-1 Kanamycin oder 15 µg·ml^-1 Tetracyclin enthielt, gestrichen. Diese Platten wurden 20 bis 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Eine einzelne, isolierte Kolonie, die eine gute Hydrolyse-Zone auf der Magermilch produzierte, wurde in einen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben, der etwa 50 ml Luria-Medium (LM) enthielt und entweder 20 µg·ml^-1 Kanamycin oder 15 µg·ml^-1 Tetracyclin enthielt, gegeben. Das Medium wurde in einem Schüttelinkubator der New Brunswick Serie 25 bei 37°C unter Schütteln bei 280 Upm über 7 bis 8 Stunden inkubiert. Entweder 2,5 ml der trüben Vorkultur wurden in 50 ml MLBSP, das entweder 20 µg·ml^-1 Kanamycin oder 15 µg·ml^-1 Tetracyclin jeweils in vier 500 ml Trennkolben überführt oder 5 ml der Vorkultur wurden als Impfmaterial für 100 ml der MLBSP-Brühe mit in jedem der beiden 500 ml Schüttelkolben enthaltenem Antibiotikum (5% v/v, Überführung) verwendet. Alle Kolben wurden bei 240 Upm und 37°C 64 Stunden inkubiert. Nach einer Inkubation von 64 Stun den wurde der Inhalt einer Kolbenserie für jede Kultur vereinigt, in 50 ml-Zentrifugengläser überführt und bei 20 000 × g_av 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Medium wurde über Miracloth (Calbiochem. Corp., Nr. 475855) in 400 ml-Bechergläser auf Eis filtriert. Der pH der Lösung wurde durch Zugabe von Eisessig auf 5,8 eingestellt. Nach Rühren über 30 Minuten wurden feine Teilchen durch Zentrifugieren bei 20 000 × g_av über 15 Minuten ent fernt. Das Volumen des Überstandes wurde aufgenommen. Aliquots von 1 ml wurden für die Analyse über native und denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PhastSystem, Pharmacia) zur Bestimmung der gesamten proteolytischen Aktivität durch das HPE Verfahren und für die Titration der aktiven Stellen entnommen. Das Medium wurde auf Eis gelagert, bis die Protease gereinigt werden konnte. Für die Langzeitlagerung oder für das Versenden wurde das Medium mit einer äquivalenten Menge Propan-1,2-diol vermischt. Die Zusammensetzung der MLBSP-Medien, die für die Herstellung von BLAP in Schüttelkolbenkulturen verwendet wurden, ist in Tabelle 3 beschrieben.

Zusammensetzung der MLBSP-Medien¹
Komponente
Menge (für 1 Liter Medium)
deionisiertes Wasser
750 ml
Difco-Casition\|10 g
Difco-Trypton	20 g
Difco-Hefeextrakt	10 g
NaCl	5 g
Natriumsuccinat	27 g

¹ Der PH-Wert des Mediums wurde mit 2 N NaOH auf 7,2 eingestellt, das Volumen wurde mit Wasser auf 815 ml gebracht und die Lösung wurde 15 Minuten bei 121°C bei einem Druck von 15 pds/inch² im Autoklaven behandelt. Nach dem Abkühlen wurden die sterilen Lagerlösungen, die in Anhang 1 beschrieben sind, unter Rühren hinzugefügt. Entweder wurde eine Kanamycin- oder Tetracyclin-Lagerlösung zu dem Medium direkt vor der Ver wendung auf eine Endkonzentration von 20 µg·ml^-1 bzw. 15 µg·ml^-1 zugefügt.

Anhang 1
(Zugaben zur MLBSP-Brühe)
Komponente
Menge (für 1 Liter Medium)
MgSO₄·7H₂O
(100 mg·ml^-1 Vorratslösung) 1.0 ml
CaCl₂·2H₂O
30 mg·ml^-1 Vorratslösung) 2,5 ml
FeSO₄·7H₂O	(1 mM Vorratslösung) 0,5 ml
MnCl₂·4H₂O	(1 mM Vorratslösung) 0,5 ml
Glucose	(25% (w/v) Vorratslösung) 80,0 ml
PIPES-Puffer	(pH 7.2,1 M Vorratslösung) 50,0 ml
Phosphat-Puffer	(pH 7.0, 1,5 M Vorratslösung) 50,0 ml

¹ Piperazin-N,N′-bis(2-ethansulfonsäure)
² Eine ausreichende Menge von 1,5-M dibasischem Phosphat (K₂HPO₄) wurde zu 200 ml 1,5 M monobasischem Phosphat (KH₂PO₄) hinzugefügt, um den pH auf 6,0 unter Verwendung eines ph-Meters (Beckmann, Modell pHI44) ausgestattet mit einer Kombinati onselektrode (Beckmann, Modell Nr. 3952C) einzustellen. Der endgültige pH wurde mit 4 M KOH auf 7,0 eingestellt.
Alle Vorratslösungen wurden bei 121°C, 15 psi über 15 Minuten in Autoklaven behandelt mit Ausnahme von FeSO₄·7H₂O, welches unter Verwendung eines 0,22 µm-Filtersystems (Costar 8301) Filter-sterilisiert wurde.

Beispiel 5 Reinigung von BLAP und den mutierten Proteinen

Soweit nicht anders erwähnt wurden alle folgenden Schritte auf Eis oder bei 4°C durchge führt. Die in Beispiel 3 erhaltenen Brüheproben wurden über einen 0,2 µm-Filter filtriert, und das Filtrat wurde durch Ultrafiltration konzentriert. Die zurückbleibende Membran hatte ein nominales Molekulargewichts-Rückhaltevermögen von 10 000 in eine Minitan-Kassette (Millipore) oder in eine Ultrafiltrationszelle (Amicon) eingebaut ist. Für den nachfolgenden Transport oder für eine längere Lagerung wurden Brühelösungen mit einem gleichen Vo lumen Propan-1,2-diol vermischt, um die Protease zu stabilisieren. Sonst wurde das Kon zentrat 16 Stunden gegenüber 20 mM Natrium-Phosphat, pH 7,0 ("Phosphat Puffer") oder gegen 20 mM N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N′-(2-ethansulfonsäure) (HEPES), die 1 mM CaCl₂ enthielt und mit NaOH auf einen pH von 7,8 eingestellt worden war ("HEPES-Puf fer"), dialysiert. Das Dialysat wurde durch Zentrifugieren (20 000 × g_av. über 10 Minuten) geklärt und der pH der Lösung wurde, falls erforderlich, erneut eingestellt. Die gegenüber dem Phosphat-Puffer dialysierten Proben wurden für 15 Minuten mit 5% (Gew./V) DEAE-Cellu lose, das in dem gleichen Puffer vorher der Gleichgewichtseinstellung unterworfen worden war, der Gleichgewichtseinstellung unterworfen, um negativ geladene Proteine abzuscheiden. Nach Entfernen der DEAE-Cellulose durch Zentrifugieren oder Filtrieren wurde der Überstand auf eine Kationen-Austauschersäule gegeben (S-Sephaose Fast Flow, Pharmacia; Durchmesser 16 mm, Länge 90 mm, Bett-Volumen 18 ml, Fließge schwindigkeit 50 ml.h^-1), deren Gleichgewicht vorher mit Phosphate-Puffer eingestellt wor den war. Die gegen den HEPES-Puffer dialysierten Proben wurden direkt einer Kationaus tauschersäule (S-Sepharose Fast Flow, Pharmacia; Durchmesser 15 mm, Länge 75 mm Bett-Volumen 13 ml, Fließgeschwindigkeit 50 ml.h^-1) unterworfen, deren Gleichgewicht vor her mit HEPES-Puffer eingestellt worden war. Als alle gefärbten Nebenprodukte eluiert waren, wurde die Säule mit dem 3- bis 5fachen Säulenvolumen des verwendeten Puffers gewaschen. Protease wurde aus dem Kationaustauscher eluiert, indem 1,0 M NaCl in den Phosphat-Puffer oder 0,25 M NaCl in den HEPES-Puffer gegeben wurde. Fraktionen, die das aktive Enzym enthielten, wurden gesammelt.

Das im Phosphat-Puffer gereinigte Enzym wurde konzentriert und durch Ultrafiltration unter Verwendung von Centricon-Röhren (Molekulargewicht-Rückhaltevermögen 10 000; Ami con) entsalzt. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Bicinchonsäure-Verfahren (BCA-Ver fahren, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) bestimmt. Zur Stabilisierung der Protease wurde 50% (V/V) Propan-1,2-diol zur Vorratslösung zugefügt.

Die gesammelten Enzym-Fraktionen, die in HEPES-Puffer gereinigt worden waren, wurden mit einem 5- bis 8fachen Volumenüberschuß von Aceton bei -20°C gemischt. Das Protein ließ man über 4 Minuten ausfallen, und das Gemisch wurde 4 Minuten bei 6600 × g_av. zen trifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Pellets wurde kurze Zeit im Vakuum gelagert (Wasserstrahlpumpe), um den größten Teil des Aceton zu entfernen und die Pellets wur den in 20 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), die 1 mM CaCl₂ enthielt und mit 2 N NaOH auf einen pH von 5,8 eingestellt worden war, gelöst, um eine geeignete Protein- Konzentration von etwa 30 mg·ml^-1 zu ergeben. Die Lösung wurde durch Zentrifugieren in einer Eppendorf-Zentrifuge über 3 Minuten bei voller Geschwindigkeit (13 000 × g_max.) ge klärt und bis zur Verwendung tiefgefroren gelagert. Die Protein-Konzentration wurde durch das Biuret-Verfahren (Gornall, A.G., Bardawill, C.S. und David, M.M. (1948) J. Biol. Chem. 177. 751-766) bestimmt.

Beispiel 6 Bestimmung der aktiven Protease

Die aktive Enzym-Konzentration wurde durch Titration der aktiven Zentren mit dem Inhibitor Phenylmethylsulfonylfluorid bestimmt. Eine Protease-Lösung wurde in 10 mM Natrium- Phosphat, pH 6,5, mit einer Konzentration von etwa 100 µM, bezogen auf Protein-Bestim mung, hergestellt. Die Inhibitor-Konzentrationen waren äquivalent zu einem geschätzten molaren Verhältnis von 0,25, 0,5, 0,75, 1,0 und 1,25. Man ließ die Gemische eine Stunde bei Raumtemperatur reagieren. Die restliche Enzym-Aktivität wurde spektrophotometrisch durch das AAPF-pNA-Verfahren (siehe unten) gemessen.

Beispiel 7 Bestimmung der proteolytischen Aktivität

Zwei unterschiedliche Protease-Proben wurden verwendet. Mit dem HEPES-Verfahren wurde die Protease-Aktivität bei einer einzigen Casein-Konzentration als Substrat be stimmt. In der AAPF-pNA-Probe wurden Anfangsraten von Succinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L- Prolyl-L-Phenylalanyl-p-Nitroanilid-unterstützte Katalyse (AAPF-pNA; Bachem, Bioscience Philadelphia, PA) verwendet, um die kinetischen Parameter K_m, k_cat und k_cat/K_m zu bestim men.

A Protease-Bestimmung durch das HPE-Verfahren

Die proteolytische Aktivität wurde durch eine diskontinuierliche Bestimmung unter Verwen dung von Casein als Substrat bestimmt. Die abschließenden Konzentrationen der Substrat- Lösung betrugen 12 mg·ml^-1 Casein (hergestellt gemäß Hammarsten; Merck, Darmstadt, Nr. 2242) und 30 mM Tris in synthetischem Leitungswasser. Synthetisches Leitungswasser ist eine Lösung von 0,029% (Gew./V) CaCl₂·2H₂O, 0,014% (Gew./V) MgCl₂·6H₂O und 0,021% (Gew./V.) NaHCO₃ mit einer Härte von 15 Grad dH (deutsche Härte). Die Substrat-Lösung wird auf 70°C erwärmt und der pH wird mit 0,1 N NaOH bei 50°C auf pH 8,5 eingestellt. Die Protease-Lösung wird mit 2% (Gew./V) wasserfreiem Pentanatrium- Tripolyphosphat in synthetischem Leitungswasser hergestellt, wobei der pH mit Salzsäure auf 8,5 eingestellt wurde. Zu 600 µl der Casein-Substrat-Lösung werden 200 µl der Enzym- Lösung zugegeben. Das Gemisch wird 15 Minuten bei 50°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 600 µl 0,44 M Trichloressigsäure (TCA), 0,22 M Natriumacetat in 3% (V/V) Essigsäure beendet. Nach Abkühlen auf Eis innerhalb von 15 Minuten wird das TCA-un lösliche Protein durch Zentrifugieren entfernt, ein Aliquot von 900 µl wird mit 300 µl 2 N NaOH gemischt und die Extinktion dieses Gemisches, das TCA-lösliche Peptide enthält, wird bei 290 nm aufgenommen. Kontrollwerte werden hergestellt durch Hinzufügen von 600 µl der TCA-Lösung zu 600 µl Casein-Lösung gefolgt von 200 µl Enzym-Lösung.

Es wurde festgelegt, daß eine Protease-Lösung, die unter den Bedingungen dieses Ver suchs eine Extinktionsänderung von 0,500 OD bei 290 nm hervorruft, eine Aktivität von 10 HPE pro ml hat. Die Daten für BLAP und BLAP-mutierte Proteine sind unten zusammenge faßt (Tabelle 4).

B. Protease-Gehaltsbestimmung mit dem chromogenem Substrat AAPF-pNA

Protease-Proben wurden mit 50% (VA() 1,2-Propandiol in 100 mM Tris, eingestellt mit 2 N HCl auf pH 8,6 bei 25°C ("Tris-Propandiol-Puffer") verdünnt, worin sie mindestens 6 Stun den bei Raumtemperatur stabil waren. Eine Vorratslösung von 160 mM AAPF-pNA wurde in Dimethylsulfoxid, vor der Verwendung mindestens 24 h über Molekular-Siebkugeln (Aldrich; 4 A, 4-8 mesh) getrocknet. Fixierte Punkt-Bestimmungen wurden bei 25°C mit 1,6 mM AAPF-pNA in 100 mM Tris, pH auf 8,6 mit 2 N HCl bei 25°C eingestellt, in einem Ge samtvolumen von 1,020 ml durchgeführt. Das Substrat wurde zum Versuchs-Puffer 1 Mi nute vor Beginn der Gehaltsbestimmung gegeben, und die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms auf eine Endkonzentration von 20 ng bis 1,3 µg Protein pro ml (0,75 bis 48,5 nM Enzym), in Abhängigkeit von der spezifischen Aktivität, gestartet. Die Freisetzung von p-Nitroanilid wurde bei 410 nm aufgezeichnet, und ein molarer Extinktionskoeffizient von 8,480 m^-1cm^-1 wurde verwendet, um die Menge und Konzentration des gebildeten Produk tes zu berechnen. (DelMar, E.G., Largman, C., Brodrick, J.W. und Geokas, M.C. (1979) Anal Biochem. 99, 316-320).

Die kinetischen Parameter wurden aus dem Diagramm Geschwindigkeit gegen Substrat- Konzentration, der aus den Anfangsgeschwindigkeiten, bestimmt jeweils bei 12 unter schiedlichen AAPF-pNA-Konzentrationen, die von 0,16 bis 3,2 mM reichten, erstellt worden war. Die Daten wurden an eine Hyperbel angepaßt und unter Verwendung des Programms ENZFITTER (Leatherbarrow, R.J. (1987) ENZFITTER. Biosoft, Cambridge, UK) proportio nal gewichtet. Ein nominales Molekulargewicht von 26,8 kDa wurde in allen Berechnungen eingesetzt was die Interkonversion der Protein-Konzentration und Molarität des Protease- Enzyms erforderte. (Tabelle 4).

Tabelle 4

Kinetische Daten der BLAP- und BLAP-mutierten Proteasen

Beispiel 8 Verifizierung der Protein-Struktur

Die in das BLAP eingeführten Mutationen wurden über die DNA-Sequenzanalyse durch die direkte Nachbarschaft des Mutationspunktes verifiziert. Es ist jedoch bekannt, daß spon tane Mutationen außerhalb der Region der stellen-gerichteten Mutagenese auftreten, und es war unbedingt erforderlich, daß die bestimmten Eigenschaften der mutierten Protease tatsächlich mit der Aminosäure-Sequenz, die aus der Nucleotid-Sequenz abgeleitet wird, übereinstimmt. Daher wurde eine tryptische Karte von BLAP hergestellt (Fig. 9), die durch die Aminosäure-Sequenzanalyse der einzelnen Peaks verifiziert wurde und mit denen alle mutierten BLAP-Proteine verglichen wurden. Nicht nur bei den Peptiden mit 17 Amino säureresten, auch in den Peptiden 5T, 7T und 10T (Fig. 9) mit 48, 44 und 49 Aminosäure resten, führte eine einzige (auch vorsichtige) Substitution zu einer deutlichen Veränderung in der Retentionszeit unter den Trennbedingungen. Besonders ähnliche Peptide wurden durch gemeinsamen Abbau und Auftrennung von gleichen Mengen der Referenz (BLAP) und des mutierten Proteins aufgeklärt.

Ein Aliquot mit bis zu 5 mg Protease aus einer Vorratslösung wurde auf Eis in ein 2,2-ml- Eppendorf-Gefäß gegeben, dann mit 1,0 ml 0,15 N HCl und Wasser (beide vorgekühlt) gemischt, um eine Endkonzentration von 3,33 mg·ml^-1 Protein und 0,1 N HCl in einem Ge samtvolumen von 1,5 ml zu erhalten. Nachdem das Gemisch 30 Minuten inkubiert worden war, wurde das Protein durch Zugabe von 165 µl gekühlter 50%iger (Gew./V) Trichlores sigsäure (TCA) ausgefällt. Man ließ den Niederschlag 5 Minuten auf Eis stehen und pelle tierte dann durch Zentrifugieren 4 Minuten bei 13 000 × g_max (Eppendorf-Zentrifuge). Das Pellet wurde einmal mit 1 ml 80%igem (V/V) Aceton gewaschen und kurz im Vakuum ge trocknet.

Alle Reagenzlösungen und das benötigte Wasser für den tryptischen Verdau wurden vor der Verwendung durch einen Filter von 0,45 µm (Ultrafree-MC, Millipore Products) filtriert. Das Pellet von denaturiertem Protein (5 mg; 185 nmol) wurde in 90 µl 0,8 M Ammonium Bicarbonat, das 8 M Harnstoff enthielt, gelöst. Diese Lösung wurde langsam mit 360 µl Wasser verdünnt und dann durch Zentrifugieren durch einen 0,45 µm-Filter filtriert. Die nachfolgenden Schritte wurden in 0,5 ml silikonisierten Mikroröhrchen (Phenix Res. Pro ducts) durchgeführt. Ein Aliquot von 300 µl wurde mit 13 µl 2,5 mg·ml^-1 Trypsin in 1 mM HCl (Massenverhältnis BLAP : Trypsin = 100 : 1) vermischt. Zur Kontrolle wurden 100 µl der Protein-Lösung mit 4,5 µl 1 mM HCl vermischt. Das verbleibende 50 µl Aliquot der Protein- Lösung wurde mit 5 µl 10%iger (V/V) Trifluoressigsäure (TFA) vermischt und als Kontrolle für das Ausgangsmaterial verwendet. Die beiden anderen Lösungen wurden 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktionen wurden beendet durch Hinzufügen von 30 µl und 10 µl 10%iger (V/V) TFA des Aufschlusses bzw. der Kontroll-Lösung zugegeben. Das Peptid gemisch wurde über Reversed-Phase-HPLC aufgetrennt.

Die HPLC-Anlage war von Waters und bestand aus einem Auto-Probensammler (Modell 715 Ultra Wisp.), einem dualen Pumpensystem (Modell 600 E) und einem Diodendetektor (Modell 990). Die Probenaufgabe und die Gradientenbildung wurden über das Software Programm "990 + Powerline" von Waters gesteuert. Tryptische Peptide wurden auf einer C₁₈-Säule (Vydac Modell 218TP54; 4,6 × 250 mm; Teilchengröße 5 µm; Porengröße 300 Å) abgetrennt. In Reihe mit der Separationssäule befand sich eine C₁₈ Schutzsäule (Vydac Modell 218FSK104, Teilchengröße 10 µ). Die Separationssäule und die Schutzsäule waren in einem Säulenofen untergebracht, der auf 30 ± 1°C eingestellt war. Das verwendete Lö sungsmittelsystem war: Lösungsmittel A = 0,1%ige (V/V) TFA Wasser; Lösungsmittel B = 0,08%ige (V/V)TFA Acetonitril. Nach Laden mit der Probe wurde die C₁₈-Säule 3 Minuten mit Lösungsmittel A, anschließend mit einem Gradienten von 0 bis 35% (V/V) Lösungsmit tel B in Lösungsmittel A in 70 Minuten entwickelt. Nach 70 Minuten wurde der Gradient auf 100% Lösungsmittel B in 15 Minuten erhöht und dann auf 100% Lösungsmittel A in 15 Minuten zurückgeführt. Vor der nächsten Injitierung erfolgte eine Gleichgewichtseinstellung der Säule über mindestens 20 Minuten mit Lösungsmittel A.

Extinktionsveränderungen wurden bei 215 nm und 280 nm aufgezeichnet. Die für analyti sche und präparative Zwecke abgetrennten Mengen des Peptidgemisches reichten von 10 µg (0,4 nmol) bis 500 µg (18 nmol) in einem Volumen von 5 bis 50 µl bei Konzentrationen von 2,2 bis 10 mg·ml^-1.

Für die Peptid-Sequenzierung des Eluats wurde gemäß der Extinktionsänderungen, die auf dem angeschlossenen Aufzeichner beobachtet wurden, wurde das Eluat per Hand fraktio niert. Vorausgehende Studien mit β-Mercaptoethanol zeigten, daß die Verzögerungszeit von der Aufzeichnezeit zur Eluierzeit aus dem System weniger als 2 Sekunden betrug. Fraktionen wurden im Vakuum mit einem Speed Vac Concentrator (Savant, Hicksville, NY) auf weniger als 100 µl konzentriert und auf 100 µl mit wäßriger TFA gebracht, um eine Endkonzentration von TFA von 1% zu erhalten. Es mußte achtgegeben werden, daß wäh rend der Konzentrierung die Proben nicht vollständig trocken waren.

Beispiel 9 Bestimmung des Irritationspotentials

Die Irritationspotentiale von BLAP (Vergleich) und der erfindungsgemäß eingesetzten Pro teasen am Beispiel von F49 wurden untersucht.

Das Irriationspotential der Proteasen wurde an Meerschweinchen im Rahmen der Dosisfin dungsversuche des Buehler-Tests bestimmt (E.V. Buehler, Arch. Dermatol. 1965, 91, 171-177). Hierzu wurde eine 10%ige Lösung der Protease auf die rasierte Haut topisch appli ziert und mittels einer Bandage (Scotchpak®-Non-Woven-Patch, Handelsprodukt; Hersteller Minnesota Mining and Manufacturing Company) für sechs Stunden fixiert. 24, 48 und 72 Stunden nach der Entfernung der Bandagen wurden die betreffenden Hautpartien ausge wertet.

Diese Versuche wurden an jeweils vier Meerschweinchen (Stamm: "Pirbright white") durch geführt, wobei pro Tier die Lösungen an mindestens zwei Applikationsstellen aufgebracht wurden.

Während der Versuchsdurchführung wurden bei den Tieren auch systemische Symptome, wie z. B. Gewichtsveränderungen, Durchfall, Gleichgewichtsstörungen, Appetitlosigkeit etc. beobachtet.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 5 und 6 wiedergegeben und stellen Mittel werte über Erythem- und Ödembildung dar. Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsge mäß eingesetzte mutierte Protease ein deutlich geringeres Irriationspotential zeigt als die unveränderte BLAP.

In den Tabellen bedeuten
die Ziffern 0, 1 und 2 die Anzahl Hautbereiche an einem Tier, an denen Irritationen der Haut beobachtet wurden.
s leichte Schorfbildung am Rand der behandelten Hautbereiche
a Schwellung.

Claims

1. Verwendung von mutierter Protease vom Subtilisin-Typ, die mindestens eine Muta tion in ihrer Aminosäure-Sequenz trägt, was zu einer reduzierten positiven Ladung oder einer erhöhten negativen Ladung in der Substrat-Bindungsregion des Moleküls führt, in kosmetischen Produkten.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich die mutierte Pro tease vom Subtilisin-Typ von alkalischer Bacillus lentus Protease, die aus dem Stamm DSM 5483 erhalten wird, ableitet.

3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die mutierte Protease eine mutierte alkalische Protease M131 (S3T + V4I + A188P + V193M + V199I) oder eine mutierte alkalische Protease M130 (S3T + A188P + V193M +V199I) ist.

4. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease mindestens eine Mutation in ihrer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den Positio nen 99, 154 und 211 aufweist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest 99, Arginin, durch einen Glycin-, Alanin- oder Serinrest ersetzt ist.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest 154, Serin, durch einen Glutaminsäure- oder einen Asparaginsäu rerest ersetzt ist.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest 211, Leucin, durch einen Glutaminsäure- oder einen Asparaginsäu rerest ersetzt ist.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die mutierte Protease eine oder mehrere der Mutationen R99G, R99S, R99A, L211D, L211E, S154D, S154E aufweist.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die kosmetischen Produkte ausgewählt sind aus Seifen in fester und flüssiger Form, Körperpflegemittel, wie Hautcremes, Softcremes, Nährcremes, Sonnenschutz cremes, Nachtcremes, Hautöle, Pflegelotionen und Körper-Aerosole, Deodorants, Rasiercremes und Rasierschaum, Peeling-Cremes, Haarshampoos, Haarspülungen und Schaumbäder, Mundspülungen und Zahnpasta.

10. Verfahren zur Herstellung von kosmetischen Produkten, dadurch gekennzeichnet, daß mutierte Protease vom Subtilisin-Typ, die mindestens eine Mutation an ihrer Aminosäure-Sequenz trägt, was zu einer reduzierten positiven Ladung oder einer erhöhten negativen Ladung in der Substrat-Bindungsregion des Moleküls führt, mit weiteren Inhaltsstoffen vermischt wird.

11. Verfahren zur Herstellung von kosmetischen Produkten nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als weitere Inhaltsstoffe anionische, nichtionische, kationi sche, amphotere bzw. zwitterionische Tenside, Emulgatoren, Ölkomponenten, Fette und Wachse, Verdickungsmittel, Überfettungsmittel, biogene Wirkstoffe, Filmbild ner, Duftstoffe, Farbstoffe, Perglanzmittel, Konservierungsmittel und pH-Regulato ren eingesetzt werden.