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Verfahren zur Reinigung und Konzentrierung bestimmter Enzyme Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Konzentrierung eines schwach proteolytisch
wirkenden Milchgerinnungsenzyms das durch Endothia iarasiticA oder eines proteolytischen
Enzyms, das durch Bacillus subtilis produziert wird, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man eine Lösung des verunreinigten Enzyms mit einer Seite einer semi-permeablen
Membrane, durch die wesentliche Mengen des Enzyms nicht hindurchgehen und wesentliche
Mengen an Lösungsmittel, anorganischen Salzen und niedermolekularen organischen
Verbindungen hindurchgehen, in Berührung bringt und die Enzymlösung unter einen
Druck setzt, der ausreicht, um den Lösungsmittelfluß von der Lösung durch die Membrane
zu bewirken.
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Enzyme sind wichtige, chemische Handelsartikel, die für viele chemische
und biochemische Reaktionen verwendbar sind.
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Zur Verwendung in vielen Verfahren und zur Lagerung und für den Transport
ist es oft notwendig, diese Enzyme in relativ reiner, kristalliner Form oder in
Form von relativ konzentrierten Lösungen zu erhalten. Ferner ist es für viele Anwendungszwecke
erforderlich, Enzyme zu verwenden, die frei von anorganischen Salzen oder organischen
Rückständen sind, die mit den Enzymen vermischt sein können, insbesondere wenn diese
Enzyme durch Fermentation produziert werden.
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Der Bedarf an Enzymen in unverfälschter Form erforderte die Notwendigkeit,
diese Enzyme zu konzentrieren und zu reinigen.
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Typische, bisher bekannte Verfahren sind Vakuumverdampfung von Enzymlösungen,
die von filtrierten Fermentationsbrühen stammen und anschließende fraktionierte
Kristallisierung und Ausfällen der Enzyme, um dieselben zu reinigen.
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Derartige Verfahren waren nicht ganz zufriedenstellend, da Enzyme
oft thermisch unbeständig sind und sich zersetzen, wodurch ein Ausbeuteverlust erzielt
wird, und da die Kristallisierung und Ausfällung mühsame Vorgänge sind, bei denen
unvollständige Trennung und Lösungsverlust beim Auswaschen unerwünschte Begleiterscheinungen
sind. Die Verluste infolge thermischer Zersetzung sind selbst dort nicht wirkungsvoll
ausgeschlossen, wo extrem niedrige Drücke angewendet werden, und zwar insoweit als
eine große Menge der einzudampfenden Flüssigkeit de relativ heißen Heizflächen berührt
8 Außerdem kr;^;;; die nicht sorgfältige Kontrolle der Verciampfungstemperatur selbst
nur für ein paar Minuten eine Überhitzung zur Folge haben, durch die eine große
Menge des Enzyms zerstört wird.
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Die erfindungsgemäße umgekehrte Osmose stellt nunmehr eine Maßnahme
dar, durch die Enzymlösungen konzentriert werden können, ohne daß große Verluste
durch Hitzeeinwirkung erzielt werden, und sie stellt außerdem eine Maßnahme dar,
durch die Salze und organische Verunreinigungen fast vollständig aus den Enzymlösungen
entfernt werden können ohne die unerwünschten mechanischen und Lösungsverluste,
die bei der Ausfällung und Filtrierung unerwünschte Begleiterscheinungen sind. Beispielsweise
in Fällen, in denen die erfindungsgemäße umgekehrte Osmose Bestandteil eines Verfahrens
zur Herstellung eines schwach proteolytisch wirkenden Milchgerinnungsenzyms durch
Fermentation von Endothia psrasitica ist, beispielsweise gemäß den Lehren der USA-Patentschrift
3 275 453, kann das neue Verfahren, bei dem eine Ausbeute von über 82 ffi erzielt
wird,eine Verdampfungs-und Ausfällungsstufe ersetzen, bei der eine Ausbeute von
nur 60-65 erzielt wird. Die Anwendung des erfindungsgerntßen Verfahrens kann daher
einen Ausbeutegewinn von etwa 20 O/o liefern.
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Ferner können beim erfindungsgemäßen Verfahren einfachere und weniger
kestspieligere Vorrichtungen verwendet werden als bei den bisherigen Verfahren zur
Reinigung und Konzentrierung verwendet wurdenz,und schließlich ist das erfindungsgemäße
Verfahren für vollständig kontinuierliche Arbeitsschemen, die zur wirtschaftlichen
Herstellung von Enzymen durch Fermentation erforderlich sind, erfolgreicher anwendbar.
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Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Enzyme dadurch gereinigt
und konzentriert, daß überschUssiges Lösungsmittel und andere Verunreinigungen mit
niedrigem Molekulargewicht unter Anwendung einer umgekehrten Osmose entfernt werden.
Die umgekehrte Osmose ermöglicht die Abtrennung der Enzyme vom Lösungsmittel und
anderen Verunreinigungen durch Verwendung einer semi-permeablen Membrane, durch
die das Lösungsmittel mit relativ niedrigem Molekulargewicht und die verunreinigenden
Molektile hindurchstrOmen, während die Enzyme mit relativ hohem Molekulargewicht
zutAckgehalten werden. Das Hindurchströmen oder Diffundieren der Verbindungen mit
niedrigem Molekulargewicht durch die Membrane wird dadurch verursacht, daß man auf
die ursprUngliche Enzymlösung, die sich in Kontakt mit der Membranoberfläche befindet,
Druck anwendet.
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Die Konzentrierung von verunreinigten Enzymlösungen durch umgekehrte
Osmose erwies sich als sehr einfltassreich auf die Leichtigkeit, mit der solche
Produkte getrocknet werden können. Durch die Entfernung einer wesentlichen Menge
an in der Fermentationsbrühe vorliegenden zufälligen Verunreinigungen lieferte die
umgekehrte Osmose Enzymkonzentrate, die selbst bei erhöhten Temperaturen, wie sie
beim SprUhtrocknen angewandt werden, getrocknet werden können. Dies ist insbesondere
unerwartet, im Hinblick auf die Tatsache, daß, obgleich enzymhaltige FermentationsbrUhe
durch Eindampfen bei niedriger Temperatur unter Vakuum konzentriert werden kann
ohne einen wesentlichen Wirkungsverlust, ein nachfolgendes Sprühtrocknen solcher
eingedampften Konzentrate gewöhnlich den vollständigen Verlust der Enzymwirksamkeit
zur Folge hat.
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Die Erfindung eignet sich zum Abtrennen von Enzymen mit relativ hohem
Molekulargewicht von Lösungsmitteln, anorganischen Salzen und Verunreinigungen mit
relativ niedrigem Molekulargewicht. Die Erfindung kann zum Konzentrieren von Enzymen
durch Entfernen des überschüssigen Lösungsmittels, in dem das Enzym gelöst ist,
angewendet werden, oder aber sie kann sowohl zum Konzentrieren und Reinigen der
Enzyme angewendet werden, in dem die organischen und anorganischen Verunreinigungen
mit niedrigem Molekulargewicht als auch das überschüssige Lösungsmitsl entfernt
werden. Der erforderliche Unterschied zwischen den Molekul,L-gewichten, der hindurchdiffundierenden
Verbindungen und der nicht hindurchdiffundierenden Verbindungen wird durch die Art
der verwendeten Membrane gesteuert, wie nachstehend noch beschrieben wird. Allgemein
gesagt, sind die für die Erfindung brauchbaren Membrane' solche, die Verbindungen
zurückhalten, deren Molekulargewicht gleich oder etwas niedriger ist als das der
zu reinigenden Enzyme und die hier solche Verbindungen durchlässig sind, deren Molekulargewicht
gleich oder etwas höher ist als das der zu entfernenden Verunreinigung. Da ein Unterschied
im Molekulargewicht zwischen den Stoffen, die durch die Membrane hindurchströmen
und denen die durch dieselbe zurückgehalten werden, bestehen muß, müssen die Molekulargewichte
der zu reinigenden Enzyme und die Molekulargewichte der zu entfernenden Verunreinigungen
ziemlich unterschiedlich spin. Mit fortschreitender Membrantechnik jedoch kann der
erforderliche Unterschied zwischen den Molekulargewichten der durchströmenden und
der zurückgehaltenen Verbindungen verringert werden, und es werden schärfere Trennungen
möglich sein.
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Typische, im vorliegenden Verfahren verwendbare Enzyme haben Molekulargewichte
zwischen 40 000 und 50 000 und kommen zusammen mit Lösungsmitteln und Verunreinigungen
vor, deren Molekulargewichte zwischen 1 000 und 5 000 oder darunter liegen. -ln
solchen oder ähnlichen Fällen ist es für den Fachmann nicht schwer, für die Erfindung
eine Membrane auszuwählen, durch die die Hauptmenge der Enzyme zurückgehalten wird
und die meisten Verunreinigungen hindurchströmen.
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Die untere Molekulargewichtsgrenze der durch eine bestimmte Membrane
zurückgehaltenen Enzyme ist nicht genau festgelegt, wie nachstehend erläutert wird
kann eine Membrane eineheil des Stoffes, der oberhalb der unteren Begrenzung liegt,
durchströmen @assen. Es ist jedoch möglich, das erfindungsgemäße Verfahren auf verschiedene
Weise durchzuführen um vergleichbare Reinigungegrade mit Membranen von verschiedenen
Zurückhalteigenschaften zu -erhalten. Beispiels weise kann eine Membrane, die nur
80 % der gelösten Stoffe mit Molekulargewichten über 10 000 zurückhält, in einer
2. umgekehrten Osmosestufe verwendet werden, um 80 % von den 20 %, die in der 1.
Stufe hindurchströmten, zurückzuhalten, wodurch eine Gewinnung von 96 % des gesamten
gelösten Stoffes mit einem Molekulargewicht über 10 000 erreicht wird. Die Anwendung
von Mehrstufenverfahren mit einem entsprechenden Kreislauf der teilabgetrennten
Ströme um einen hohen Reinigungsgrad zu erreichen, ist dem Fachmann bekannt und
die umgekehrte Osmose der vorliegenden Erfindung kann in einem Mehrstufenverfahren
angewendet werden.
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Gleichermaßen schließt die Erfindung die Verwendung einer Reihe von
Membranen von verschiedenen Molekulargewichtsc'urch lässigkeits /stufen ein, um
die gewünschten Trennungen zu erzielen.
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Die Erfindung ist besonders anwendbar bei einem proteolytischen milden
Milchgerinnungsenzym, das durch Endothia parasitica produkiert wird. Ein Verfahren
zur Herstellung dieses Milchgerinnungsenzyms, das bei der Herstellung von Käse verwendet
wird, wird in der USA-Patentschrift 3 275 453 beschrieben. Dieses Enzym, das in
relativ reiner Form erfordert wird, wird von Fermentationsbruhen, die außerdem große
Mengen an Wasser als auch unvergorene Kohlehydrate, Zucker, Farbstoffe, Aminosäuren
und anorganische Salze einschl. Phosphate und Magnesium- und Kaliumsalze enthalten,
abgetrennt. Frühere Verfahren verwendeten Verdampfung, Ausfällen und fraktionierte
Kristallisation, um das Enzym vom Wasser und den Verunreinigungen abzutrennen, womit
jedoch starke Ausbeuteverluste verbunden waren. Das erfindungsgemäße Verfahren schließt
das alte Verdampfungsverfahren mit seinen Produktverlusten durch thermische Zersetzung
von etwa 20 % vollständig aus und schließt außerdem mehrere Ausfällungsstufen, Wasch-
und Filtrierstufen mit deren zusätzlichen Produktverlusten aus.
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Wenn das neue Verfahren bei Raumtemperatur durchgeführt wird, ist
der Gesamtausbeuteverlust gewöhnlich etwa 10-15 % und kann auch nur 4-7 % betragen.
Diese Verluste lassen sich noch weiter verringern, wenn man das neue Verfahren bei
niedrigeren Temperaturen, die zwischen dem Gefrierpunkt der Lösung und etwa 180C
liegen, durchführt oder durch Verwendung einer 2. Membrane, um jegliches Enzym von
dem durchlässigen Stoff zu entfernen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist außerdem besonders geeignet, um
die durch Bacillus subtilis prodozierten protU tischen Enzyme zu reinigen und zu
konzentrieren. Dieses Enzym, das zur Reinigung von Textilien geeignet ist, und einen
Teil von Haushaltswaschmitteln darstellt, wird durch Fermentation zusammen mit Wasser
und organischen und anorganischen Vo-runreiniIngen hergestellt. Durch das
erfindungsgemäße
Verfahren können sowohl Konzentrierung durch Wasserentfernung und Reinigung durchgeführt
werden.
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Eine Form des Enzyms, das als Waschmittelzusatz hergestellt wird,
ist Maxatase (Handelsbezeichnung) und wird von der Royal Netherlands Fermentation
Industries, Ltd., in Delft, Holland, hergestellt.
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Die Trennung von gewünschten und ungewünschten Anteilen der ursprünglichen
Enzymlösung wird durch Anwendung von umgekehrter Osmose durchgeführt Unter umgekehrter
Osmose wird in vorliegender Anmeldung ein Verfahren verstanden, bei dem Wasser oder
ein Lösungsmittel aus einer Lösung durch Anwendung von Druck durch eine semi-permeable
Membraune fließt. Der Strom des Lösungsmittels wird durch einen Teil, jedoch nicht
alle, in demselben gelösten Substanzen begleitet. Unter dem Ausdruck umgekehrte
Osmose, wie er hier verwendet wird, sollen auch solche Yerfahren verstanden werden,
die man als Ultrafiltration bezeichnet.
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Der Ausdruck umgekehrte Osmose soll im allgemeinen oder wie er hier
verstanden wird nicht auf Wasser als Lösungsmittel begrenzt sein, sondern schließt
auch andere l,bsungsmittcl ein. Die umgekehrte Osmose unterscheidet sich außerdem
von der Dialyse, in der eine gelöste Substanz durch eine semi-pereable Membran/unter
dem Einfluß einer treibenden Kraft eines Konzentrationsgefälles hindurchdi fundiert,
Bei der umgekehrten Osmose wird eine semi-perable Membran verwendet, um Stoffe mit
verschiedenen Molekulargewichten zu trennen. Die ursprüngliche Lösung, die sowohl
das Enzym als auch das unerwünschte überschüssige Lösungsmittel, üblicherweise Wasser,
und organische und anorganische Verunreinigungen enthält und die die filtrierte
Fermentationsbrühe sein kann, in der das Enzym ursprünglich produ@jert
wurde
oder aber eine andere Enzymlösung sein kann wird einer Seite der Membrane unter
einem äußerlich angewendeten hydraulischen Druck ausgesetzt. Folglich liegt ein
Druckunterschied innerhalb der Dicke der Membrane vor. Dieser Druck verursacht,
daß Wasser oder ein anderes Losungsmittel mit niedrigem Molekulargewicht durch die
Membrane fließt, wobei die Salze und andere Verunreinigungen mit einer Konzentration,
die im allgemeinen etwas niedriger oder manchmal wesentlich niedriger als die der
ursprünglichen Lösung ist, mitgeschleppt werden. Die Konzentration der Verunreinigungen
in dem Wasser, das durch die Membrane fließt, hängt im allgemeinen von der Art der
Membrane, der Konzentration der ursprünglichen Lösung und vom angewendeten Druck
ab. Es wird darauf hingewiesen, daß bei der umgekehrten Osmose hohe Fließgeschwindigkeiten
zweckmäßig sind, da die untere Fließgeschwindigkeit der Verunreinigungen mit dem
Anwachsen der Wasser- oder Lösungsmittelfließgeschwindigkeit größer wird, ohne ein
entsprechendes Anwachsen der Fließgeschwindigkeit des gewünschten Enzyms durch die
Membrane. Mit der poröseren Art von Membranen hat man festgestellt2 daß manchmal
die Fließgeschwindigkeiten derart sind, daß die Konzentration an Verunreinigungen
in dem durchfließenden Strom, der durch die Membrane durchgeflossen ist, fast mit
der Konzentration im ursprünglichen Strom identisch ist, Dies steht im Gegensatz
zur Situation bei der Dialyse, , bei der die Fließgeschwindigkeit des durchfließenden
Lösungsmittels proportional zum Konzentrationsunterschie d innerhalb der Membrane
ist, und wobei nur eine geringe Menge an Lö.9ungsmittel durch die Membrane hindurchfließt,
mit Konzentrationsunterschieden, die praktisch gleich oft sind.
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Je nach der Art der verwendeten Membrane werden wesentliche Mengen
an unerwünschten Salzen und niedermolekularen Verunreinigungen mit dem Wasser durch
die Membrane mitgoschl--ppt,
wodurch die gewünschte Abtrennung
der Verunreinigungen vom Enzym, welches zurückbleibt, erreicht wird.
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Es ist nicht erforderlich, daß die nicht unter Druck stehende Oberfläche
der Membrane zur wirksamen Durchführung des Verfahrens einem reinen Lösungsmittel
oder einer enzymfreien Lösung ausgesetzt wird. Das Druckgefälle innerhalb der Dicke
der Membrane ist das einzige erforderliche äußerlich anzuwendende Gefälle. Deshalb
können das Lösungsmittel und die Verunreinigungen, die durch die Membrane fließen,
dazu veranlaßt werden, von der nicht unter Druck stehenden Oberfläche wegzufließen,
sobald sie durch dieselbe von der unter Druck stehenden Oberfläche hindurchdMYndiert
sind.
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Der hydraulische Druck, der auf die ursprüngliche Lösung angewendet
wird, und auf die zurückhaltende Seite der Membrane übertragen wird, kann im Hinblick
auf die vielen Variablen ausgewählt werden. Im allgemeinen muß der anzuwendende
Druck den Unterschied zwischen dem osmotischen Druck der Enzymlösung auf der unter
Druck stehenden Seite der Membrane und dem osmotischen Druck der relativ enzymfreien
Lösung der unter niedrigem Druck stehenden Seite der Membrane übersteigen. Höhere
Drücke verursachen im -llgemeinen eine größere Durchdringungsgeschwindigkeit der
Verunreinigungen und Lösungsmitteln durch die Membrane bis zu einem bestimmten Maximum
je nach Art der Membrane und sind folglich erstrebenswert. Die Größenordnung der
wnte-en Druckgrenze hängt von vielen Faktoren ab, insbesondere von der Art der verwendeten
Membran. Der niedrigste anwendbare 2 Druck kann folglich nur weniger als 1 kg/cm2
sein in Fällen einer stark porösen Membrane von geringer Selektivität oder mehrere
@ehn kg/cm2 bei relativ dichten Membranen mit einer hohen Selektivität.
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Die obere Druckgrenze wird durch die Mechanik der Membrane bestimmt,
und die Membrane muß so konstruiert oder befestigt sein* daß sie den hydraulischen
Druck, der auf #eine ihrer Seiten ausgeübt wird, aushält. Bei der vorliegenden Erfindung
kann typischerweise eine flache Membran durch eine poröse Platte gestützt werden
oder eine Membran mit einem ringförmigen Querschnitt kann dadurch gestützt werden,
daß sie an der inneren Oberfläche einer porösen Röhre angebracht ist. Andere Halterungsmethoden,
wie z.B. eine selbsttragende Membrane, die aus kleinen Bohrlöchern und relativ schweren
Rchrwandungen, wie beispielsweise hohlen Gespinsten, besteht, können selbstverständlich
auch verwendet werden.
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Der übliche Druck kann außerdem dadurch begrenzt werden, daß die Membrane
selbst gegen ihre halterung mit Hilfe von hohen Drücken gedrückt wird und kann folglich
einen Teil ihrer Fähigkeit, niedermolekulare Verbindungen hindurchströmen zu lassen,
verli3ren. Der Fachmann wird jedoch in der Lage sein, die geeigneten Drücke zur
Durchführung der Erfindung auszuwählen. Die anzuwendenden Drücke hängen vom Grad
der gewünschten Trennung, der Art der Verunreinigungen, der Art der verwendeten
Membran und von anderen Faktoren ab. Im allgemeinen liegen die erfindungsgemäßen
Drücke zwischen 0,7 atü und 105atü , d .h. den Bereich eines z.Z. zur Entsalzung
von Brackwasser verwendeten Apparates.
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Es sind außerdem auch höhere Drücke anwendbar, wobei die Grenzen durch
die Vorrichtungsgrenzen gesetzt sind. Mit einer Celluloseacetat-Membrane, die in
einer Ausführungsform der Erfindung verwendet wird, werden Drücke zwischen 2,11
fit und 70,3 atü, vorzugsweise zwischen 7,03 und 52,7 atü angewendet. Mit Membranen
vom polyelektrolytischen Komplextyp lassen sich erfolgreich niedere Drücke von etwa
352 bis e 7703 atü anwenden.
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Die erfindungsgemäß verwendbaren semi-pereablen membranen sind solche,
die unter dem Einfluß eines ausreichend großen Druckgefälles einen relativ großen
Fluß von niedermolaren Lösungsmitteln und Verunreinigungen durch die Membran gestatten,
während überhaupt kein oder nur ein geringer P5tlß en des Enzyms stattfindet. Diese
Membran/lassen die Trennung dadurch durchführen, daß man Verbindungen* die unterhalb
eines bestimmten Molekulargewichts liegen, leicht hindurchfließen läßt und daß man
den Fluß von Verbindungen, die oberhalb eines bestimmten Molekulargewichtes liegen,
verringert oder ausschließt. Diese Art von Membranen lassen sich mit einer Molekulargewichtsbegrenaung
herstellen, die sicli ü%r einen weiten Bereich erstrecken kann. Eine bestimmte Merbraue
läßt daher Verbindungen mit einem Molekulargewicht unterhalb von 3000 durehdringen
und hält Verbindungen , deren$ Molekulargewicht diesen Wert übersteigt, zurück.
Die Molekulargewichtsbegrenzung ist nicht scharf und einTeil derjenigen Verbindung,
deren Molekulargewichte unterhalb dieser Grenze liegen, können zurückgehalten werden
und manchmal können Verbindungen mit Molekulargewichten, did obe-ftb dieser Grenze
liegen, durch die Membrane durchdringen. , Die Trennung ist eine relative, und im
allgemeinen wächst die Trennschärfe in dem Maße, in dem das Molekulargewicht der
Verbindungen die Molekulargewichtsbegrenzung der jeweiligen Membrane unter oder
überschreitet. Es können auch andere Gesichtspunkte, wie beispielsweise die chemische
Natur der jeweiligen durchdringenden Verbindungen den Durchlässigkeitsgrad einer
bestimmten Membran beeinflussen. So können z.B. anorganische Salze mit einem bestimmten
Molekulargewicht eine bestimmte Membran leichter durchdringen als eine organische
Verbindung mit dem gleichen Molekulargewicht oder umgekehrt. Die zur Durchführung
der vorliegenden Erf.n'3ung bevorzugten Membranen sind diejenigen der porösen Celluloseacetat-Sorte
mit einem hohen Durchfluß, die häufig in der
Literatur, die sich
mit umgekehrter Osmose beschäftigt, als "Loeb-Typ"-Membranen bezeichnet werden und
lassen sich durch bekannte Verfahren herstellen.
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Beispielsweise lassen sich die in den USA-Patentschriften 3 133 132
und 3 133 137 beschriebenen Verfahren und diejenigen von Manjikian (Report No. 65-13,
Department of Engineering, University of California, Los Angeles, Mareh, 1965 und
Ind. Eng. Chem., Product Research and Development, 6, No. 1, 23-32 (1967)) mit entsprechenden
Modifikationen anwenden, um die dabei entstehenden Membranen für übliohe einwertige
Salze, wie Natriumchlorid, durchlässig zu machen. Es ist bekannt, daß der Grad an
Salzzurückhaltung einer Membrane, die nach den vorstehenden Verfahren hergestellt
wurde, eng von der in der Brennstufe verwendeten Temperatur, bei der die Membrane
bei einer bestimmten Temperatur für eine bestimmte Zeit in Wasser eingetaucht wird,
abhängt. So hat beispielsweise Manjikian (Ind.Eng.Chem., Product Research and Development,
6; Ne. 1, 23-32 (1967)) dadurch Membranenhergestellt, daß er (1) eine Lösung herstellte,
die 25 % Celluloseacetat, 45 tjb Aceton und 30 % Formamid enthielt, (2) aus dieser
Lösung bei 23°C einen Film auf eine Glasplatte aufgoß, (3) einen Teil des Lösungsmittels
30 Sekunden lang bei 230C aus dem aufgegossenen Film verdunsten ließ, (4) den Film
eine Stunde lang bei 0 - 3°C in Wasser eintauchte und (5) die dabei erhaltene Membrane
durch Eintauchen in @asser 5 Min. lang bei einer bestimmten Temperatur härtete oder
brannte. Wenn die Brenntemperatur verändert wird, zeigen die dabei entstehenden
Membranen einen unterschiedlichen Grad an Entsalzungsfähigkeit, wie durch die Testergebnisse
in Tabelle I gezeigt wird. Diese Ergebnisse wurden in einer Laboratoriumstestzelle
erhalten, die bei ciric?m Druck von 42 , 2 atü und einer Sole mit einem Gehalt an
5.000
ppm Natriumchlorid betrieben wurde.
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Tabelle I Wirkung der Härtetemperatur auf die Membraneigenschaften
Membrane Härte-Temp.,°C Durchfluss Salzgehalt 1/m2/Tag ppm A nicht erhitzt (23°C)
3 999,5 3 800 B 70 1 894,5 800 C 76 1 263 250 D 78 715,7 110 E 81 505,2 85 Es wurde
gefunden, daß nicht erhitzte Membranen die ein schlechtes Entsalzungsvrmögen aufweisen,
ähnlich wie die Membrane A der Tabelle I, überraschenderweise Salze und andere niedermolare
Verunreinigungen, wie Zucker und organische Verbindungen zusammen mit Wasser leicht
hinaurchgehen lassen , wenn Enzymlösungen, die derartige Salze und andere Verunreinigungen
enthalten, auf-der einen Seite der Membrane unter Druck gesetzt werden, während
die hochmolaren Enzyme zurückgehalten werden. Membranen mit mittelmäßigem Entsalzungsvermögen,
etwa zwischen A und 13 der Tabelle I, könnon, wenn man sie auf 50°C erhitzt, ebenfalls
verwendet werden, jedoch dringen Salze und andere Verunreinigungen nicht so schnell
durch die Membrane hindurch. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die
oben beschriebenen Celluloseacetat-Membranen beschränkt. Es werden eine Menge Membranen
hergestellt und zum Verkauf angeboten, die unterschiedliche Entsalzungseigenschaften
bositzep Die erfindungsgemäß verwendebaren Celluloseacetat-Membranen sind solche,
die man im sllgemeinen ais "lose", "offen",
mit offener Struktur
oder "mehr porös bezeichnet werden.
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Sie sind nicht durch den Porendurchmesser oder durch irgend eine andere
einfache physikalische Eigenschaft charakterisiert, jedoch sud ihre Zurückhaltung
gelöster Stoffe und Fließgescbwindigkeitseigenschaften den Eigenschaften der Membranen
ähnlich, die nach in vorstehend genannten Veröffentlichungen beschriebenen Verfahren
hergestellt wurden, wobei diese Eigenschaften in ähnlicher Weise verändert werden
denen.
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In manchen Fällen kann CE nötig sein, eine Membrane, die eine zu hohe
Salzzurückhaltn ,der eine Zurückhaltung von Lösungsmitteln oder andere V?unreinigungen
aufweist, mit einem Quellmittel, wie in Wasser gelöstes Magnaiumperchlorat zu behandeln,
um sie für die Lösungsmittel und Verunreinigungen durchlässiger zu machen.
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Wie bereits vorstehend ausgeführt wurde, ist die Erfindung nicht auf
die Celluloseacetat-Rembrane beschränkt und eine andere erfindungsgemäß bevorzugt
zu verwendende Membrane ist die Polyelektrolytkomplexmcmbrane, die Polystyrolsulfonatgruppen
als anionen und Polyvinylbenzyltrimethylammoniumgruppen als Kationen enthält, wie
sie durch A.S. Michaels in Ind. Eng. en. 57 (1C), 32-40 (1965) beschrieben wird.
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Es können außerdem Membranen aus anderen Cellulosederivaten und aus
Mischpolymeren aus Mono- und Dimethacrylaten von Äthylenglycol mit Methylincthacrylaten
hergestellt werden und sie können entweder kationisch, anionisch oder nichtanionisch
sein. Ferner können Membranen verwendet werden, die aus substituiertem Nylon sind
als auch solche, die aus filmbildenden Celluloseestern bestehen.
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Fig. I ist eine schematische Bezeichnung einer Ausführungßform des
erfindungsgemäßen Verfahrens. In dieser Fig. I wird die ursprüngliche Enyzmlösung
in einem Beschickungstank 1 gehalten, der gekühlt werden kann, um thermischen Abbau
zu vermeiden. Vom Beschiokungstank 1 wird die Enzymlösung in eine Druck- und Kreislaufpumpe
2 geführt. Pumpe 2 ist eine Hochdruckverdrängerpumpe, die dazu verwendet wird* um
die Glasfaserröhre, die sich innerhalb des kleinen Gefäßes für die umgekehrte Osmose
3 befindet, unter Druck zu setzen und den Fluß durch das kleine Gefäß hindurch zu
bewirken.
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Der Druck innerhalb der Glasfaserröhre 4 kann außerdem durch komprimierte
Luft, Stickstoff oder ähnlich Gase bewirkt werden. Die ursprüngliche Lösung wird
durch die Pumpe in das Innere einer porösen Glasfaserröhre 4 befördert.
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Die innere Oberfläche dieser Röhre ist mit einer semi-permeablen Membrane
5 beschichtet. Die mit der Membrane 5 beschichtete Glasfaserröhre 4 ist so gebaut,
daß sie den Druck, der durch die Pumpe 2 erzeugt wird, aushält. Wenn die ursprüngliche
Flüssigkeit durch die Mitte der Glasfaserröhre fließt, geht ein Teil der Flüssigkeit
durch die semi-permeable Membrane 5, durch die Wandung der porösen Glasfaserröhre
4 und in den leeren, ringförmigen Raum 6, der die membranbeschichtete Glasfaserröhre
4 umgibt.-Die durchgedrungene Flüssigkeit, die aus einem Überschuß an Wasser oder
Lösungsmittel und niedermolekularen anorganischen Salzen und organischen Verbindungen
besteht, wird in dem ringförmigen Raum 6 gesammelt und in einen Sammeltank 7 für
das durchgedrtzgene Material geleitet oder verworfen. T)er äußere Teil des ringförmigen
Raumes 6 wird durch eine steife Röhre 8 umgeben, die dazu dient, die Glasfaserröhre
4 zu halten und das durchgedrungene Material zurückzuhalten, bis es verworfen wird
oder in den Sammeltank 7 fließt. Die zurückgehaltene Flüssigkeit, d.h. die Plüssigkeitfdie
das Enzym enthalt, die nicht durch die Membran 5 und die Röhre 4 durchdrint,
fließt
vom Ende 9 der Glasfaserröhre 4 durch ein Druckablassventil 10 und kann über eine
Kreislaufleitung 11 in den Beschickungstank 1 zur weiteren Konzentrierung und Reinigung
rückgeführt werden. Wahlweise kann die zurückbleibende Flüssigkeit in einen Trenntank
12 geleitet werden oder zur weiteren Behandlung bearbeitet werden.
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Modifikationen dieser Vorrichtung können die Verwendung einer allgemeinen
Halterung 8 einschließen, die eine Gruppe von membranbeschichteten Glasfaserröhren
4 enthält und in der die Flüssigkeit von allen diesen Röhren 4 gesammelt wird. Bine
andere Ausführungsform der Erfindung schließt die Verwendung einer Reihe von Halterungen
8 ein, die hintereinander oder parallel oder hintereinander und parallel kombiniert
geschaltet sein können und die Gruppen von beschichteten, hintoreinandergeschalteten
Glasfaserröhren 4 enthalten. Eine weitere Modifikation kann die Verwendung von Kühlschlangen
oder eines Kühlbades einschließen, das die Halterungen 8 umgibt, wodurch Ausbeuteverluste
durch thermische Zersetzung auf ein Minimum herabgesetzt werden, da durch deren
Verwendung bei niedrigerer Temperatur gearbeitet werden kann. Es kann außerdem bei
erhöhten Temperaturen, die unterhalb der Zersetzungstemperaturdes Enzyms liegen,
gearbeitet werden, da colche Temperaturen die Fließgeschwindigkeit durch die Membrane
erhöhen.
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In Fig. II ist ein Querschnitt einer einzigen Halterung 8, die eine
einzige Glasfaserröhre 4 enthält, dargastellt. In dieser Figur wird die äußere Halterung
mit 8 bezeichnet, die durchgedrungene Flüssigkeit, die durch die Membrane 5 und
die Glasfaserröhre 4 hindurchgeflossen ist, wird mit 14 beeeichnet. Die Glasfaserröhre
4 und die durchlässige Membrane 5 umgeben den inneren Raum 15, der vollständig mit
der ursprünglichen Flüssigkeit gefüllt ist,die unter Druck
steht
und die teilweise an niedermolaren 3cstandteilen verarmt ist.
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Die im erfindungsgemäßen Verfahren ala Besohickung verwendete Enzymlösung
braucht nicht aus handelsüblichen oder gereinigten Enzymen hergestellt worden zu
sein. Die ursprüngliche Beschickung kann aus teilweise gereinigten Enzymen oder
aus einer Enzymlösung bestehen, die aus einer früheren Stufe des Herstellungs- oder
Fermentationsverfahrens stammt.
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Beispiel 1o Eine Gesamtmenge von etwa 627 Litern an Fermentationsbrühe
wurde aus dem Stoff hergestellt, der aus einem Fermentationsverfahren, das im wesentlichen
gemäß der USA-Paten-tschrift 3 275 453 durchgeführt worden war, erhalten wurde.
Die Brühe, die das schwach proteolytisch wirkende durch den Fungus Endothia parasitica
produzierte Milchgerinnungsenzym enthielt, wurde dadurch hergestellt, daß man die
rohe Brühe filtrierte, um die groben Stoffe zu entfernen und die filtrierte Brühe
einer 2. Filtrierung durch ein Super-Cel-Diatomeenerdefilter unterzog. Die filtrierte
und geklärte Brühe wurde portionsweise in den Beschickungstank einer Vorrichtung
für umgekehrte Osmose gegeben. Die Vorrichtung für umgekehrte Osmose war im Prinzip
im wesentlichen genauso wie die in Fig. 1 beschriebene Vorrichtung.
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Der Beschickungstank, der gekühlt war, hielt die Brille auf etwa 25
0C. Die Vorrichtung für umgekehrte Osmose bestand aus 35 porösen Glasfaserröhren
mit einem Durchmcsser von etwa 1,27 cm und einer Länge von etwa 2,40 in, die hintereinander
geschaltet waren und einen inneren Obflächenbereich von etwa 3 m aufwiesen. Auf
der inneren Oberfläche jeder der Glasfaserröhren war eine Membrane
aus
einem modifizierten Celluloseacetat aufgebracht durch die Wasser, anorganische Salze
und niedermolekulare organische Verbindungen (unter etwa 500) hindurchgingen, während
wesentliche Mengen von Stoffen mit höherem Molekulargewicht einschließlich des Enzyms
(etwa en Enzym mit Molekulargewichten zwischen 40 000 und 50 000) zurückgehalten
wurden. Einige Enzyme jedoch gingen durch die Membrane hindurch. Bezüglich der Salæzurückhaltungscigenschaften
entsprach die Membrane dem mehr porösen, vorstehend beschriebenen Loeb-Typ und war
nicht speziell zum Zwecke der Reinigung und Konzentrierung von Enzymen hergestellt.
Es war bekannt, daß die Membrane schlechte Salzrückhalteigenschaften besaß. Die
Glasfaserröhren besaßen poröse Wände, so daß jegliche Flüssigkeit und gelöste Stoffe,
die durch die membranbeschichteten Wände hindurchgingen, leicht durch die Wände
der Glasfaserröhren flossen. Die verwendete Einheit, die aus 7 hintereinandergeschalteten
Glasfaserröhren bestand, war durch eine getrennte äußere Rähre gehaltert, in der
die Flüssigkeit, die durch die membranbeschichteten Glasfaserröhren hindurchgegangen
war, gesammelt wurde und aus der die durchgedrungoms Flüssigkeit zur getrennten
Lagerung entfernt wurde. Bei dieser Arbeitsmethode wurden 5 kleine Gefäße verwendet
vor denen jedes aus einem äußeren Rohr bestand, das 7 Glasfaserröhren entkielt.
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Die Brühe wurde durch die Vorrichtung mit einer Geschwindigkeit von
etwa 7S57 Liter pro Minute unter einem Druel von etwa 9,28 bis etwa 13 ritt', der
durch eine Kolbenpumpe erzeugt worden war und durch ein Rückschlagventil aufrochterhalten
wurde gepumpt. Der Druck wurde aus die Innenseite der porösen Glasfaserröhren ausgeübt
und die filtrierte Brille füllte, während sie hindurchflof, diese Röhren vellständis
aue. Die Lösung, die durch die Glasfaserrönren hindurel, @in
oder
hindurchdiffundierte wurde gesammelt, analysiert und verworfen. Der Teil der Lösung,
der nicht durch die membranbeschichtete innere Oberfläche der Glasfaserröhren hindurchging,
wurde in den Beschickungstank zurückgeführt und im Kreislauf durch die Vorrichtung
für die umgekehrte Osmose geführt. Die Konzenbrier- und Kreislaufbehandlung wurde
etwa 8,75 Stunden durchgeführt, wobei sich während dieser Zeit die Durchdringungsgeschwindigkeit
von 2 600 cm3/Min. auf 710 cm3/Min. verringerte. Die Gesamtmenge der Lösung, die
durch die Membrane hindurchdrang, betrug 575 1 und die Gesamtmenge der Lösung, die
nicht durch die Membrane diffundierte, betrug 48,9 1. Die Gesamtmenge an Enzym,
das durch die Membrane hindurchdrang, betrug 9,9 % der Enzymbeschickung und der
Rest des Enzyms in der Vorrichtung betrug 93,4 %. Die Gesamtmenge an anorganischem
Stoff, der in der durchgedrnngenen Lösung vorlag, betrug 87,0 ffi der anorganischen
in der gesamten Beschickungsbrühe vorliegenden Stoffe. Die Potenz an Enzymlösung,
die nicht durch die Membrane hindurchdrüng, war 11,5 x der Potenz an Enzym in der
ursprünglichen Brühe. Die Potenz wurde als Milchgerinnungseinheit (milk clot units@mcu).
nach dem Verfahren von C. A. Ernstrom, J. of Dairy Science, 41, 1664 (1958) bestimmt.
Dieses Verfahren ist dem Fachmann alr Bestimmung der Stärke von Rennet-Präpcaraten
bekannt. Die Endpotenz der zurückgebliebenen Flüssigkeit betrug 17,45 Mill Einheiten/Liter.
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Beispiel 2: Man verfuhr nach dem Verfahren des Beispiels 1 mit der
Abweichung, daß 541 1 der filtrierten und gekehrten Brühe bei einem Druck von 8,79
bis 13,5 atü verwendet wurden. Die Temperatur des Beschickungstanks betrug zwischen
21,6 bis 24,90C: und die Druchdringungsrate während des Versuchs,
der
8 Stunden lang dauerte, verringerte sich von 2.800 cm3/ Minute auf 670 cm inute.
Die Gesamtmenge an Lösung, die durch die Membrane hindurchdrang, betrug 497 1 und
die Gesamtmenge an Bruhe, die nicht durch die Membrane hindurchdiffundierte betrug
44s3 1. Die Gesamtmenge an Enzym, die durch die Membrane hindurchging, betrug 6,8
Vom der Enzymbeschickung und der Rest an Enzym in der Vorrichtung betrug 89,7 %.
Die Gesamtmenge an anorganischem Stoff, der in der durchgedrungenen Lösung vorlag,
betrug 83,5 ß des in der Gesamtbeschickung vorliegenden anorganischen Stoffes.
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Die Potenz der Enzymlösung, die nicht durch die Membrane hindurchdrang,
betrug 9,67 x der Potenz des Enzyms in der ursprünglichen Brühe. Die Eidpotenz in
der zurückgehaltenen Flüssigkeit betrug 15,87 Mil:L. Einheiten/Liter.
-
Beispiel 3. titan verfuhr nach dem Verfahren des Beispiels 1 mit der
Abweichung, dass 1.238 1 der filtrierten Brühe verwendet wurden. Diese Brühe wurde
nicht weiter durch Verwendung eines Diathmeenerdefilters geklärt. Der Druck während
des Versuches, der etwa 28 Std. dauerte, betrug etwa 8,44 bis 19,0 atü,und die Temperatur
des Beschickungstanks betrug zwischen 22,0 und 23w5°C. Die Durchdringungsgeschwindigkeit
während des Versuchs betrug zwischen 2200 cm3/Min. bis 370 cm3 in. Die Gesamtmenge
an Lösung, die durch die Membrane hindurchging, betrug 1.156 Liter und die Gesamtmenge
an Brühe, die nicht durch die Membrane hindurchdiffundierte, betrug 81,8 1. Die
Gesamtmenge an Enzym, das durch die Membrane hindurchging, betrug 2,1 % der Enzymbeschickung
und der Rest des enzymhaltigen Stoffes in der Vorrichtung betrug 1)4,4 . Die Gesamtmenge
an organischem Stoff in der durchgedrungenen Lösung betrug 86,4 ' des organischen
Stoffen
in der gesamten Beschickungsbrühe. Die Potenz der Enzymlösung, die nicht durch die
Membrane hindurchdremg, betrug 12,15 x der Potenz an Enzym in der ursprünglichen
Brühe. Die Endpotenz der zurückgehaltenen Flüssigkeit betrug 24,74 Mill.inheiten/Liter.
-
Beispiel 4: Eine Lösung des durch Bacillus subtilis produzierten proteolytischen
Enzyms wurde dadurch hergestellt, daß man 5,0 g eines Gemischs, das das Enzym und
34,3 fo anorganischer Feststoffe (meistens Natriumsulfat) in soviel destilliertem
Wasser löste, daß man 510 cm3 der Lösung erhielt.
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Die Proteaseaktivität der ursprünglichen Enzymlösung und der anderen,
in diesem Beispiel hergestellten Lösungen wurde nach der nachstehend beschriebenen
Methode bestimmt.
-
Diese Methode, die durch die Royal Netherlands Fermentation Industries,
Ltd. geliefert wurde, wurde zur Bestimmung der Proteaseaktivität, ausgedrückt in
Delft Units (DU), verwendet. Bei der verwendeten Versuchsmethode ließ man das Enzym
auf eine Kaseinlösung einwirken und zwar für eine bestimmte Zeit unter Bedingungen,
die diejenigen simulieren, die bei einem Vorwaschverfahren (für Haushaltwaschzwecke)
unter Verwendung von synthetisch hergestelltem hartem Wasser in Gegenwart von Natriumtripolyphosphat
angewendet werden. Die Reaktion wurde dadurch abgebrochen, daß man das zurückbleibende,
intakte Kasein unter Verwendung einer Trichloressigsäurelösung ausfällte.
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Der Niederschlag wurde entferntlund die Veränderung der optischen
Dichte im Verhältnis zu einer Vergleichsprobe, bei der keine Proteolyse stattfand,
wurde bestimmt.
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Die Veränderung der optischen Dichte, die auf Grund des Vorliegens
von Proteinfraktionen mit Aminosäuren, die einen aromatischen Kern enthalten, in
der Lösung hervorgerufen wird, ist ein Maß für die Enzymaktivität. Eine Proteaseaktivität
von 1 000 DU/g liegt dann vor, wenn 1 cm3 einer 2 %igen Lösung eines Enzympräparates
eine Veränderung der optischen Dichte von 0,400 unter den oben beschriebenen Bedingungen
(Kaseinlösung, synth. hartes Wasser, Gegenwart von Natriumtripolyphosphat) zeigt.
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Genauer beschrieben war das Verfahren folgendermaßen: (1) Folgende
Reagentien wurden hergestellt: Reagens 1 - Eine Lösung aus 130 g CaCl2.6H2O in so
viel destilliertem Wasser, daß 3 000 cm3 erhalten werden.
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Reagens 2 - Eine Lösung aus 42 g MgC12.6H20 in so viel destilliertem
Wasser, daß 3 000 cm3 erhalten werden.
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Reagens 3 - Eine Lösung von 63 g NaHC03 in so viel destilliertem Wasser,
daß 3 000 cm3 erhalten werden.
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Reagens 4 - Synthetisches hartes Leitungswasser hergestellt durch
Mischen in der angegebenen Reihenfolge unter ständigem Rühren von 100 cm3 jeweils
der Reagentien 1, 2 und 3 und 9 700 cm3 destilliertem Wasser.
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Reagens 5 - Eine Lösung aus 36s34 g Tris(hydroxymethyl)-aminomethan,
gelöst in Reagens 4 unter Bildung von 1000 cm3.
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Reagens 6 - Zugabe von 1000 g Natriumtripolyphosphat langsam unter
ständigem Rühren zu 48,5 1 destilliertem Wasser; anschließend Zugabe in folgender
Reihenfolge von 500 cm3 des Reagens 1, 500 cm3 des Reagens 2 und 500 @@@ des Reagens
3 unter ständigem Rühren. Nachdem. die Feststoffe gelöst worden waren, wurde der
pH-'Nert der Lösung unter Verwendung von 10 jiger HO1 auf 8,5 eingestellt. Pic Bestandteile
der Lösung ließ man sich absetzen.
Die Lösung wurde so lauge filtriert,
bis sie klar war.
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Reagens 7 - Eine Lösung von 540 g Trichloressigsäure in so viel destilliertem
Wasser, daß man 3000 cm3 erhielt.
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10 cm3 dieser Lösung wurden unter Verwendung von 21,9 cm3 0,5n NaOH
neutralisiert, wobei Phenolphthalein als Indikator verwendet wurde.
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Reagens 8 - Eine Lösung von QOO g Natriumacetat « 3H2O in so viel
destilliertem Wasser, daß man 3000 cm3 erhielt.
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Das spezifische Gewicht dieser Lösung war 1,1 bei 20°C.
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Reagens 9 - Eine Lösung von 900 cm3 Essigsäure in so viel destilliertem
Wasser, daß man 3000 cm3 erhielt. 2 cm3 wurden unter Verwendung von 20,75 cm3 0,5n
NaOH neutralisiert, wobei Phenolphthalein als Indikator verwendet wurde.
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Reagens 10 - Eine Lösung von 2,5 cm3 eines komplexen Gemischs von
Polyoxyäthylenäther von gemiscltn' Oleinsäurepartialester mit Sorbitanhydriden wurde
in so viel destilliertem Wasser gelöst, daß man 50 cm3 erhält und vor jedem Gebrauch
gerührt.
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Reagens 11 - Folgende Bestandteile wurden in der angegebenen Reihenfolge
mit so viel destilliertem Wasser vermischt, daß man 1000 cm3 erhielt: Jeweils 100
cm3 der Reagentien 7-, 8 und 9 und 4 cm3 des Reagens 10.
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Reagens 12 - Das Kaseinsubstrat wurde dadurch hergestellt, daß man
2,5 1 des Reagens 4 unter Rühren zu 63,0 g Kasein zusetzte, Das Gemisch wurde danach
10 Min. gerührt und das Reagens 5 zugesetzt und dieses Gemisch anschließend weitere
10 Min. gerührt. Der Behälter mit diesem Gemisch
wurde auf einem
Wasserbad von 7000 so lange geruhrt, bis die Temperatur dr Lösung 40°C betrug, wonach
der pH-Wert der Lösung unter Verwendung von in NaOH auf 8,5 eingestellt wurde. Die
Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Reagens 4 auf 3 Liter verdünnt.
Dieses Reagens 12 wurde jeden Tag frisch hergestellt und das Kaseinsubstrat, das
zu späterer Tageszeit verwendet wurde, wurde bis zu seinem Gebrauch im Kühlschrank
aufbewahrt.
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(2) Die zu untersuchende Enzymprobe (fest oder in Lösung) wurde dadurch
hergestellt, daß man den Feststoff löste oder die Lösung verdünnte, in einer Menge
des Reagens 6 ~ , wobei die Mengenanteile so gewählt wurden, daß die Lösung zwischen
20 und 30 DU an Protcase/cm3 enthielt. Der pH-Wert der Lösung wurde unter Verwendung
von in NaOH oder in HOI auf 8,5 eingestellt.
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Die Lösung wurde jeweils innerhalb von 2 Stunden der Verwendung hergestellt.
Die Enzymlösung, eine Menge des Kaseinsubstrats (Reagens 12) und 2 Zentrifugierröhrchen
wurden auf einem Wasserbad von 400C + 0,1°C auf 400C erwärmt. 1 cm3 der Enzymlösung
wurde in ein Sentrifugierröhren pipettiert, 5 cm3 der Substratlösung wurden in das
Röhrchen am Zeitpunkt 0 pipettiert und die Bestandteile des Röhrchens wurden durch
Schütteln gemischt und genau 40 Minuten inkubiert. Am Ende dieses Zeitabschnitts
wurden 5 cm3 des Reagens ii in das Röhrchen pipettiert und durch Quirlen gemischt.
Das Röhrchen wurde weitere 30 Minuten in das Wasserbad gegeben, wodurch der Niederschlag
koagulierte und wurde dann 15 Min. zentrifugiert.
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(3) Ein Blindversuch für jode zu prüfende Enzymlösung wurde durchgoführt,
indem man 5 cm3 des Reagens 11 in das Zentrifugierröhren pipettierte und 1 cm3 der
Enzymlösung und 5 3 des Reagens 12 dem Zentrifugierröhrchen unter Quirlen
zusetzte,
nachdem die ursprünglichen 5 cm3 des Reagens 11 eine Temperatur von 40 °C erreicht
hatten. Das Röhrchen und dessen Inhalt für den Blindversuch wurden 30 Minuten lang
in das Wasserbad gegeben und danach 15 Min. lang zentrifugiert.
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(4) Die optische Dichte der Enzymlösung und der Blindprobe wurden
in einem UV-Spektrophotometer, bezogen auf destilliertes Wasser,. bei 275m/u bestimmt.
Der Unterschied in der optischen Dichte (Testprobe minus Blindprobe) betrug 0,4-0,6.
Bei Versuchen, in denen der Unterschied in der optischen Dichte zu hoch oder zu
niedrig war, warde der Test wiederholt, wobei die anfängliche Verdünnung der Enzymlösung
entsprechend eingestellt wurde.
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(5) Der Unterschied in optischer Dichte war die optische Dichte der
Testprobe minus derjenigen der Blindprobe. Die Zahl der Delfter Einheiten (DU) der
Proteaseaktivität der Proben wurde dadurch erhalten, daß man den Unterschied in
der optischen Dichte mit einer Standardkurve eines Unterschieds der, optischen Dichte
gegen über der Proteaseakti-Die vität verglich/Standardkurve wurde jeden Tag dadurch
erhalten, daß man den Versuch, wie vorstehend beschrieben, bei T-6 Proben durchführte,
die aus der Originalmaxatase Enzymzubereitung hergestellt worden waren. Durch den
Hersteller wurde die ursprüngliche Enzymzubereitung als solche bezeichnet, die eine
Proteaseaktivität von 300 000 DU/g aufweist. Es wurden Lösungen mit verschiedenen
Verdünnungen hergestellt, indem man bestimmte Mengen der Enzymzubereitung abwog
und wurden dann untersucht, um die Standardkurve zu erhalten.
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400 cm3 der Enzymlösung wurden in eine Diafloultrafiltrationszelle
Modell 400 gegeben. Diese Beschickungslösung war hellberr'steinI'arbig, besaß eisen
pH-Wert von7,7, hatte einen Gesamtfeststoffgehalt von 9,1 mg/cm3, zeigte eine Proteaseaktivität
von 2 400 DU/cm3 und besaß eine Konzentration an gelösten anorganischen Stoffen
von 3,14 mg/cm3.
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Die Ultrafiltrationszelle Modell 400 wurde zur Bewertung der Ei-genschaften
einer Diafloultrafiltrationsmembrane XM 50 verwendet. I)ie Zelle selbst bestand
aus einer zylindrischen Röhre, die mit ihrer Vertikalachse an einem Deokel angebracht
war, der mit einem Verschluß versehen war, der ein Druckventil und einen Anschluß
an eine Druckquelle oder ein Resevda enthielt. Der Boden der zylindrischen Röhre
war durch die zu testende Membrane geschlossen, welche durch eine poröse Platte
getragen wurde, Die poröse Tragplatte ihrerseits war auf einer Bodenanordnung angebracht,
die aus einem Sammelgefäß für die Flüssigkeiten bestand, die durch die Membranen
hindurchgingen, und die außerdem eine Auslaßöffnun'g besaß. Der Druck wurde dadurch
erzeugt, daß man die Zelle unter Verwendung von Stickstoff, der durch einen Anschluß,
der mit dem Zellenverschluß verbunden war, zugeführt wurde, unter Druck setzte.
Die Flüssigkeit, die sich in der Ultrafiltrationszelle befand und in Perübrung mit
der Membrane stand, wurde durch eine magnetische Rührvorrichtung* die einen Teil
der Ultrafiltrationszelle darstellte, gemischt.
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Die durchgedrungene Flüssigkeit wurde bei Umgebungsdruck durch die
Auslassöffnung, die an den Sammelbehälter angeschlossen war und die die Membrane
am Boden des offenen Zylinderendes trug, kontinuierlich entfernt. Das Konzentrat
oder die zurückgebliebene Flüssigkeit wurde am Schluß des Versuches von der Zelle
abdecandiert. Alle inneren Metaliteile der Zelle waren mit Polytetrafluoräthylen
beschichtet
und die zylindrische Zellkammer war aus einem Polycarbonatkunststoff hergestellt.
Der Durchmesser der runden Membrane, die der Flüssigkeit ausgesetzt war, betrug
5 cm.
-
Die Ultrafiltrationszelle wurde 250 Min. bei einem Druck von 3,52
atü und einer Temperatur von 3033,2OC betrieben.
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Es wurde eine Gesamtmenge von 358 cm3 einer goldgelben durchgedrungenen
Lösung erhalten. Die durchgedrungene Lösung besaß einen pH-Wert von 7,6, eine Gesamtfeststoffkonzentration
von 7,05 mg/cm3 und eine Proteaseaktivität von 300 DU/cm3. Die Gesamtmenge an Konzentrat
oder zurückgebliebener Lösung betrug 25 cm3, besaß einen pH-Wert von 7,4, eine Gesamtfeststoffkonzentration
von 38,6 mg/cm3 und eine Proteaseaktivität von 23.800 DU/cm3. Das Konzentrat war
dunkelbraun und enthielt einige sichtbare Feststoffe.
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Der Gesamtfeststoffgehalt des Konzentrates wurde als 33 %0 anorganischer
Stoff bestimmt. Die Zelle wurde gewaschen und 25 cm3 des hellgelben Waschwassers
mit einem pH-Wert von 7,6 enthielten 1,75 mg/cm3 an Gesamtfe3tstoffen und besaßen
eine Proteaseaktivität von 400 DU/cm3. Der Rest des Enzymstoffes innerhalb der Ultrafiltrationszelle
betrug 7415 %.
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Die Brauchbarkeit der umgekehrten Osmose wurde dadurch bewiesen, daß
der zurückgebliebene Stoff 595 000 DU oder 62 % der Enzymbeschickung in nur 6,25
% des Volumens der flüssigen Beschickung enthielt. Die Fähigkeit der umgekehrten
Osmosemembrane, das Enzym zu reinigen, wird dadurch bewiesen, daß die in dem zurückbleibenden
Stoff enthalter.eo Feststoffe eine Getamtproteaseaktivität von 615 000 DU/g aufwiesen,
verglichen mit der Gesamtproteaseaktivität der ursprünglichen Enzymzubereitung von
262 000 DU/g. Ferner wurde die Menge an anorganischen Stoffen, die mit dem Enzym
zusammen vorlagen, in der ursprünglichen
Enzymbeschickungslösung
mit 1,31 g/Million DU berechnet, während die anorganischen Stoffe, die zusammen
mit dem zurückgebliebenen Stoff vorkamen, mit nur 0,54 g/Million DU berechnet wurden.
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Die X3I-50 Membrane wurde vom Hersteller als eine solche bezeichnet,
die gelöste Stoffe mit einem Molekulargewicht über 50 000 zurückhält. Eine vergleichbare
Reinigung wird bei Beschickungsdrücken von 2,11 atü unter Verwendung des gleichen
B.subtilis, der oben angewendet wurde, erzielt.
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Beispiel 5 Die Ultrafiltrationszelle Modell 400 wurde mit 300 des
durchgetretenen Anteils von Beispiel 4 beschickt, dann wurde nach dem Verfahren
des Beispiels 4 weitergearbeitet. Die benutzte Membrane war der Typ UM-l, hergestellt
von der Amicon Corporation. Der gleiche Membranendurchmesser wurde benutzt wie in
Beispiel 4. Vom Hersteller wird angegeben, dass die Membrane Typ UM-l gelöste Stoffe
mit Molekulargewichten über 10 000 zurückhält. Die Beschickungslösung hatte einen
pH-Wert von 7,6, einen Gesamtfeststoffgehalt von 7,05 mg/ml und eine Protease-Aktivität
von 300 Delfteinheiten/ml. Die Ultrafiltrationszelle wurde unter einem Druck von
7,61 bis 8,03 kg/ cm2und bei einer Temperatur von 27,80 C bis 29,0 °C während 103
Minuten betrieben.Der durchgetretenen Anteil zeigte einen pH-Wert von 7,0 und eine
Protease-Aktivität von weniger als 25 Delfteinheiten/ml. Das-Konzentrat oder die
zurückgehaltene Lösung betrug insgesamt 24 ml, zeigte einen Feststoffgehalt von
insgesamt 33,9 mg/ml und eine Protease-Aktivität von 3 500 Delfteinheiten/ml. Das
Konzentrat war hell bernsteinfarben. Es wurde ermittelt, dass der Feststoffgesamtgehalt
des Konzentrates 34 %0 anorganisches Material enthielt.
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Die Zelle wurde gewaschen und die 25 ml des farblosen Waschwassers
zeigten einen pH-Wert von 7,2 und eine Protease-Aktivität von weniger als 25 Delfteinheiten/ml.
Der Rest des Enzymmaterials um die Ultrafiltrationszelle betrug 93,1 %.
-
Das zurückgehaltene Material enthielt 84 000 Delfteinheiten insgesamt,
was 93,1 % der Aktivität der Lösung darstellt, mit der die Zelle ursprünglich beschickt
wurde. Diese Enzym aktivität im zurückgehaltenen Anteil war in einem Volumen enthalten,
das lediglich 8,0 des ursprünglichen Flüssigkkeitsvolumens darstellt, mit dem die
Zelle beschickt worden
war. Die in dem zurückgehaltenen Anteil
enthaltenen Feststoffe zeigen eine Protease-Aktivität von insgesamt 103 000 Delfteinheiten/g,
verglichen mit der Protease-Aktivität in der Beschickungslösung von insgesamt 44
000 Delfteinheiten/g. Eine ähnliche Reinigung kann man mit dieser Ausrüstung und
diesem Verfahren erreichen, wenn man die unreine E.parasitica-Lösung benutzt, welche
in Beispiel 1 unter einem Zuflussdruck von ca. 2,1 bis 7,0 kg/cm2 als Beschickung
diente.
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Beispiel 6 Die in Beispiel 4 benutzte Ultrafiltrationszelle odell
400 wurde mit 200 ml einer Lösung von 3,0 g Maxatas Rin 300 ml Wasser beschickt.
Die benutzte Maxatase war das gleiche Enzympräparat,wie in Beispiel 4 beschrieben,
und enthielt 34,3 % anorganisches Material. Bevor die Zelle mit ihr beschickt wurde,
wurde die Lösung durch einen Diatomeenerde-Filter (Super-CEL) filtriert. Dann wurde
nach Beispiel 4 weiter verfahren. Die benutzte Membrane war vom Typ UM-2, hergestellt
von der Amicon Corporation. Der gleiche Membranen durchmesser wie in Beispiel 4
wurde benutzt. Vom Hersteller wird angegeben, dass die Membrane vom Typ UM-2 gelöste
Stoffe mit Molekulargewichten über 1 000 zurückhält. Die Beschickungslösung, welche
bernsteinfarben war, wies einen pH-Wert von 7,9, einen Gesamtfeststoffgehalt von
8,92 mg/ml und eine Protease-Aktivität von 2 500 Delfteinheiten/ml auf.
-
Die Ultrafiltrationszelle wurde unter einem Druck von 7,82 bis 7,89
kg/cm2 und bei einer Temperatur von 29,8 bis 30,2 ° C während 129 Minuten betrieben.
Eine farblose durchgetretene Lösung von insgesamt 150 ml wurde erhalten, sie wies
einen pH-Wert von 6,9 und eine Protease-Aktivität von weniger als 25 Delfteinheiten/ml
auf. Das Konzentrat oder
die zurückgehaltene Lösung betrug insgesamt
47,5 ml, zeigte eine Gesamtfeststoffkonzentration von 25,2 mg/ml und eine Protease-Aktivität
von 11 700 Delfteinheiten/ma. Das Konzentrat, welches einen pH-Wert von 5,6 zeigte,
war dunkelbraun, und etwas festes Material war in ihm zu sehen Der Gesamtfeststoffgehalt
des Konzentrates enthielt 35 % anorganisches Material. Die Zelle wurde gewaschen
und die 25 ml des farblosen Waschwassers vom pH 7,1 zeigten eine Protease-Aktivität
von weniger als 25 Delftainheiten/ml. Der Rest des Enzymmaterials um die Ultrafiltrationszelle
betrug 111,0 .
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Das zurückgehaltene Material enthielt 555 000 Delfteinheiten oder
111,0 % des Enzyms, mit dem die Zelle beschickt worden war, in nur 23,7 % des Volumens
der flüssigen Beschickung.
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Das zurückgehaltene Material zeigte eine Protease-Aktivität von insgesamt
463 000 Delfteinheiten/g, verglichen mit der Gesamtprotease-Aktivitet der ursprünglichen
Enzymlösung (durch Eichen der Beschickung) von 280 000 Delfteinheiten/g.
-
Die Menge an anorganischem Material zusammen mit dem Enzym in der
Originalbeschickungslösung wurde zu 1,31 g/Mill.
-
Delfteinheiten berechnet, während das anorganische Material zusammen
mit dem Material im zurückgehaltenen Anteil zu 0,75 g/Mill. Delfteinheiten berechnet
wurde.
-
Beispiel 7 Die in Beispiel 4 benutzte Ultrafiltrationszelle Modell
400 wurde/250 ml einer Enzymlösung beschickt, welche in einer im wesentlichen gleichen
Weise hergestellt wurde,wie diejsnige, welche für die Herstellung der Ausgangslösung
für Bespiel 6 benutzt wurde. Die Lösung wurde auch in der Weise filtriert, wie die
Ausgangslösung für Beispiel 6. Die benutzte Membrane war eine Celluloseacètat-Membrane
von Typ XF-10 (geliefert von der Firma Desalination Systems, TncO of /mit
Escondido,
California). Der Membranendurchmesser war der gleiche wie in Beispiel 4.
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Danach wurde wie in Beispiel 4 weiter verfahren. Die Beschickungslösung
wies einen pH-Wert von 7,7, einen Gesamtfeststoffgehalt von 8,92 mg/ml und eine
Protease-Aktivität von 2 350 Delfteinheiten/ml auf. Die Ultrafiltrationszelle wurde
unter einem Druck von 7,68 bis 7,89 kg/cm2 und bei einer Temperatur von 29,5 bis
33,80 C während 29 Stunden betrieben. Es wurde eine durchgetretene Lösung von insgesamt
126 ml erhalten. Der durchgetretene Anteil zeigte einen pH-Wert von 6,6 und eine
Protease-Aktivität von 25 Delfteinheiten/ml. Das Konzentrat oder die zurückgehaltene
Lösung betrug 107 ml, zeigte eine Gesamtf,eststoffkonzentration von 17,64 mg/ml
und eine Protease-Aktivität von 5 300 Delfteinheiten/ml, es wies einen pH-Wert von
5,2 auf.
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Es wurde ermittelt, dass der Gesamtfeststoffgehalt des Konzentrats
66 %0 anorganisches Material enthielt. Die Zelle wurde gewaschen und die 24,5 ml
des Waschwassers vom pH 6,4 zeigten eine Protease-Aktivität von 160 Delfteinheiten/
ml. Der Rest des Enzymmaterials um die Ultrafiltrationszelle betrug 97,0 %.
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Das zurückgehaltene Material enthielt 567 000 Delfteinheiten oder
96,8 %0 des Enzyms, mit dem die Zelle beschickt worden war, in 42,8 des Volumens
der flüssigen Beschickung.
-
Das zurückgehaltene Material zeigte eine Protease-Aktivität von insgesamt
303 000 Delfteinheiten/g, verglichen mit der Gesamtprotease-Aktivität der ursprünglichen
Enzymlösung (durch Eichen der Beschickung) von 263 000 Delfteinheiten/g. Das anorganische
Material zusammen mit dem Material in dem zurückgehaltenen Anteil wurde auf 2,18
g/Mill. Delfteinheiten berechnet.
-
Beispiel 8 Wie in Beispiel 1 wurde durch Fermentation mittels E.parasitica
eine Brühe hergestellt gemäss dem USA-Patent 3 275 453, welche ein proteolytisches
Milchgerinnungsenzym 'enthielt.' 420 Liter dieser Brühe wurden nach Filtration unter
einem Einlassdruck von 24,6 bis 25,3 kg/cm2.in der umgekehrten Osmose-Einheit nach
Havens, die in Beispiel 1 beschrieben ist, im Kreislauf geführt, wobei die Celluloseacetat-Membrane
von Beispiel 1 benutzt wurde. Dieses Mal jedoch wurden nur 2 kleine Gefässe mit
7 Rohren, jedes in Serie, benutzt, wobei eine Membranenoberfläche von annähernd
1,21 m2 erhalten wurde. Die Beschickungsbrühe hatte eine Stärke von 2 100 Milchgerinnungseinheiten/ml
und enthielt 2,32 g Gesamtfeststoffe/ml, was einer Stärke an Feststoffen von 90
800 Milchgerinnungseinheiten entspricht. Nach 30 Stunden wurden 13 Liter der zurückgehaltenen
Flüssigkeit sufgefangen, welche eine Stärke von 60 270 Milchgerinnungseinheiten
(milk clot units) / ml und' einen Gesamtfeststoffgehalt von 15,61 g/100 ml aufwiesen,
was 386 100 Milchgerinnungseinheiten/g entspricht und 88,8 %0 Wiedergewinn der eingeführten
Aktivität darstellt.
-
Dieses erste Konzentrat wurde mit Wasser auf 99 Liter wieder verdünnt
und einer zweiten Konzentrierung bei 24,6 bis 25s3 kg/cm2 in der umgekehrten Osmose-Einheit
unterworfen. Der letzte zurückgehaltene Anteil hatte ein Volumen von 17 Litern,
eine Stärke von 43 705 Milchgerinnungseinheiten/ml und einen Gesamtfeststoffgehalt
von 8,56 g/100 ml, was 510 000 Milchgerinnungseinheiten/g und einem Wiedergewinn
von insgesamt 84R5 ffi der Aktivität in der ursprünglich8eiltrierten Brühe entspricht.
Das zweimalig durchgelaufene Konzentrat wurde auf dem Filter geschäumt (filter -
sparkled) und der Kuchen mit Wasser gewaschen, wobei ein Endkonzentrat erhalten
wurde, welches
37 367 Milchgerinnungseinheiten/ml und 6,88 g/100
ml Gesamtfeststoffe enthielt, was 542 000 Mìlchgerinnungseinheiten/g entspricht.
Ein Teil dieses Konzentrates wurde zu einem braunen, nicht hygroskopischen freifliessenden
Pulver in einem- Bowen-Laborsprühtrockner getrocknet, welcher einen Durchmesser
von 76,2 cm, und eine ca. 76 cm hohe Trockenkammer aufwies, unter Zerstäubung durch
eine Sektorenscheibe bei 40 000 U/min. bei einer durchschnittlichen Zuflussgeschwindigkeit
von 70 ml/min, und einer Einlasslufttemperatur von ca. 1600 C. Eine Beschickung
von 1 416 ml eines flüssigen Konzentrates lieferte 86 g eines trockenen Pulvers,
welches eine Stärke von 425 000 Milchgerinnungseinheiten/g hatte, entsprechend einem
Wiedergewinn von 78,4 % der Aktivität gegenüber der Trocknungsstufe, bezogen auf
die Stärke der Feststoffe. Eine zweite E. parasitica-Fermentationsbrüho wurde filtriert,
unter Vakuum bei 25 bis 350 C eingedampft und geschäumt (sparkled), wobei ein Konzentrat
erhalten wurde, welches 14 800 Milchgerinnungseinheiten/ml und 0,2958 g/ml Gesamtfeststoffe
enthielt, entsprechend 50 000 Xilchgerinnungseinheiten/g.
-
Der Aktivitätswiedergewinn gegenüber der Konzentraticnsstufe war 83,5
%. 3 Teile zu je 1 Liter dieses gonzentrates wurden in dem zuvor beschriebenen Bowen-Sprühtrockner
zu hellgelben hygroskopischen Pulvern getrocknet, wobei folgende Ergebnisse erhalten
wurden:
Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3 Einlasstemperatur (°C) ca.
163 177 ca. 191 Produktgewicht (g) 101 131 136 Produkteichung (Milongerinnungseinheiten/g)
5970 4870 912 Ausbeute, bezogen auf die Feststoffstärke (%) 11,9 997 1,8 Beispiel
9 Einc wässerige Lösung des proteolytischen Enzyms, produziert von B. subtilis,
geeicht auf 15 600 Delfeinheiten/ml, wie beschrieben in Beispiel 4, 31,94 mg/ml
Gesamtfeststoffe und 9,86 mg/ml sulfatierte Asche2 wurde in 3 Teile geteilt: Teil
A wurde auf etwa 1/5 des Volumens bei 25 bis 300 C unter Vakuum eingedampft, wobei
ein Konzentrat erhalten wurde, welches eine Stärke von 80 00O Delft'einheiten/ml
aufwies und 157,11 mg/ml Gesamtfeststoffe enthielt.
-
Teil B wurde durch umgekehrte Osmose, wie in Beispiel 1 beschrieben,
auf angenähert das 10-faehe konzentriert, wobei die Membrane und die Vorrichtung
von Beispiel 1 benutzt wurde und der Kreislauf bei etwa 17,6 kg/cm2 durchgeführt
wurde. Es wurde ein Konzentrat erhalten, welches eine Stärke von 93 740 Delfteinheiten/ml
aufwies und 87,37 mg/ml Gesamtfeststoffe enthielt.
-
Teil C stellt ein Teil des Konzentrats des Teils B dar, verdünnt auf
die halbe Stärke mit Wasser und,wie zuvor beschrieben, wiederkonzentriert in der
umgekehrten Osmoseeinheit; hierbei wurde ein Konzentrat erhalten, welches eine Stärke
von 163 700 Delfteinheiten/ml aufwies und 93,51 mg/ml Gesamtfeststoffe enthielt.
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Teile von 1 Liter jeder dieser 3 Konzentrate wurden in dem Bowen-Laborsprühtrockner,
welcher im vorhergehenden Beispiel beschrieben wurde, zu hellgelben bis hellbraunen
Pulvern getrocknet, wobei eine durchschnittliche Zuflussgeschwindigkeit von 50 ml/min.
und eine Luftstromgeschwindigkeit von 6,37 m3/min. (geschlossene Öffnungen) eingehalten
wurde.
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Hierbei wurden folgende Ergebnisse erhalten: Getrocknetes Produkt
Versuch Be- 3inlass- Gewicht Flüch- Delft- Ausschickg. trocknungs- (g) tige einhei-
beute temp. (°C) Bestand- ten/mg (%) teile(%) (b) 1 A 149 - (a) -2 A ca.l57 - (a)
- - -3 A ca.l77 10 ~ 6 1,2 4 B ca.l46 81 16,00 925 102,2 5 B ca.l63 85 13,27 760
81,5 6 B ca.171 80 12,64 360 38,4 7 C ca.l50 91 8,81 1480 9295 8 C ca.163 90 6,84
1473 90,2 9 C ca.l79 - 83 7,15 1419 87,3 (a) Keine Feststoffe wiedergewinnbar (b)
Berechnet als Verhältnis der Stärke der Feststoffe des Produkts (korrigiert bezgl.
der flüchtigen Bestandteile) zu der Feststoffstärke der Beschickung; z.B. für Versuch
50 760 x 100 x 87,37 x 100 = 81,5 ffi 100-13,27 93,740
Beispiel
10 Dieser Versuch wurde mit dem System der umgekehrten Osmose durchgeführt, welches
von der American Standard Inc. of New Brunswick, New Jersey geliefert worden war.
Es bestand aus zwei kleinen Gefässen vom Typ TM-5-14, wobei jedes mit 14 fiberglasverstärkten
Epoxyrohren einer Länge von annähernd 1,52 m und einem Innendurchmesser von 1,27
cm versehen war, ausgestattet mit insgesamt etwa 1,69 m2 Celluloseacetat-Membranen,
welche durch eine- zurückgehaltene Salzmenge von 2 - 3 gekennzeichnet waren. Dieses
ist ein System mit einmaligem Durchlauf, ohne Kreislauf. Wässeriges B. subtilis-proteolytisches
Enzym wie in Beispiel 9 wurde eingeführt bei einem Druck von 70,3 kg/cm2, und bei
diesem gleichen Druck wurden 3 zusätzliche Durchläufc ausgeführt.
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Hierbei war die Beschickung eines jeden der späteren Durchläufe der
zurückgehaltene Anteil oder das Konzentrat von dem unmittelbar vorhergehenden Durchlauf.
Folgende Ergebnisse wurden erhalten: Stärke, Gesamt- Sulfa- Reduzie-(Delftein- feststoffe,
tierte rende heiten/com) (Gew.%/Vol.) Asche Zucker (Gew.%/ (Gew.%/ Vol.) Vol.) Durch-
Beschickg. 14,800 4,89 1,27 0,756 lauf I durchgetretoner Anteil 0 1,72 0,58 0,356
Konzentrat 28,200 7,63 1,57 1,10 Durch- durchgetrelauf II toner Anteil 200 3,12
lsOO 0,53 Konzentrat 49,000 11,34 2,25 1,64 Durch- durchgetrelauf III tener Anteil
0 3,10 1,24 0,62 Konzentrat 69,000 16,5 2,77 2,075 Durch- durchgetrelauf IV tener
Anteil 900 3,84 1,17 0,77 Konzentrat 98,000 20,3 2,80 2,5
Auf diese
Weise wurde die Reinheit von 303 auf 483 Delfteinheiten/mg erhöht, unter vernachlässigbarem
Verlust an durchgetretenem Anteil. Eine ähnliche Reinigung kann beispielsweise erreicht
werden bei einem Zuflussdruck von 52,7 kg/cm2, ebenso wie mit der E. parasitica-Beschickung
des Beispiels 1.