DE1617914A1

DE1617914A1 - Verfahren zur herstellung eines konzentrats eines bifidogenen faktors

Info

Publication number: DE1617914A1
Application number: DE19671617914
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: Nestle SA
Current assignee: Nestle SA
Priority date: 1966-01-18
Filing date: 1967-01-16
Publication date: 1973-04-12
Also published as: US3556801A; CH453052A; IT990479B; NL6700652A; BE692104A; ES336219A1; AT276631B

Description

Ursina AG, Konolfingen (Bern, Schweiz)

Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats eines bifidogenen Faktors

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines bifidogenen Faktors, genannt "Bifidus 2" (BF2) mit erhöhter Aktivität. Es ist seit Tissier bekannt, dass der Mikrooganismus Bifidus (Synonymat Bifidibacteriumbifidum, Lactobacillus bifidus, Actinobacterium bifidum) vorwiegend im Verdauungstrakt von Säuglingen vorkommt. Im Stuhl von mit Muttermilch ernährten Säuglingen stellt der Lactobacillus bifidus 90 # der die Darmflora ausmachenden Bakterien dar. Beim Uebergang von der Ernährung mit Müttermilch auf

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normale Milchnahrung erfolgt eine totale Veränderung der Barmflora. Der Lactobacillus bifidus stellt danach, falls er nicht vollständig verschwindet, nur noch einen kleinen Anteil der Bakterien der Darmflora des mit Kuhmilch ernährten Kleinkindes und einen noch geringeren Anteil bei dem mit Mischkost ernährten Kind und den Erwachsenen dar. Man versucht seit längerer Zeit, die Zusammensetzung der ^ Nahrung von Säuglingen, die nicht mit Muttermilch ernährt werden, derart zu ändern, dass der Lactobacillus bifidus im Darminhalt verbleibt. Zusammensetzungen der Nahrung, die dies ermöglichen, werden als bifidogen bezeichnet. Man kann eine solche "bif idogene Nahrung erreichen durch :

1) Nahrungszusätze, deren Wirkungsmechanismus unbekannt ist,

2) Zusätze von Wachstumsfaktoren zur Kuhmilch, die vom Lactobacillus bifidus benötigt werden.

Unter die erstgenannte Gruppe fällt das Verfahren von Petuely, das in einer Erhöhung des Verhältnisses Lactose/Protein und dem Zusatz von Lactuloae besteht. In vitro wird dadurch keine Wirkung auf den Lactobacillus bifidus erzielt.

Um die zweitgenannte Möglichkeit zu realisieren, muss man die Wachstumsfaktoren, deren der Lactobacillus bifidus bedarf, kennen.

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Bestimmte Mutanten benötigen einen Paktot

■ - · .en --"--. (Faktor Bifidus 1), dessen Funktion^durch eine Heine von Derivaten des N-Acetylglucosamins erfüllt werden können, insbesondere durch das AjO-Galactösidyl-N-acetyl-glucösamin und die ß-Alkyl-N-acetyl-glucosaminide. Es wird angenommen, dass diese ti Phktor eine nicht identifizierte Lücke in der Kette von Reaktionen ausfüllt, welche die Synthese des Mucopeptids der Magen- und Darmwand erlauben. Von Raynaud (J

wurde gezeigt, dass nahezu sämtliche aus dem Darminhalt des Säuglings isolierbaren Bakterienstämme diesen Paktor nicht benötigen, jedoch andererseits nur in Gegenwart einer andern Substanz, die von Raynaud als "Bifidus 2" bezeichnet wurde, wachsen. Das Vorliegen dfeses Paktors konnte exakt bestätigt werden. In einem Nährmedium, das verschiedene Aminosäuren, p-Aminobenzoesäure, Biotin und Calciumpantothenat enthält, wächst dar Lactobacillus bifidus nur,falls man ein Präparat enthaltend den Paktor Bifidus 2 zusetzt. Das Wachstum ist '

daher in einem bestimmten Bereich der Menge an zugesetztem Paktor Bifidus 2 proportional.

Das verwendete Kährmedium hatte folgende Zusammensetzung j

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Asparagin 5 g

Aminosäuren, erhalten durch saure Hydrolyse

von Casein ( Casamino-säuren DIPCO) 10 g

Cystin 0,200 g

Lactose 10 g

Na-acetat.6H₂0 5 g

MgSO₄.7H₂O 0,5g

Na₂HPO₄.12H₂O 2,33 s

KH₂PO₄ 0,90 g

p-Amino b enzoesäure 1 mg

Biotin 0,010 mg

Ca-pantothenat 1 mg

H₂O q.s. ad 500 ml

pH = 6,4.

Man verwendet 2,5 ml dieses Mediums und ein standardisiertes Impfmaterial, wobei man ein Gesamtvolumen von 5 ml erhält. Eine Einheit BP 2 entspricht der Menge, die nach 5 Tagen anaerober Züchtung bei 38 C zum Wachstum derjenigen Menge an Keimen führt, die zur Bildung einer solchen Säurenmenge führen (Essigsäure und Milchsäure), die ein ml n/10 Säure pro Teströhrchen mit 5 ml Inhalt entspricht. Auf diese Weise wurde festgestellt, dass der Paktor BP2 mit keinem andern der bisher bekannten Wachstumsfaktoren identisch ist. Er kann ins-

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"besondere durch kein. Purin (Adenin, Guanin, Hypoxanthin), ferner auch nicht durch streptogenin-reiche Präparate ersetzt werden.

Man hat festgestellt, dass der Paktor BF2 je nach den Versuchsbedingungen in Enzymhydrolysäten von Proteinen, insbesondere von Casein in verschiedenen Mengen vorliegt. Bs war möglich, BF2-reiche Enzymhydrolysate mit 5000 bis 20000 Einheiten BF2 pro Gramm herzustellen. Mit diesen Präparaten wurde bei Versuchen an Säuglingen festgestellt, dass die Zugabe des Faktors BF2 zu einer bifidogenen Nahrung die Menge an Lactobacillus bifidus im Stuhl wesentlich erhöht. Bei ausreichenden Mengen an BF2 stellte der Lactobacillus bifidus 40 bis 95 $ der Bakterien im Darm dar.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von BF2-reichen Präparaten. Das bisher reinste Produkt, das hergestellt wurde, enthielt 3.000.000 Einheiten BF2 pro Gramm und ist peptidartig.

Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man ein den Faktor BF2 enthaltendes Protein-hydrolysat mindestens zweimal an einem Ionenaustauscherharz oder Dextrangel chromatographiert.

Die Durchführung der ersten Chromatographierung kann beispielsweise mit "Dowex" 50 X 4 (Korngrösse 0,15 bis 0,3 mm) in der Säureform erfolgen.

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Dabei löst man 100 g Proteinhydrolysat, das den Paktor BF2 enthält, in In Schwefelsäure (beispielsweise 100 g in 1000 ml). Eine gegebenenfalls vorhandene unlösliche Fraktion wird abfiltriert. Die klare Lösung wird auf eine mit DOWEX 50 X 2 (Teilchengrösse 0,3 bis 0,15 mm) gefüllte Kolonne aufgegeben, wobei beispielsweise mit einer Säule mit 2,5 cm Durchmesser, 35 cm Höhe, die mit 600 g Harz gefüllt ist, gearbeitet werden kann. Die die Säule unarisorbiert durchlaufende Fraktion wird verworfen. Die vom Harz adsorbierte Fraktion wird zunächst mit einer 2n-Ammoniaklösung, dann mit Wasser eluiert (beispielsweise 1000 ml Ammoniak, 1000 ml Wasser). Diese Fraktion wird sodann im vakuum eingeengt, wobei der grösste Teil des Ammoniaks entfernt wird.

Eine zweite Chromatographierung kann mit "Amberlite" IRC-50 (Teilchengrösse 0,3 bis 0,15 mm) erfolgen, wobei beispielsweise wiederum eine Kolonne von 2,5 x 35 cm, gefüllt mit 500 g des Harzes verwendet werden kann. Das Harz wurde vorher mit 0,1 molarer Ammoniumacetatlösung vom pH 4,7 gepuffert.Die bei der ersten Chromatographierung erhaltene eingeengte Lösung wird dann auf die zweite Kolonne aufgegeben, und man fängt die nicht adsorbierte Fraktion auf. Die Eluierung wird durch Ammoniumacetat-Pufferlösung vorgenommen. Die nicht adsorbierte Fraktion wie auch das Eluat

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werden im Vacuum eingedampft und durch Sublimation im Vacuum oder LyophiXisierung getrocknet. Das so erhaltene Produkt wird im folgenden als Fraktion N bezeichnet. In obigem Beispiel betrug die der Kolonne aufgegebene Lösung aus der ersten Chromatographierung 1000 ml, Ferner wurde mit 1000 ml

Ammonder^äJ^phosphat-Pufferlösung eluiert. Der Gehalt der Fraktion N

an BF2~Einheiten pro Gramm lag bei 20.000 bis 25.000. Die

Fraktion umfasst 12 bis 16% des ursprünglichen Proteinhydroly- ™

sats. Die Fraktion N kann als halbreines Präparat von BF2 bereits in Säuglingsnährmitteln verwendet werden.

Eine stärkere Xonzentrierung des Faktors BF2 kann wie folgt vorgenommen werden : Man chromatographiert weiter UÄBIM* an DOWEX 50 Ii X 2 (Teilchengröße 0,075 bis 0,037 mm). Für eine Lösung von 2 g der Fraktion N in 100 ml Wasser kann man z.B. 750 g dieses Harzes in einer Kolonne von 2,5 x 15 cm verwenden. Das Harz wird zunächst mit 0,2-molarer

Ammoniumacetat-Pufferlösung vom pH 5,46 behandelt. Die '

iluierung erfolgt mit der gleichen Pufferlösung, die mit konstanter Geschwindigkeit durch die Säule geführt wird (beispielsweise 120 ml/Std,}. Die den Faktor BF2 enthaltende Eluatfraktion wird aufgefangen. In obigem Beispiel tritt sie zwischen 3200 und 7500 ml auf.

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Die erhaltene Lösung wird im Vakuum eingeengt und durch Sublimation oder Lyophilisierung getrocknet. Bei den günstigsten Verfahrensbedingungen erhält man auf 100 Teile Ausgangshydrolysat 0,56 Teile Produkt mit 28 # der BF2-Aktivität. Das Produkt enthält 500.000 BF2-Einheiten pro Gramm.

Gemäss einer andern Verfahrensweise wird das Produkt N in möglichst konzentrierter wässriger Lösung (beispielsweise 20 mg pro ml) durch Dextrangel (z.B. Sephadex öpr) filtriert, Dabei wird die nicht festgehaltene Fraktion aufgefangen, die fast den gesamten Faktor BF2 (Ausbeute 90 bis 100$) enthält und eine Aktivität von 25.000 bis 50.000 Einheiten pro Gramm aufweist. (Fraktion N₁₃). Diese Fraktion kann als bifid ©genes Präparat verwendet werden.

Gemäss einer weiteren VerfahrensVariante wird die Fraktion N (oder auch die Fraktion N^) an DOWEX 1X2 chromatographiert.

Die Eluierung erfolgt mit Pyridinacetat oder Collidinacetat, das steigende Mengen Essigsäure enthält. Die eluierten Produkte werden durch die Ninhydrin-Reaktion identifiziert. Sie erscheinen als Serie von insgesamt ca. 20 Ikxima. Die Anzahl der Maxima variiert je nach der Art desbei der Herstellung der Fraktion N (oder N_Q) verwendeten Hydrolysats.

Die BF2-angereicherte Fraktion entspricht einem einzigen dieser Maxima.

Beispiel:

Es wurde mit einer Kolonne von 150 cm Länge,

2 cm Durchmesser, gefüllt mit DOKEX 1X2 bei 35°C gearbeitet.' Durchsatz durch die Kolonne : 40 ml/Std; Grosse der aufgefangenen Fraktionen: 10 ml.

Man eluiert zunächst mit l^iger Pyridinacetatlösung ™

vom pH-Wert 8,0, dann mit einer Mischung aus 1% Collidin plus 1$ Pyridin plus soviel 0,1 η-Essigsäure, daBs der pH-Wert 7,5 beträgt. Danach wird mit 2n Essigsäure gearbeitet (Fraktionen 150-250) und schliesslich mit Eisessig.

Auf die Kolonne wird eine Lösung aufgebracht, die 100 bis 300 mg der Fraktion N enthält. Die BF2-Aktivität erscheint beim Maximum No.17, während bei den andern Maxima inaktive Substanzen erhalten werden. Das so erhaltene Pro-

dukt wird mit Np oder NS-p bezeichnet. Es enthält 500.000 bis 1.000.000 BF2-Einheiten pro Gramm (Ausbeute an Faktor BF2 zwischen 20 bis 70 #). Auch dieses Produkt kann als bifidogenes Präparat verwendet werden.

Verabreicht man die verschiedenen obigen halbreinen oder hochgereinigten Präparate einem Säugling, in dessen Stuhl kein Lactobacillus bifidus gefunden wurde, zu-

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sammen mit der üblichen Nahrung, so wird dieser Bazillus entwickelt. Bis zum Auftreten des Lactobacillus bifidus im Stuhl nach der Verabreichung verstreicht, je nach der verabreichten Menge, eine Zeit von 1 bis 15 Tagen. Mit 5000 bis 10.000 Einheiten BF2 pro Tag tritt nach 10 bis 15 Tagen der Lactobacillus bifidus in einer Menge von 10 bis 40% der gesamten Flora auf. Oberhalb von 100.000 Einheiten BF2 pro Tag entwickelt sich eineBifidus-Flora sehr rasch, d.h. in 1 bis 5 Tagen, mit einem Anteil von 50 bis 95# der gesamten Flora.

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Claims

P a "tent a η s ρ r ίί ehe »»»»»·-»»»»»»»»»»»»*»»«»««»»»»

lu\ Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats eines Λ
bifidogenen Paktors Bifidus 2_t welcher die Errichtung oder Aufrechterhaltung einer Bifidus-Plora "beim nicht mit Muttermilch ernährten Säugling erlaubt, dadurch gekennzeichnet, dass man ein diesen Paktor enthaltendes Proteinhydrolysat mindestens zweimal an Ionenaustauscherharzen oder Dextrangel Chromatograph!ert.
2. Verwendung des gemäss dem Verfahren von Anspruch 1 erhaltenen Konzentrats zur Herstellung von künstlicher Säuglingsnahrung.

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