DE1817652B2 - Verfahren zur quantitativen bestimmung geringer mengen vom bacitracin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung geringer Mengen von Bacitracin und dessen Salzen in Futterstoffen für Tiere, bei dem der Futterstoff gegebenenfalls mit Azeton behandelt wird, falls der Feuchtigkeits- und Fettgehalt 8 bzw. 2% 4s Übersteigt, dann der Futterstoff bei pH 2 einer Säurebehandlung unterzogen wird und anschließend ein Von unerwünschten und ungelösten Proteinen und Futterstoffbestandteilen freier Extrakt hergestellt wird, der mit Phosphatpuffer verdünnt einer mikrobiologitchen Analyse unterworfen wird.

Bactracin und seine Salze werden als waehstumsförtlernde Mittel viel als Zusatz in Tierfuttermitteln Verwendet. Zur Kontrolle, ob der Bacitracingehalt in «lern Futter mit dem angegebenen Wert übereinstimmt, ss benötigt man genaue Analysemethoden, auch wenn die Wirksubstanz nur in sehr geringen Mengen vorliegt. Der Ausdruck Bacitracin, wie er hier verwendet wird, schließt dessen Salze, Zinkbacitracin, Manganbacitracin, ßacitracinmethylendisalieylpräpara'e usw. ein. Aus der <>u IIS-PS 33 Od 827 ist es bekannt. Bacitracin in Futterstoffen durch Entfernen von Fett und Feuchtigkeit mit Azeton (oder anderen ähnlichen dehydratisierenden und fettlösenden Substanzen), anschließende Extraktion dos Bacitracins nach Zugabe von verdünnter Salzsäure (15 mit einer Pyridinlösung. Abtrennen der Feststoffe von dem Extrakt mittels Z.enirifugation, Eindampfen der Fxiraktionslösune und Auflösen des Eindampfrückstandes, Einstellen des pH-Wertes auf etwa 2,0 und anschließende mikrobiologische Analyse zu bestimmen. Diese Methode ist langwierig und umständlich und wird noch dadurch erschwert, daß die erhaltenen Werte nicht zuverlässig sind, wenn der Extrakt mehr als 1% Pyridin enthält. Enthalten die Analysenproben weniger als 20 ppm Bacitracin, muß darüber hinaus gegen einen Blindwert gemessen werden. Weiter ist Pyridin giftig, und es dürfen in der Luft im Labor nicht mehr als 5 ppm Pyridin vorhanden sein. Daher ist für die Untersuchungsräume ein hochwirksames und konstspieliges Entlüftungssystem erforderlich.

Es wurde nun gefunden, daß diese Nachteile nicht auftreten, wenn die Säurebehandlung mit angesäuertem Methanol durchgeführt wird, darauf Phosphatpuffer von pH 6,5 zugegeben und anschließend zentrifugiert wird und der so erhaltene Extrakt mit Phosphatpuffer bis zu einer Bacitracinkonzentration von 0,01 bis 1 IE/ml verdünnt wird.

Die Futterstoffe lassen sich in zwei Gruppen einteilen: solche, die mehr als 50 ppm Bacitracin enthalten und solche mit weniger als 50 ppm. Die erste Gruppe wird nach der »kurzen Methanolmethode«, die zweite nach der «langen Methanolmethode« analysiert.

Die kurze Methanolmethode umfaßt Tolgende Schritte: Der Futterstoff wird mit Azeton behandelt, wodurch Feuchtigkeit und Fettstoffe aus dem Futter entfernt wird. Diese Azetonbehandlung kann allerdings entfallen, wenn der Futterstoff weniger als 2% Fettstoffe und weniger als 8% Feuchtigkeit enthält. Nach der Azetonbehandlung wird das Futter getrocknet und das Bacitracin aus dem Futter mit Methanol/HCI extrahiert. Nach Zusatz von Methanol/HCI soll der pH-Wert 2 oder weniger betragen. Ist dies nicht der Fall, wird I n-HCI zugesetzt, bis der pH 2 ist. Ein entsprechendes Volumen 5%igen Phosphatpuffers pH 6.5 wird zugegeben und das Gemisch etwa 15 — 25 Min. geschüttelt. Nach Trennen der Feststoffe vom Extrakt durch Zentrifugieren wird der Extrakt mit Phosphatpuffer bis zu einer geeigneten Bacitracinkonzentration (von 0,01 bis 1 IE/ml, vorzugsweise 0,1 ΙΕ/ml) verdünnt. Der Extrakt wird anschließend mikrobiologisch auf seinen Inhalt von Bacitracin analysiert, wobei jede beliebige geeignete mikrobiologische Analysiermethode in Betracht kommen kann, wie z. B. die in »Assay methods of Antibiotics, A Laboratory Manual«, 1955. D. C. Grove und W. A. Randall und im US-Patent 33 06 827 beschriebene Agardiffusionsmethode. Bei unseren Untersuchungen hat sich ergeben, daß die Methanolkonzentration im zu analysierenden Extrakt nicht 18% überschreiten soll, da eine höhere Konzentration die mikrobiologische Analyse stören würde.

Die lange Methanolmethode umfaßt eine Azetonbehandlung nebst Extrahieren mit Methanol/HCI und Phosphatpuffer, wie oben beschrieben. Nach dem Zentrifugieren wird der pH-Wert, beispielsweise in 10 —20 ml des Extrakts mittels 1 n-NaOH und einem Indikator, z. B. Bromkresolpurpur, auf 6,5 eingestellt. Danach wird etwa die Hälfte der Extraktionsmittel in einem rotierenden Vakuumeindampfer eingedampft und der Eindampfrest in Phosphatpuffer aufgelöst, worauf der Bacitracingehalt des Extrakts wie oben erwähnt mikrobiologisch analysiert wird.

Es geht hervor, daß die Zahl der Reaktionsschritte, insbesondere bei der kurzen, aber auch bei der langen Methanolmethode geringer als bei der Pyridinmethode ist. Gemäß der Erfindung kann man die Analysenkapazität mit der kurzen Methanolmethode zumindest

vervierfachen (das Ausfällen der Proteine aus dem Extrakt, das Eindampfen und die pH-Einstellung können entfallen) und mit der langen Methanolmethode zumindest verdoppeln (weil das Ausfällen der Proteine im Extrakt entfallen kann und das Eindampfen des Extrakts nicht quantitativ sein muß).

Bei der Pyridinmethode muß man Blindwertextrakte für die mikrobiologische Probe beim Analysieren von weniger als 20 ppm Bacitracin enthaltenden Futterstof fen verwenden. Die Herstellung eines Blindwertextraktes ist sehr zeitraubend. Nach unseren Erfahrungen war

es in keinem einzigen Falle erforderlich, bei Verwendung der Methanolmethoden mit einem Bündwertextrakt zu vergleichen. Die Analysierarbeit wird auch dadurch erleichtert und preiswerter gemacht, daß das bei der Arbeit mit Methanol erforderliche Entlüftungssystem weitaus einfacher und preiswerter als das bei der Arbeit mit Pyridin erforderliche ist.

Wir haben Analysen mil 27 Futtergemischen mit Bacitracinkonzentrationen von 3 —300 ppm (siehe Tabelle 1) vorgenommen. In der Tabelle 1 ist ein Auszug dieser Analysen wiedergegeben.

Futter	Futtertyp	Ergebnis be	i Methanol-	kur/e	Ergebnis bei
Nr.		analyse in ppm	Methode	Pyridinanalvse
		Bacitracin		ppm Bacitracin
		lange
		Methode
!	Norw. Schweinefuner	5.1		\l
2	Dänisches Kükenfutter	5.2	_	4.5
3	Norw. Schweinefuttcr	21	51	21
4	Jugoslawisches Schweinelutier	21	37	18
5	desgl.	11	42	24
6	Norw. Schweinefutter	_.	233	50
7	desgl.	_	222	3b
8	desgl.	_	41
Q	desgl.		221
10	desgl.		21 3

Sämtliche Werte in der Tabelle geben den Mittelwert zumindest dreier Parallel-Analysen an.

Beispiel 1
(kurze Methanolmethode)

4 Proben ä 10 g eines Futters, dem 50 g Bacitracin je t zugesetzt waren, werden in je einen Mörser gegeben. Jede Probe wird 2 Minuten mit 25 ml Methanol, dem 2% konzentrierte Salzsäure zugesetzt sind, gerieben. Das so erhaltene Gemisch wird zusammen mit 25 ml Phosphatpuffer pH 6,5 in einen 250-ml-Erlcnmeyer-Kolben gegeben und 20 Minuten geschüttelt. Anschließend wird das Gemisch 5 Minuten bei 4000 Umdrehungen/Minute zentrifugiert und der Überstand mit 5%igem Phosphatpuffer pH 6,5 auf 1 : 10 verdünnt. Die 4 verdünnten Extrakte werden gemäß der in US-PS 33 06 827 und von D. C. Grove und W. A. Randall in »Assay Methods of Antibiotics«, 1955 beschriebenen Methode auf ihren Bacitracingehalt geprüft. Diese Prüfung geschieht wie folgt:

In 24 Petrischalen (Durchmesser 9cm) werden je 10 ml Agar gegeben, der mit Microeoecus flavus beimpft ist. Auf jede Schale werden aut den Agar 6 .Stahlzylinder (Durchmesser 7 mm) gesetzt. Es werden Bacitracin-Standardlösungen mit 0.02. 0.04 und 0.1 IE/ml Bacitracin in 5%igem Phosphatpuffer pH 6,5 hergestellt (1 mg Bacitracin = 42 Internationale Einheiten [IE]). Auf 4 Agarscheiben werden die Zylinder abwechselnd mit den Standardlösungen, die 0,02 und 0.04 IE/ml Bacitracin enthalten, gefüllt. Auf 4 anderen Agarscheiben werden die Zylinder abwechselnd mit den Standardlösungen. die 0,04 und 0,1 IE/ml Bacitracin enthalten, gefüllt. Die Zylinder von jeweils 4 weiteren Agarscheiben werden abwechselnd mit einem Futterstoffextrakt und der Standardlösung mit 0,04 IE/ml Bacitracin gefüllt. Anschließend werden die Scheiben 16—18 Stunden bei 32 —35°C inkubiert. Die Durchmesser der einzelnen Hemmungszonen werden gemessen und die Mittelwerte für die verschiedenen Lösungen sowie die Differenz der Mittelwerte ermittelt. Die Tabelle II zeigt die erhaltenen Ergebnisse:

Lösung	Mittelwert der	Mittelwert der	Differenz	IE/ml ge
	Durchmesser der	Durchmc-ser für		mäß Stan
	Henimungszonen	0,04 IE/ml		dardkurve
0,02 I E/ml	15,04 mm	16,82 mm	- 1.78 mm
0,1 IE/ml	19.30 mm	16,90 mm	+ 2,40 mm	—
Probe 1	16,85 mm	16,75 mm	+ 0,10 mm	0.0415
Probe 2	16.90 mm	16.85 mm	+ 0,06 mm	0.0410
Probe 3	16.85 nur,	16,80 mm	+ 0.05 mm	0.0410
Probe 4	16.85 mm	16,68 mm	+ 0.17 mm	0.0425

Nun wird eine Standardkurve gezeichnet, indem man auf halblogarithmischem Papier den Logarithmus IE/ml auf der Abszisse und den Durchmesser der Hemmungszonen in mm auf der Ordinate einzeichnet. Mit Hilfe des obenstehenden Mitteluntcrschiedes zwischen den Hemmiincs7onen für 0.04 IE/ml und 0,02 IE/ml. und des Mittelunterschiedes zwischen den Hemmungszonen für 0,04 und 0,1 IE/ml kann man nun 3 Punkte eintragen, und die beste, gerade Linie zwischen diesen Punkten ist die Standardkurve (siehe Figur).

Mittels der Mittelunterschicde zwischen den Henimungszonen für jeden Phosphatextrakt und für

J,04 IE/ml kann man auf der Standardkurve den Bacitracininhalt in jeder einzelnen der vier Proben ablesen. Diese Werte sind in der Tabelle IM wiedergc-

Anzahl IE ml · IO (ml) ■ 50 (ml)
1 (ml) ■ 42 (IE/ml) ■ 10 (g)

(Bei der Ausrechnung wurde berücksichtigt, daß
Bacitracin =42 inlern. Einheiten sind.)

mg

Tabelle 111

Das Ergebnis der

Beispiele ist:

Probe Nr.

I E/ml

0.0415
0,0410
0.0410
0,0425

der Tabelle Il angegeber en

ppm Bacitracin

49,5
48,8
48,8
50.5

Mittelweri:49.4 ppm Bacitracin.

Beispiel 11
(Lange Methanolmethode)

Vier Proben α 10 g Futterstoff, denen 5 g ppm Bacitracin zugesetzt sind, werden in vier Mörsern abgewogen. Jede Probe wird folgendermaßen behandelt:

Die Probe wird 2 Min. mit 50 ml Azeton verrieben. Das Azeton wird hierauf in ein Zentrifugengias dekantiert. Azeton und die im Azeton aufgeschlcmmten

Anzahl I E/ml ■ 20 ■ 50
2(f^; Hf-'42"

KHK) ben. Wenn man die im Futterstoffextrakt enthaltene Anzahl IE Baeitracin/ml gefunden hat, läßt sich der F'uttergehalt an Bacitracin folgendermaßen ausrechnen:

ppm Bacitracin im Futterstoff

Futterstolfresle werden 5 Min. bei 4000 Umdr.Min. zentrifugiert. Das A/eion wird dekantiert und weggeworfen. Das Futter im Mörser und die Futterstoffreste im Zentrifugengias werden getrocknet (gegebenenfalls im Wärmeschrank bei 40''C). Mit 25 ml Methanol, welches 2% konzentrierte Salzsäure enthält, werden die F'uUerstoffe im Zentrifugenglas quantitativ z.u dem Futter im Mörser gespült. Das Gemisch wird 2 Min. gerieben und dann mittels 25 ml 5%igcm Phosphatpuffer pH 6.5 quantitativ in einen 250 ml Erlenmeyerkolben überführt. Das Gemisch wird 20 Min. geschüttelt, worauf es 5 Min. bei 4000 Umdr./Min. zentrifugiert w ird. 20 ml des Überstandes werden in einen 250 ml Rundkolben mit Schliff überführt und mit 1 ml 0.04 ßromkresolpurpurauflösung versetzt. Hierauf wird 1 n-NaOH tropfenweise bis zum Umschlag des Indikators (pH 6.5) zugegeben. Der Inhalt des Rundkolbens wird dann mit einem Rotationsverdampfer bei 30 C auf wenigstens die Hälfte seines Volumens eingedampft. Der Eindampfrest wird in 5%igem Phosphatpuffer mit pH 6.5 aufgelöst und quantitativ in einen 20-ml-Meßkolben übertragen, der bis zur Anzeige gefüllt wird. Die vier Futterstoffextrakte werden nun nach der Agardiffusionsmethode. wie im Beispiel I besehrieben, auf ihren Bacitracingehalt geprüft, und die Anzahl ppm Bacitracin wird wie folgt ausgerechnet:

- ppm Bacitracin im Futterstoff

Der Mittelwert der vier Parallelanalyscn war im Beispie! 4,9 ppm Bacitracin.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

1. Patentansprüche:

   , 1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung geringer Mengen von Bacitracin und dessen Salzen in Futterstoffen für Tiere, bei dem der Futterstoff gegebenenfalls mit Azeton behandelt wird, falls der Feuchtigkeits- und Fettgehalt 8 bzw. 2% übersteigt, dann der Futterstoff bei pH 2 einer Säurebehandlung unterzogen wird und anschließend ein von unerwünschten und ungelösten Proteinen und Futterstoffbestandteilen freier Extrakt hergestellt wird, der mit Phosphatpuffer verdünnt einer mikrobiologischen Analyse unterworfen wird, d a durch gekennzeichnet, daß die Säurebehandlung mit angesäuertem Methanol durchgeführt wird, darauf Phosphatpuff er von pH 6,5 zugegeben und anschließend zentrifugiert wird und der erhaltene Extrakt mit Phosphatpuffer bis zu einer Bacitracinkonzentration von 0,01 bis 1 ΙΕ/ml verdünnt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung des Bacitracingehaltes in Futterstoffen, wo dieser Gehalt unter 50 ppm ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Methanol vor der mikrobiologischen Analyse aus dem Extrakt entfernt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Extraktes mit NaOH auf 6.5 eingestellt wird, darauf das Methanol entfernt und schließlich der Eindampfrest mit Phosphatpuffer bis auf eine Bacitracinkonzentration innerhalb des Gebietes0,01 — 1 ΙΕ/ml verdünnt wird.
4. 4. Verfahren nach Ansprucn 1—3, dadurch gekennzeichnet, daß die Methanolkonzentration im Extrakt vor der mikrobiologischen Analyse auf weniger als 18% gebracht wird.