DE1442220A1 - Process for the production of new active ingredients - Google Patents
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Heut fiir den Druck der O/ftnlegungsechrift beiitiapt« An— aeldungeunterlagen - uns« Zeiobem 20 157-BR/ro -Today for the printing of the publication enclosed with "An- aeldungeunterlagen - us «Zeiobem 20 157-BR / ro -
, 1442220 CIBA AKTIENGESELLSCHAFT, BASEL (SCHWEIZ) , 1442220 CIBA AKTIENGESELLSCHAFT, BASEL (SWITZERLAND)
Case 5157/I-3/ECase 5157 / I-3 / E
DeutschlandGermany
Verfahren zur Herstellung neuer Wirkstoffe.Process for the production of new active ingredients.
Aus Materialien biologischen Ursprungs, insbesondere Mikroorganismen, ist bereits eine grössere Anzahl eisenhaltiger Wuchsstoffe isoliert worden, beispielsweise die Ferrichrome, das Coprogen, die Ferrioxamine,There are already a large number of materials of biological origin, in particular microorganisms ferrous growth substances have been isolated, for example the ferrichrome, the coprogen, the ferrioxamine,
Es wurde nun gefunden, dass man aus Aspergillus-Stämmen einen neuen eisenhaltigen Wuchsstoff, das Ferrirho-It has now been found that Aspergillus strains a new ferrous growth substance, the Ferrirho-
809805/0960 Neu© Untertanen (Art.7IiAh. 9 w,.809805/0960 New © subjects (Art.7IiAh. 9 w ,.
din, und die entsprechende eisenfreie Verbindung, das Desferrirhodin, gewinnen kann. Ferrirhodin-bildende Stämme sind ZwBv Aspergillus versicolor ETH M 3636 und Aspergillus nidulans ETH M 2734. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung dieser Stämme zur Herstellung von Ferrirhodin und Desferrirhodin, mittels üblicher Züchtungsbedingungen, Perrirhodin und Desferrirhodin werden bei der Züchtung der genannten Stämme neben dem Wuchsstoff Perri- " crocin bzw. Desferricrocin gebildet. ·din, and the corresponding iron-free compound, the desferrirhodin, can win. Ferrirhodin-producing strains are ZwBv Aspergillus versicolor ETH M 3636 and Aspergillus nidulans ETH M 2734. The present invention is hence the use of these strains to produce ferrirhodine and desferrirhodin, by means of usual cultivation conditions, perrirhodin and desferrirhodin are in the Breeding of the named strains in addition to the growth substance Perri- " crocin and desferricrocin are formed. ·
Die genannten Stämme werden in der Eidgenössischen Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, und in unseren Laboratorien unter der angegebenen Bezeichnung aufbewahrt. Sie wurden ferner im United States Department of· Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, unter den Nummern NRRL 3052 (= M 3636) und NRRL 3055 (= M 2734) hinterlegt.The named strains are in the Federal Institute of Technology, Institute for Special Botany, Zurich, and in our laboratories under the specified Designation retained. They have also been registered in the United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, under numbers NRRL 3052 (= M 3636) and NRRL 3055 (= M 2734).
Die Bestimmung .der Aspergillus-Art erfolgte nach CH.Tho and K.B.Raper, A Manual of Aspergilli, The Williams . and Wilkins Co., Baltimore, I945.The Aspergillus species was determined according to CH.Tho and K.B. Raper, A Manual of Aspergilli, The Williams. and Wilkins Co., Baltimore, 1945.
Beide Stämme wurden aus einem Rieselboden von Münster, Westfalen, isoliert.Both strains were isolated from a Rieselboden from Münster, Westphalia.
Aspergillus versicolor M 3636 ist durch' grüne, z.T. auch fleischfarbene Konidienkb'pfchen, nicht gefärbte, ' glatte Konidienträgerwände und eine doppelte Serie Sterigmen, ferner durch kugelige Veszikel und das Fehlen vonAspergillus versicolor M 3636 is characterized by 'green, partly also flesh-colored conidia cups, not colored, ' smooth conidial support walls and a double series of sterigms, furthermore by spherical vescicles and the absence of
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Perithecien gekennzeichnet als Vertreter der Aspergillus versicolor-Gruppe. Der stacheligen Konidien wegen ist er der Art Aspergillus versicolor (Vuill.) Tiraboschi 19O8 zuzuordnen (I.e. S.192).Perithecia marked as representatives of the Aspergillus versicolor group. It is because of the prickly conidia assigned to the species Aspergillus versicolor (Vuill.) Tiraboschi 19O8 (I.e. p.192).
Aspergillus nldulans M 2734 bildet in Reinkultur Perithecien mit rotbraunen Ascosporen, wodurch seine Zugehörigkeit zur Aspergillus nidulans-Gruppe sichergestellt ist. Die zwei, ca. 1μ breiten Längsleisten an den glatten Ascosporen sind typisch für die Art Aspergillus nidulans (Eidam) Wint. in Rabh. 1884. Stamm M 2734 differiert nur unwesentlich von der Beschreibung bei Thorn u. Raper, nämlich in der meist etwas blasseren Pigmentierung und in den wenig breiteren Längsleisten.Aspergillus nldulans M 2734 forms in pure culture Perithecia with red-brown ascospores, making its affiliation to the Aspergillus nidulans group is assured. The two, approx. 1μ wide longitudinal strips on the smooth Ascospores are typical of the species Aspergillus nidulans (Eidam) Wint. in Rabh. 1884. Strain M 2734 only differs insignificant from the description in Thorn and Raper, namely in the mostly somewhat paler pigmentation and in the little wider longitudinal ridges.
Perrirhod.in ist eine rotbraune, kristalline Substanz. Es weist eine ähnliche Struktur auf wie die Sideramine Ferrichrom, Ferrichrom A, Perricrocin, Ferrichrysin und Ferrirubin, die alle Eisen komplex an i-N-Acyl-i-N-L-hydroxy-ornithinreste gebunden enthalten und in denen das ^-Hydroxyornithin mit einer oder zwei weiteren Aminosäuren zu einem cyclischen Hexapeptid verbunden ist. Die Bausteine der genannten Sideramine sind aus der folgenden Tabelle ersichtlich :Perrirhod.in is a red-brown, crystalline substance. It has a similar structure to the sideramines ferrichrom, ferrichrom A, perricrocin, and ferrichrysin and ferrirubin, which are all iron complexes attached to i-N-acyl-i-N-L-hydroxy-ornithine residues contain bound and in which the ^ -hydroxyornithine with one or two other amino acids is linked to a cyclic hexapeptide. The building blocks of the sideramines mentioned are shown in the table below :
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ornithin£ -N-hydroxy-
ornithine
Die Säurekomponente des Ferrirhodins konnte im Sinne der Formel I (eis) aufgeklärt werden, indem es gelang, nach der Hydroxamsäurespaltung mittels Perjodsäure da^ Lakton der 5-Hydroxy-3-methyl-penten-(2)-säure (II) zu fassen und seine Konstitution durch das UV.-, IR.- und vor allem das NMR-Spektrum abzuleiten.The acid component of ferrirhodine could be elucidated in the sense of formula I (ice) by succeeding after hydroxamic acid cleavage by means of periodic acid there is lactone of 5-hydroxy-3-methyl-pentenoic acid (II) and to deduce its constitution from the UV, IR and especially the NMR spectrum.
HOCH2-CH2-C=CH-CO-HOCH 2 -CH 2 -C = CH-CO-
I III II
Im IR.-Absorptionsspektrum (in Tetrachlorkohlenstoff) zeigt die Verbindung eine starke Bande bei I73O cm" , die einer Carbonylgruppe (Lakton, Ester) zuzuschreiben ist. Ein hohes UV.-Absorptionsmaxirnum bei 216-217 πιμ (loci:= 3,92In the IR absorption spectrum (in carbon tetrachloride) the compound shows a strong band at 170 cm ", which can be ascribed to a carbonyl group (lactone, ester). A high UV absorption maximum at 216-217 πιμ (loci: = 3.92
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in Peinsprit) zeigt, dass zur Carbony!gruppe eine Doppelbindung konjugiert ist. Das Spektrum zeigt ferner ein hohes Absorptionsmaximum bei 254 πιμ und im sichtbaren Gebiet ein breites Maximum bei 445-450 ιημ. Die NMR.-Signale (in Tetrachlorkohlenstoff) sind sehr gut aufgelöst und lassen sich den einzelnen Wasserstoffatomen eindeutig zuordnen. Die chemischen Verschiebungen sind in ö-Werten angegeben, Spin-Spin-Wechselwirkungen in cps. Es bedeuten : d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett. Man findet folgende Signale :in Peinsprit) shows that there is a double bond to the carbony group is conjugated. The spectrum also shows a high absorption maximum at 254 πιμ and in the visible area broad maximum at 445-450 ιημ. The NMR signals (in carbon tetrachloride) are very well resolved and can be clearly assigned to the individual hydrogen atoms. the chemical shifts are given in δ values, spin-spin interactions in cps. The following mean: d = doublet, t = triplet, q = quartet. The following signals can be found:
2,00 ppm (d, J = 1,2 cpsj 3 H),2.00 ppm (d, J = 1.2 cpsj 3 H),
2,3β ppm (t, J = 6,3 cps; 2 H),2.3β ppm (t, J = 6.3 cps; 2 H),
4,31 ppm (t, J = 6,3 cpsj 2 H),4.31 ppm (t, J = 6.3 cpsj 2 H),
5,68 ppm" (q, J = 1,2 cpsj 1 H).5.68 ppm "(q, J = 1.2 cpsj 1 H).
Interne Bezugssubstanz : Tetramethylsilan-Internal reference substance: tetramethylsilane
Das Signal der Methylgruppe 3 neben der Doppelbindung ist durch das Proton an C-2 infolge 1,3-Wechselwirkung über die Doppelbindung in ein Dublett mit kleiner Kupplungskonstante gespalten. Die gleiche Wechselwirkung spaltet anderseits das Signal des einzelnen Protons an C-2-mit der gleichen Kupplungskonstante - in ein Quartett. Ausserdem findet man die Signale der Methylengruppen ;an C-4 und C-5 bei 2,36 bzw. 4,31 ppm, die durch Spin-Spin-Wechselwirkung als Triplett mit der normalen Kupplungskonstante von ca. 6 cps. in Erscheinung treten.The signal of methyl group 3 next to the double bond is due to the proton at C-2 as a result of 1,3 interaction split via the double bond into a doublet with a small coupling constant. The same interaction on the other hand, splits the signal of the single proton at C-2 - with the same coupling constant - into a quartet. Besides that the signals for the methylene groups are found at C-4 and C-5 at 2.36 and 4.31 ppm, respectively, which are due to spin-spin interaction as a triplet with the normal coupling constant of approx. 6 cps. appear.
Durch diese spektroskopischen Daten ist die Konstitution des Abbaulaktons mit sehr grosser Wahrscheinlich-Based on these spectroscopic data, the constitution of the degradation lactone is very likely
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keit Im Sinne von Formel II gegeben.given in the sense of formula II.
Ferrirhodin wird die folgende Formel III zugeschrieben: Ferrirhodine is assigned the following formula III:
CH CO Mi CHCH CO Mi CH
HH (CH) R (CH ) \0 HH (CH) R (CH) \ 0
/ Vx0 A \/ Vx 0 A \
/ V I1 / CW \/ VI 1 / CW \
CH (CH) UT 0PΌ CCH (CH) UT 0PΌ C
, χ _ Xi.3 / \, χ _ Xi.3 / \
CH- (CH9) ,-UT^- 0 TPe Ό CH-CH0OHCH- (CH 9 ), -UT ^ - 0 TPe Ό CH-CH 0 OH
BH „/ CO.BH "/ CO.
CO KHCO KH
^ NH CO CH^ NH CO CH
CH2OHCH 2 OH
R = OH-CH0-CH0-C=CH- ' . ■R = OH-CH 0 -CH 0 -C = CH- '. ■
d.d. d j d j
(eis) CH3 III(ice) CH 3 III
i Ferrirhodin hat die Elementarzusammensetzung C =x 49,28 %; H = 6,38 %} N= 12,30 %; Fe = 6,25 %, Diese- Daten entsprechen der Bruttoformel Ο^,Η,-^Ο, „NQFe. Das UV-Spek-i Ferrirhodin has the elemental composition C = x 49.28 %; H = 6.38 %} N = 12.30 %; Fe = 6.25 %, these data correspond to the gross formula Ο ^, Η, - ^ Ο, “N Q Fe. The UV spec-
1 Ψ 1 Ψ
trum in Feinsprit zeigt folgende Maxima: 215 mp- (lögLET ■' =trum in Feinprit shows the following maxima: 215 mp- (lög L E T ■ ' =
i j χ cmi j χ cm
2,55); 252 ΐημ (log *\ ^ « 2,33); ^5 Γημ (log E^ Jm = 1,58).2.55); 252 ΐημ (log * \ ^ «2.33); ^ 5 Γημ (log E ^ J m = 1.58).
Das Maximum bei 252 ιημ fehlt bei den Acethydroxa- maten Ferrichrom, Ferrichrysin und Ferricrocin, wie auch beiThe maximum at 252 ιημ absent in Acethydroxa- maten Ferrichrome, Ferrichrysin and ferricrocin, as with
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den Perrloxaminen. Es ist sehr wahrscheinlich charakteristisch für Eisentrihydroxamate mit α,ß-ungesättigter Säurekomponente, indem es ausser beim Ferrirhodin auch beim Perrichrom A (ß-Methylglutaconsäure als Säurekomponente) gefunden wird. Das gleiche Maximum findet sich auch bei Ferrirubin und beim Coprogen mit bisher unbekannter Säurekomponente. Das IR-Spektrum in Kaliumbromid weist u.a. Banden auf bei 852," 933, 988, IO38, 1142, II90, 1244, 1355, 1460, 1539, 1660, 2945, 3440 cm"1, vgl. Fig. 1.the pearl oxamines. It is very likely characteristic of iron trihydroxamates with α, ß-unsaturated acid components, as it is found not only in ferrirhodine but also in perrichrome A (ß-methylglutaconic acid as acid component). The same maximum is also found with ferrirubin and with coprogen with a previously unknown acid component. The IR spectrum in potassium bromide has, inter alia, bands at 852, "933, 988, IO38, 1142, II90, 1244, 1355, 1460, 1539, 1660, 2945, 3440 cm" 1 , see FIG. 1.
Die Kristalle zersetzen sich bei etwa 2700C unter Schwarzfärbung, ohne zu schmelzen. Im Papierchromatogramm werden folgende Rf-Werte erhalten : 0,43 im System I (n-Butanol-Eisessig-Wasser, 4:1:1) und 0,88 im System II (tert.-Butanol-0,004-n. Salzsäure-gesättigte wässerige Natriumchloridlösung, 2:1:1; Papier imprägniert mit Aceton-Wasser-gesättigte wässerige Natriumchloridlösung, 6:3:1). Unter den gleichen Versuchsbedingungen werden für Ferrichrom die Rf-Werte 0,28 (System I) und 0,30 (System II), für Coprogen 0,43 (System I) und 0,55 (System II), für Perrichrysin 0,26 (System I) und 0,34 (System II), für Perrirubin 0,42 (System I) und 0,73 (System II) und für' Perricrocin 0,29 (System I) und 0,28 (System II) erhalten.The crystals decompose at about 270 ° C., turning black, without melting. The following Rf values are obtained in the paper chromatogram: 0.43 in system I (n-butanol-glacial acetic acid-water, 4: 1: 1) and 0.88 in system II (tert.-butanol-0.004-n. Hydrochloric acid saturated aqueous sodium chloride solution, 2: 1: 1; paper impregnated with acetone-water-saturated aqueous sodium chloride solution, 6: 3: 1). Under the same test conditions, the Rf values for ferrichrome are 0.28 (system I) and 0.30 (system II), for coprogen 0.43 (system I) and 0.55 (system II), for perrichrysin 0.26 (System I) and 0.34 (System II), for perrirubin 0.42 (System I) and 0.73 (System II) and for perricrocin 0.29 (System I) and 0.28 (System II) .
Bei der Behandlung des Ferrirhodins mit 3asen oder Säuren oder mit Eisenkomplex-bildenden Stoffen wird das Eisen aus dem Molekül entfernt, wobei das farbloseWhen treating ferrirhodine with 3ases or acids or with substances that form iron complexes, the iron is removed from the molecule, whereby the colorless
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Desferrirhodin gebildet wird.Desferrirhodin is formed.
Bei der katalytisehen Hydrierung des Ferrirho- dins wird die cis-5-Hydroxy-3-methyl-penten-(2)-säure hydriert, ohne dass der übrige Teil des Moleküls angegriffen wird. Man erhält so Hexahydroferrirhodin, dessen Säurekomponente die 5-Hydroxy-3-methyl-valeriansäure ist,. Das Hexahydroferrirhodin ist identisch mit dem Hexahydroferrirubin, das durch Hydrierung von Perrirubin erhalten wird, dessen Säurekomponente die trans-5-Hydroxy-3-methyl-penten-(2)-säure ist (vgl. Anm.Nr. C 301Ö0 IVa/6b _ Case 5089/1-4/E). Das IR.-Spektrum der Hexahydroverbindung in Nuj öl ist in .Fig. 2 dargestellt. Im UV-Spektrum des Hexahydroferrirhodins ist die Absorptionsbande bei 254 πιμ verschwunden und die Absorptionsbande im Sichtbaren nach 425-430 πιμ verschoben. Die Absorptionskurve ist praktisch deckungsgleich mit der des Ferrichrysins (dieses besitzt an Stelle der drei 5-Hydroxy-3-methyl-valeriansäurereste drei Acetylreste, vgl. Anm.Nr. C 28460 IVa/6a - Case 4972/1-4/5038). Die Rf-Werte des Hexahydroferrirhodins in den Systemen I und II sind 0,57 und 0,80 im Vergleich zu 0,65 und 0,85 des Ferrirhodins (gelborange Fleck im Gegensatz zum rötlich-braunen Fleck im Gegensatz zum rötlich-braunen Fleck des Ferrirhodins). In the catalytic hydrogenation of ferriridine the cis-5-hydroxy-3-methyl-pentene (2) acid is hydrogenated, without attacking the rest of the molecule. This gives hexahydroferrirhodine, its acid component is 5-hydroxy-3-methyl-valeric acid. The hexahydroferrirhodin is identical to hexahydroferrirubin, obtained by hydrogenation of perrirubin, its Acid component is trans-5-hydroxy-3-methyl-pentene (2) acid (see note number C 301Ö0 IVa / 6b _ Case 5089 / 1-4 / E). The IR spectrum of the hexahydro compound in Nuj oil is in .Fig. 2 shown. In the UV spectrum of hexahydroferrirhodine the absorption band at 254 πιμ has disappeared and the absorption band in the visible shifted to 425-430 πιμ. The absorption curve is practically congruent with that of ferrichrysin (this has instead of the three 5-hydroxy-3-methyl-valeric acid residues three acetyl residues, see note no. C 28460 IVa / 6a - Case 4972 / 1-4 / 5038). the Rf values of the hexahydroferrirhodine in systems I and II are 0.57 and 0.80 compared to 0.65 and 0.85 of the ferrirhodine (yellow-orange spot in contrast to the reddish-brown spot in contrast to the reddish-brown spot of Ferrirhodin).
Entfernt man aus dem Hexahydroferrirhodin das Eisen, beispielsweise mittels 8-Hydroxychinolin, spaltetIf the iron is removed from the hexahydroferrirhodine, for example by means of 8-hydroxyquinoline, it splits
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in dem erhaltenen Des-ferri-hexahydroferrirhodin durch milde saure Hydrolyse die 5-Hydroxy-3-methyl-valeriansäurereste ab, acetyliert (am Stickstoff und Sauerstoff) und spaltet die O-Acetylgruppen selektiv ab, z.B. mittels Ammoniak, so erhält man Desferriehrysin, das mit' Eisen( III) salz in Perrichrysin übergeführt werden kann. Das so aus Ferrirhodin erhaltene Perrichrysin zeigt im Papierchromatogramm in den Systemen I und II dieselben Rf-Werte wie authentisches Perrichrysin.in the obtained des-ferri-hexahydroferrirhodin by mild acid hydrolysis of the 5-hydroxy-3-methyl-valeric acid residues ab, acetylated (on nitrogen and oxygen) and selectively splits off the O-acetyl groups, e.g. using ammonia, see above Desferriehrysin is obtained, which can be converted into Perrichrysin with iron (III) salt. That from Ferrirhodin The perrichrysin obtained shows the same Rf values as authentic in the paper chromatogram in systems I and II Perrichrysin.
Aus Desferrirhodin wird bei Zusatz von Eisenionen das Ferrirhodin zurückerhalten.Ferrirhodin is recovered from desferrirhodin when iron ions are added.
Derivate des Perrirhodins und Desferrirhodins und ihrer Hydrierungsprodukte sind beispielsweise Verbindungen, in denen die Hydroxylgruppe der Serinreste verestert ist, oder in denen die Acylgruppe der Hydroxamsäurereste durch andere Acylgruppen substituiert ist, beispielsweise durch Niederalkanoyl- oder Niederalkenoyl- oder andere ω-Hydroxy-alkenoylgruppen als die 5-Hydroxy-3-methylpentenoylgruppe, z.B. Propionyl, Butyryl, Pentanoyl, Pentenoyl, 5-Hydroxy-pentenoyl. Die erstgenannten Derivate werden erhalten, wenn man Ferrirhodin oder Hexahydroferrirhodin mit acylierenden Mitteln behandelt, z.B. mit Säureanhydriden oder Säurehaiogeniden, wie Essigsäureanhydrid oder Acetylchlorid, und die Ester isoliert und, wenn erwünscht, das Eisen eliminiert. Die Desacylverbindung erhält man durchDerivatives of Perrirhodins and Desferrirhodins and their hydrogenation products are, for example, compounds in which the hydroxyl group of the serine residues is esterified, or in which the acyl group of the hydroxamic acid residues is substituted by other acyl groups, for example by lower alkanoyl or lower alkenoyl or other ω-hydroxy-alkenoyl groups than the 5-hydroxy-3-methylpentenoyl group, e.g. propionyl, butyryl, pentanoyl, pentenoyl, 5-hydroxy-pentenoyl. The former derivatives are obtained when ferrirhodine or hexahydroferrirhodine are treated with acylating agents, e.g. acid anhydrides or acid halides, such as acetic anhydride or acetyl chloride, and the esters isolated and, if desired, eliminates the iron. The deacyl compound is obtained through
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Desacylierung des Desferrirhodins oder Hexahydrodesferrirhodins In müdem saurem Medium, z.B. in Gegenwart verdünnter Mineralsäuren. Das so erhaltene cyclische Hexapeptid kann in bekannter Weise acyliert werden; dabei gebildete O-Acylgruppen lassen sich mit Ammoniak, beispielsweise in Methanol, abspalten. Das Acylanalogon des Desferrirhodins kann mit Eisensalzen in den entsprechenden Eisenkomplex übergeführt werden.Deacylation of desferrirhodin or hexahydrodesferrirhodin in a tired acidic medium, e.g. in the presence of diluted Mineral acids. The cyclic hexapeptide obtained in this way can be acylated in a known manner; thereby formed O-acyl groups can be with ammonia, for example in Split off methanol. The acyl analog of desferrirhodine can be converted into the corresponding iron complex with iron salts be transferred.
Ferrlrhodin, Desferrirhodin und Analoge sind • Wuchsstoffe für verschiedene Mikroorganismen; sie können daher bei der Kultur solcher Organismen verwendet werden.Ferrlrhodin, Desferrirhodin and analogues are • growth substances for various microorganisms; you can therefore used in the culture of such organisms.
Die eisenhaltigen Verbindungen besitzen antiänaemische Eigenschaften und können dementsprechend als Heilmittel verwendet werden. Auch Desferrirhodin und seine Derivate haben wertvolle pharmakologische Eigenschaften. So verhindern sie die Ablagerung eisenhaltiger Pigmente im Gewebe bzw. bewirken in Fällen von pathologischer Eisenablagerung im Organismus eine Ausscheidung des Eisens, z.B. bei Hämochromatose und Hämoslderose. Sie können dementsprechend in der Heilkunde verwendet .werden. ■The iron-containing compounds have anti-anemic properties and can accordingly be used as remedies be used. Desferrirhodin and its derivatives also have valuable pharmacological properties. In this way they prevent the deposition of iron-containing pigments in the tissue or, in cases of pathological iron deposition an excretion of iron in the organism, e.g. in hemochromatosis and hemoslderosis. You can accordingly used in medicine. ■
Wie andere Sideramine ist auch Ferrlrhodin Im* stände, die antibakterielle Wirkung von Antibiotika, die der Gruppe der Sideromycine angehören, gegenüber grampositiven Erregern kompetitiv aufzuheben (Antisideromycin-Wirkung). Like other sideramines, Ferrlrhodin is also Im * states the antibacterial effects of antibiotics that belong to the group of sideromycins, competitively lift off against gram-positive pathogens (antisideromycin effect).
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Ferrirhodin, Desferrirhodin sowie Derivate dieser Verbindungen werden erhalten, wenn man Ferrirhodin-bildende Aspergillus-Stämme in einer wässerigen Nährlösung, die eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthält, unter aeroben Bedingungen züchtet, aus dem KuIturfiltrat Ferrirhodin und/oder Desferrirhodin isoliert und, wenn erwünscht, Ferrirhodin in die eisenfreie Verbindung überführt oder Hydrierungsprodukte oder Derivate dieser Verbindungen herstellt. Da die Bildung des Ferrirhodins und/oder Desferrirhodins durch ein eisenarmes Nährmedium begünstigt wird, ist es zweckmässig, die Züchtung unter Eisenmangel, vorzugsweise bei einem Eisengehalt von höchstens 10 Mol/Liter, vorzunehmen.Ferrirhodin, Desferrirhodin as well as derivatives of these compounds are obtained by using ferrirhodin-forming compounds Aspergillus strains in an aqueous nutrient solution, which is a carbon and nitrogen source and inorganic salts contains, cultured under aerobic conditions, isolated from the culture filtrate ferrirhodin and / or desferrirhodin and, if desired, ferrirhodin is converted into the iron-free compound or hydrogenation products or derivatives thereof Establishes connections. Because the formation of Ferrirhodins and / or Desferrirhodins by a nutrient medium poor in iron is favored, it is advisable to breed under iron deficiency, preferably with an iron content of at most 10 moles / liter.
Für die Züchtung der Stämme kommen als Kohlenstoff- und Stickstoffquellen in Betracht : Kohlenhydrate, z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, · Stärke, Alkohole, wie Mannit und Glycerin, -Aminosäuren, z.B. Ornithin, Peptide, Proteine und deren Abbauprodukte, wie Pepton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais oder Weizen, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Hefe, Samen, insbesondere der Raps- und Soyapflanze, der Baumwollpflanze, Ammoniumsalze, Nitrate. An anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate, Nitrate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Zink und Mangan sowie Spuren vonThe following carbon and nitrogen sources can be considered for breeding the strains: carbohydrates, e.g. glucose, sucrose, lactose, starch, alcohols such as mannitol and glycerine, amino acids, e.g. ornithine, peptides, Proteins and their breakdown products, such as peptone or tryptone, meat extracts, water-soluble parts of cereal grains, such as corn or wheat, distillation residues from alcohol production, yeast, seeds, especially from the rapeseed and soy plants, of the cotton plant, ammonium salts, nitrates. The nutrient solution can, for example, contain inorganic salts Chlorides, carbonates, sulfates, nitrates of alkalis, alkaline earths, magnesium, zinc and manganese as well as traces of
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Eisen enthalten.Contain iron.
Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise· in ruhender Oberflächenkultur, oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40°C, vorzugsweise 27 C. Eine wesentliche Sideraminwirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 8-12 Tagen.The cultivation takes place aerobically, for example in resting surface culture, or preferably submerged with shaking or stirring with air or oxygen in shaker bottles or the well-known fermenters. As a temperature a suitable temperature between 18 and 40 ° C, preferably 27 C. A significant sideramine effect is shown by the Nutrient solution generally after 8-12 days.
Die Ferrirhodin-Aktivität kann mikrobiologisch mittels des abgewandelten Bonifas-Test.es (vgl. Zähner et al., Arch.Mikrobiol. JjjS, 325 ff. [i960]) bestimmt werden. Als .Testlösung verwendet man eine Ferrimycinlösung von 0,1 mg/ml Gehalt, als Teststamm Staphylococcus aureus Rosenbach.The ferrirhodin activity can be microbiologically determined by means of the modified Bonifas test (cf.Zahner et al., Arch. Microbiol. JjjS, 325 ff. [1960]). as A ferrimycin solution of 0.1 mg / ml is used as the test solution Salary, as a test strain Staphylococcus aureus Rosenbach.
Man kann auch optisch die Ferrirhodin-Konzentration der Kulturlösung feststellen. Zu diesem Zweck werden 5 ml Kulturflüssigkeit mit 1,-5 g Natriumchlorid, 1 ml 0,1$- iger Ferrisulfatlösung und 5 ml Benzylalkohol 5 Minuten geschüttelt, abzentrifugiert, die organische Phase filtriert und die Extinktion der organischen Phase bei 410 πιμ bestimmt. Als Vergleichsprobe dient ein auf gleiche Weise hergestellter Extrakt aus unbeimpfter Nährlösung.The ferrirhodin concentration of the culture solution can also be determined optically. Be for this purpose 5 ml culture liquid with 1.5 g sodium chloride, 1 ml 0.1 $ - iger ferric sulfate solution and 5 ml benzyl alcohol shaken for 5 minutes, centrifuged off, the organic phase filtered and the absorbance of the organic phase determined at 410 πιμ. An extract prepared in the same way from uninoculated nutrient solution is used as a comparison sample.
Nach 8-12 Tagen erreichen die Kulturen eine Aktivität, die 100-200 mg/Liter reinem Ferrirhodin entspricht.After 8-12 days the cultures reach an activity which corresponds to 100-200 mg / liter of pure ferrirhodine.
Bei Beendigung der Züchtung kann man pro Liter 1 g Ferrichlorid zur Nährlösung geben, wobei das vorhandeneAt the end of the cultivation, 1 g of ferric chloride per liter can be added to the nutrient solution, with the existing
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Desferrirhodin in Ferrirhodin tiberge:".'/.rt wird. Der Eisenzusatz kann auch zu einem beliebigen anderen Zeitpunkt der Fermentation oder auch gestaffelt erfolgen. Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, vorzugsweise in Gegenwart eines Filterhilfsmittels, z.B. Hyflo-Supercel, wonach die Hauptmenge des Ferrirhodins im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen davon am Mycel haften. Es ist daher vorteilhaft, dieses gut auszuwaschen. Dazu eignen sich beispielsweise Wasser oder wässerige Alkohole, wie wässeriges Methanol.Desferrirhodin in Ferrirhodin tiberge: ". '/. Rt is. The iron addition can also take place at any other point in time of the fermentation or also staggered. You separate that Mycelium from the culture filtrate, preferably in the presence of one Filter aid, e.g. Hyflo-Supercel, after which the main amount des ferrirhodine is found in the culture filtrate. Nevertheless, significant amounts of it stick to the mycelium. It is therefore advantageous to wash it off well. For this purpose, for example, water or aqueous alcohols are suitable, like aqueous methanol.
Für die Isolierung von Ferrirhodin aus dem Kulturfiltrat kann man nach an sich bekannten Methoden vorgehen und z.B. eine der nachfolgend angegebenen Arbeitsweisen oder Kombinationen davon anwenden.Methods known per se can be used to isolate ferrirhodine from the culture filtrate and e.g. one of the following working methods or use combinations thereof.
1) Man kann Adsorptionsmittel verwenden, z.B. Aktivkohlen, wie Norit, aktivierte Erden, wie Frankonit, Fullererde oder Floridin, oder Harzadsorber, wie Asmit. Die Elution der Adsorbate erfolgt zweckmässig mit Gemischen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln mit Wasser, z.B. mit Wasser-Methanol-, Wasser-Pyridin-, verdünnte Essigsäure-Methanol- oder Wasser-Methanol-Eisessig-Butanol-Gemischen. Als besonders vorteilhaft für die Elution eines Frankonit- oder Noritadsorbates hat sich das Gemisch von Wasser (4 Volumteile) und Pyridin (1 Volumteil) erwiesen.1) Adsorbents can be used, e.g. activated carbons such as Norit, activated earths such as Frankonit, Fuller's earth or floridine, or resin adsorbers such as Asmit. The adsorbates are expediently eluted with mixtures of water-miscible organic solvents with water, e.g. with water-methanol-, water-pyridine- Acetic acid-methanol or water-methanol-glacial acetic acid-butanol mixtures. As particularly advantageous for elution of a frankonite or norite adsorbate, the mixture of water (4 parts by volume) and pyridine (1 part by volume) proven.
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2) Weiter kann das Ferrirhodin einer wässrigen Lösung mittels organischer Lösungsmittel entzogen werden. Für diese Extraktionsverfahren haben sich höhere organische Alkohole, z.B. Benzylalkohol oder Isopropylalkohol, besonders bewährt. Zweckmässigerweise wird dabei der wässrigen Phase ein anorganisches Salz, z.B. Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid, zugesetzt. Aus den erhaltenen organischen Extrakten kann das Ferrirhodin entweder durch Abdampfen des Lösungsmittels oder durch Ausfällung mittels eines geeigneten organischen Lösungsmittels, z.B. Aether, Petroläther oder Aethylacetat, in angereicherter Form erhalten werden.2) Furthermore, the ferrirhodin can be removed from an aqueous solution by means of organic solvents. Higher organic alcohols, e.g. benzyl alcohol or isopropyl alcohol, are particularly suitable for these extraction processes proven. Appropriately, an inorganic salt, e.g. ammonium sulfate or sodium chloride, is added to the aqueous phase. added. The ferrirhodin can be obtained from the organic extracts obtained either by evaporating the Solvent or by precipitation using a suitable organic solvent, e.g. ether, petroleum ether or ethyl acetate, can be obtained in enriched form.
3) Eine weitere Methode der Anreicherung des'3) Another method of enriching the '
Ferrirhodins besteht darin, dass man es zwischen einer wässerigen Lösung und einer Lösung von Phenol in Chloroform verteilt, wobei der Phenolgehalt der Chloroformlösung variiert werden kann. -.-..-Ferrirhodins consists in putting it between an aqueous solution and a solution of phenol in chloroform distributed, the phenol content of the chloroform solution can be varied. -.-..-
4) Eine andere Methode zur Anreicherung des Ferrirhodins stellt die Chromatographie dar, wie Adsorptionschromatographie an verschiedenen Materialien, z.B. an Norit, Aluminiumoxyd, Magnesiumsi-likaten, Silicagel, Calciumsulfat, sowie Verteilungschromatographie mit Cellulose, Stärke, Silicagel, Celite und dergl. als Trägersubstanzen.4) Another method for enriching ferrirhodine is chromatography, such as adsorption chromatography on various materials, e.g. on Norit, aluminum oxide, magnesium silicates, silica gel, calcium sulfate, as well as partition chromatography with cellulose, starch, silica gel, celite and the like as carrier substances.
5) Welter kann das Ferrirhodin durch Gegenstromverteilung nach Craig zwischen zwei nicht mischbaren Lösungsmittelphasen angereichert werden. Folgendes Lösungs-5) Ferrirhodin can be weltered by countercurrent distribution according to Craig between two immiscible solvent phases. The following solution
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mittelsystem hat sich dabei besonders bewährt : n-Butanol-Benzylalkohol-OjOOl-n. Salzsäure-wässrige, bei I9 gesättigte Natriumchloridlösung (9:9:15:5).medium system has proven particularly useful: n-butanol-benzyl alcohol-OjOOl-n. Hydrochloric acid aqueous sodium chloride solution saturated at 19 (9: 9: 15: 5).
Desferrirhodin wird neben Ferrirhodin von den genannten Aspergillus-Stämmen gebildet und kann daher auch direkt aus dem KuIturfiltrat isoliert werden. Vorteilhaft entfernt man bei der Isolierung im Kulturfiltrat vorhandenes Eisen, beispielsweise durch Zusatz Eisenkomplex-bildender Stoffe, z.B. 8-Oxy-chinolin.Desferrirhodin is used next to Ferrirhodin by the called Aspergillus strains and can therefore also be isolated directly from the culture filtrate. Advantageous iron present in the culture filtrate is removed during isolation, for example by adding iron complexes Substances, e.g. 8-oxy-quinoline.
Man kann die Eisenkomplex-bildenden Stoffe direkt nach Beendigung der Fermentation der KuItürbrühe zusetzen. Vorteilhaft erfolgt der Zusatz in einem späteren Stadium der Aufarbeitung um allfällige durch die benützten Agenzien eingeschleppte Eisen-(III)-ionen ebenfalls zu entfernen.The iron complex-forming substances can be added to the cooling broth immediately after the fermentation has ended. The addition advantageously takes place at a later stage of the work-up to include any agents used also remove entrained iron (III) ions.
Die Isolierung des Desferrirhodins aus der Kulturlösung erfolgt nach den für die Isolierung von Ferrirhodin erwähnten Methoden.The isolation of desferrirhodin from the culture solution is carried out according to the methods mentioned for the isolation of ferrirhodine.
Die pharmazeutischen Präparate enthalten Ferrirhodin, Desferrirhodin, ihre Hydrierungsprodukte und/oder Derivate dieser Verbindungen in Mischung mit einem organischen oder anorganischen pharmazeutischen Träger, der für die enterale oder parenterale Anwendung geeignet ist. Die Präparate werden aus dem Ausgangsmaterial nach den üblichen Methoden hergestellt. Geeignete Träger sind Substanzen, die mit aktiven Substanzen nicht reagieren, wie z.B. Gelatine,The pharmaceutical preparations contain ferrirhodin, desferrirhodin, their hydrogenation products and / or Derivatives of these compounds in admixture with an organic or inorganic pharmaceutical carrier suitable for enteral or parenteral use is suitable. The preparations are made from the starting material according to the usual Methods made. Suitable carriers are substances that do not react with active substances, such as gelatin,
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Laktose, Glukose, Natriumchlorid, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche OeIe, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Cholesterin oder andere bekannte medizinische Träger.Lactose, glucose, sodium chloride, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohols, rubber, polyalkylene glycols, Cholesterol or other known medicinal carriers.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben. The invention is described in the following examples. The temperatures are given in degrees Celsius.
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- 17 Beispiel- 1 : - 17 Example- 1:
Der Stamm Aspergillus versicolor M J>6j>6 wird in gut belüfteter Submerskultur bei 27° gezüchtet. Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter· destilliertem Wasser 20 g Glukose (eisenfrei), 5 g L-Asparagin, 1 g sek.-Kaliumphosphat, 1 g krist. Magnesiumsulfat (MgSO1^, 7.H2O) und 0,5 g Calciumchlorid enthält. Die Nährlösung wird 20 Minuten bei 120° sterilisiert. Geimpft wird mit einer Sporensuspension, die 100-200 Millionen Sporen pro Liter enthält.The strain Aspergillus versicolor M J>6j> 6 is grown in a well-ventilated submerged culture at 27 °. A nutrient solution is used which contains 20 g of glucose (iron-free), 5 g of L-asparagine, 1 g of secondary potassium phosphate, 1 g of crystalline per liter of distilled water. Contains magnesium sulfate (MgSO 1 ^, 7.H 2 O) and 0.5 g calcium chloride. The nutrient solution is sterilized at 120 ° for 20 minutes. It is vaccinated with a spore suspension that contains 100-200 million spores per liter.
Nach 8-12 Tagen wird den Kulturen 1 g Ferrichlorid pro Liter zugesetzt und unter Zusatz von 2ffo Celit filtriert. Das Kulturfiltrat wird nun mit Natriumchlorid gesättigt und die klare Lösung zweimal mit l/lO Volumen Benzylalkohol extrahiert. Die organische Phase wird mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und mit 3 Volumen Aether versetzt. Das Benzylalkohol-Aethergemisch extrahiert man bis zur Entfärbung mit destilliertem Wasser. Die wässrigen Auszüge werden vereinigt, die Reste von Benzylalkohol mit Aether entfernt und lyophilisiert, wobei man ein rotes Pulver erhält.After 8-12 days, 1 g of ferric chloride per liter is added to the cultures and filtered with the addition of 2ff celite. The culture filtrate is now saturated with sodium chloride and the clear solution is extracted twice with 1/10 volume of benzyl alcohol. The organic phase is dried with sodium sulfate, filtered and mixed with 3 volumes of ether. The benzyl alcohol-ether mixture is extracted with distilled water until it is discolored. The aqueous extracts are combined, the residues of benzyl alcohol are removed with ether and lyophilized, a red powder being obtained.
10,6 g Rohprodukt werden einer 137-stufigen10.6 g of crude product are a 137-stage
Craig-Verteilung unterzogen. Als zweiphasiges Lösungsmittelsystem dient ein Gemisch aus 1,8 Liter Benzylalkohol, 1,8 Liter n-Butylalkohol, 1,0 Liter gesättigter wässrigerSubjected to craig distribution. A mixture of 1.8 liters of benzyl alcohol, 1.8, is used as the two-phase solvent system Liter of n-butyl alcohol, 1.0 liter of saturated aqueous
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Natriumchloridlösung und 3 Liter 0,001-n. wässriger Salzsäure .Sodium chloride solution and 3 liters of 0.001-n. aqueous hydrochloric acid .
Im Verlauf der Verteilung wird der rotbraune Farbstoff im wesentlichen in.eine Haupt- und eine Nebenkomponente aufgetrennt. Die Hauptkomponente besitzt ein Maximum in Stufe 52 (K ca. 0,5), die Nebenkomponente in Stufe 123 (K ca. 11). Die Aufarbeitung der Fraktionen 4O-6O ergibt 1,29 S Ferricrocin (vgl. Anmeldung Nr. C 3016I IVa/6b Case 5O88/I-3/E).In the course of the distribution, the red-brown dye is essentially divided into a main component and a secondary component separated. The main component has a maximum in level 52 (K approx. 0.5), the secondary component in Level 123 (K approx. 11). The processing of the fractions 4O-6O yields 1.29 S ferricrocin (cf. Application No. C 3016I IVa / 6b Case 5O88 / I-3 / E).
Die Fraktionen IO6-I3O werden vereinigt. Durch ,Zusatz von Aether wird das Ferrirhodin in die wässrige Phase gedrängt. Diese wird abgetrennt und die organische Schicht noch zweimal mit Wasser ausgeschüttelt. Die vereinigten wässrigen Lösungen werden mit Natriumchlorid etwa halb gesättigt und mehrmals mit Phenol-Chloroform (1 kg Phenol auf 1 Liter Chloroform) ausgeschüttelt. Die trüben rotbraunen Phenol-Chloroform-Auszüge werden an einer Säule aus Celit geklärt, mit dem doppelten Volumen Aether versetzt und mehrmals mit destilliertem Wasser ausgezogen. Die wässrigen Lösungen wäscht man mehrmals mit Aether, um das Phenol vollständig zu entfernen, und dampft sie im Vakuum ein. Man erhält 32H ™S eines rotbraunen kristallinen Rückstandes. Durch Umkristallisieren aus Methanol-Aether wird das Ferrirhodin in Form glänzender rotbrauner Kristalle erhalten; Zersetzungspunkt ca. 270°.The fractions IO6-I3O are combined. By adding ether, the ferrirhodin is forced into the aqueous phase. This is separated off and the organic layer is extracted twice more with water. The combined aqueous solutions are approximately half saturated with sodium chloride and extracted several times with phenol-chloroform (1 kg of phenol to 1 liter of chloroform). The cloudy red-brown phenol-chloroform extracts are clarified on a column of Celite, double the volume of ether is added and the extract is extracted several times with distilled water. The aqueous solutions are washed several times with ether in order to completely remove the phenol, and they are evaporated in vacuo. 3 2 H ™ S of a red-brown crystalline residue are obtained. By recrystallization from methanol-ether, the ferrirhodine is obtained in the form of shiny red-brown crystals; Decomposition point approx. 270 °.
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Analyse : Gef. C 49,28$; H 6,38$; Pe 6,25$; Ν 12,30$. Ber. für C41H64O17N9PeAnalysis: Found C $ 49.28; H $ 6.38; Pe $ 6.25; Ν $ 12.30. Ber. for C 41 H 64 O 17 N 9 Pe
C 48,71$; H 6,38$; N 12,47$;. Pe 5,53$· Absorptionsspektrum in Feinsprit : Λ „_. = 215 ηιμ (logC $ 48.71; H $ 6.38; N $ 12.47 ;. Pe $ 5.53 Absorption spectrum in fine spirits: Λ „_. = 215 ηιμ (log
maxMax
(log B^m- 1.56). (log B ^ m - 1.56).
Das IR-Spektrum in Kaliumbromid zeigt u.a. Banden bei 852, 933, 988, 1038, 1142, 1190, 1244, 1355, 1460, 1539, 1660, 2945, 3440 cm"1, vgl. Pig. I.The IR spectrum in potassium bromide shows, inter alia, bands at 852, 933, 988, 1038, 1142, 1190, 1244, 1355, 1460, 1539, 1660, 2945, 3440 cm " 1 , cf. Pig. I.
Im Papierchromatogramm wurde Perrirhodin mit anderen Sideraminen verglichen, siehe Tabelle 2. Die Methode ist folgende : Ein Blatt Whatman-Filterpapier Nr. 1 wird mit einem Gemisch aus Aceton, Wasser und gesättigter wässriger Natriumchloridlösung (Volumen-Verhältnis 6:3:1) imprägniert und IO-I5 Minuten an der Luft getrocknet. Auf die Startlinie wird abwechslungsweise ein Tropfen einer methanolischen Lösung der Vergleichssubstanz (Startpunkte 1, 3, 5 und 7) und des Ferrirhodins (Startpunkte 2,4,6 und 8) aufgetragen. Das Chromatogramm wird während ca. 20 Stunden entwickelt mit dem Fliessmittel tert.-Butanol-0,004-n. Salzsäure-gesätt.wäss. Natriumchloridlösung (2:1:1). Die Flecke der Sideramine werden durch ihre Eigenfarbe erkannt. Trotz des relativ geringen Unterschiedes in den Rf-Werten einiger Sideramine ergibt sich nach der beschriebenen Methode eine eindeutige Unterscheidung.Perrirhodin was compared with other sideramines in the paper chromatogram, see Table 2. The method is as follows: A sheet of Whatman No. 1 filter paper is washed with a mixture of acetone, water and saturated aqueous Sodium chloride solution (volume ratio 6: 3: 1) impregnated and air-dried for 10-15 minutes. On the The starting line is alternately a drop of a methanolic solution of the reference substance (starting points 1, 3, 5 and 7) and of ferrirhodine (starting points 2, 4, 6 and 8). The chromatogram lasts for about 20 hours developed with the superplasticizer tert-butanol-0.004-n. Hydrochloric acid sat. Sodium chloride solution (2: 1: 1). the Sideramine spots are recognized by their own color. Despite the relatively small difference in the Rf values Some sideramines result in a clear distinction using the method described.
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Der Stamm Aspergillus versicolor M 3636 wird wie in Beispiel 1 gezüchtet, das Kulturmedium mit Eisenchlorid versetzt und unter Zusatz von Celit filtriert. Man extrahiert das erhaltene Kulturfiltrat 2mal mit l/lO Volumen Chloroform-Phenol (l Volumteil : 1 Gewichtsteil), trennt die organische Phase ab und filtriert sie durch Celit. Dann versetzt man die organische Lösung mit 4 Volumen Aether und extrahiert sie bis zur Entfärbung mehrmals mit destilliertem Wasser. Die wässrigen Auszüge werden vereinigt, zur Entfernung von Phenolresten mit Aether gewaschen, im Vakuum vom Aether befreit und anschliessend lyophylisiert. Das erhaltene Rohprodukt wird wie in Beispiel 1 gereinigt. In gleicher Weise wie in Beispiel 1 be-The strain Aspergillus versicolor M 3636 becomes like grown in Example 1, the culture medium mixed with iron chloride and filtered with the addition of Celite. One extracts the culture filtrate obtained is separated twice with 1/10 volume of chloroform-phenol (1 part by volume: 1 part by weight) the organic phase and filtered through Celite. Then the organic solution is mixed with 4 volumes of ether and extract it several times with distilled water until it becomes discolored. The aqueous extracts are combined for removal washed of phenol residues with ether, in vacuo freed from ether and then lyophilized. The crude product obtained is purified as in Example 1. In the same way as in example 1
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schrieben wird Perrirhodin erhalten, wenn man Aspergillus nidulans M 273^· züchtet und das Kulturmedium wie beschrieben aufarbeitet.perrirhodin is obtained when Aspergillus nidulans M 273 ^ · is cultivated and the culture medium is as described worked up.
150 mg krist. Perrirhodin werden in 10 ml Wasser gelöst und 200 mg 8-Hydroxy-chinolin, gelöst in 3 ml Methanol, zugefügt. Nach 20-stündigem Rühren wird vom schwarzen Niederschlag abfiltriert und das überschüssige Reagens aus dem Piltrat durch mehrmaliges Ausschütteln mit Chloroform entfernt. Die blass-rötliche wässrige Lösung .enthält das Desferrirhodin. Die Lösung wird mit I50 mg Perjodsäure in 5 ml Wasser vermischt und zwei Stunden stehen gelassen. Darauf wird mit konz. Salzsäure stark sauer gemacht und 2 Stunden mit Aether kontinuierlich extrahiert. Die Aetherlösung wird getrocknet und eingedampft und der Rückstand bei 12 mm Druck und einer Blocktemperatur von 120-140 destilliert. Man erhält ca. 40 mg eines gelben OeIs, das im Dünnschichtchromatogramm einheitlich ist (Rf 0,50 in Benzol-Essigester 1:1 auf Kieselgelj Anfärbung durch Besprühen mit Schwefelsäure und anschließend mit 1-proz. Kaliumpermanganatlösung. Nach kurzem Erwärmen wird das Lakton als weisser Fleck auf bräunlichem Hintergrund sichtbar. max in Peinsprit 217 πιμ, log £= 3,92.150 mg crystall. Perrirhodin are dissolved in 10 ml of water and 200 mg of 8-hydroxy-quinoline, dissolved in 3 m l of methanol was added. After stirring for 20 hours, the black precipitate is filtered off and the excess reagent is removed from the piltrate by shaking it out several times with chloroform. The pale reddish aqueous solution contains the desferrirhodin. The solution is mixed with 150 mg of periodic acid in 5 ml of water and left to stand for two hours. Then with conc. Hydrochloric acid made strongly acidic and extracted continuously with ether for 2 hours. The ethereal solution is dried and evaporated and the residue is distilled at 12 mm pressure and a block temperature of 120-140. About 40 mg of a yellow oil are obtained, which is uniform in the thin-layer chromatogram (Rf 0.50 in benzene-ethyl acetate 1: 1 on silica gel). Coloring by spraying with sulfuric acid and then with 1% potassium permanganate solution white spot visible on brownish background. max πιμ in Peinsprit 217, log £ = 3.92.
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■\)(CO) in Tetrachlorkohlenstoff : I73O cm" .■ \) (CO) in carbon tetrachloride: 173O cm ".
NMR.-Spektrum : 2,00 ppm (d, J = 1,2 cps; 3 H),Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 2.00 ppm (d, J = 1.2 cps; 3 H),
2,36 ppm (t, J = 6,3 cps; 2 H),2.36 ppm (t, J = 6.3 cps; 2 H),
4,31 ppm (t, J = 6,3 cps; 2 H),4.31 ppm (t, J = 6.3 cps; 2 H),
5,68 ppm (q, J = 1,2 cps j 1 H).5.68 ppm (q, J = 1.2 cps j 1 H).
Es handelt sich darnach um das Lakton der 5-Hydroxy-3-methyl-penten-(2)-säure. According to this, it is the lactone of 5-hydroxy-3-methyl-pentenoic (2) acid.
10 mg Perrirhodin werden in 1 ml 6-n. Salzsäure gelöst und während 3 Stunden kontinuierlich mit Aether extrahiert, wonach die wässerige Lösung eisenfrei ist. Zur wässerigen Phase fügt man noch 0,3 ml konz. Salzsäure und schmilzt die farblose Lösung in ein Glasrohr ein. Nach 18 Stunden Erhitzen auf 110° wird im Vakuum eingedampft und eine Probe des Rückstandes nach Moore und Stein analysiert. Es lassen sich Serin und Glycin nachweisen. An basischen Aminosäuren wird eine Spur Ornithin gefunden. Ein weiterer nicht identifizierbarer Peak ist offenbar dem £-N-Hydroxyornithin zuzuschreiben.10 mg perrirhodin are in 1 ml 6-n. Dissolved hydrochloric acid and extracted continuously with ether for 3 hours, after which the aqueous solution is iron-free. 0.3 ml of conc. Hydrochloric acid and melt the colorless solution in a glass tube. After 18 hours of heating at 110 °, it is evaporated in vacuo and a sample of the residue was analyzed according to Moore and Stein. Serine and glycine can be detected. At basic A trace of ornithine is found in amino acids. Another unidentifiable peak is apparently £ -N-hydroxyornithine attributable to.
Die Hauptmenge des Hydrolysates wird in 2 Tropfen Wasser und 5 rnl Feinsprit gelöst und mit 20 mg Platin-dioxyd 24 Std. lang hydriert. Die Moore und Stein-Analyse des Hydrierungsproduktes zeigt die Anwesenheit von Serin und Glycin im ungefähren Verhältnis 1,3 : 1, sowieThe bulk of the hydrolyzate is dissolved in 2 drops of water and 5 ml of fine spirits and with 20 mg of platinum dioxide Hydrogenated for 24 hours. The Moore and Stein analysis of the hydrogenation product shows the presence of serine and glycine in an approximate ratio of 1.3: 1, as well
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Ornithin und Ammoniak (ca..2:1), deren Summe etwa der dreifachen molekularen Menge des nachgewiesenen Glycins entspricht. Das Auftreten von Ammoniak im hydrierten Hydrolysat ist durch eine Zersetzung eines Teils des $-N-'Hydroxyornithins während der Hydrolyse zu erklären.Ornithine and ammonia (approx. 2: 1), the sum of which corresponds to about three times the molecular amount of the detected glycine. The appearance of ammonia in the hydrogenated hydrolyzate is due to the decomposition of part of the $ -N-'hydroxyornithine to explain during hydrolysis.
Beispiel 5 Example 5 '·'·
12 mg Perrirhodin werden mit 1 ml 57-proz. Jodwasserstoff säure in ein Glasrohr eingeschmolzen und 6 Std. auf 110° erhitzt. Das Reaktionsgemisch dampft man im Vakuum ein, wobei man einen tiefbraunen Rückstand erhält. Dieser wird in wenig Wasser gelöst, eingetrocknet, erneut 'gelöst und eingetrocknet, bis das Hydrolysat praktisch farblos ist.12 mg perrirhodin are mixed with 1 ml 57 percent. Hydroiodic acid melted in a glass tube and heated for 6 hours. heated to 110 °. The reaction mixture is evaporated in vacuo, a deep brown residue being obtained. This is dissolved in a little water, dried, redissolved and dried until the hydrolyzate is practically colorless is.
Die Analyse nach Moore und Stein ergibt die Anwesenheit folgender Aminosäuren :The analysis according to Moore and Stein shows the presence of the following amino acids:
0,20 Serin, 1,00 Glycin, 1,55 Alanin, 2,95 Ornithin, 0,03 NH5.0.20 serine, 1.00 glycine, 1.55 alanine, 2.95 ornithine, 0.03 NH 5 .
Die Zahlen geben das molekulare Verhältnis bezogen auf Glycin = 1,00 an.The numbers indicate the molecular ratio based on glycine = 1.00.
Die Ausbeute an Glycin ist quantitativ. Serin wird zwar zu einem grossen Teil verändert, das umgesetzte Serin tritt aber fast vollständig als Alanin im Hydrolysat auf und kann als solches quantitativ bestimmt werden. DieThe glycine yield is quantitative. Serine is changed to a large extent, the converted Serine occurs almost entirely as alanine in the hydrolyzate and can be quantified as such. the
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Summe aus Serin + Alanin entspricht mit guter Reproduzierbarkeit ca. 90$ des theoretischen Serin-Wertes.Sum of serine alanine + corresponds with good reproducibility 90 $ de s theoretical serine value.
Ornithin wird durch reduktive Hydrolyse des Hydroxylaminderivates gebildet und fast quantitativ erfasst. Ammoniak tritt nur in. Spuren (1-2$ des Ornithins) auf.Ornithine is produced by reductive hydrolysis of the hydroxylamine derivative educated and recorded almost quantitatively. Ammonia occurs only in traces (1-2 $ of ornithine).
Zu einer Aufschlämmung von 100 mg 10$iger Palladiumkohle in 5 ml Methanol gibt man eine Lösung von 149 mg Ferrirhodin in 5 ml Methanol und rührt das Gemisch bei • Zimmertemperatur in einer Wasserstoffatmosphäre. Die Wasserstoffaufnahme ist anfangs sehr rasch. Nach ca. 1 Std. sind ca. 3 Mol Wasserstoff aufgenommen und die Hydrierung kommt zum Stillstand. Nun wird vom Katalysator abfiltriert. Zum orangebraunen Filtrat fügt man eine Lösung von 100 mg Eisen-(III)-chlorid in Methanol hinzu, um allenfalls reduziertes Eisen zu ersetzen und puffert die Lösung ab durch Zugabe von etwas krist. Natriumacetat. Nach 4-stündigem Stehen wird die Lösung im Vakuum eingedampft, der Rückstand in Wasser aufgenommen und die Lösung mehrmals mit Phenol-Chloroform (1:1) ausgeschüttelt. Der durch Celit filtrierte Phenol-Chloroform-Auszug wird mit 2 Vol. Aether verdünnt, dreimal mit dest. Wasser ausgeschüttelt und die mit Aether gewaschenen wässrigen Lösungen im Vakuum eingedampft.To a slurry of 100 mg of 10 $ palladium carbon a solution of 149 mg is added to 5 ml of methanol Ferrirhodin in 5 ml of methanol and stir the mixture • Room temperature in a hydrogen atmosphere. The hydrogen uptake is very quick at first. After approx. 1 hour approx. 3 mol of hydrogen have been taken up and the hydrogenation takes place to a standstill. The catalyst is now filtered off. A solution of 100 mg is added to the orange-brown filtrate Iron (III) chloride in methanol is added to reduce the amount at best Replace iron and buffer the solution by adding some crystalline. Sodium acetate. After 4 hours Standing, the solution is evaporated in vacuo, the residue is taken up in water and the solution is repeated several times with phenol-chloroform (1: 1) shaken out. The phenol-chloroform extract filtered through Celite is diluted with 2 vol. Of ether, three times with dist. Shaken out water and evaporated the aqueous solutions washed with ether in vacuo.
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Man erhält das Hexahydroferrirhodin als orangegelbes amorphes Pulver. Ausbeute : I32 mg.The hexahydroferrirhodine is obtained as an orange-yellow amorphous powder. Yield: 132 mg.
UV.-Absorptionsmaxima in Peinsprit : Hohe Endabsorption bei 220 ΐημ (log £ Über 4); Maximum bei 425-430 ηιμ. (log £3,5). IR.-Spektrum in Nujöl, s.'Fig. 2.UV absorption maxima in Peinsprit: high final absorption at 220 ΐημ (log £ over 4); Maximum at 425-430 ηιμ. (log £ 3.5). IR spectrum in Nujöl, see 'Fig. 2.
In der Papierchromatographie sind die Rf-Werte in den Systemen I und II : ■In paper chromatography, the Rf values in systems I and II are: ■
I III II
Ferrirhodin 0,65 0,85Ferrirhodine 0.65 0.85
Hexahydroferrirhodin 0,57 0,80Hexahydroferrirhodine 0.57 0.80
Ferrirhodin gibt einen rötlich-braunen, das Hydrierungsprodukt einen gelborangen Fleck. Ferrirhodin gives a reddish-brown spot, the hydrogenation product a yellow-orange spot.
1 g rohes Hexahydroferrirhodin wird in 40 ml Wasser gelöst und mit 1,5 g 8-Hydroxychinolin, gelöst in 15 ml Methanol, vermischt. Nach 24-stündigem Rühren bei filtriert man vom ausgeschiedenen Eisen(lll)oxinat ab. Das Filtrat wird 5mal mit Chloroform ausgeschüttelt und dann im Vakuum zur Trockene verdampft. Man erhält 900 mg Desferrihexahydroferrirhodin der Formel IV1 g of crude hexahydroferrirhodine is dissolved in 40 ml of water and 1.5 g of 8-hydroxyquinoline, dissolved in 15 ml of methanol, mixed. After stirring for 24 hours at the precipitated iron (III) oxinate is filtered off. That The filtrate is extracted 5 times with chloroform and then evaporated to dryness in vacuo. 900 mg of desferrihexahydroferrirhodine are obtained of formula IV
809805/0960809805/0960
CH,CH,
CH-CH2-CH2-OHCH-CH 2 -CH 2 -OH
coco
I /I /
HO-N-(CH2) -OHHO-N- (CH 2 ) -OH
CO—NH-CH-CO CH.CO-NH-CH-CO CH.
CH-CH2-CH2OHCH-CH 2 -CH 2 OH
ι 2 ι 2
CO .CO.
NHNH
COCO
NH CH-(CH2) -N-OHNH CH- (CH 2 ) -N-OH
COCO
CH-CH0OH ■ IV 2CH-CH 0 OH ■ IV 2
CO—CH-NH-COCO-CH-NH-CO
J-N-CO-CH2-CH-CH2-CH2Oh OH CH,JN-CO-CH 2 -CH-CH 2 -CH 2 Oh OH CH,
als nahezu amorphes farbloses Pulver, das mit Ferrichlorid (~L% in Methanol) eine violette Farbreaktion zeigt. Im NMR.-Spektrum, das in schwerem Wasser (Dp0) aufgenommen wird, findet man folgende Signale :as an almost amorphous colorless powder that shows a violet color reaction with ferric chloride (~ L% in methanol). The following signals are found in the NMR spectrum, which is recorded in heavy water (D p 0):
(ppm) Aufspaltung 0,93 d (J = 5 cps) (ppm) split 0.93 d (J = 5 cps)
1,2-2,2 b1.2-2.2 b
2,42.4
b bb b
Anzahl HNumber of H
2121
6 18 Zuordnung .6 18 Assignment .
Methylgruppen der 5-Hydroxy-3-methyl-pentan- säurereste.Methyl groups of the 5-hydroxy-3-methyl-pentane acid residues.
ß- und 7-CH- der N-Hydroxy-ornitninreste; γ-CH- der--5-Hydroxy-3rmethyl-pentansäurereste; ß-CH der 5-Hydroxy-3-methyl-pentansäurereste. ß- and 7-CH- the N-hydroxy-ornitnine residues; γ-CH- der - 5-hydroxy-3rmethylpentanoic acid residues; ß-CH of the 5-hydroxy-3-methylpentanoic acid residues.
ct-CHp der 5-Hydroxy-3-methyl-pentansäurereste. ct-CHp of the 5-hydroxy-3-methylpentanoic acid residues.
<£-CH2 der N-Hydroxy-ornithmreste; <£ -CH 2 of the N-hydroxy-ornithm radicals;
des Glycinrestes;the glycine residue;
8 0 9 8 0 5/09608 0 9 8 0 5/0960
(ppm) Aufspaltung Anzahl H Zuordnung(ppm) Splitting number of H allocation
der Serinreste; p der 5-Hydroxy-3-methyl-pentansäurereste. the serine residues; p of the 5-hydroxy-3-methylpentanoic acid residues.
4,3 b 5' a-CH der N-Hydroxy-or4,3 b 5 'a-CH of the N-hydroxy-or
nithin- und Serinreste.nithine and serine residues.
900 mg Desferri-hexahydroferrirhodin werden mit 30 ml N-Salzsäure im Wasserbad auf ca. 95° erwärmt. In Abständen von ca. 5 Minuten wird ein Tropfen der Lösung auf der Tüpfelplatte mit 2 Tropfen 2#iger methanolischer Eisen-(III)-chloridlösung versetzt. Anfänglich tritt eine starke violette Farbreaktion auf. Nach 50 Minuten ist die 'Farbreaktion nur noch sehr blass. Die Hydrolyse wird abgebrochen und'die Lösung, welche das Cyclo-tL-^-hydroxy-ornithyl-glycyl-L-^-hydroxy-ornithyl-L-seryl-L-^-hydroxy-ornithyl-L-seryl) enthält, im Vakuum eingedampft. Den Rückstand acetyliert man mit je 10 ml Essigsäureanhydrid und Pyridin während 5 Stunden bei Zimmertemperatur. Das Reaktionsgemisch wird erneut im Vakuum eingedampft. Zur partiellen Ammonolyse der gebildeten O-Acetylbindungen wird das Reaktionsprodukt in 60 ml kaltgesättigtem methanolischem Ammoniak 4 Stunden stehen gelassen. Der Eindampfrückstand dieser Lösung, der das Desferrichrysin und Nebenprodukte enthält, wird darauf in methanolischer Lösung mit Ig Eisen-(III)-chlorid umge-900 mg desferri-hexahydroferrirhodin are used with 30 ml of N-hydrochloric acid heated to approx. 95 ° in a water bath. At intervals of about 5 minutes, one drop of the solution is placed on the spot plate with 2 drops of 2 # strength methanolic iron (III) chloride solution offset. Initially there is a strong purple color reaction. After 50 minutes the 'color reaction just very pale. The hydrolysis is stopped and the solution which contains the cyclo-tL - ^ - hydroxy-ornithyl-glycyl-L - ^ - hydroxy-ornithyl-L-seryl-L - ^ - hydroxy-ornithyl-L-seryl) contains, evaporated in vacuo. The residue is acetylated with 10 ml each of acetic anhydride and pyridine during 5 hours at room temperature. The reaction mixture is again evaporated in vacuo. For partial ammonolysis of the O-acetyl bonds formed becomes the reaction product left to stand in 60 ml of cold-saturated methanolic ammonia for 4 hours. The evaporation residue of this solution, the which contains desferrichrysin and byproducts is on it in methanolic solution with Ig iron (III) chloride reacted
809805/0960809805/0960
setzt, die tief violette Lösung mit krist. Natriumacetat gepuffert, bis ein Farbumschlag nach orangebraun eintritt, und die Lösung nach 4-stündigem Stehen eingedampft. Den •Rückstand löst man in Wasser, gibt ca. 10$ Natriumchlorid dazu und schüttelt mehrmals mit Phenol-Chloroform (lg: 1 ml) aus und filtriert die· anfänglich trübe Phenol-Chloroformlösung durch eine Säule aus 10 g Celite. Das klare Piltrat verdünnt man mit Aether und extrahiert dreimal mit destilliertem Wasser. Die gut mit Aether gewaschenen wässerigen Auszüge dampft man im Vakuum ein und reinigt das Rohprodukt durch eine Craig-Verteilung über 50 Stufen. Als Lösungsmittelsystem verwendet man ein Gemisch aus 9 Teilen n-Butanol, 9 Teilen Benzylalkohol, 15 Teilen 0,001 N-SaIzsäure und 5 Teilen gesättigter wässriger Natriumchloridlösung. Die Hauptkomponente des Gemisches ist in der Stufe 19 am stärksten angereichert, was einem Verteilungskoeffizienten von 0,62 entspricht (authentisches Perrichrysin : k = 0,63).sets, the deep purple solution with krist. Sodium acetate buffered until the color changes to orange-brown and the solution evaporated after standing for 4 hours. The • Dissolve the residue in water, add about 10 $ sodium chloride and shake several times with phenol-chloroform (lg: 1 ml) and the initially cloudy phenol-chloroform solution is filtered through a column of 10 g Celite. The clear piltrate is diluted with ether and extracted three times with distilled water. The aqueous extracts, washed well with ether, are evaporated in vacuo and the crude product is purified through a Craig distribution over 50 levels. as In the solvent system, a mixture of 9 parts of n-butanol, 9 parts of benzyl alcohol, 15 parts of 0.001 N-hydrochloric acid is used and 5 parts of saturated aqueous sodium chloride solution. The main component of the mixture is in the stage 19 most enriched, which corresponds to a distribution coefficient of 0.62 (authentic perrichrysin: k = 0.63).
Die Fraktionen 12 bis 25 werden in üblicherFractions 12 to 25 are more common
Weise mit Phenol-Chloroform aufgearbeitet. Man erhält 202 mg Ferrlchrysih, das durch Kristallisation aus Aethylalkohol weiter gereinigt wird. Die rotorangen Kristalle zersetzen sich, wie authentisches Ferrichrysin, langsam bei ca. 25O-26O , ohne zu schmelzen.Way worked up with phenol-chloroform. 202 mg are obtained Ferrlchrysih, which is further purified by crystallization from ethyl alcohol. The red-orange crystals decompose like authentic ferrichrysin, slowly at approx. 25O-26O without melting.
809805/0960809805/0960
Das Produkt verhält sich bei der Papierchromatographie in den Systemen I und II genau wie authentisches
Perrichrysin (vgl. Tabelle unten), und das IR.-Absorptionsspektrum
stimmt mit dem von authentischem Perrichrysin völlig überein.
Papierchromatographie : In paper chromatography in systems I and II, the product behaves exactly like authentic perrichrysin (cf. table below), and the IR absorption spectrum corresponds completely to that of authentic perrichrysin.
Paper chromatography:
auth.Perrichrysin
auth.
produktTransformation
product
Im Antagonismustest gegen Perrimycin A verhält sich das Produkt wie natürliches Ferrichrysin.In the antagonism test against perrimycin A, the product behaves like natural ferrichrysin.
809805/0960809805/0960
Claims (3)
Neue Unteriagen (Art 7 ii Abs» 2 nm setz 3 de« Xnoeruqgee·«· * * »· 8 09805/0960
New documents (Art 7 ii Abs »2 nm setz 3 de« Xnoeruqgee · «· * *» ·
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Legal Events
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SH | Request for examination between 03.10.1968 and 22.04.1971 |