DE1815332A1 - Process for binding organic compounds to polymers - Google Patents

Process for binding organic compounds to polymers

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Description

RECHTSANWÄLTELAWYERS

DR. JUR. DIPL-CHEM. WALTER BEIl DR. JUR. DIPL-CHEM. WALTER AT

ALFRED KCE2PF.NERALFRED KCE2PF.NER

DR. JUR. DIP.--HiV. H..J. WOLFP DR. JUR. DIP .-- HiV. H..J. WOLFP

DR. JUR. HANS CM-S. BEIL ( J DR. JUR. HANS CM-S. BEIL ( J

623FRANKFURTAMArtAIN-HaCHST623FRANKFURTAMARTAIN-HACHST

ADELONSTKASSE 58ADELONSTKASSE 58

Unsere Nr0 15Our number 0 15

Pharmacia Aktiebolag Uppsala, SchwedenPharmacia Aktiebolag Uppsala, Sweden

Verfahren zur Bindung organischer Verbindungen an Polymere,Process for binding organic compounds to polymers,

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bindung organischer Verbindungen mit einer oder mehreren Gruppen der Formel -YH1 in der -YH eine primäre oder se« kundäre Äminogruppe darstellt, an Polymere mit einer oder mehreren Gruppen der Formel -XH1 in der -XH eine Hydroxylgruppe oder eine primäre oder sekundäre Äminogruppe darstellt, unter Bildung covalenter Bindungen, wobei das Polymer mit einer Verbindung umgesetzt wird, die zur Bildung eines reaktionsfähigen Derivats des Polymers befähigt ist, und dieses Derivat mit der organischen Verbindung umgesetzt wird.The present invention relates to a method for binding organic compounds with one or more groups of the formula -YH 1 in which -YH represents a primary or secondary amino group, to polymers with one or more groups of the formula -XH 1 in which -XH represents a Represents hydroxyl group or a primary or secondary amino group, with the formation of covalent bonds, wherein the polymer is reacted with a compound which is capable of forming a reactive derivative of the polymer, and this derivative is reacted with the organic compound.

Derartige Verfahren sind bereits bekannt. Organische Verbindungen mit einer oder mehreren Gruppen der Formel -YH, deren Bindung an Polymere von speziellem Interesse ist, sind insbesondere Proteine, Polypeptide, Peptide, Aminosäuren und deren Derivate. Beispiele solcher Verbindungen sind Enzyme, Antikörper, Protein- und/oder Peptid-Hormone,.Antigen-Proteine, Allergene oder Haptene. Ein wichtiges Beispiel sind die Antikörper, die zur analytischen Bestimmung auf diese Weise an Polymere gebunden werden können. Weitere Beispiele derartigerSuch processes are already known. Organic Compounds with one or more groups of the formula -YH whose attachment to polymers is of particular interest in particular proteins, polypeptides, peptides, amino acids and their derivatives. Examples of such compounds are enzymes, Antibodies, protein and / or peptide hormones, antigen proteins, Allergens or haptens. An important example are the antibodies, which can be bound to polymers in this way for analytical determination. More examples of this

. 909830/1SQ5. 909830 / 1SQ5

organischer Verbindungen sind Derivate von Kohlehydraten, beispielsweise Polysaccharide, die eine Aminogruppe der For« mel -YH aufweisen« Beispiele für Polymere mit einer oder mehreren Gruppen der Formel -XH sind Polysaccharide wie Dextran, Cellulose, Stärke, Dextrin und 4gar-Agar ("Sepharos"), Copolymere von Dextran mit Epichlorhydrin oder Derivate dieser Verbindungen wie Hydroxyäthylcellulose und 2-fiydroxy~3~(i*'~ amino-phenoxy)-propyl-substituierte Copolymere von Dextran mit Epichlorhydrin. Auch Polyaminostyrol ist ein geeignetes Polymer»Organic compounds are derivatives of carbohydrates, for example polysaccharides, which have an amino group of the formula -YH. Examples of polymers with one or more groups of the formula -XH are polysaccharides such as dextran, cellulose, starch, dextrin and 4gar agar ("Sepharos "), Copolymers of dextran with epichlorohydrin or derivatives of these compounds such as hydroxyethyl cellulose and 2-hydroxy ~ 3 ~ ( i * '~ aminophenoxy) propyl-substituted copolymers of dextran with epichlorohydrin. Polyaminostyrene is also a suitable polymer »

φ Zur Herstellung eines reaktionsfähigen Derivats des Polymers bekannte Verbindungen sind Mittel zur Einführung von Azidgruppen, Isocyanatgruppen und Diazoniumgruppen. Die Herstellung der reaktionsfähigen Derivate ist häufig kompliziert, und die Ergebnisse sind nur schwer reproduzierbar. Es war ferner bekannt, äaft reaktionsfähige Gruppen in ein Polymer einzuführen, das eine oder mehrere Gruppen der Formel -XH aufweist, durch Behandeln des Polymers mit Bromcyan. Diese Verbindung ist jedoch sehr toxisch und daher zum Arbeiten in technischem Maßstab ungeeignet»φ To produce a reactive derivative of the polymer known compounds are agents for introducing azide groups, isocyanate groups and diazonium groups. The production of reactive derivatives is often complicated and the results are difficult to reproduce. It was also known to have reactive groups in a polymer to introduce, which has one or more groups of the formula -XH, by treating the polymer with cyanogen bromide. This connection however, it is very toxic and therefore unsuitable for working on an industrial scale »

Während Bromcyan ein reaktionsfähiges Derivat ergibt, das unter verschiedenen Gesichtspunkten außerordentlich gute w Eigenschaften zeigt, besteht ein Nachteil dieser Verbindung darin, daß die Reaktionsfähigkeit des so erhaltenen Derivats kaum variiert bezw. dem jeweiligen Fall angepaßt werden kann.While cyanogen bromide is a reactive derivative, it is extraordinarily good from various points of view w exhibits properties, a disadvantage of this compound is that the reactivity of the derivative thus obtained hardly varied resp. can be adapted to the particular case.

Gemäß vorliegender Erfindung wurde nun eine Methode ermittelt, durch die die obigen Nachteile weitgehend vermieden werden können« Erfindungsgemäß wird zur Bildung des reaktionsfähigen Derivats des Polymers eine Verbindung eingesetzt, die eine oder mehrere Cyanatgruppen aufweist.According to the present invention, a method has now been determined by means of which the above disadvantages largely avoided «According to the invention, the formation of the reactive Derivative of the polymer used a compound which has one or more cyanate groups.

Bevorzugte Verbindungen dieser Art besitzen die Formel R (OCN)x Preferred compounds of this type have the formula R (OCN) x

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in der R beispielsweise eine halogenierte Alkylgruppe, eine substituierte aromatische Gruppe, ein heterocyclisches Ringsystem oder eine cycloaliphatische Gruppe und χ die Zahl 1 oder 2 bedeuten, Substituenten der aromatischen Reste sind beispielsweise Nitrogruppen, Halogen wie Chlor, Alkylreste wie Methyl oder tert· -Butyl, Alkoxygruppen wie z.B. die Methoxygruppe. in which R is, for example, a halogenated alkyl group, a substituted aromatic group, a heterocyclic ring system or a cycloaliphatic group and χ the number 1 or 2 mean, substituents of the aromatic radicals are for example Nitro groups, halogen such as chlorine, alkyl radicals such as methyl or tert-butyl, alkoxy groups such as the methoxy group.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Verbindungen mit mindestens einer Cyanatgruppe können sehr verschiedener Natur sein* Es kann sich beispielsweise um substituierte oder un~ substituierte organische Verbindungen wie substituierte oder unsubstituierte aliphatische, alicyclisch-aromatische oder heterocyclische Cyanatverbindungen handeln, oder um anorganische Cyanate wie Natrium-, Kaliumcyanat oder dgl. Als Beispiele derartiger Verbindungen seien genannt: β,β,β-Irichloräthylcyanat, 1-Adamantylcyanat, Phenylcyanat, o-Nitrophenylcyanat, p-Nitrophenylcyanat, m-Chlorphenylcyanat, p-Methoxyphenylcyanat, o-tert.-Butylphenylcyanat, 2,2-Dlmethylphenyl« cyanat, 2,M-, o-Tri-tert.-butylphenylcyanat, 2-Naphthylcyanat, 1,4-Dicyanatobenzol.The compounds with at least one cyanate group used according to the invention can be very different in nature * They can, for example, be substituted or unsubstituted organic compounds such as substituted or unsubstituted aliphatic, alicyclic-aromatic or heterocyclic cyanate compounds, or inorganic cyanates such as sodium, potassium cyanate or The like. Examples of such compounds include: β, β, β-irichloroethyl cyanate, 1-adamantyl cyanate, phenyl cyanate, o-nitrophenyl cyanate, p-nitrophenyl cyanate, m-chlorophenyl cyanate, p-methoxyphenyl cyanate, o-tert-butylphenyl cyanate, 2,2- Dimethylphenyl cyanate, 2, M-, o-tri-tert-butylphenyl cyanate, 2-naphthyl cyanate, 1,4-dicyanatobenzene.

Wie bereits erwähnt, besteht das vorliegende Verfahren aus zwei Stufen. Die erste Stufe, nämlich die Herstellung des reaktionsfähigen Derivats, erfolgt gewöhnlich derart, daß man das eine oder mehrere Gruppen der Formel -XH enthaltende Polymer mit dem betreffenden Cyanat in Berührung bringt. Die Umsetzung erfolgt zweckmäßig in wässriger Lösung oder Suspension, wobei sowohl saure wie .auch basische Bedingungen möglich sind. Die pH-Werte liegen jedoch im allgemeinen zwischen 7 und 13. Die Reaktion kann ferner in von Wasser verschiedenen Lösungsmitteln, beispielsweise mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln wie Aceton oder Dioxan erfolgen. Zur Einstellung des zweck« mäßigen pH-Werts oder pH-Bereichs geeignete Verbindungen sind Natriumhydroxyd, Calciumhydroxyd, Natriumbicarbonat, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Triäthylamin«As already mentioned, the present process consists of two stages. The first stage, namely the production of the reactive derivative, is usually carried out in such a way that one or more groups of the formula -XH-containing polymer brings into contact with the cyanate in question. The reaction is expediently carried out in an aqueous solution or suspension, both acidic and basic conditions are possible. However, the pH values are generally between 7 and 13. The reaction can also be carried out in solvents other than water, for example with water-miscible solvents such as acetone or dioxane. To set the purpose « Suitable compounds for a moderate pH value or pH range are sodium hydroxide, calcium hydroxide, sodium bicarbonate, sodium carbonate, Potassium carbonate, triethylamine "

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Der geeignete pH-Wert oder pH-Bereich, der unter anderem von Reaktionstemperatur und Reaktionszeit abhängt, kann vom Fachmann leicht ermittelt werden. Die Reaktion kann bei verschiedenen Temperaturen, beispielsweise im Bereich zwischen 0 und 500C erfolgen, und die Reaktionszeit kann in einem breiten Bereich schwanken und beispielsweise von wenigen Minuten bis zu mehreren Stunden betragen. Das reaktionsfähige Derivat des Polymers wird vor der Bindung an die organische Verbindung zweckmäßig gereinigt, beispielsweise durch Waschen mit geeigneten Lösungsmitteln, etwa Wasser oder Aceton. In der zweiten Verfahrensstufe, d.h. bei der Bindung des reaktionsfähigen Derivats an die organische Verbindung, die eine ode r mehrere Gruppen der Formel -YH aufweist, wird vorzugsweise in einer schwach alkalischen Lösung bei einer Temperatur von im allgemeinen 0 bis 5O0C, beispielsweise bei Raumtemperatur, gearbeitet· Die zweite Stufe erfolgt zweckmäßig in wässriger Lösung. The suitable pH value or pH range, which among other things depends on the reaction temperature and reaction time, can easily be determined by the person skilled in the art. The reaction can take place at different temperatures, for example in the range between 0 and 50 ° C., and the reaction time can fluctuate within a wide range and can be, for example, from a few minutes to several hours. The reactive derivative of the polymer is expediently purified before binding to the organic compound, for example by washing with suitable solvents, such as water or acetone. In the second stage, ie in the binding of the reactive derivative of the organic compound having an o r more groups of the formula -YH, is preferably in a weakly alkaline solution at a temperature of generally from 0 to 5O 0 C, for example at Room temperature, worked · The second stage is expediently carried out in an aqueous solution.

Bin wesentlicher Vorteil bei der Verwendung- von Cyanatverbindungen als Mittel zur Einführung der reaktionsfähigen Gruppen besteht darin, daß man auch sehr empfindliche Verbindungen an Polymere binden kann, ohne daß erstere einer nicht erwünschten Veränderung unterliegen. Durch Umsetzung des die Gruppen der Formel -XH enthaltenden Polymers mit verschiedenen Cyanatverbindungen erhält man sehr reaktionsfähige» Zwischenprodukte, die schematisch wie folgt dargestellt werden können: A major advantage when using cyanate compounds as a means of introducing the reactive groups is that one also very sensitive compounds can bind to polymers without the former being subject to an undesirable change. By implementing the Polymers containing groups of the formula -XH with various cyanate compounds result in very reactive »intermediates, which can be shown schematically as follows:

P-X-C-O-R1 PXCOR 1

Il 1 Il 1

NHNH

worin X die obige Bedeutung besitzt und R1 den Cyanatrest darstellt. Diese Zwischenprodukte reagieren leicht unter milden Reaktionsbedingungen mit einer Aminogruppe der betreffenden organischen Verbindung. Beispielsweise kann man einen Antikörper auf diese Weise an das Polymer binden, ohne daß die Fähigkeit des Antikörpers zur Bindung seines Antigens verlorengeht·wherein X has the above meaning and R 1 represents the cyanate radical. These intermediates readily react with an amino group of the organic compound in question under mild reaction conditions. For example, one can bind an antibody to the polymer in this way without losing the ability of the antibody to bind its antigen.

Das erfindungsgemäß eingesetzte Polymer kann auch in WasserThe polymer used according to the invention can also be used in water

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unlöslich sein. Als Beispiel für ein solches Polymer sei ein Copolymer aus Dextran und Epichlorhydrin ("Sephadex") genannt. Dieses Polymer ist durch verschiedene Wasseraufnahme und variierende Teilchengrößen gekennzeichnet. Zur Bindung, beispielsweise von Antikörpern an das Dextran-copolymer, kann man eine aus kleinen Körnchen, vorzugsweise von 1 bis 10 /um, e bestehende Qualität verwenden.be insoluble. An example of such a polymer is a Copolymer of dextran and epichlorohydrin ("Sephadex") called. This polymer is characterized by different water absorption and varying particle sizes. For binding, for example of antibodies to the dextran copolymer, one can be one of small granules, preferably from 1 to 10 µm, e use existing quality.

Aus nachstehendem Beispiel ist ersichtlich, daß die Art des Substituenten in der organischen Cyanatverbindung variiert werden kann. Der Substituent kann fähig sein, Elektronen abzugeben oder aufzunehmen, ferner kann er eine gewisse sterlsehe Hinderung verursachen} die Stellung des Substituenten |B gegenüber der Cyanatgruppe ist nicht essentiell. Die Aktivierung des Polymers kann bei verschiedenen pH-Werten und Temperaturen erfolgen, wobei der Fachmann für jede einzelne Cyanatverbindung die besten Bedingungen leicht feststellen kann0 It can be seen from the following example that the nature of the substituent in the organic cyanate compound can be varied. The substituent can be able to donate or accept electrons, and it can also cause a certain sterile hindrance} the position of the substituent | B in relation to the cyanate group is not essential. The activation of the polymer can take place at various pH values and temperatures, and the person skilled in the art can easily determine the best conditions for each individual cyanate compound 0

Beispielexample

A. Herstellung des reaktionsfähigen Derivats« Allgemeines VerfahrenjA. Preparation of the reactive derivative « General Procedurej

1 g des Polymers (d.fcu vernetztes Dextran, Agar-gel von Agar-Agar, Cellulose) wird in ^O ml destilliertem Wasser 3 Minuten lang gerührt, dann werden 2 g der mindestens eine Cyanatgruppe 'aufweisenden Verbindung zugesetzt* Der pH-Wert wird auf ™ 10,7 eingestellteren automatische Zugabe einer wässrigen 2« molaren Lösung von Natriumhydroxyd auf diesem Wert gehalten. Die Reaktion wird 6 Minuten lang fortgesetzt, dann wird das Reaktionsprodukt abfiltriert und sorgfältig mit Wasser, Aceton und Wasser und schließlich Aceton gewaschen und getrocknet*1 g of the polymer (d.fcu crosslinked dextran, agar gel from Agar-agar, cellulose) is dissolved in ^ O ml of distilled water 3 Stirred for minutes, then 2 g of the compound containing at least one cyanate group are added * The pH is adjusted to ™ 10.7 set automatic addition of an aqueous 2 « molar solution of sodium hydroxide kept at this value. The reaction is continued for 6 minutes, then the The reaction product is filtered off and carefully washed with water, acetone and water and finally acetone and dried *

Die Herstellung des reaktionsfähigen Derivats kann auch bei anderen pH-Werten und unter Verwendung anderer Reaktionszeiten (Tabelle 5) erfolgen. Solche Abweichungen vom allgemeinen Verfahren sind nachstehend illustriert.The preparation of the reactive derivative can also be carried out at other pH values and using other reaction times (Table 5). Such deviations from the general procedure are illustrated below.

9Q983Q/1SQ59Q983Q / 1SQ5

B. Bindung des reaktionsfähigen Derivats an organische Verbindungen, die eine oder mehrere Gruppen der Formel -YH enthalten» B. Binding of the reactive derivative to organic compounds that contain one or more groups of the formula -YH »

1. Bindung von Insulin-Antikörpern an Teilchen aus vernetztem Dextran, 4gar*-^gar unä Cellulose.1. Binding of insulin antibodies to particles of cross-linked dextran, 4g ar * - ^ g ar un ä cellulose.

100 g des reaktionsfähigen Derivats werden in ^t-OO/Ul eines Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Puffers (pH 9,2) 10 Minuten lang gequollen. 100 au. der Lösung des Antikörpers in der gleichen Pufferlösung werden dem reaktionsfähigen Derivat zugegeben, dann wird bei +It-0C 2 bis 3 Tage lang geschüttelt. Danach gibt man wenige ml einer 0,1-molaren Natriumbicarbonatlösung zu, worauf zentrifugiert und die klare Lösung abgesaugt wird. Der feste Rückstand wird mit 0,1-molarer Natriumbicarbonatlösung, 0,5-isolarem Essigsäurepuffer (pH k,5) und schließlich mit dem Puffer, der später für die auszuführende Analyse verwendet wird (Tabelle 1-^), gewaschen.100 g of the reactive derivative are swollen in ^ t-OO / UI of a sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer (pH 9.2) for 10 minutes. 100 au. the solution of the antibody in the same buffer solution is added to the reactive derivative, then it is shaken at + It- 0 C for 2 to 3 days. A few ml of a 0.1 molar sodium bicarbonate solution are then added, after which it is centrifuged and the clear solution is suctioned off. The solid residue is washed with 0.1 molar sodium bicarbonate solution, 0.5 isolar acetic acid buffer (pH k.5 ) and finally with the buffer that will be used later for the analysis to be carried out (Table 1- ^).

2. Bindung von Cystein, Glycylleucin und Glycyltyr osin an das reaktionsfähige Derivat von vernetztem Dextran. 0,20 g des reaktionsfähigen Derivats von vernetztem2. Binding of cysteine, glycylleucine and glycyltyrosine to the reactive derivative of crosslinked dextran. 0.20 g of the reactive derivative of crosslinked

Dextran und 0,08 g Cystein, Glycylleucin oder Glycyltgrosin werden in 1 ml einer Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung (pH 9,2) 2 Tage lang bei k°G gerührt. Das Produkt wird abfiltriert und mit 0,5-molarer Natriumbicarbonatlösung und 0,01-molarer Salzsäure und 1-molarem NaCl, und schließlich mit Wasser gewaschen. Das gewaschene Produkt wird mit Aceton geschrumpft und getrocknet.Dextran and 0.08 g of cysteine, glycylleucine or glycyltgrosine are stirred in 1 ml of a sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer solution (pH 9.2) for 2 days at k ° G. The product is filtered off and washed with 0.5 molar sodium bicarbonate solution and 0.01 molar hydrochloric acid and 1 molar NaCl, and finally with water. The washed product is shrunk with acetone and dried.

Analyse:Analysis:

1) Die an das vernetzte Dextran gebundene Cysteinmenge beträgt 6%* 1) The amount of cysteine bound to the cross-linked dextran is 6% *

Z) Die an das vernetzte Dextran gebundene !«enge Glycylleucin beträgt 13## Z) The glycylleucine bound to the crosslinked dextran is 13 # #

3) Dio an das vernetzte Dextran gebundene Menge an Glyoyltyrosin beträgt3) Dio amount of glyoyltyrosine bound to the crosslinked dextran amounts to

In den folgenden Tabellen werden die Eigenschaften verschiedener Arten von vernetztem Dextran, die durch verschiedeneThe following tables list the properties of different types of crosslinked dextran that are produced by different

£09830/1505£ 09830/1505

organische Cyanate aktiviert sind, miteinander verglichen. Die Ergebnisse der jeweiligen Tabellen sind nicht untereinander ver· gleichbar· Unter cpm wird die Anzahl von Ausschlägen pro Mi«organic cyanates are activated compared to each other. The results of the respective tables are not mutually exclusive equal · Under cpm, the number of deflections per Wed «

nute angegeben, die mitutes indicated that with

IOC -Insulin/absorbiert durch 0,1 mg IOC -insulin / absorbed by 0.1 mg

eines Komplexes zwischen Antikörpern und aktiviertem vernetzten Dextran, erhalten wird. a complex between antibodies and activated crosslinked dextran.

Tabelle 1Table 1

CyanatCyanate

Phenylcyanat
p-Nitrophenylcyanat o-Nitrophenylcyanat m-ChlorphenylcyanatPhenyl cyanate
p-nitrophenyl cyanate o-nitrophenyl cyanate m-chlorophenyl cyanate

cpmcpm

92009200

93009300

46004600

14001400

Tabelle 2Table 2

CyanatCyanate

PhenylcyanatPhenyl cyanate

p-Methoxyphenylcyanat 2,4~Dichlorphenylcyanat 2-tert.-Butylphenylcyanat 2,6-Dimethylphenylcyanat 1-Adamantylcyanatp-methoxyphenyl cyanate 2,4 ~ dichlorophenyl cyanate 2-tert-butylphenyl cyanate 2,6-dimethylphenyl cyanate 1-adamantyl cyanate

cpmcpm

26002600

22402240

540 2040 1100540 2040 1100

580580

Tabelle 3Table 3

CyanatCyanate

ßtß,ß-Trichloräthylcyanat 2,4,6-Tri-tert.-butylphenylcyanat cpm ß t ß, ß-trichloroethyl cyanate 2,4,6-tri-tert-butylphenyl cpm

3400034000

1800018000

Tabelle 4Table 4

CyanatCyanate

1-Naphthylcyanat1-naphthyl cyanate

1,4-Phenyl'endicyanat Phenylcyanat1,4-phenylenedicyanate Phenyl cyanate

cpm 1200 600 1250 cpm 1200 600 1250

909830/15909830/15

Tabelle 5Table 5

CyanatCyanate EäEä Aktivierungszeit, Min.Activation time, min. Tabelle 6Table 6 PhenylcyanatPhenyl cyanate 10,10, 7 1,57 1.5 Polymerpolymer NN 10,10, 7 67 6 vernetztes Dextrancross-linked dextran NN 88th 66th (Sephadexw)(Sephadex w ) IlIl 77th 66th CelluloseCellulose HH 44th 66th Agar-AgarAgar Agar (Sepharos^)(Sepharos ^) CyanatCyanate Tabelle 7Table 7 PhenylcyanatPhenyl cyanate Polymerpolymer HH NN CyanatCyanate

cpmcpm

112000112000

9300093000

4400044000

40004000

70007000

Natriumcyanat Polyν inylalkoho1Sodium cyanate polyvinyl alcohol1

cpm 9200cpm 9200

9000 91009000 9100

vernetztes Dextrancross-linked dextran

cpm 1000 cpm 1000

70007000

3# Bindung von Insulin-Antikörpern an Teilchen aus ver«3 # Binding of insulin antibodies to particles from different

netztem Dextran*wetted dextran *

Es wurde nach obigem Verfahren B· 1· feearbeitet, jedoch mit folgenden Abweichungen:The above procedure was B x 1 x fine, however with the following deviations:

Die Lösung des Antikörpers wurde dem reaktionsfähigen Derivat zugesetzt und bei +230C 1,2,4,6 bezw, 24 Stunden lang geschüttelt· Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefaßt.The solution of the antibody was added to the reactive derivative and BEZW at +23 0 C 1,2,4,6, 24 hours · shaken The results are summarized in Table 8 below.

Tabelle 8Table 8 CyanatCyanate Reaktionszeitreaction time PhenylcyanatPhenyl cyanate 11 HH 22 IlIl 44th IlIl 66th IlIl 909830/^505909830 / ^ 505

cpmcpm

4500 4700 4800 4800 48004500 4700 4800 4800 4800

Mit Ausnahme von l-Adamantylcyanat und o-Nitrophenylcyanat waren alle getesteten Verbindungen aus der Literatur bekannt (vgl. Grigat, Ec, und Pütter, H., Angew. Ghem. 21t 219 (1967). Das 1-Adamantylcyanat wurde nach einem bekannten Verfahren g hergestellt, (vgle Kauer, J0G0, und Hendersson, W.W· J.Am, ChemeSoCe 86,, 4·732, 1964-), ebenso das o-Nitrophenylcyanat, (vgl. Grigat, E. und Pütter, R., Chem. Bere 2Z» 3018 (196^).With the exception of l-adamantyl cyanate and o-nitrophenyl cyanate, all tested compounds were known from the literature (cf. Grigat, Ec, and Pütter, H., Angew. Ghem. 21t 219 (1967). The 1-adamantyl cyanate was obtained by a known method g (cf. e Kauer, J 0 G 0 , and Hendersson, WW · J. Am, ChemeSoCe 86 ,, 4 · 73 2 , 1964-), as well as o-nitrophenyl cyanate (cf. Grigat, E. and Pütter , R., Chem. Ber e 2Z »3018 (196 ^).

1-Adamantyloyana t.1-Adamantyloyana t.

Eine 50#ige Suspension von Natriumhydrid (5 g) in Öl wurde zweimal mit trockenem Benzol gewaschen, das dann abdekan« tiert wurde. Das .Natriumhydrid wurde sodann in 75 ml trockenem Benzol dispergiert, danach wurden 15,3 g 1-Adamantanol züge« setzt. Das Gemisch wurde unter Rühren ^ Stunden lang am Rück« fluß gekocht, dann wurde auf Raumtemperatur abgekühlt« Sodann wurden 10,5 g Bromcyan, in 25 ml trockenem Benzol gelöst, im Verlauf von etwa 15 Minuten zugetropft. Nach weiterem 10-minütigern Rühren wurde der Niederschlag abfiltriert und mit trocke« nem Benzol gewaschen. Piltrat und Waschlösungen wurden ver« einigt und zur Trockene eingedampft. 10 g des Rückstands wurden in 25 ml siedendem Benzol gelöst und die Lösung wurde über Nacht bei -200C stehen gelassen» Der resultierende Nieder« schlag wurde abfiltriert und das Piltrat wurde zur Trockene eingedampft. Der so erhaltene Rückstand wurde als Aktivierungsmittel verwendet.
o-Nitrophenylcyanat. . . .A 50 # strength suspension of sodium hydride (5 g) in oil was washed twice with dry benzene, which was then decanted off. The sodium hydride was then dispersed in 75 ml of dry benzene, after which 15.3 g of 1-adamantanol were added. The mixture was refluxed with stirring for 4 hours, then cooled to room temperature. 10.5 g of cyanogen bromide, dissolved in 25 ml of dry benzene, were then added dropwise over the course of about 15 minutes. After stirring for a further 10 minutes, the precipitate was filtered off and washed with dry benzene. Piltrate and washing solutions were combined and evaporated to dryness. 10 g of the residue were dissolved in 25 ml of boiling benzene, and the solution was stirred overnight at -20 0 C allowed to stand "The resulting low" was filtered off and the Piltrat was evaporated to dryness. The residue thus obtained was used as an activating agent.
o-nitrophenyl cyanate. . . .

13»9 g o-Nitrophenol und 11,1 g Bromcyan wurden in 30 ml Aceton gelöst, Dann wurden 10,1 g Triethylamin unter Eiskühlung in solcher -Geschwindigkeit zugetropft, daß die Temperatur nicht über 1O0G anstieg. Nach beendeter Zugabe wurde noch 5 Minuten lang gerührt« Sodann wurde das Reaktionsgemisch fil~ triert, und das Piltrat wurde in Eiswasser gegossen. Das Pro« dukt wurde abfiltriert und in einem Exsiccator-über Phosphor« pentoxyd getrocknet«, Man erhielt 1^,2 g Produkt (87$). Dieses Rohprodukt wurde als Aktivierungsmittel verwendet.13 »9 g of o-nitrophenol and 11.1 g of cyanogen bromide was dissolved in 30 ml acetone, then 10.1 g of triethylamine was added dropwise under ice-cooling in such -Speed that the temperature did not exceed 1O 0 G. When the addition was complete, the mixture was stirred for a further 5 minutes. The reaction mixture was then filtered and the piltrate was poured into ice water. The product was filtered off and dried over phosphorus pentoxide in a desiccator. 1.2 g of product ($ 87) were obtained. This crude product was used as an activating agent.

9098 30/1 50 59098 30/1 50 5

Claims (8)

Ίο Patentansprüche ·Ίο patent claims 1. Verfahren zur Bindung organischer Verbindungen mit einer oder mehreren Gruppen der Formel -YH, die eine primäre oder sekundäre Aminogruppe darstellt, an Polymere mit einer oder mehreren Gruppen der Formel -XH, die eine Hydroxylgruppe oder eine primäre oder sekundäre Aminogruppe darstellt, durch kovalente Bindungen, wobei das die Gruppe (n) der Formel -XH enthaltende» Polymer mit einer Verbindung umgesetzt wird, die ein reaktionsfähiges Derivat des Polymers zu bilden vermag, worauf das Derivat mit der organischen Verbindung umgesetzt wird, dadurch gekennzeichne tip daß man als zur Bildung des reaktionsfähigen Derivats des Polymers befähigte Verbindung eine Verbindung mit einer oder mehreren Cyanatgruppen verwendet. - -■ -■ ."ν -■ "1. Process for binding organic compounds with one or more groups of the formula -YH having a primary or secondary amino group, on polymers with one or more groups of the formula -XH, which represent a hydroxyl group or represents a primary or secondary amino group, through covalent bonds, which is the group (s) of the formula -XH containing »polymer is reacted with a compound capable of forming a reactive derivative of the polymer, whereupon the derivative is reacted with the organic compound, thereby marked tip that one is used to form the reactive derivative of the polymer capable compound a compound with one or more cyanate groups is used. - - ■ - ■. "Ν - ■" 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das eine oder mehrere Gruppen der Formel -XH enthaltende Polymer ein Polysaccharid oder ein Polysaccharidderivat ist, das Hydroxylgruppen und/oder primäre und/oder sekundäre Aminogruppen enthält·2. The method according to claim 1, characterized in that the one or more groups of the formula -XH containing Polymer is a polysaccharide or a polysaccharide derivative that has hydroxyl groups and / or primary and / or secondary Contains amino groups 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das eine oder mehrere Gruppen der Formel -XH enthaltende Polymere in Wasser unlöslich ist«3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the one or more groups of the formula -XH containing polymers is insoluble in water « 4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das eine oder mehrere Gruppen der Formel -XH enthaltende Polymer aus einem vernetzten, dreidimensionalen, hydroxylgruppenhaltigen Netzwerk besteht und in Wasser unlöslich ist«4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the polymer containing one or more groups of the formula -XH consists of a crosslinked, three-dimensional, hydroxyl-containing network and is insoluble in water " 5· Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die eine oder mehrere Gruppen der Formel -YH enthaltende organische Verbindung ein Protein, Polypeptid oder ein Peptid oder ein Derivat eines Proteins, Polypeptids oder Peptide ist·5 · Method according to one of the preceding claims, characterized in that the one or more groups organic compound of the formula -YH containing a protein, polypeptide or a peptide or a derivative of a protein, Polypeptide or peptide is 909830/1505909830/1505 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 « 4·, dadurch gekennzeichnet, daß die eine oder mehrere Gruppen der Formel -YH enthaltende organische Verbindung efne Aminosäure oder ein Derivat einer Aminosäure ist· 6. The method according to any one of claims 1 «4 ·, characterized in that the organic compound containing one or more groups of the formula -YH is an amino acid or a derivative of an amino acid · 7· Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß die organische Verbindung ein Enzym oder ein Derivat eines Enzyms ist.7 · The method according to claim 5 »characterized in that the organic compound is an enzyme or a derivative of a Enzyme is. 8. Verfahren nach Anspruch 5# dadurch gekennzeichnet, daß die organische Verbindung ein Antikörper oder ein Derivat eines Antikörpers ist· 8. The method of claim 5 # characterized in that the organic compound is an antibody or a derivative of an antibody · 9« Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die organische Verbindung ein Antigen oder ein Derivat eines Antigens ist» 9 « Method according to claim 5, characterized in that the organic compound is an antigen or a derivative of an antigen» Für Pharmacia Afetiebolag Uppsala, SchwedenFor Pharmacia Afetiebolag Uppsala, Sweden RechtsanwaltLawyer 909830/1505909830/1505
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