DE1442217A1 - Process for the production of new active ingredients - Google Patents

Process for the production of new active ingredients

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DE1442217A1
DE1442217A1 DE19631442217 DE1442217A DE1442217A1 DE 1442217 A1 DE1442217 A1 DE 1442217A1 DE 19631442217 DE19631442217 DE 19631442217 DE 1442217 A DE1442217 A DE 1442217A DE 1442217 A1 DE1442217 A1 DE 1442217A1
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Gaeumann Dr Ernst
Vischer Dr Ernst
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BASF Schweiz AG
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Ciba AG
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K7/64Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description

Neue für Äön Druck der Offenlei^gescarrrt "besfimmte Anmeläungsunterlagen - uns. Zeichen: 20 130-BR/ro -New registration documents specific to Äön Druck der Offenlei ^ gescarrrt "- us. Sign: 20 130-BR / ro -

CIBA AKTIENGESELLSCHAFT, BASEL (SCHWEIZ)CIBA AKTIENGESELLSCHAFT, BASEL (SWITZERLAND)

Case 5089/1-4/E
Deutschland
Case 5089 / 1-4 / E
Germany

Verfahren zur Herstellung neuer Wirkstoffe.Process for the production of new active ingredients.

Aus Materialien biologischen Ursprungs, insbesonto dere Mikroorganismen, ist bereits eine grössere AnzahlThere are already a large number of materials of biological origin, especially microorganisms

° eisenhaltiger Wuchsstoffe isoliert worden, beispielsweise° ferrous growth substances have been isolated, for example

C^ die Perrichrome, das Coprogen, die Perrioxamine.C ^ the Perrichromes, the Coprogen, the Perrioxamines.

σ> Es wurde nun gefunden, dass man aus PiIzstammenσ> It has now been found that one originates from PiIz

Neue Unteriaoen {^7iiA^2Hr^ssu3ae9j^finit>a90m.v.4.a.\mn I New Unteriaoen {^ 7iiA ^ ^ 2Hr ssu3ae 9 j ^ finite> A90M. v .4.a. \ mn I

der Familie Aspergillaceae einen neuen eisenhaltigen Wuchs» stoff, das Ferrirubin, und die entsprechende eisenfreie Verbindungen, das Desferrirübin, gewinnen kann. Ferrirubinbildende Stämme sind insbesondere Penicillium variabile M 2733, Spicaria sp. M 4622 und Paecilomyces variotl M 4646# Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung dieser Stämme zur Herstellung von Ferrirubin und Desferrirubin mittels üblichen Zuchtungsbedingungen.of the Aspergillaceae family a new iron-containing growth substance, ferrirubin, and the corresponding iron-free compound, desferrubin. Ferrirubin-producing strains are in particular Penicillium variabile M 2733, Spicaria sp. M 4622 and Paecilomyces variotl M 4646 # The present invention therefore relates to the use of these strains for the production of ferrirubin and desferrirubin by means of customary breeding conditions.

Die genannten Stämme werden in der Eidg. Techn. Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, sowie in unseren Laboratorien unter der angegebenen Bezeichnung aufbewahrt. Die Bestimmung der Stämme erfolgte nach K.B.Raper and .Ch.Thorn, A Manual of the Penicillia, Baltimore, The Williams & Wilkins Co., I949.The named strains are in the Eidg. Techn. University, Institute for Special Botany, Zurich, as well as in our laboratories under the specified designation kept. The strains were determined according to K.B. Raper and .Ch.Thorn, A Manual of the Penicillia, Baltimore, The Williams & Wilkins Co., 1949.

Penicillium variabile M 2733 wurde aus einer Erdprobe aus dem Botanischen Garten in Zürich isoliert. Der Stamm ist in die Sektion Biverticillata-Symmetrica der Penicillien einzuordnen. Da Perithecien oder Sklerotien fehlen, die Kolonien eine typisch sammetige Oberfläche aufweisen und die Rückseite der Kolonien oft rot-orange bis braun gefärbt ist, gehört der'Stamm in die Series Penicillium purpurogenum. Charakteristisch für Stamm ETH M2733 ist weiter die Bildung steriler, gelber Luftmycelpartien, weshalb der isolierte Stamm der Art Penicillium variabile Sppp 1912 zuzuordnen ist. Die Umschreibung dieser Art bei ~Penicillium variabile M 2733 was isolated from a soil sample from the Botanical Garden in Zurich. Of the Trunk is to be classified in the section Biverticillata-Symmetrica of the penicillia. There perithecia or sclerotia are absent, the colonies have a typically velvety surface and the back of the colonies often red-orange to is brown in color, the 'strain belongs to the Penicillium series purpurogenum. It is characteristic of the ETH strain M2733 furthermore the formation of sterile, yellow aerial mycelia, which is why the isolated strain of the species Penicillium variabile Sppp 1912 is to be assigned. The description of this kind at ~

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Raper u. Thorn (i.e. S. 642-644} ist ausführlich und Stamm M 2733 lässt sich gut in den Variationsbereich des Taxons einreihen.Raper and Thorn (i.e. pp. 642-644} is detailed and stem M 2733 fits well into the range of variation of the taxon line up.

Spicaria sp. M 4622 wurde aus einer Probe eines infizierten SUssmostes der Zentralstelle für Obst- und Kartoffelverwertung, Wadenswil, Kt. Zürich, isoliert. Der Organismus zeigt eine gelblich-sandfarbene Sporulation; die langen zugespitzten Sterigmen entstehen in Wirtein und zeigen stark divergierende Tendenzen; die Konidien entstehen in Ketten, an den Enden der Sterigmen. Derartige Formen sind der Gattung Spicaria Harz I87I zuzuordnen (Raper u. Thorn, S. 24-25). Eine Artbestimmung innerhalb der Gattung Spicaria ist nicht mit Sicherheit möglich, da die Prinzipien der Artdifferenzierung nicht fest stehen. Die Isolierung lsi daher zu bezeichnen als Spicaria species Stamm ETH M 4622.Spicaria sp. M 4622 was isolated from a sample of an infected SUssmostes from the Central Office for Fruit and Potato Utilization, Wadenswil, Canton of Zurich. The organism shows a yellowish-sand-colored sporulation; the long, pointed sterigms arise in Wirtein and show strongly diverging tendencies; the conidia arise in chains at the ends of the sterigms. Such forms are to be assigned to the genus Spicaria Harz I87I (Raper and Thorn, pp. 24-25). A species identification within the genus Spicaria is not possible with certainty, since the principles of species differentiation are not fixed. The isolation is therefore to be referred to as Spicaria species strain ETH M 4622.

Paecilomyces varioti M 4646 wurde in der Eidg. Versuchsanstalt in Wädenswil, Kt. Zürich, isoliert. Der i Organismus bildet reichlich, bräunlich-gelbe, länglich ova- · le Konidien an den Enden langer, zugespitzter Kcnidienträger, die in verticiller Anordnung stehen und stark divergieren. Der Organismus ist der Gattung' Paecilomyces Bainier I907 zuzuordnen und darin der Art Paecilomyces varioti Bainer 1907,der vielleicht einzigen, sehr variablen Art der Gattung (vgl. Raper u. Thorn, S. 688-692).Paecilomyces varioti M 4646 was isolated at the Federal Research Institute in Wädenswil, Canton of Zurich. The i The organism forms abundantly, brownish-yellow, elongated ova- · le conidia at the ends of long, pointed cnidia, which are vertically arranged and strong diverge. The organism is to be assigned to the genus' Paecilomyces Bainier I907 and therein to the species Paecilomyces varioti Bainer 1907, perhaps the only very variable species of the genus (cf. Raper and Thorn, pp. 688-692).

809806/076A809806 / 076A

Perrirubin ist eine rotbraune Substanz, die bisher nur in amorphem Zustand erhalten wurde. Sie ist sehr hygroskopisch. Analysenwerte : C = 49,01$; H = 6,57$; N = 12,70$; Pe = 5,25$; 0 = 26,47$ (ber.); Acetyl = 0$. . Das UV-Spektrum in Aethanol zeigt Maxima bei 216 ηιμ (log Elcm τ 2^58); 252 πιμ (log E1^n = 2,34) und 450 mμ (log E1 = 1,52). Das IR-Spektrum in Kaliumbromid weist u.a. Banden auf bei 842, 945, 990 (Schulter), 1040, IO66, 1125 (Schulter), 1195 (Schulter), 1239, 1282 (Schulter), 1341 (Schulter), 1366, l46o, 1533, 1647, 2938, 3085 (Schulter), 3420 Cm-1ZVgI. Pig. I.Perrirubin is a reddish-brown substance that has so far only been obtained in an amorphous state. It is very hygroscopic. Analysis values: C = $ 49.01; H = $ 6.57; N = $ 12.70; Pe = $ 5.25; 0 = $ 26.47 (calc.); Acetyl = $ 0. . The UV spectrum in ethanol shows maxima at 216 ηιμ (log E lcm τ 2 ^ 58); 252 πιμ (log E 1 ^ n = 2.34) and 450 mμ (log E 1 = 1.52). The IR spectrum in potassium bromide shows bands at 842, 945, 990 (shoulder), 1040, IO66, 1125 (shoulder), 1195 (shoulder), 1239, 1282 (shoulder), 1341 (shoulder), 1366, l46o, 1533, 1647, 2938, 3085 (shoulder), 3420 cm -1 ZVgI. Pig. I.

Im Papierchromatogramm werden folgende Rf-Werte erhalten : 0,42 im System I (n-Butanol-Eisessig-Wasser, 4:lsi) und 0,73 im System II (tert.-Butanol-0,004-n. Salzsäure-gesättigte wässerige Natriumchloridlösung, 2:1:1; Papier imprägniert mit Aceton-Wasser-gesättigte wässerige Natriumchloridlösung, 6:3:1)·The following Rf values are shown in the paper chromatogram obtained: 0.42 in system I (n-butanol-glacial acetic acid-water, 4: lsi) and 0.73 in system II (tert.-butanol-0.004-n. hydrochloric acid-saturated aqueous sodium chloride solution, 2: 1: 1; Paper impregnated with acetone-water-saturated aqueous Sodium chloride solution, 6: 3: 1)

Bei der sauren Hydrolyse des Perrirubins wird im Gegensatz zu Ferrichrom, Ferrichrysin und Perricrocin keine Essigsäure, sondern 3 Mol trans-5-Hydroxy-3-methylpentenr(2)-säure erhalten.In the acidic hydrolysis of perrirubin, in contrast to ferrichrome, ferrichrysin and perricrocin, none is produced Acetic acid, but 3 moles of trans-5-hydroxy-3-methylpentene (2) acid.

Bei der Behandlung des Perrirubins mit Basen oder Säuren oder mit Eisenkomplex-bildenden Stoffen wird das Eisen aus dem Molekül entfernt, wobei ein farbloses Pulver, das Desferrirubin, gebildet wird. Wenn man dieses "When treating Perrirubin with bases or acids or with substances that form iron complexes removes the iron from the molecule, forming a colorless powder called desferrirubin. If you have this "

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mit 6-n. Salzsäure hydrolysiert und die Hydrolyseprodukte
(zwecks Reduktion gegebenenfalls vorhandener Hydroxylaminogruppen)katalytisoh hydriert, erhält man drei ninhydrinpositlve produkte, die auf Grund der papierchromatographisehen Untersuchung (Fliessmittel Phenol-Wasser 8:2 und Butanol-Eisessig-Wasser 4:1:1 und Anfärben ipit Ninhydrin)
sowie bei der Analyse nach Moore und Stein als Ornithin,
Glycin und Serin identifiziert werden. Glycin und Serin
sind im molekularen Verhältnis 1:2 vorhanden. Elsenfreies
Perrichrom, mit 6-n. Salzsäure hydrolysiert und katalytisch I
with 6-n. Hydrochloric acid hydrolyzes and the hydrolysis products
Catalytically hydrogenated (for the purpose of reducing any hydroxylamino groups that may be present), three ninhydrin-positive products are obtained, which on the basis of paper chromatography analysis (mobile phase phenol-water 8: 2 and butanol-glacial acetic acid-water 4: 1: 1 and staining ipit ninhydrin)
as well as ornithine in the analysis according to Moore and Stein,
Glycine and Serine can be identified. Glycine and serine
are present in a molecular ratio of 1: 2. Elsen-free
Perrichrom, with 6-n. Hydrochloric acid hydrolyzed and catalytic I

hydriert, liefert nicht drei, sondern nur zwei ninhydrin- ihydrogenated, gives not three, but only two ninhydrin- i

positive Produkte, nämlich Glycin und Ornithin. Coprogen : positive products, namely glycine and ornithine. Coprogen :

gibt als einziges ninhydrin-positives Hydrolyseprodukt ·.is the only ninhydrin-positive hydrolysis product ·.

Ornithin. 'Ornithine. '

Im Perrirubin sind die Aminosäuren Serin·(2· Mol), jIn perrirubin the amino acids are serine · (2 · mol), j

Glycin (1 Mol) und §-Hydroxyornithin (3 Mol) zu einem cyoli- jGlycine (1 mol) and §-hydroxyornithine (3 mol) to a cyoli- j

sehen Hexapeptld verbunden. Das Hydroxyornithin 1st N(C)-acy- : liert; an die so gebildeten Hydroxamsäurereste ist das Eisensee Hexapeptld connected. The hydroxyornithine is N (C) -acy- : lated; the hydroxamic acid residues formed in this way are iron

komplex gebunden.complex bound.

I Perrirubin wird die folgende Formel zugeschrieben: j I perrirubin is assigned the following formula: j

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CH2OHCH 2 OH

R = HOCH2-CH2-C=CH- (trans)R = HOCH 2 -CH 2 -C = CH- (trans)

Die mit den 3 Ornithinresten verbundene Säure hat demzu- j folge die Struktur der trans-5-Hydroxy-3-methyl-penten-(2)- iThe acid connected to the 3 ornithine residues has therefore j follow the structure of trans-5-hydroxy-3-methyl-pentene- (2) - i

säure ίacid ί

HOCh0-CH0-C=CH-COOH . jHOCh 0 -CH 0 -C = CH-COOH. j

. CH ί. CH ί

Die Bruttoformel des Perrlrubins ist demnach Cj,,HghO17NqPe. Bei der katalytischen Hydrierung des Perrirubins wird die trans-5~Hydroxy-3-methyl-penten-(2)-säure hydriert, ohne dass der Übrige Teil der Molekel angegriffen wird. Man erhält das Hexahydroferrlrubin, dessen Säurekomponente die 5-Hydroxy-3-methyl-valeriansäure ist. Hexähydroferri- » rubin ist identisch mit dem durch Hydrierung von Perrirhodln erhaltenen Hexahydroferrirhodin (vgl. Anm. No.The gross formula of pearl ruby is therefore Cj ,, HghO 17 NqPe. During the catalytic hydrogenation of perrirubin, the trans-5-hydroxy-3-methyl-pentene (2) acid is hydrogenated without the remaining part of the molecules being attacked. The result is hexahydroferrubine, the acid component of which is 5-hydroxy-3-methyl-valeric acid. Hexahydroferri- »ruby is identical to the Hexahydroferrirhodin obtained by hydrogenation of Perrirhodin (cf. note no.

809806/0764 ·809806/0764

P l4 42 220.9 - Case 5157/1-3/E)· Das IR-Absorptionsspektrum der Verbindung in Nujol ist in Fig. 3 wiedergegeben. Im UV-Absorptionsspektrum des Hexahydroferrirubins ist die starke Absorptionsbande des Ferrirubins bei 252 Γημ verschwunden und das breite Maximum bei 450 πιμ nach 425-430 Γημ verschoben. Die Absorptionskurve ist praktisch deckungsgleich mit der des Ferrichrysins (dieses besitzt an Stelle der drei 5-Hydroxy-3-methyl-valeriansäurereste drei Acetylreste, vgl. Anm. Nr. P 14 42 073-6 - Case 4972/1-4/5038). Die Rf-Werte des Hex&hydroferrirubins in den Systemen I und ΐί sind 0,57 und 0,80 im Vergleich zu 0,52 und 0,81 des Ferrirubins; (gelboranger Fleck im Gegensatz zum rötlich-braunen' Fleck des. Ferrirubins). Entfernt man aus dem Hexahydro- : ferrirubin das Eisen, beispielsweise mittels 8-Hydroxychinolin, spaltet in dem erhaltenen Desferri-hexahydro-P l4 42 220.9 - Case 5157 / 1-3 / E) · The IR absorption spectrum of the Compound in Nujol is shown in FIG. In the UV absorption spectrum Hexahydroferrirubin is the strongest one Absorption band of ferrirubin at 252 Γημ disappeared and the broad maximum at 450 πιμ shifted to 425-430 Γημ. The absorption curve is practically congruent with that of ferrichrysin (this has instead of the three 5-Hydroxy-3-methyl-valeric acid residues, three acetyl residues, see note No. P 14 42 073-6 - Case 4972 / 1-4 / 5038). The Rf values des hex & hydroferrirubins in systems I and ΐί are 0.57 and 0.80 compared to 0.52 and 0.81 of ferrirubin; (yellow-orange spot in contrast to the reddish-brown 'spot of ferrirubin). If you remove from the hexahydro: ferrirubin the iron, for example by means of 8-hydroxyquinoline, cleaves in the obtained Desferri-hexahydro-

ferrirubin durch milde saure Hydrolyse die 5-Hydroxy-3~ methyl-valeriansäurereste ab, acetyliert (am Stickstoff ■ und Sauerstoff) und spaltet die O-Acetylgruppen selektiv ab, z.B. mittels Ammoniak, so erhält man Desferrichrysin, das mit Eisen(III)-salz in Ferrichrysin übergeführt werden kann. Das so aus Ferrirubin erhaltene Ferrichrysin zeigt im Papierchromatogramm in den Systemen I und II dieselben Rf-Werte wie authentisches Ferrichrysin.ferrirubin produces 5-hydroxy-3 ~ by mild acid hydrolysis methyl-valeric acid residues, acetylated (on nitrogen and oxygen) and selectively cleaves the O-acetyl groups from, e.g. by means of ammonia, one obtains desferrichrysin, which can be converted into ferrichrysin with iron (III) salt. The ferrichrysin thus obtained from ferrirubin shows in the paper chromatogram in systems I and II the same RF values like authentic ferrichrysin.

Bei der Elementaranalyse des eisenfreien Ferrirubins werden folgende Werte gefunden : C =51,12; *The elemental analysis of the iron-free ferrirubin found the following values: C = 51.12; *

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H = 7,29; N= 13,00; Acetyl = 0#.H = 7.29; N = 13.00; Acetyl = 0 #.

Ein wesentlicher Unterschied gegenüber den eisenfreien Sideraminen Ferrichrysin, Ferricrocin und Perrichrom besteht in der Hydrolysegeschwindigkeit der Hydroxamsäurebindungen. Die letzteren drei Verbindungen verlieren ihr Komplexbindungsvermögen zu Eisen-(III)-Ion vollständig nach ca. 18 Minuten beim Erwärmen mit n. Salzsäure im siedenden Wasserbad. Beim eisenfreien Ferrirubin nimmt die Intensität der Eisenchloridreaktion erst nach ca. 2 Stunden merklich ab. Eine ähnlich hohe Resistenz gegen Säure wurde bisher in der Sideraminreihe nur beim biologisch unwirksamen Ferrichrom A beobachtet. Die übrigen Eigenschaften von Perrirubin stimmen aber mit denen von Perrichrom A nicht überein. Perrichrom A ist eine Säure mit drei freien Carboxylgruppen (ß-Methylglutaconsäure-.reste), während Ferrirubin keine titrierbaren Gruppen besitzt. A major difference compared to the iron-free sideramines Ferrichrysin, Ferricrocin and Perrichrome consists in the rate of hydrolysis of the hydroxamic acid bonds. The latter three compounds lose their ability to bind complexes to form iron (III) ions completely after approx. 18 minutes when warming with hydrochloric acid in a boiling water bath. With iron-free ferrirubin the intensity of the iron chloride reaction only decreases noticeably after about 2 hours. A similarly high level of resistance Against acid was previously in the sideramine series only with biologically inactive ferrichrome A was observed. The other properties of perrirubin agree with those of Perrichrome A does not match. Perrichrome A is an acid with three free carboxyl groups (ß-methylglutaconic acid .reste), while ferrirubin has no titratable groups.

. Im NMR-Spektrum, aufgenommen mit einem Varian-Spektrographen in DpO, weist Desferrirubin folgende Signale auf (vgl. Fig. 2) : . -. In the NMR spectrum, recorded with a Varian spectrograph in DpO, desferrirubin exhibits the following signals on (see. Fig. 2):. -

l,86^ppm (14 H); 2,38 ppm (4 H); 2,92 ppm (1 H); 3,79 PPm (10 H); 4,39 ppm (4 H); 6,03 PPm (2 H).1.86 ^ ppm (14 H); 2.38 ppm (4 H); 2.92 ppm (1H); 3.79 PPm (10H); 4.39 ppm (4 H); 6.03 PPm (2H).

Angaben der chemischen Verschiebungen inInformation on the chemical shifts in

ö-Werten gegenüber Tetramethylsilan = 0. Die durch Integration erhaltenen Protonenzahlen bedeuten reine Verhältnis-*δ values compared to tetramethylsilane = 0. The through integration obtained proton numbers mean pure ratio- *

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zahlen, wobei das kleinste Signal als 1 angenommen wurde. Alle Signale bilden breite Signalanhäufungen ohne deutliche Auflösung* Die Signalhaufen bei 3,79 und 6,03 ppm be- \ sitzen deutliche Doppelmaxima, sind aber offenbar keine reinen Dublette.numbers, where the smallest signal was assumed to be 1. All signals form broad signal clusters without clear resolution * Auto pile at 3.79 and 6.03 ppm loading \ sit distinct double peaks, but are apparently not pure doublet.

Aus Desferrirubin wird bei Zusatz von Eisenchlorid bei neutralem pH das Ferrirubin zurückerhalten. . ;With the addition of ferric chloride at neutral pH, the ferrirubin is recovered from desferrirubin. . ;

Derivate des Perrirubins und Desferrirubins und ihrer Hydrierungsprodukte sind beispielsweise Verbindungen, in denen die Hydroxylgruppe der Serinreste verestert ist, oder in denen die Acylgruppe der Hydroxamsäurereste durch andere Acylgruppen substituiert ist, beispielsweise durch Niederalkanoyl- oder Niederalkenoyl- oder andere W-Hydroxyalkenoylgruppen als die 5-Hydroxy-3-methyl-pentenoylgruppe, z.B. Propionyl, Butyryl, Pentanoyl, Pentenoyl, 5-Hydroxypentenoyl. Die erstgenannten Derivate werden erhalten, wenn man Ferrirubin oder Hexahydroferrirubin mit acylierenden Mitteln behandelt, z.B. mit Säureanhydriden oder Säurehalogeniden,. wie Essigsäurearihydrid oder Acetylchlorid, und ! die Ester isoliert und, wenn erwünscht, das Eisen elimi- \ niert. Die Desacylverbindung erhält man durch Desacylierung \, Derivatives of perrirubin and desferrirubin and their hydrogenation products are, for example, compounds in which the hydroxyl group of the serine residues is esterified, or in which the acyl group of the hydroxamic acid residues is substituted by other acyl groups, for example by lower alkanoyl or lower alkenoyl or other W-hydroxyalkenoyl groups than the 5- Hydroxy-3-methyl-pentenoyl group, for example propionyl, butyryl, pentanoyl, pentenoyl, 5-hydroxypentenoyl. The first-mentioned derivatives are obtained when ferrirubin or hexahydroferrirubin is treated with acylating agents, for example with acid anhydrides or acid halides. like acetic anhydride or acetyl chloride, and! the ester is isolated and, if desired, the iron elimi- \ defined. The deacyl compound is obtained by deacylation \,

i ;i;

des Desferrirubins oder Hexahydrodesferrirubins in mildem \ saurem Medium, z.B. in Gegenwart verdünnter Mineralsäuren. Das so erhaltene cyclische Hexapeptid kann in bekannter Weise aoyllert werdenj dabei gebildete O-Aeylgruppen lassen" the Desferrirubins or Hexahydrodesferrirubins in mild \ acidic medium, eg in the presence of dilute mineral acids. The cyclic hexapeptide obtained in this way can be aoyllerted in a known mannerj leave O-ayl groups formed in the process "

8 0 9806/07 648 0 9806/07 64

- ίο -- ίο -

sich mit Ammoniak, beispielsweise in Methanol, abspalten. Das Acyl-analogon des Desferrirubins kann mit Eisensalzen in den entsprechenden Eisenkomplex übergeführt werden.split off with ammonia, for example in methanol. The acyl analogue of desferrirubin can be mixed with iron salts be converted into the corresponding iron complex.

Ferrirubin, Desferrirubin und Analoge sind Wuchsstoffe für verschiedene Mikroorganismen] sie können daher bei der Kultur solcher Organismen verwendet werden.Ferrirubin, desferrirubin and analogues are growth substances for various microorganisms] they can therefore used in the culture of such organisms.

Diese Verbindungen besitzen antianaemische Eigenschaften und können dementsprechend als Heilmittel verwendet werden. Auch Desferrirubin und seine Derivate haben wertvolle pharmakologische Eigenschaften. So verhindern sie die Ablagerung eisenhaltiger Pigmente im Gewebe bzw. bewirken in Fällen von pathologischer Eisenablagerung im Organismus eine Ausscheidung des Eisens,z.B. bei Hämochromatose und Hämosiderose. Sie können dementsprechend in der Heilkunde verwendet werden.These compounds are anti-anemic Properties and, accordingly, can be used as remedies. Also desferrirubin and its derivatives have valuable pharmacological properties. So prevent they cause the deposition of iron-containing pigments in the tissue or in cases of pathological iron deposition an excretion of iron in the organism, e.g. in hemochromatosis and hemosiderosis. You can accordingly used in medicine.

Die pharmazeutischen Präparate enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem organischen oder anorganischen pharmazeutischen Träger, der für die enterale oder parenterale Anwendung geeignet ist. Die Präparate werden aus dem Ausgangsmaterial nach den üblichen Methoden hergestellt. Geeignete Träger sind Substanzen, die mit Desferrirubin nicht reagieren, wie z.B. GeIa-: tine, Laktose, Glukose, Natriumchlorid, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche OeIe, Benzylalkohol, Gummi, Polyalkylenglykole, Cholesterin oder andere bekannte medi-The pharmaceutical preparations contain the compounds mentioned in a mixture with an organic one or inorganic pharmaceutical carrier suitable for enteral or parenteral use. the Preparations are made from the starting material according to the usual methods. Suitable carriers are substances which do not react with desferrirubin, such as GeIa-: tine, lactose, glucose, sodium chloride, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohol, gum, Polyalkylene glycols, cholesterol or other known medi-

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zjinische Träger.zjin porters.

Wie andere Sideramine ist auch Ferrirubin imstande, die antibakterielle Wirkung von Antibiotika, die der Gruppe der Sideromycine angehören, gegenüber grampositiven Erregern kompetitiv aufzuheben (Antisideromycin-Wirkung). Like other sideramines, ferrirubin is able to reduce the antibacterial effects of antibiotics that belong to the group of sideromycins, competitively lift off against gram-positive pathogens (antisideromycin effect).

Ferrirubin, Desferrirubin sowie Derivate dieser Verbindungen werden erhalten, wenn man Ferrirubin-bildende Stämme aus der Familie der Aspergillaceae in einer wässerigen Nährlösung, die eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthält, unter aeroben Bedingungen züchtet, aus dem Kulturfiltrat Ferrirubin und/oder Desferrirubin isoliert und, wenn erwünscht, Ferrirubin in die eisenfreie Verbindung überführt oder Hydrierungsprodukte oder Derivate dieser Verbindungen herstellt. ; Da die Bildung des Ferrirubins und/oder Des-Ferrirubin, desferrirubin and derivatives of these compounds are obtained if ferrirubin-forming compounds are used Strains of the Aspergillaceae family in an aqueous nutrient solution that is a source of carbon and nitrogen as well as containing inorganic salts, cultured under aerobic conditions, ferrirubin and / or from the culture filtrate Desferrirubin is isolated and, if desired, ferrirubin is converted into the iron-free compound or hydrogenation products or derivatives of these compounds. ; Since the formation of ferrirubin and / or des-

' ι ' ι

ι ι

ferrirubins durch ein eisenarmes Nährmedium begünstigt wird, ist es zweckmässig, die Züchtung unter Eisenmangel, vorzugsweise bei einem Eisengehalt von höchstens 10"' Mol/ Liter, vorzunehmen.ferrirubins favored by a nutrient medium poor in iron is, it is advisable to breed under iron deficiency, preferably with an iron content of at most 10 "'mol / Liters.

Für die Züchtung der Stämme kommen als Kohlenstoff- und Stickstoffquellen in Betracht : Kohlenhydrate, z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Stärke, Alkohole, wie Mannit und Glycerin, Aminosäuren, z.B. Ornithin, Peptide, Proteine und deren Abbauprodukte, wie Pepton oder Trypton5The following carbon and nitrogen sources can be considered for breeding the strains: carbohydrates, e.g. glucose, sucrose, lactose, starch, alcohols such as mannitol and glycerine, amino acids such as ornithine, peptides, Proteins and their breakdown products such as peptone or tryptone5

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Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais oder Weizen, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Hefe, Samen, insbesondere der Raps- und Soyapflanze, der Baumwollpflanze, Ammoniumsalze, Nitrate. An anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate, Nitrate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Zink und Mangan sowie Spuren von Eisen enthalten.Meat extracts, water-soluble fractions of cereal grains, such as maize or wheat, distillation residues from alcohol production, yeast, seeds, in particular the rapeseed and soya plants, the cotton plant, ammonium salts, nitrates. In terms of inorganic salts, the nutrient solution can contain, for example, chlorides, carbonates, sulfates, nitrates of alkalis, alkaline earths, magnesium, zinc and manganese as well as traces of iron.

Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise ,-in ruhender Oberflächenkultur, oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schuttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40 C, vorzugsweise 27 C. Eine wesentliche Ferr.irubin-Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 12-16 Tagen. . Die Ferrirubin-Aktivität kann mikrobiologisch mittels des abgewandelten Bonifas-Testes (vgl. Zähner et al.,The cultivation takes place aerobically, for example, in resting surface culture, or preferably submerged while shaking or stirring with air or oxygen in shake bottles or the well-known fermenters. As a temperature a temperature between 18 and 40 ° C, preferably 27 ° C, is suitable the nutrient solution generally after 12-16 days. . The ferrirubin activity can be microbiological using the modified Bonifas test (see zahner et al.,

Areh.Mikrobiol. ^, 325 ff. [i960]) bestimmt werden. Als ί
Testlösung verwendet man eine Ferrimycinlösung von 0,1 mg/ml
Areh.Microbiol. ^, 325 ff. [1960]). As ί
A ferrimycin solution of 0.1 mg / ml is used for the test solution

Gehalt, als Teststamm Staphylococcus aureus Rosenbach.Salary, as a test strain Staphylococcus aureus Rosenbach.

Man kann auch optisch die Ferrirubin-Konzentration der KuItürlösung feststellen. Zu diesem Zweck werden 5 ml Kulturflüssigkeit mit 1,5 g Natriumchlorid, 1 ml 0,l#iger Ferrisulfatlösung und 5 ml Benzylalkohol 5 Minuten geschüttelt, abzentrifugiert, die organische Phase filtriert'The ferrirubin concentration of the cooling solution can also be determined optically. Be for this purpose 5 ml culture liquid with 1.5 g sodium chloride, 1 ml 0.1 # ferric sulfate solution and 5 ml benzyl alcohol for 5 minutes shaken, centrifuged, the organic phase filtered '

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und die Extinktion der organischen Phase bei 440 ιτιμ bestimmt. Als Vergleichsprobe dient ein auf gleiche Weise hergestellter Extrakt aus unbeimpfter Nährlösung.and the absorbance of the organic phase is determined at 440 ιτιμ. An extract prepared in the same way from uninoculated nutrient solution is used as a comparison sample.

Nach 12-16 Tagen erreichen die Kulturen eine Aktivität, die 50-200 mg reinem Ferrirubin entspricht.After 12-16 days, the cultures reach an activity equivalent to 50-200 mg of pure ferrirubin.

■ Bei Beendigung der Züchtung kann man pro Liter 1 g Ferrichlorid zur Nährlösung geben, wobei das vorhandene Desferrirubin in Ferrirubin übergeführt wird. Man trennt das ttjfcei" vom Kulturf iltrat ab, vorzugsweise in Gegenwart eines Filterhilfsmittels, z.B. Hyflo-Supercel, wonach die Hauptmenge des Ferrirubins im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen davon am Mycel haften. Es ist daher vorteilhaft, dieses gut auszuwaschen. Dazu eignen sich beispielsweise Wasser oder wässerige Alkohole, wie wässeriges Methanol.■ At the end of the cultivation one can per liter Add 1 g of ferric chloride to the nutrient solution, taking the existing Desferrirubin is converted into ferrirubin. One separates the ttjfcei "from the culture filtrate, preferably in the presence a filter aid, e.g. Hyflo-Supercel, after which the Most of the ferrirubin is found in the culture filtrate. Nevertheless, significant amounts of it stick to the mycelium. It is therefore advantageous to wash it off well. For this purpose, for example, water or aqueous alcohols are suitable, like aqueous methanol.

Für die Isolierung von Ferrirubin aus dem .XuItuFfIltrat kann man nach an sich bekannten Methoden vorgehen und z.B. eine der nachfolgend angegebenen Arbeitsweieen oder Kombinationen davon anwenden.Methods known per se can be used to isolate ferrirubin from the .XuItuFIltrat proceed and, for example, use one of the working methods specified below or a combination thereof.

. 1) Man kann Adsorptionsmittel verwenden, z.B. Aktivkohlen, wie Norit, aktivierte Erden, wie Frankonit, Fullererde oder Floridin, oder Harzadsorber, wie Asmit. Die Elution der Adsorbate erfolgt zweckmässig mit Gemischen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln mit Wasser, z.B. mit Wasser-Methanol-, Wasser-Pyridin-,. 1) Adsorbents can be used, e.g. activated carbons such as Norit, activated earths such as Frankonit, Fuller's earth or floridine, or resin adsorbers such as Asmit. The adsorbates are expediently eluted with mixtures of water-miscible organic solvents with water, e.g. with water-methanol, water-pyridine,

8 0.9 80 6/078 0.9 80 6/07

- i4 -- i4 -

verdünnte Essigsäure-Methanol- oder Wasser-Methanol-Eis— essig-Butanol-Gemischen. Als besonders vorteilhaft für die Elution eines Frankonit- oder Noritadsorbates hat sich das Gemisch von Wasser (4 Volumteile) und Pyridin (1 Volumteil) erwiesen»dilute acetic acid-methanol or water-methanol-ice- vinegar-butanol mixtures. This has proven to be particularly advantageous for the elution of a frankonite or norite adsorbate Proven mixture of water (4 parts by volume) and pyridine (1 part by volume) »

2) Weiter kann Perrirubin einer wässrigen Lösung mittels organischen Lösungsmitteln entzogen werden. Pur diese Extraktionsverfahren haben sich höhere organische Alkohole, z.B. Benzylalkohol oder Isopropylalkohol, besonders bewährt. Zweekmässigerweise wird dabei der wässrigen Phase ein anorganisches Salz, z.B. Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid, zugesetzt. Aus den erhaltenen organischen \. Extrakten kann Ferrirubin entweder durch Abdampfen des .. Lösungsmittels oder durch Ausfällung mittels eines geeigneten organischen Lösungsmittels, z.B. Aether, Petroläther oder Aethylacetat, in angereicherter Form erhalten werden.2) Perrirubin can also be removed from an aqueous solution by means of organic solvents. For these extraction processes, higher organic alcohols, such as benzyl alcohol or isopropyl alcohol, have proven particularly useful. In two cases, an inorganic salt, for example ammonium sulfate or sodium chloride, is added to the aqueous phase. From the organic \. Ferrirubin can be obtained in enriched form in extracts either by evaporating off the solvent or by precipitation using a suitable organic solvent, for example ether, petroleum ether or ethyl acetate.

5) Eine weitere Methode der Anreicherung des Perrirubins besteht darin, dass man es zwischen einer wässerigen Lösung und einer Lösung von Phenol in Chloroform verteilt, wobei der Phenolgehalt der Chloroformlösung variiert werden kann.5) Another method of enriching Perrirubin is that it is placed between a aqueous solution and a solution of phenol in chloroform, the phenol content of the chloroform solution can be varied.

4) Eine andere Methode zur Anreicherung des Ferrirubins stellt die Chromatographie dar, wie Adsorptionschromatographie an verschiedenen Materialien, z.B. an Norit, Aluminiumoxyd, Magnesiumsilikaten, Silicagel, CaI-**4) Another method for enriching ferrirubin is chromatography, such as adsorption chromatography on various materials, e.g. on Norit, aluminum oxide, magnesium silicates, silica gel, CaI - **

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•ciumsulfat, sowie Verteilungschromatographie mit Cellulose, '■ Stärke, Silicagel, Celite und dergl. als Trägersubstanzen.• Calcium sulfate, as well as partition chromatography with cellulose, '■ starch, silica gel, celite and the like. As carrier substances.

5) Weiter kann das Ferrirubin durch Gegenstrom- ■5) Furthermore, the ferrirubin can by countercurrent ■

verteilung nach Craig zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsmittelphasen angereichert werden. Folgendes Lösungsmittelsystem hat sich dabei besonders bewährt : n-Butanol-distribution according to Craig between two immiscible solvent phases be enriched. The following solvent system has proven to be particularly effective: n-butanol

ί Benzylalkohol-Ο,ΟΟΙ-η. Salzsäure-wässrige, bei 19 gesättig- : ί Benzyl alcohol-Ο, ΟΟΙ-η. Hydrochloric acid-aqueous, saturated at 19 :

te Natriumchloridlösung (9:9:15:5). !te sodium chloride solution (9: 9: 15: 5). !

Desferrirubin wird neben Ferrirubin von den genannten Stämmen gebildet und.kann daher auch direkt aus dem KuIturfiltrat isoliert werden. Vorteilhaft entfernt : man bei der Isolierung im Kulturfiltrat vorhandenes Eisen, beispielsweise durch Zusatz Eisenkomplex-bildender Stoffe, z.B. 8-Oxychinolin. ;In addition to ferrirubin, desferrirubin is formed by the named strains and can therefore also be derived directly from the KuIturfiltrat be isolated. Advantageously removed: iron present in the culture filtrate during isolation, for example by adding iron complex-forming substances, e.g., 8-oxyquinoline. ;

Man kann die Eisenkomplex-bildenden Stoffe direkt nach Beendigung der Fermentation der Kulturbrühe zusetzen. Vorteilhaft erfolgt der Zusatz in einem späteren Stadium der Aufarbeitung um allfällige durch die benützten Agenzien eingeschleppte Eisen-(Ill)-ionen ebenfalls zu " '. entfernen. . IThe iron complex-forming substances can be added to the culture broth immediately after the fermentation has ended. Advantageously, the addition is carried out at a later stage of the work-up to any entrained by agents who used iron (III) also. Ions to "" remove.. I

Die Isolierung des Desferrirubins aus der *The isolation of desferrirubin from the *

Kulturlösung erfolgt nach den für die Isolierung von Ferrirubin erwähnten Methoden.Culture solution is carried out according to the methods mentioned for the isolation of ferrirubin.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden ange-' geben.The invention is described in the following examples. The temperatures are in degrees Celsius give.

809806/076Λ809806 / 076Λ

Beispiel 1 ;Example 1 ;

Der Stamm Penicillium variabile M 2733 wird in gut belüfteter Submerskultur bei 27° gezüchtet. Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter destilliertem Wasser 20 g Glucose (eisenfrei), 5 g L-Asparagin, 1 g sek.-Kaliumphosphat, 1 g krist. Magnesiumsulfat (MgSO^, 7 H3O) und 0*5 g Calciumchlorid enthält. Die Nährlösung wird 20 Minuten bei 120° sterilisiert. Geimpft wird mit einer Sporensuspension von Reiskulturen in dest. Wasser + 5$ TweenThe strain Penicillium variabile M 2733 is grown in a well-ventilated submerged culture at 27 °. A nutrient solution is used which contains 20 g of glucose (iron-free), 5 g of L-asparagine, 1 g of secondary potassium phosphate, 1 g of crystalline per liter of distilled water. Contains magnesium sulfate (MgSO ^, 7 H 3 O) and 0 * 5 g calcium chloride. The nutrient solution is sterilized at 120 ° for 20 minutes. It is inoculated with a spore suspension of rice cultures in dist. Water + $ 5 tween

Der Gehalt an Ferrirubin im Kulturmedium wird wie folgt bestimmt :The content of ferrirubin in the culture medium is determined as follows:

10 ml Kulturfiltrat + 3g Natriumchlorid + 10 ijL Benzylalkohol werden gut geschüttelt und zentrifugiert. Die organische Phase wird filtriert, mit 3-facnem Volumen Aether und Puffer pH 8 geschüttelt und erneut zentrifugiert. Im wässrigen Auszug wird die Extinktion bei 440 ηιμ bestimmt und anhand einer Eichkurve die mg rohes Perrirubin abgelesen. 10 ml culture filtrate + 3 g sodium chloride + 10 μl benzyl alcohol are shaken well and centrifuged. The organic phase is filtered, shaken with 3-fold volume of ether and pH 8 buffer and centrifuged again. In the aqueous extract, the extinction at 440 ηιμ is determined and the mg of crude perrirubin read off using a calibration curve.

Nach' 12-16 Tagen wird den Kulturen 1 g Ferrichlorid pro Liter zugesetzt und unter Zusatz von 2% Celit filtriert·. Das Kulturfiltrat wird nun mit Natriumchlorid gesättigt.und die klare Lösung zweimal mit l/lO Volumen · Benzylalkohol extrahiert. Die organische Phase wird mitAfter 12-16 days, 1 g of ferric chloride per liter is added to the cultures and filtered with the addition of 2% Celite. The culture filtrate is now saturated with sodium chloride and the clear solution is extracted twice with 1/10 volume of benzyl alcohol. The organic phase is with

i . ■ .i. ■.

Natriumsulfat getrocknet, filtriert und mit 3 Volumen "' Sodium sulfate dried, filtered and with 3 volumes "'

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Aether versetzt. Das Benzylalkohol-Aethergemisch extrahiert man bis zur Entfärbung mit destilliertem Wasser. Die wässrigen Auszüge werden vereinigt, die Reste von Benzylalkohol mit Aether entfernt und lyophilisiert, wobei man ein rotes Pulver erhält.Aether displaced. The benzyl alcohol-ether mixture extracted until discoloration with distilled water. The aqueous extracts are combined, the remains of benzyl alcohol removed with ether and lyophilized to give a red powder.

10,4 g Rohprodukt werden einer 15^-stufigen ■Craig-Verteilung unterzogen. Als Verteilungssystem dient ein Gemisch aus Benzylalkohol, n-Butylalkohol, gesätt. wässr. Natriumchloridlösung und 0,001-n. wässrige Salzsäure im Volumenverhältnis 18:18:10:30.10.4 g of crude product are a 15 ^ -stufigen ■ subjected to craig distribution. A mixture of benzyl alcohol, n-butyl alcohol, sat. watery Sodium chloride solution and 0.001-n. aqueous hydrochloric acid in a volume ratio of 18: 18: 10: 30.

Der rotbraune Farbstoff bildet.ein einziges Verteilungsmaximum in Stufe 128. Dies entspricht ungefähren Verteilungskoeffizienten von K = 5,0.The red-brown dye forms a single distribution maximum in step 128. This corresponds to an approximate distribution coefficient of K = 5.0.

Die Fraktionen Il6-l4o werden zusammengefasst. Durch Zusatz von 2 Volumen Aether wird Ferrirubin in die wässrige Phase gedrängt. Diese wird abgetrennt und die or-· ganiSQhe SchiGht noch dreimal mit wenig Wasser ausgeschüttelt. Die vereinigten wässrigen Lösungen werden mit Natriumchlorid etwa halb gesättigt und mehrmals mit Phenol-Chloroform (1 kg Phenol auf 1 Liter Chloroform) ausgeschüttelt, wobei der Farbstoff in die organische Phase übergeht. Die Extrakte werden an einer Celit-Säule geklärt, mit dem doppelten Volumen Aether verdünnt und viermal mit wenig Walser ausgesohüttelt, wobei der braunrote Farbstoff in die wässrige Phase geht. Man wäscht die wässrigen Lösungen"The fractions II6-14o are combined. By adding 2 volumes of ether, ferrirubin is forced into the aqueous phase. This is separated and the or- GaniSQhe SchiGht shaken out three more times with a little water. The combined aqueous solutions are made with sodium chloride about half saturated and shaken out several times with phenol-chloroform (1 kg of phenol to 1 liter of chloroform), whereby the dye passes into the organic phase. The extracts are clarified on a Celite column with the double volume of ether and shaken out four times with a little Walser, the brownish-red dye in the aqueous phase goes. The aqueous solutions are washed "

06/0706/07

mehrmals mit Aether um das Phenol vollständig zu entfernen und dampft sie im Vakuum ein. Der rotbraune amorphe Rückstand (1,245 g) wird durch Umfallen aus Methanol-Aether weiter gereinigt. Die reine Verbindung ist sehr hygroskopisch. ■several times with ether to completely remove the phenol and evaporate it in vacuo. The red-brown amorphous residue (1.245 g) is further purified by reprecipitation from methanol-ether. The pure connection is very hygroscopic. ■

Bei der Elementaranalyse wurden gefunden : C = 49,01$; H = 6,57$; N = 12,70$; Pe = 5,25$; 0 = 26,47$ (ber.); Acetyl = 0$.The elemental analysis found: C = $ 49.01; H = $ 6.57; N = $ 12.70; Pe = $ 5.25; 0 = $ 26.47 (calc.); Acetyl = $ 0.

Absorptionsspektrum in Aethanol :A QAbsorption spectrum in ethanol: A Q "

maxMax

4cm = 2'58bÄmax = 252 „μ. (log ^4cm = 2 '58bÄ max = 252 "μ. (log ^

:A Q„ = 216 πιμ; max: A Q "= 216 πιμ; Max

450 up (log E^1n = 1,52). ..-; - \ 450 up (log E ^ 1n = 1.52). ..-; - \

Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt u.a. ■The IR spectrum in potassium bromide shows i.a.

Banden bei 842, 945, 990 (Schulter), 1040, 1066, 1125 'Bands at 842, 945, 990 (shoulder), 1040, 1066, 1125 '

(Schulter), 1195 (Schulter), 1239, 1282 (Schulter), 134l \ (Shoulder), 1195 (shoulder), 1239, 1282 (shoulder), 134l \

(Schulter), 1366, l46O, 1533, 1647, 2938, 3085 (Schulter), !(Shoulder), 1366, 1460, 1533, 1647, 2938, 3085 (shoulder),!

-1 ·-1 ·

3420 cm , vgl. Pig. I.3420 cm, see Pig. I.

Im Papierchromatogramm wurde Perrirubin mit ; Perrirubin was found in the paper chromatogram with ;

!. anderen Sideraminen verglichen, s. Tabelle. Die Methode | ist folgende : Ein Blatt Whatman-Filterpapier Nr. 1 wird mit einem Gemisch aus Aceton, Wasser und gesättigter wässriger Natriumchloridlösung (Volumen-Verhältnis 6:3:1) imprägniert und. 10-15 Minuten an der Luft getrocknet. Auf die Startlinie wird abweohslungsweise ein Tropfen einer methanol ischen Lösung der Vergleiohssubsfeänz (Startpunkte 1, 3, 5 und 7) und des Ferrirubins (Startpunkte 2, 4," 6 und 8)! compared to other sideramines, see table. The method | is as follows: A sheet of Whatman No. 1 filter paper is washed with a mixture of acetone, water and saturated aqueous Sodium chloride solution (volume ratio 6: 3: 1) impregnated and. Air dried for 10-15 minutes. On the The starting line is alternately a drop of methanol ical solution of the comparison subsections (starting points 1, 3, 5 and 7) and the ferrirubin (starting points 2, 4, "6 and 8)

8Q98Q6/07648Q98Q6 / 0764

aufgetragen. Das Chromatogramm wird während ca. 20 Stunden entwickelt mit dem Fliessmittel tert.-Butanol/0,004-n. Salzsäure/gesätt.wäss. Natriumchloridlösung (2:1:1). Die Flecke der Sideramine werden durch ihre Eigenfarbe erkannt. Trotz des relativ geringen Unterschiedes in den Rf-Werten einiger Sideramine ergibt sich nach der beschriebenen Methode eine eindeutige Unterscheidung.applied. The chromatogram lasts for about 20 hours developed with the superplasticizer tert-butanol / 0.004-n. Hydrochloric acid / sat. Sodium chloride solution (2: 1: 1). the Sideramine spots are recognized by their own color. Despite the relatively small difference in the Rf values Some sideramines result in a clear distinction using the method described.

Tabelle 1Table 1

SideraminSideramine Rf (System I)Rf (System I) Rf (System II).Rf (System II). FerrichromFerrichrome 0,280.28 0,300.30 FerricrocinFerricrocin 0,290.29 0,280.28 FerrichrysinFerrichrysine 0,260.26 0,340.34 CoprogenCoprogen 0,430.43 0,550.55 FerrirubinFerrirubin 0,420.42 0,730.73

Beispiel 2 :Example 2:

Der Stamm Penicillium variabile M 2733 wird wie in Beispiel 1 gezüchtet, das Kulturmedium mit Eisenchlorid versetzt und unter Zusatz von Celit filtriert. Man extrahiert das erhaltene Kulturfiltrat 3mal mit l/20 Volumen Chloroform-Phenol (1 Volumteil : 1 Gewichtsteil),· trennt die organische Phase ab und filtriert sie durch Celit. Dann versetzt man die organische Lösung mit 3 VolumenThe strain Penicillium variabile M 2733 is like grown in Example 1, the culture medium mixed with iron chloride and filtered with the addition of Celite. One extracts the culture filtrate obtained 3 times with 1/20 volume of chloroform-phenol (1 part by volume: 1 part by weight), · separates the organic phase and filtered through Celite. Then 3 volumes are added to the organic solution

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Aether und extrahiert sie bis zur Entfärbung mehrmals mit destilliertem Wasser. Die wässrigen Auszüge werden vereinigt, zur Entfernung von Phenolreste.n mit Aether gewaschen, im Vakuum vom Aether befreit und anschliessend lyophylisiert. Das erhaltene Rohprodukt wird wie in Beispiel 1 gereinigt. " 'Ether and extract it several times with distilled water until it becomes discolored. The aqueous extracts are combined, washed with ether to remove phenol residues, freed from ether in vacuo and then lyophilized. The crude product obtained is as in Example 1 cleaned. "'

In gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben wird Perrirubin erhalten, wenn man den Stamm Spicaria sp. M 4622 oder den Stamm Paecilomyees varioti M 4646 (bei 33 ) züchtet und das Kulturmedium wie beschrieben aufarbeitet.In the same way as described in Example 1, perrirubin is obtained if the strain Spicaria sp. M 4622 or the strain Paecilomyees varioti M 4646 (at 33) and the culture medium is processed as described.

Beispiel 5 ;Example 5;

435 mg Ferrirubin werden in 30 ml Wasser gelöst und 1,0 g 8-Hydroxychinolin,' gelöst in ca, I5 ml Methanol, zugegeben. Nach 24-std. Rühren bei Zimmertemperatur wird vom schwarzen Niederschlag (Hydroxychinolin-Eisenkomplex) ,abfiltriert und das blass gelbliche Piltrat dreimal mit jühloroform ausgezogen, um das überschüssige Reagens zu entfernen. Darauf dampft man die wässerige Lösung ein und erhält^das eisenfr.eie Perrirubin als blassgelben amorphen -· Rückstand. Ausbeute 39° m435 mg ferric Rubin are dissolved in 30 m l of water and 1.0 g 8-hydroxyquinoline dissolved in ca, I5 ml of methanol was added '. After 24 hours Stirring at room temperature, the black precipitate (hydroxyquinoline iron complex) is filtered off and the pale yellowish piltrate is extracted three times with jühloroform in order to remove the excess reagent. The aqueous solution is then evaporated, and the iron-free perrirubin is obtained as a pale yellow amorphous residue. Yield 39 ° m S

Eine in DpO gelöste· Probe der Verbindung zeigt im NMR-Spektrum (aufgenommen mit einem Varian-Spektrographen', Modell \ 60) folgende Signale :A dissolved in DPO · sample of the compound shows the NMR spectrum (taken on a Varian-spectrograph ', model \ 60) the following signals:

80 9806/07 6480 9806/07 64

1,86 ppm (14 H); 2,38 ppm (4 H); 2,92 ppm (1 H);1.86 ppm (14 H); 2.38 ppm (4 H); 2.92 ppm (1H);

3*79 Ρ?« (10 H); 4,39 Ppm (4 H); 6,03 PPm (2 H). Angaben der chemischen Verschiebungen in 4-Werten gegenüber Tetraraethylsilan = 0. Die durch Integration erhaltenen Protonenzahlen bedeuten reine Verhältniszahlen, wobei das kleinste Signal als 1 angenommen wurde*. Alle Signale ■■ bilden breite Signalanhäufungen ohne deutliche Auflösung. Die Signalhaufen bei 3>79 und 6,03 ppm besitzen deutliche Doppelmaxima, sind aber offenbar keine reinen Dublette.3 * 79 Ρ? «(10 H); 4.39 ppm (4H); 6.03 PPm (2H). Information on the chemical shifts in 4-values compared to tetraraethylsilane = 0. The proton numbers obtained by integration represent pure ratios, the smallest signal being assumed to be 1 *. All signals ■■ form broad signal clusters with no clear resolution. The signal clusters at 3> 79 and 6.03 ppm have clear double maxima, but are evidently not pure doublets.

Bei der Elementaranalyse werden folgende Vierte gefunden : C 51,12; H 7,29; N 13,00; Acetyl 0#.The following fourths are found in the elemental analysis: C 51.12; H 7.29; N 13.00; Acetyl 0 #.

Beispiel 4 : j Example 4: j

150 mg eisenfreies Ferrirubin werden mit 4 ml j. 6-n. Salzsäure in ein Glasrohr eingeschmolzen und 24 Stunden auf 110 erhitzt. Den Eindampfrückstand des Hydrolysate löst man in wenig Wasser, verdünnt mit Peinsprit auf ; ca. 30 ό1 und hydriert in Gegenwart von 50 mg vorhydriertem Platinoxyd über Nacht. Eine Probe des Eindampfrück- ! Standes prüft man durch zweidimensional Papierchromatographie (Phenol-Wasser 8:2 und Butanol-Eisessig-Wasser ; 4:1:Ij Ninhydrin) sowie durch eine Analyse nach Moore und Stein auf Aminosäuren. Beide Methoden zeigen die Anwesen- ' 150 mg of iron-free ferrirubin are mixed with 4 ml of j. 6-n. Hydrochloric acid melted in a glass tube and heated to 110 for 24 hours. The evaporation residue of the hydrolyzate is dissolved in a little water and diluted with Peinsprit; approx. 30 ό1 and hydrogenated in the presence of 50 mg of prehydrogenated platinum oxide overnight. A sample of the evaporation return! The status is checked by two-dimensional paper chromatography (phenol-water 8: 2 and butanol-glacial acetic acid-water; 4: 1: Ij ninhydrin) and by analysis according to Moore and Stein for amino acids. Both methods show the presence '

heit von Ornithin, Serin und Glycin. Serin und Glycin sind :called ornithine, serine and glycine. Serine and glycine are:

809806/0764809806/0764

im molekularen Verhältnis 2:1 vorhanden.present in a molecular ratio of 2: 1.

Beispiel 5 *Example 5 *

28 rag eisenfreies Perrirubin, gelöst in 1 ml · Methanol, werden mit 25 mg Eisenchlorid in 2 ml Methanol vermischt. Es tritt sofort eine tiefe violettschwarze Farbe auf, die nach Abpuffern der Lösung mit etwas krist. Natriumacetat nach rotbraun umschlägt. Nach 1-std. Stehen wird im Vakuum zur Trockne verdampft, der Rückstand in 5| ml Wasser gelöst, mit Natriumchlorid etwa halb gesättigt und das Perrirubin mit Benzylalkohol extrahiert. Die Extrakte werden mit gesätt. Natriumchloridlösung gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wird mit Aether verdünnt und das Sideramin wieder mit Wasser ausgezogen. Durch Eindampfen der mit Aether gewaschenen Auszüge erhält man Perrirubin, ca. 25 mg orangerotes Pulver. Durch PapierChromatographie in den Lösungsmittelsystemen I und II (si Tab. l) wird gezeigt, dass der auf diesem Wege gewonnene Eisenkomplex mit dem"direkt isolierten identisch ist.28 rag iron-free perrirubin, dissolved in 1 ml · methanol, are mixed with 25 mg iron chloride in 2 ml methanol mixed. Immediately a deep purple-black appears Color, which after buffering the solution with a bit of crystalline. Sodium acetate turns reddish brown. After 1 hour Standing is evaporated to dryness in vacuo, the residue in 5 | ml of water dissolved, about half saturated with sodium chloride and extracted the perrirubin with benzyl alcohol. The extracts are sat. Washed sodium chloride solution and dried with sodium sulfate. The solution is with Aether diluted and the sideramine extracted again with water. Evaporation of the ether-washed extracts gives perrirubin, approx. 25 mg of orange-red powder. By Paper chromatography in solvent systems I and II (see Tab. 1) it is shown that the won in this way Iron complex is identical to the "directly isolated.

809806/0764809806/0764

Beispiel 6 : : Example 6 ::

Zu einer Aufschlämmung von 100 mg 10-proz. jTo a slurry of 100 mg 10 percent. j

I Palladiumkohle in 5 ml Methanol gibt man eine Lösung von ;I palladium carbon in 5 ml of methanol is given a solution of;

149 mg Ferrirubin in 5 ml Methanol und rührt das Gemisch149 mg of ferrirubin in 5 ml of methanol and stir the mixture

bei Zimmertemperatur in einer Wasserstoffatmosphäre. Die ; Wasserstoffaufnähme ist anfangs sehr rasch. Nach ca. 1 Std. sind ca. 3 Mol Wasserstoff aufgenommen und die Hydrierung kommt zum Stillstand. Nun wird vom Katalysator abfiltriert. Zum orangebraunen Piltrat fügt man eine Lösung von 100 mg Eisen(III)-chlorid in Methanol hinzu, um allenfalls reduziertes Eisen zu ersetzen und puffert die Lösung ab durch Zugabe von etwas krist. Natriumacetat. Nach 4-stündigem Stehen wird die Lösung im Vakuum eingedampft, der Rückstand in.Wasser aufgenommen und die Lösung mehrmals mit Phenol-Chloroform (Ig : 1 ml) ausgeschüttelt. Der durch Celit filtrierte Phenol-Chloroform-Auszug wird mit 2 Vol. Aether verdünnt, dreimal mit dest. Wasser ausgeschüttelt und die mit Aether gewaschenen wässrigen Lösungen im Vakuum einge- · dampft. Man erhält Hexahydroferrirubin als orangegelbes amorphes Pulver; Ausbeute : 132 mg. UV.-Absorptionsmaxima ,in Peinsprit : Hohe Endabsorption bei 220 ιτιμ (log £ über 4); Maximum bei 425-430 ηιμ (log £ 3,5). IR.-Spektrum in Nujöl, siehe Pig. 3. In der Papierchromatographie sind die Rf-Werte in den Systemen I und II :at room temperature in a hydrogen atmosphere. The ; Hydrogen uptake is very rapid at first. After approx. 1 hour approx. 3 mol of hydrogen have been absorbed and the hydrogenation comes to a standstill. The catalyst is now filtered off. A solution of 100 mg of iron (III) chloride in methanol is added to the orange-brown piltrate to remove any reduced Replace iron and buffer the solution by adding some crystalline. Sodium acetate. After 4 hours Standing, the solution is evaporated in vacuo, the residue is taken up in.Wasser and the solution is repeated several times with phenol-chloroform (Ig: 1 ml) shaken out. The phenol-chloroform extract, filtered through Celite, is mixed with 2 vol. Ether diluted, three times with dist. Shaken out water and the aqueous solutions washed with ether in a vacuum steams. Hexahydroferrirubin is obtained as an orange-yellow amorphous powder; Yield: 132 mg. UV absorption maxima , in torment fuel: high final absorption at 220 ιτιμ (log £ over 4); Maximum at 425-430 ηιμ (log £ 3.5). IR spectrum in Nujöl, see Pig. 3. In paper chromatography they are Rf values in systems I and II:

809806/0764809806/0764

I III II

Perrirubin 0,52 0,81 Hexahydroferrirubin 0,57 . 0,80Perrirubin 0.52 0.81 Hexahydroferrirubin 0.57. 0.80

Perrirubin gibt einen rötlich-braunen, das Hydrierungs«·. Perrirubin gives a reddish-brown, the hydrogenation «·.

produkt einen gelborangen Fleck.product a yellow-orange stain.

Beispiel 7 Example 7 ' '

Ϊ g rohes Hexahydroferrirubin wird in 40 ml Wasser gelöst und mit 1,5 g 8-Hydroxychinolin, gelöst in 15 ml Methanol, vermischt. Nach 24-std. Rühren bei 20° filtriert man vom ausgeschiedenen Eisen(III)-oxinat ab. Das Piltrat wird 5mal mit.Chloroform ausgeschüttelt und dann im Vakuum zur Trockene verdampft. Man erhält 900 mg Desferri-hexahydroferrirubin" der Formel IIΪ g of raw hexahydroferrirubin is in 40 ml Dissolved water and mixed with 1.5 g of 8-hydroxyquinoline dissolved in 15 ml of methanol. After 24 hours Stir at 20 ° the precipitated iron (III) oxinate is filtered off. The Piltrat is shaken out 5 times with chloroform and then evaporated to dryness in vacuo. 900 mg are obtained Desferri-hexahydroferrirubin "of the formula II

3
CH-CH2-CH2OH CH^
3
CH-CH 2 -CH 2 OH CH ^

^2 CO-NH-CH2- CO CH-CH2-CH2OH^ 2 CO-NH-CH 2 - CO CH-CH 2 -CH 2 OH

.ι , , / a Λ te.ι,, / a Λ te

HO-N-(CH0),-CH NHHO-N- (CH 0 ), - CH NH

NH ' CH-(CHg)3-N-OHNH 'CH- (CHg) 3 -N-OH

CO· COCO · CO

HOCH2-CH NH IIHOCH 2 -CH NH II

NH CH-CH2OHNH CH-CH 2 OH

CO—CH-NH-L-COCO-CH-NH-L-CO

(CH2J3-N-Co-CH2-CH-CH2-CH2OH OH CH3 (CH 2 J 3 -N-Co-CH 2 -CH-CH 2 -CH 2 OH OH CH 3

9806/07649806/0764

als nahezu amorphes farbloses Pulver, das mit Perrichlorid ^ ' ' vlf^S§fMaÄi«^ötioi) όΐή© viölest© Farbreaktion zeigt» Imas an almost amorphous colorless powder which shows color reaction with perrichloride ^ '' vlf ^ S§fMaÄi «^ ötioi) όΐή © viölest ©» Im

NMH-Spektrum, das in Dgl folgende Signale :LMWH spectrum, which in Dgl the following signals:

(ppm) Aufspaltung 0,93 d (J - 5 cps) (ppm) breakdown 0.93 d (J - 5 cps)

1,2 - 2,2 b1.2-2.2 b

2,4
3,4 - 4,:
2.4
3.4 - 4,:

aufgenommen wird, findet manis recorded, one finds

Anzahl H ZuordnungNumber of H assignment

■ 9 Methylgruppen der 5-Hydroxy-3-methyl-pentansäurereste. ■ 9 methyl groups of the 5-hydroxy-3-methyl-pentanoic acid residues.

ß- und 7-CH2 der N-Hydroxy-ornithinrestej 7-CH2 der 5-Hydroxy-3-methyl-pentansäurereste; ß-CH der 5-Hydroxy-3-methyl-pentansäurereste. β- and 7-CH 2 of the N-hydroxy-ornithine residues; 7-CH 2 of the 5-hydroxy-3-methyl-pentanoic acid residues; ß-CH of the 5-hydroxy-3-methylpentanoic acid residues.

a-CHp der 5-Hydroxy-3-methyl-pentansäure- reste.a-CHp of the 5-hydroxy-3-methylpentanoic acid residues.

IB £-CH der N-Hydroxy-IB £ -CH the N-Hydroxy-

orni^hinreste; CH2 des Glycinrestes; CH2 der Serinreste; £-CH2 der 5-Hydroxy-3-methylpentansäurereste. orni ^ remnants; CH 2 of the glycine residue; CH 2 of the serine residues; £ -CH 2 of the 5-hydroxy-3-methylpentanoic acid residues.

a-CH der N-Hydroxy-ornithin- und Serinreste.a-CH the N-hydroxy-ornithine and serine residues.

Beispiel 8 ;Example 8;

t i 900 mg Besferri-hexahydroferrirubin werden mit 30 »1 ti. Salzsäure im Wasserbad auf ca. 95° erwärmt. In Abständen von ca. 5 Min. wird ein Tropfen der Lösung auf der Tüpfelplatte mit 2 Tropfen 2-proz. methanolischert i 900 mg Besferri-hexahydroferrirubin are with 30 »1 day Hydrochloric acid heated to approx. 95 ° in a water bath. In At intervals of approx. 5 minutes, a drop of the solution is added to the spot plate with 2 drops of 2 percent. methanolic

-chloridlösung versetzt. Anfänglich tritt einechloride solution added. Initially one occurs

ORIGINAL INSPECTED , 809806/0764 ~~~"~ORIGINAL INSPECTED, 809806/0764 ~~~ "~

starke violette Farbreaktion auf. Nach 50 Min, ist die Farbreaktion nur noch ,sehr blass. Die Hydrolyse wird abgebrochen und die Lösung, welche das Cyclo-(L~&-hydroxyornithyl-glycyl-L-£-hydroxyornithyl-L-seryl-L-&-hydroxyornithyl-L-seryl) enthält, im Vakuum eingedampft. Den Rückstand acetyliert man mit je 10 ml Essigsäureanhydrid und Pyridin während 5 Std. bei Zimmertemperatur. Das Reaktionsgemisch wird erneut im Vakuum eingedampft. Zur partiellen Ammonolyse der gebildeten Q-Acetylbindungen wird das, Reaktionsprodukt in 60 ml kaltgesättigtem methanolischem Ammoniak K Std. stehen gelassen. Der Eindampfrückstand dieser Lösung, der das Desferrichrysin und Nebenprodukte enthält, wird darauf in methanolischer Lösung mit 1 g Eisen(IIl)-chlorid umgesetzt, die tief violette Lösung mit krlst. Natriumacetat gepuffert, bis ein Farbumschlag nach orangebraun eintritt, und die Lösung nach 4-stündigem Stehen eingedampft. Den Rückstand löst man in Wasser, gibt ca. 10$ Natriumchlorid dazu und schüttelt mehrmals mit. Phenol-Chloroform (Ig : 1 ml) aus und filtriert die anfänglich trübe Phenol-Chloroformlösung durch eine Säule aus 10 g Celite. Das klare Filtrat verdünnt man mit Aether und extrahiert dreimal mit dest. Wasser. Die gut mit Aether gewaschenen wässerigen Auszüge dampft man im Vakuum ein und reinigt das Rohprodukt durch eine Craig-Verteilung über 50 Stufen. Als Lösungsmittelsystem verwendet man ein' strong violet color reaction. After 50 minutes, the color reaction is only very pale. The hydrolysis is stopped and the solution, which contains the cyclo- (L ~ & -hydroxyornithyl-glycyl-L- £ -hydroxyornithyl-L-seryl-L - & - hydroxyornithyl-L-seryl), evaporated in vacuo. The residue is acetylated with 10 ml each of acetic anhydride and pyridine for 5 hours at room temperature. The reaction mixture is again evaporated in vacuo. For partial ammonolysis of the Q-acetyl bonds formed, the reaction product is left to stand in 60 ml of cold-saturated methanolic ammonia for K hours. The evaporation residue of this solution, which contains the desferrichrysin and by-products, is then reacted in methanolic solution with 1 g of iron (III) chloride, the deep violet solution with krlst. Sodium acetate buffered until the color changes to orange-brown, and the solution evaporated after standing for 4 hours. The residue is dissolved in water, about 10 $ sodium chloride is added and shaken several times. Phenol-chloroform (Ig: 1 ml) and filtered the initially cloudy phenol-chloroform solution through a column of 10 g of Celite. The clear filtrate is diluted with ether and extracted three times with dist. Water. The aqueous extracts, washed well with ether, are evaporated in vacuo and the crude product is purified by a Craig distribution over 50 stages. The solvent system used is a '

809806/0764809806/0764

• Gemisch aus 9 Teilen n-Butanol, 9 Teilen Benzylalkohol, 15 !Teilen 0,001-n. Salzsäure und 5 Teilen gesätt. wäss. Natriumchloridlösung. Die Hauptkomponente des Gemisches ist in der Stufe 19 am stärksten angereichert, was einem Verteilungskoeffizienten von 0,62 entspricht (authentisches Perrichrysin : k « 0,63).• Mixture of 9 parts of n-butanol, 9 parts of benzyl alcohol, 15 ! Divide 0.001-n. Hydrochloric acid and 5 parts sat. water Sodium chloride solution. The main component of the mixture is most enriched in stage 19, which is a distribution coefficient of 0.62 (authentic Perrichrysin: k «0.63).

Die Fraktionen 12 bis 25 werden in üblicher Weise mit Phenol-Chloroform aufgearbeitet. Man erhält 202 mg Perrichrysin, das durch Kristallisation aus Aethylalkohol weiter gereinigt wird. Die rotorangen Kristalle zersetzen sich, wie" authentisches Perrichrysin, langsam bei ca. 250-260°, -ohne zu schmelzen.Fractions 12 to 25 are worked up in the usual way with phenol-chloroform. 202 mg are obtained Perrichrysin, which is further purified by crystallization from ethyl alcohol. The red-orange crystals decompose like "authentic perrichrysin" slowly at approx. 250-260 ° without melting.

1 Das Produkt verhält sich bei der Papierchromatographie in den Systemen I und II genau wie authentisches Perrichrysin (vgl. Tabelle 2), und das IR.-Absorptionsspektrum stimmt mit dem von authentischem Perrichrysin 1 The product behaves in paper chromatography in systems I and II exactly like authentic perrichrysin (see Table 2), and the IR absorption spectrum agrees with that of authentic perrichrysin

völlig überein. Papierchromatographie :completely agree. Paper chromatography:

Tabelle 2Table 2

System I
Kieselgel-
Platte
System I.
Silica gel
plate
FilterpapierFilter paper System II
Filter
papier
System II
filter
paper
Perrichrysin, auth.
Umwandlungsprodukt
Perrichrysin, auth.
Conversion product
Rf 0,129
Rf 0,129
Rf 0.129
Rf 0.129
0,39
0,39
0.39
0.39
0,32
0,32
0.32
0.32

809806/0764809806/0764

Im Antagonismus-Test gegen Ferrimycin A verhält sich das Produkt wie natürliches Perrichrysin.In the antagonism test against ferrimycin A, the product behaves like natural perrichrysin.

809806/0764809806/0764

Claims (3)

- 29 Patentansprüche :- 29 claims: 1. Die Verwendung von Penicillium variabile M 2733» Spicaria sp. M 4622 oder Paecilomyces varioti M 4646 zurHer stellung von Ferrirubin und Desferrirubin mittels üblicher Züchtungsbedingungen.1. The use of Penicillium variabile M 2733 »Spicaria sp. M 4622 or Paecilomyces varioti M 4646 for her production of ferrirubin and desferrirubin by means of the usual cultivation conditions. 2. Ferrirubin^der Fe(III)-Komplex von Cyclo--feeryl)p glycyl-[Np-hydroxy-N^-(trans-5-hydroxy-3-methyl-pentenyl)-ornithylJ^J. 2. Ferrirubin ^ the Fe (III) complex of cyclo-feeryl) p glycyl- [N p -hydroxy-N ^ - (trans-5-hydroxy-3-methyl-pentenyl) -ornithylJ ^ J. 3. Desferrirubin der Formel Cyclo-£(seryl)p-glycyl-[N^-hydroxy-N^-(trans-5-hydroxy-3-methyl-pentenyl)-ornithyl]3). 3. Desferrirubin of the formula cyclo- £ (seryl) p-glycyl- [N ^ -hydroxy-N ^ - (trans-5-hydroxy-3-methyl-pentenyl) -ornithyl] 3 ). Neue Unteriagen (Art. 7 ξ Τ Abe. 2 Nr. I Satz 3 des ÄmJerungsg·«· v. 4.9. J9«7) New documents (Art. 7 ξ Τ Abe. 2 No. I sentence 3 of the ÄmJerungsg · «· of 4.9. J9« 7) 809806/0 7 64809806/0 7 64
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