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Reagenzgemisch für die Zubereitung von Nährböden zur Kultivation von
Bakterien Die Erfindung betrifft ein Reagenzgemisch für die Zubereitung von Nährböden
zur Bakterienkultivation9 inebeeondere zur Kultivation von Bakterien aus Blut und
anderen Körperflüssigkeiten oder aua menschlichen und tierischen Exkreten
in ea®nheit von Blut.
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Bakterien aus Blut und anderen Körperflüssigkeiten kultivierte man
bisher in der Regel in möglichst höchstuniversellen Nährböden von hoher pfindliohkeit,
um auch geringe Bakterienmengen vermehren zu können. Nachteilig erscheinen diese
Nährböden dadurch, _daß Ihre Zubmroitung kompliziert ist, daß sie bei. der Handhabur4
und Verwendung
empfindlich sind, und schließlich dadurch, daß sie
sehr teuer sind, so da13 ihre Verwendung praktisch nur in einer-spezialisierten
Fabrik in Frage kommt. Die für Routine-Laboratorien mit Rücksicht auf den Preis
zugänglichen Böden entsprechen meistens nicht vollkommen den zu stellenden Ansprüchen.
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Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzgemisch, das sich in Anwesenheit
von Blut und gegebenenfalls einer weiteren Körperflüssigkeit oder eines Exkrete
zur Zubereitung von billigen Nährböden für die Bakteri.enkkultivation eignet.
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Die aus dem Reagenzgemisch erfindungsgemäß zubereiteten Nährböden
können sowohl zur Kultivation von im Blut oder in einer anderen Körperflüssigkeit,
die eine Komponente des Mrbodena bildet, enthaltenen Bakterien, als auch zur Kultivation
von zwecks Vermehrung in Böden eingeimpften Bakterien verwendet werden.
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Des Reagenzgesch für die Zubereitung von Böden in Änwesenheit von
Baut ist erfindungagemU dadurch charakterisiert, daß es y
bin 18 Gewichtsteile Ionenaustauscher, vorzugsweise auf Styralbaeis,
in der U#--Form, gegebenenfalls mindestens ein Gerichtsteil Ionerau®tauscher
auf Styrolbasia in der Yg++-Form und 1 bis t® Gewiehteteiae Zitrat-Anion enthält,
jeweils bezogen auf die Gewichtsmenge von 0607l--.
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Das. Gemisch der oben artgeführten Komponenten kann. ferner
als
Zusatz eine unlösliche Substanz in körniger
oder kleinstöckiger Form
enthalten, insbesondere Glas-
perlen oder Glasschotter,
die als Antükoagulationamittel wirkt. Die Gewichtsmenge dieser Substanz
kann größer sein als des Gesamtgewicht aller Gemischkomponenten:
Bei der Zubereitung von Iffährbüden wird das Reegenzgemisch
erfindungegezU mit Blut, insbesondere defibriviertem, und gegebenenfalls
mit einer weiteren ]örperflüssigkelt bzw. einemret versetzt, und zwar
in
einem Volumenverhältnis von 1 Teil Miaahung zu 10 bin
60
Teilen Blut, einschließlich einer weiteren Körperflüssigkei.t. Um
die Buepensionnbildung au beschleunigen, kann man 129J1 lfsungsmittel,
z.B. Bassar, zu-
setzen. Da. es für die Bakterienvermehrung günstig
iat, wenn der Wshrboden einen pH-Wert von 590 bis 695 auf-
weist,
kann der 1 Teil Pufferlösung zagesetzt werden.
Ein
aus den ertindungegemäßen Reagenzgemisch, Blut und
gegebenentalle einer
weiteren Kürperflfseigkeit bestehender Währboden i$t praktisch ein universellen
1Cultvstionnmedium und eignet sieh zum Vernehren von torobeu Bakterien, 4.h.
Organsamn, die zu= Wachgen einen erhöh-
ten 002-Dmmk benötse%
weil infolge Zersetzung von
Blutbioarbonat C02 in geMgender Menge
entsteht. Unter
geeigneten Bedifnngen, :.B. durch hermetischen Verschließen
des Gefäßes mit den'Bährboden, ist das Reagenzgemlach auch
mm lerashrten von anaeroben lfkroorganianen Seeignet. Diabei ist
die Ampfindlchke""it des Näh=bodens aus -durch. den Ionemastanecher
aufbereitet« Blut als
Kultivationamedium größer als die der übrien
allgemein verwendeten Böden. Die üblichen flübsigen Nährböden müssen unter streng
eingehaltenen Bedingungen, z.B. bei einer Temperatur von +40C u.a.,'gehalten werden,
und ihre Verwendbarkeit hängt von der Bxpirationsdauer.ab, die einige Tage, ausnahmsweise
einige Wochen beträgt und bei flüssigen Nährböden niemals zwei Jahre überschreitet.
Demgegenäber kann das erfindungsgemäße Reagenzgemisch bei Raumtemperatur unbeschränkt
lange aufbewahrt werden, weil seine Komponenten erst beim Kontakt mit Blut zu gegenseitiger
Wechselwirkung gelangen, und der Nährboden kann unmittelbar-vor seiner Verwendung
hergestellt werden. Beim Versetzen des Reagenzgemisches mit Blut entsteht ein flüssiger
Vermehrungsboden,durch Zugabe von #gar oder durch Gerinnung des Blutes, z.B. durch
Nrwärmung, ein fester Boden. Sobald das erfindungsgemäße Reagenzgemisch im Blut
suspendiert wird, beginnt die Wirkung des Ionenaustaus-chers in der BA-Form und
des Zitratanions auf das Blut, welche die bakterizide Wirkung des Blutserums eliminieren.
Durch Einwirken des Ionenaustauschers in der H+-form wird nämlich das nötige Ansäuern
des Blutes herbeigeführt, wobei das Zitratanion die Mg++-Ionen des Blutaerums
bindet, welche die Vermehrung der Bakterien behindern. Im Nährboden können sich
also gramnegative Bakterien vermehren. Wenn man auch grampositive Bakterien kultivieren
will, missen durch Zugabe eines Ionenau.stauschers in der Mg++-Yorm dem Boden
*g++-Ionen zuge-geben werden, die das Vermehren von grampositisen
Bak-
terien bedingen. Nicht einmal die Zugabe eines über-Schusses an
Ionenaustauscher in der X«++-]form kann das
Wachstum der
kramnegativen Bakterien behindern, weil bei saurer Blutreai-:tion die Wg++-Ionen
des Ionenaustauschers in der 1%++-Form die bakterizide Fähigkeit des Blutserums
nicht wiederherstellen können. Da in diesem Fall das :@itratanion nicht als Antikoaulationsmittel
wirkt, ist es vorteilhaft, die Blutkoagulation zu verhindern. Diesem Zwecidient
die unlösliche, im, Reagenzgemisch enthaltene Schüttsubstanz, z.D. Glasperlen oder
Glasschotter, mit denen die Lösung durchgeschüttelt wird. Damit die Resultate der
bakteriologischen Versuche vergleichbar sind, ist es vorteilhaft, sowohl
bei der Zubereitung des Nährbodens als auch bei seiner Verwendung eine standardisierte
Arbeitsweise anzuwenden. Aus diesem
Grund ist es angebracht, Gefäße von Standardgröße,
z.8. Glas,efäße von 20 oder 5 ml Passungsvermögen,zu verwenden
und zum Reagenz&emisch
1(? oder 20 m1 Blut und gegebenenfalls weitere Körperflüssigkeit sle Standardvolumen
zuzusetzen. Zwecks Feststellung der nötigen Menge einzelner gemiachkonponenten
Jet ihre fähigkett, Zonen &ussutaueahen, zu berücksichtigen,
die bei einzelnen Rohstoffen verschieden ist. Bei dar Zubereitung
des Reaggnzgemaohee maß man deshalb zuerst laborverrucbe darohführen,
um die
Qualität der Rohstoffe festzustellen, und nach deren Rom aultat
wird dann dar quantitative Verhdltnie der Zogponum ten im
Gemisch bestimmt.
Die Versuche werden derart durchgeführt,
daß man zuerst mit dem lonenaustauscrer in der H+-Form eine Blutprobe ansäuert und
die Intensität der Aassäuerung feststellt.
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Da bei der ZubLreitung des Nährbodens ein Standardvolumen von 10 bzw.
20 ml Blut dem Gemisch zugesetzt wird, wird aufgrund der erreichten Ansäuerungsatufe
des Blutes eine Menge an Ionenaustauscher berechnet, deren Zugabe zum Standardvolumen
des frisch abgenommenen Blutes dessen pH-Wert auf 5,0 bis 6,5 bringt und ihn in
diesen Grenzen etwa eine Stunde lang aufrechthält. Die auf diese Weise berechnete
Menge des Ionenaurtauschers in der tl--FOTm beträgt meistens 100 bis 400
mg/10 ml Blut.
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In ähnlicher Weine Wird auch die benötigte lindestmenge
des Ionenauatauschers in der lög++-form festgestellt,
die durch
Beginn des Wachstums der grampositiven Bakterien bestimmt ist. Die Menge an Ionenaustauscher
in der Ng++-Form betrKgt meistens 25 bis 100 mg/10 ml Blut, ein etwaiger
Überschuß beeinträchtigt jedoch die Kultivation von Bakterien nicht.
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Die Menge der das Zitrat-Anion enthaltenden Komponente, mit
Vorteil den Natriumsitraten, ist durch die Menge der
1 ++-Ionen
iM Blutserum, die das Zitratanion binden soll,
bentimmt und betrege meie@ens-etwa
140 mg Natriumeitrat/ 10 a1 Blut. Xaa kann in analoge=
Weise auch Uliumsitrat, lmmoniuluitrat oder Zitronsaläure verwenden.
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Nach feUtetellung den litagen@rerhä,ltnssee
der einzelnen Gemiaohhomponeaten wird du Gesieoh aus lonenaustausoh«
und dag: Zitrat in ein 20 oder 50 ml fasendes aem
gebracht,
wonach gegebenenfalls Glasperlen oder Glasschotter mit einer bevorzugten Korngröße
von 1 bis 4 mm zugegeben werden. De.s hermetisch verechlossene Gefäß wird sterilisiert,
womit das Gemisch für die Blutzugabe vorbereitet ist.
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Auf dem bakteriologischen Arbeitsplatz, wo die Kultivation von Bakterien
durchgeführt werden soll, setzt man dann der Mischun6 im derärt vorbereiteten Gefäß
10 oder 20 ml Blut zu, das durch 3 bis 5 Minuten dauerndes Durchschütteln defibriniert
wird. Gleichzeitig oder separat kann man 1 ml Wasser zusetzen, das die Suspensionsbildung
beschleunigt, oder eine Pufferlösung zur Stabilisierung des pH-Wertes. Ausser Blut
können dem Reagenzgemisch andere Körperflüssigkeiten, z.B. die cerebrospinale Flüesigkeit,
Harn oder Funktionsflüssigkeiten, deren Bakterien kultiviert werden sollen, zugesetzt
werden. Die Mengen an Blut und an weiteren Plüssi-keiten werden dabei addiert. Das
erfindungsgemäße Reagenzgemisch für die Zubereitung von Nährböden zur Bakterienkultivation
in Anwesenheit von Blut kann sowohl im Iabormaßstab als auch großtechnisch angewendet
werden, z.B. in der pharmazeutischen oder Bebenamittelindustrie für sämtliche
Zwecke der
Routine- und E=perimentalarbeit.
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Die Zubereitung und Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenzgemisches
wird in folgenden Beispielen erläutert.
B e i s p i e 1 1s
In ein 20 ml fassendes Gefäß wird ein trockenes Gemisch folgender vusammensetzung
gebracht:
| Ionenaustauscher auf Styrol-Basis |
| in der H+-Form 350 mg |
| Ionenaustauscher auf Styrol-Basis |
| in der Ng++-Form 100 mg |
| Natriumzitrat 100 mg |
| Glasperlen 5 500 mg . |
Das
hermetisch verschlossene Gefäß wird 20 kinuten lang in
einem Autoklaven
bei einer Temperatur von 1200C
sterilisiert. Dann
werden dem Gemisch
10 m1
frisches
Blut zugesetzt: Das
Gefäß mit
dem Gemisch
wird nachher
4 Idinuten lang durchgeschüttelt
und anschließend
in den
lutoklaven
gelegt, wo dann
die Kultivation
der Blut-
bakterien verläuft.
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B e i s.p i
e 1 2:
In
ein 20 ml fassendes Gefäß
wird ein Gemisch folgender
Zusammensetzung
gebracht:
| Ionenaustauscher auf Styrol-Baeie |
| in der e-forn 700 mg |
| Ionenaustauscher auf Styrol-Basis |
| in der Ng++-Yorm |
| 150 |
| Natriumzitrat (10 Gew.%ige Lösung |
| in Wasser) 1 ml |
Das hermetisch verschlossene Gefäß wird 20 kinuten lang bei 124°C
sterilisiert. Zu dem so er:altenen Gemisch im Gefäß werden e ml steriles Blut und-2
ml cerebrospinale Flüssigkeit zugesetzt. Dann wird das Gefäß in einen Inkubator
gestellt, wo die bultivation von Bakterien aus der cerebrospirlalen Flüssigkeit
verläuft.